PEMERIKSAAN IMUNOLOGI PENYAKIT INFEKSIElisabeth D. HarahapDepartemen Mikrobiologi FK UKRIDA

Pemeriksaan imunologik untuk diagnosispenyakit infeksi dapat dilakukan dengan:

Reaksi Antigen- Antibodi invitro (Rx. SEROLOGI)

Uji serologi dapat digunakan untuk:

Deteksi Antigen menggunakan antibodi yang sudah diketahui.

2. Deteksi Antibodi menggunakan antigen yang sudah diketahui.

Deteksi Antigen:dapat dilakukan untuk spesimenklinik langsung atau untukidentifikasi mikroba.

Deteksi Antibodi:Untuk mendeteksi respon antiboditertentu (IgM/IgG).IgM muncul lebih dini pada suatuinfeksi daripada IgG.

Diagnosis dapat ditegakkan dengan:

Adanya antibodi IgM terhadap suatumikroorganisme patogen tertentu menandakan infeksi yang baru atausedang berlangsung.

Adanya kenaikan titer antibodi sebesar 4 kali atau lebih antara serum masa akut dan serum masa konvalesenmenunjukkan adanya infeksi.

RESPON ANTIBODI

ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

DETEKSI

ANTIGEN ANTIBODI YANG DIKETAHUI

ANTIBODI ANTIGEN YANG DIKETAHUI

Uji serologi untuk infeksi dengue:

1. Uji untuk mendeteksi komponen virus, mendeteksi antigen NS1 dengan teknik ELISA.

2. Uji serologi memakai serum tunggal, melihat ada/tidaknya antibodi kelas tertentu (IgM & IgG)Rapid Immunochromatographic test

3. Uji serologi memakai serum ganda, yaitu serum masa akut dan masa konvalesen. Lihat kenaikan titer (minimal 4 kali). Teknik Hambatan hemaglutinasi (HI)

SKEMA VIRUS DENGUEEHARNAC

SKEMA GENOM VIRUS DENGUESNS35CMENS1 NS2A NS2B NS3 NS4A NS4B NS5

Serum pasien 1:10Inkubasi 1 jam, 37CAntibodi NS1 pada plateAntigen NS1

Cuci plate 6 kaliTambahkan monoklonal antibodi anti-NS1yang di label dengan ensim HRP(HRP = Horseradish peroxidase)Tutup plate, inkubasi 37C, 1 jamAntibodi anti-NS1 (HRP)

Cuci plate 6 kaliTambahkan substrat 100 ul tiap wellTMB (Tetramethylbenzydine) + H2O2Inkubasi RT (20 - 25C), 10 menit.Stop reaksi, dengan menambahkanlarutan stopBaca dengan spektrofotometer

Kit yang digunakan:DENGUE EARLY ELISA (Panbio)

Terdiri dari:

1. Anti-NS1 Antibody Coated Microwells (12 x 8 wells)2. HRP Conjugated Anti-NS1 MAb3. Wash Buffer (20 x) Dilute one part Wash Buffer with 19 parts of distilled water.4. Sample Diluent5. TMB Chromogen6. Positive Control7. Calibrator8. Negative Control9. Stop Solution

Control and Sample Predilution :

Dilute the Positive Control, Negative Control, Calibratorand Patient Samples.

Add 135 uL Sample Diluent to 15 uL of Samples.Mix well.The final dilution of the sample is 1 in 10.

ELISA PROCEDURENPCALCALCAL1234567891011 Pipette 100 uL diluted test samples and Controls into their respective microwells.

Cover plate and incubate 1 hour at 37C

Wash six (6) times with diluted Wash Buffer

Pipette 100 uL HRP Conjugated Anti-NS1 MAb into each well.

Cover plate and incubate 1 hour at 37C

Wash six (6) times with diluted Wash Buffer Pipette 100 Ul of TMB into each well. (viii) Incubate for 10 minutes at room temprature (20-25C)

Pipette 100uL of Stop Solution to all wells.

Read the absorbance with spectrophotometer (450 nm)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12ACBEDFGHNilai ODA. Neg Control 0.104B. Pos Control 1.234C. Calibrator 0.802D. Calibrator 0.800E. Calibrator 0.804F. Sample A 0.949G. Sample B 0.070H. Sample C 0.098Perhitungan:

Rata-rata Calibrator = 0.802Calibration factor = 0.62Cutt-off value = 0.802 x 0.62 = 0.497Panbio units = Index value x 10Index value = Sample absorbance Cut-off value

Sample A = 0.949/0.497 x 10 = 19.1Sample B = 0.070/0.497 x 10 = 1.4Sample C = 0.098/0.497 X 10 = 1.97

Sample A = 0.949/0.497 x 10 = 19.1(Positive)

Sample B = 0.070/0.497 x 10 = 1.4(Negative)

Sample C = 0.098/0.497 X 10 = 1.97(Negative)Interpretasi hasil:

INDEXPANBIO UNITS RESULTS 11 Positive

anti-human IgManti-human IgG++IgMIgGGold-labelled anti-denguemonoklonal antibody (mab)+antigen

Warna merah muda

MCGCARA KERJA:Teteskan serumpasien 10 ulTeteskan reagen 2 tetesTunggu 15 menit

MCGAnti human-IgMAnti human-IgG--------

MCGMCGMCGMCGNegatifInfeksiprimerInfeksisekunderMungkinInfeksisekunderHASIL:

&

MEMPUNYAI HEMAGLUTININ, DAPAT MENGGUMPALKANSEL DARAH MERAH.SDMSDMSDMSDMVIRUSHEMAGLUTININREAKSI INI DAPAT DIHAMBAT OLEH ANTIBODI YANG HOMOLOGREAKSI HAMBATAN HEMAGLUTINASIVIRUS + ANTIBODI+SDMSDMHAMBATANHEMAGLUTINASISEL DARAH MERAHANTIBODISDMVIRUSSDMSDM

HEMAGLUTINASITIDAK HEMAGLUTINASISel darah merahmenggumpalSel darah merahmngendap

REAGENTSNa Cl0,87% Na Cl 8,7 gr Distilled water to 1000 ml

BPA (Bovine Protein Albumin) 4% Bovine Protein Albumin 4gr Na Cl (0,87%)to 100 ml

BS (Boric-Saline) sol. Boric acid3,1 gr Na OH0,96 gr Na Cl7 gr Distilled water to 1 litrepH 9

BS-BPA0,4%Kaolin sol. BPA 4%10 ml Kaolin25 gr BS sol.90 ml BS sol. pH 950 ml

VAD (Viral Adjusting Diluent)

Sol. ASol. B0,15 M NaCl 0,15 M NaCl0,2 M Na2HPO40,2M NaH2PO4Final pH (ml) (ml)

3.097.05.7512.587.56.022.078.06.232.068.06.445.055.06.655.045.06.864.036.07.072.028.07.279.021.07.4

Goose Red Blood Cell (RBC)

Mix total blood with anticoagulant, centrifuge 1000 rpm, 15 min.Discard supernatant, resuspend pellet RBC with 3 total blood vol.NaCl 0,87%3.Centrifuge 1000 rpm, 15 min. Discard supernatant.Repeat no 1 & 2 2 x more.Resuspend final RBC with NaCl 087% to make RBC stock.Store in refrigerator.(Goose-RBC for HA & HI test 0,4 % in VAD sol.)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12ACBEDFGHREAKSI HEMAGLUTINASIAntigen : Titer..? Masing masing sumur diisi dengan 50 ul BS-BPA Sumur pertama diisi dengan antigen/virus 50 ul Lakukan penipisan antigen Tambahkan ke masing-masing sumur sel darah merah 0,4% 50 ul- Inkubasi 37 C, 1 jamPenipisan AntigenAgK

Titer virus : 640 (1 unit)

Untuk reaksi hambatan-hemaglutinasi virus yang digunakan4 8 unit 8 x 1/640 = 8/640 = 1/80AgK1/201/801/401/3201/1601/6401/12801/2560AgK

Absorption Kaolin and Goose-RBC

Sera samples must be pretreated with Kaolin to remove nonspecific inhibitor of hemaglutination, and then adsorbed withGoose red blood cell to remove non specific agglutinin.Haemagglutination Inhibition test required paired sera (acute andconvalescent sera) with interval > 7 days.

Kaolin absorption:

0,1 ml sera + 0,4 ml BS sol. + 0,5 ml kaolin susp. incubate RT, 20( by occasional shaking every 5). Centrifuge 300 rpm, 15 min.Supernatant is 1:10 diluted sera.

Adsorb with goose-RBC:

Add 0,1 ml goose-RBC to each treated serum.Incubate 20 min. in ice bath by occasional shaking (every 5 min.)Centrifuge 1500 rpm, 10 min. Supernatant is 1:10 diluted and treated sera.Sera is ready to use for HI test.

Serum 100 ulLar. BS 400 ulKaolin 500 ulKocokInkubasi 20 menit RT(tiap 5 menit kocok)Sentrifus 3000 RPM, 15 Ambil supernatanMasukkan ke tabung baruAbsorbsi dengan kaolin dan sel darah merah angsaIIII = serum akut, II = serum konvalesen

supernatan sdm padat 100ulInkubasi 4C/EsKocok, inkubasi 4C, 20 menit(Tiap 5 menit, kocok)Sentrifus 1500 rpm, 15 menitIIIIII

Serum siap di uji HI(penipisan serum 1:10)Ambil supernatanPindahkan ke tabung lainpellet snatanIIIIII

REAKSI HAMBATAN HEMAGLUTINASISerum ISerum IIkontrol Ag 8Ukontrol sdm Cara kerja :

Isi sumur dengan lar. BS-BPA 0,4%.

Isi sumur pertama dgn serum pasien yg telah di kaolin, masing2 50 ul (buat duplo). Lakukan pengenceran serum dgn multi pipet.

Tambahkan antigen 8U masing2 50 ul.

Lakukan juga titrasi antigen 8U (kontrol)

-Inkubasi pd 4C, 1 malam

1/201/12801/102401/25601/51201/204801/409601/401/801/1601/3201/640Penipisan serum

Serum ISerum IIKontrol Ag 8UKontrol sdm1/201/12801/102401/25601/51201/204801/409601/401/801/1601/3201/640Penipisan serumKeluarkan plate dari 4C.

-Biarkan suhu ruang 30

-Buat sdm 0,4% dalam VAD

-Isi setiap sumur dengan sdm Reaksi HI masing2 100 ul Untuk HA & kontrol 50 ul

-Inkubasi 37C, 1 jam

- Baca hasil (lihat tabel)

1/201/12801/102401/25601/51201/204801/409601/401/801/1601/3201/640Penipisan serumSerum ISerum IIKontrol Ag 8UKontrol sdmLIHAT

TABELBaca hasil :

Table . Interpretation of dengue HI antibody responseAntibody S1 S2 Convalescent Interpretationresponse interval titre

4- fold rise 7 days 1 : 1280 Acute flavivirus infection, primary

4- fold rise Any specimen 1 : 2560 Acute flavivirus infection, secondary

4- fold rise < 7 days 1 : 1280 Acute flavivirus infection, either primary or secondary

No change Any specimen > 1 : 2560 Recent flavivirus infection, secondary

No change 7 days 1 : 1280 Not dengue

No change < 7 days 1 : 1280 Uninterpretable

Unknown single specimen 1 : 1280 Uninterpretable

1/25601/1280 1/640 1/320 1/160 1/80 1/40 1/20 AG K/SDM UJI HEMAGLUTINASI

1/25601/1280 1/640 1/320 1/160 1/80 1/40 1/20SERUM ISERUM IIK/AGK/SDMUJI HAMBATAN HEMAGLUTINASI