klorofilase (siti nur avida) new

7/25/2019 Klorofilase (Siti Nur Avida) New

1/15

ENZIM KLOROFILASE

(Chlorophyllase)

Mata Kuliah Teknologi Enzim

(Revisi)

Oleh :Siti Nur Avida (11!1"11)

JURUSAN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS JEMBER

2015


2/15

I. PENDAHULUAN

1.1 Enzim Klorofilas

Enzim merupakan suatu protein yang berfungsi sebagai katalisator reaksi kimia.

Enzim memegang peranan dalam berbagai kehidupan baik dibidang laboratorium

atau bidang industri. Perkembangan enzim sebanding dengan adanya perkembangan

teknologi enzim. Mata kuliah teknologi enzim mempelari tentang enzim dan

pengaplikasiannya sebagai dasar pengembangan pemanfaatan enzim.

Enzim berfungsi sebagai katalisator yang mampu mengkatalisis suatu reaksi,

sehingga proses reaksi berlangsung lebih cepat. Hal ini karena setiap enzim memilikidaya katalitik yang tinggi yang digambarkan melalui aktivitasnya dan dapat

menurunkan energi aktivasi selama proses reaksi. Aktifitas enzim dipengaruhi

beberapa faktor antara lain, pH, suhu, konsentrasi enzim, konsentrasi substrat, dan

inhibitor (ehninger, !"#$%.&alah satu enzim yang memiliki manfaat penting dalam kehidupan adalah

enzim klorofilase. Enzim klorofilase berperan dalam metabolisme daun yaitu proses

fotosintesis. &elain itu, enzim klorofilase digunakan pada industri minyak yaitu

sebagai agen bleaching pada minyak sayur dengan cara menghilangkan senya'a

klorofilnya (hamessan, dkk., !")*%.Enzim lorofilase ditemukan pertama kali oleh +ilstater dan &toll pada tahun

!"!. lorofilase merupakan salah satu enzim yang berperan penting dalam

metabolisme dalam daun. lorofilase dapat ditemukan dalam membrane tilakoid

kloroplas dan etioplas pada tanaman tinggi, lumut, dan ganggang. Peran klorofilase

dalam mendegradasi klorofil dapat dilihat saat ter-adi perubahan 'arna hi-au men-adi

'arna kuning atau coklat, hal ini ter-adi pada perubahan 'arna buah, bunga, daun.

Hal ini ter-adi karena enzim klorofilase dapat hidrolisis klorofil menghasilkan

klorofilade dan fitol. &elain itu -uga berperan dalam reaksi hidrolisis karboksilat ester.

Enzim klorofilasi beker-a pada kondisi optimal yaitu pH #, dan suhu /. Paper ini#


3/15

men-elaskan tentang klasifikasi, struktur, mekanisme, isolasi, purifikasi dan

karakterisasi, dan bioinformatika enzim klorofilase.

II. PEM!AHASAN

".1 #a$a Nama

Enzim klorofilase memiliki nomor pengklafisian secara internasional yaituEC

Number0.!.!.!1 dengan nama Chlorophyllase, selain itu disebut Chlase, Chlorophyll

chlorophyllido-hydrolyase, dan Chlorophyll-chlorophyllidohydrolase. &ecara

klasifikasi, enzim klorofilase memiliki nomer E/ 0.!.!.!1 . E/ 0. artinya masuk

dalam klas hidrolase. E/ 0.!. artinya memotong ikatan ester. E/ 0.!.! artinya mampu

menghidrolisis ikatan karboksilat ester. E/ 0.!.!.!1 artinya spesifik enzim

klorofilase. Enzim ini temasuk dalam kelas hidrolase yaitu enzim yang menkatalisis

reaksi enzimatis dengan melibatkan H$2.

3ambar !. lasifikasi enzim klorofilase

"." Sr%&$%r 'an M&anism Ra&si

&truktur 04 enzim klorofilase masih belum teridentifikasi, hal ini di-elaskan

dalam beberapa -urnal dan P45 sum -uga belum menampilkan struktur enzim

tersebut. 6amun, menurut secara struktur $4 diidentifikasi bah'a struktur enzim

klorofilase memiliki tiga residu katalitik yaitu serin !1, histidin $*$, dan aspartame

!)$. 6omer pada residu katalitik tersebut sebagai posisi urutan asam aminonya


4/15

.

3ambar $. &truktur $4 enzim klorofilase

Enzim klorofilase memiliki substrat yang spesifik yaitu klorofil. lorofil ada

dua macam yaitu klorofil a dan klorofil b. 6amun pada pepar ini hanya fokus pada

klorofil a sa-a. Perbedaan antara klorofil a dan b hanya pada rantai pengikatnya

klorofil a mengikat /H0 sedangkan klorofil b mengikat /H2. 7eaksi kimia yang

ter-adi adalah sebagai berikut8

3ambar 0.7eaksi enzim klorofilase

Enzim klorofilase menghidrolisis klorofil menghasilkan klorofilade dan fitol

dengan bantuan H$2. Enzim klorofilase memiliki tiga residu katalitik serin, histidin


5/15

dan aspartam. &erin memiliki gugus 2H berfungsi sebagai nukleofil, namun serin

tersebut distabilkan oleh histidin. arena histitin memiliki dua electron bebas pada 6,

sehingga dapat mengikat H pada serin. &erin menyerang gugus ester pada rantai /,

sehingga ikatan 2 karbonil putus dan 2 memiliki elektron berlebih. 9erbentuk

kompleks enzim:substrat dan filol lepas dan terbentuk 2 ikatan rangkap kembali.

Produk fitol telah terbentuk, sehingga stuktur enzim klorofilase men-adi berubah.

H$2 memiliki nukleofil yaitu H2:akan menyrang / karbonil sehingga akan terbentuk

gugus alkohol. 7esonansi ter-adi untuk membentuk kestabilan sehingga gugus serin

terlepas dan terbentuk klorofilade. Enzim klorofilase terbentuk kembali sehingga

dapat mengikat substrat yang lain hingga dihasilkan produk dan seterusnya.

Mekanisme reaksi katalitik ter-adi secara asam basa. 5erikut mekanisme reaksi

katalitik enzimatik yang ter-adi8

3ambar 1. Mekanisme katalisis klorofilase

". Isolasi 'an Pm%rnian nzim &lorofilas

Enzim klorofilase dapat diisolasi dari beberapa organisme seperti tumbuhan

tingkat tinggi, lumut dan ganggang. 5eberapa penelitian telah berhasil mengisolasi

enzim klorofilase dari berbagai organisme antara lain8 Triticum aestivum ('heat%,

Phaseolus vulgaris, Phaeodactylum tricornutum, Capsicum annuum, Olea europaea,

Chenopodium album, dan Arabidopsis thaliana. Paper ini dibahas tentang enzim


6/15

klorofilase yang diisolasi dari daun tanaman ceri dengan bebepapa spesies, yaitu8

5ird cherry (Prunus padus.%, European plum (Prunus domestica.% dan &our cherry

(Prunus cerasus.%.

Proses isolasi melalui beberapa tahap yaitu ekstrasi enzim, pemurnian enzim

(homogenasi, fraksinasi ammonium sulfat, dialisis dan filtrasi gel%, dan karakterisasi .

: Ekstrasi enzim

&ebanyak 0 gram daun dalam 1 ml aseton dingin (#;% dihomogenkan

pada suhu 1< / selama menit. /ampuran disaring dan disentrifugasi

dengan kecepatan g selama ! menit. &upernatan digunakan sebagai klorofilase

a. Pelat dilarutkan dalam buffer kalium fosfat mM pH ) ( mM /l dan ,$1 ;

9riton =:!%. /ampuran disentrufugasi dengan kecepatan !$ g selama ! menit.

&epernatan digunakan sebagai ekstrak kasar enzim klorofilase.

: >raksinasi Amonium sulfat

&ebanyak 0,1 g amonium sulfat ditambahkan dalam ! ml crude enzim

(ke-enuhan 0;% disentrifugasi dengan kecepatan ! g selama $ menit,

supernatan dibuang dan pelatnya dilarutkan dengan buffer dan ditambahkan amonium

sulfat hingga fraksi *;.

: 4ialisisPelat hasil fraksinasi dilarutkan dalam buffer dan di dialisis selama $1 -am pada

suhu 1ilrasi gel

&ebanyak ! ml destilat dimasukkan dalam kolom glass ($ ? 1 cm% dengan

&ephade? 3:$ dan disetimbangkan dengan buffer pH ). Enzim di elusi bersama

buffer dengan kecepatan ,0 ml@menit. adar protein diukur dengan spektrometri

pada pan-ang gelombang $# dan $* nm. Massa molekul ditentukan berdasarkan

kurva standar av vs. og Mr dibandingkan dengan protein standar sitokrom c (!$.0

k4a%, tripsin ($0.# k4a%, ovalbumin (1. k4a%, bovine serum albumin (**.

k4a%, and miosin ($. k4a% (&ytykie'icz et al., $#%.


7/15

: Aktivitas klorofilase dan penentuan konsentrasi substrat&ebanyak ,0 ml ekstrak enzim ditambah ,! ml substrat dalam aseton dan !

ml buffer natrium fosfat mM pH ). 4iinkubasi dalan ruang gelap selama 0 menit

dengan suhu 0< /. 7eaksi dihentikan dengan menambahkan $ ml aseton

dingin dan $ ml n heksana. /ampuran di vortek dan disentrifugasi $ menit dengan

kecepatan !$ g. Aktifitas diukur pada pan-ang gelombang *11, **$, dan ) nm

(spektrometer B:Bis He'lett:Packrd model #10%. apisan atas mengandung

klorofil a dan ditentukan konsentrasinya menggunakan rumus berikut 8

5erdasarkan proses pemurnian enzim klorofilase dengan beberapa tahapan,

diperoleh hasil pemurnian sebagai berikut8


8/15

9iga macam tamanan ceri diatas menun-ukkan tingkat kemurnian yang berbeda.

4ilihat dari proses pemurniannya, tahap homogenasi memiliki nilai kadar protein

yang besar dibandingkan tahap selan-utnya. Hal ini ter-adi karena pada tahap

homogenasi masih banyak pengotor enzim klorofilase dan enzim yang terekstrak

masih sedikit. Aktifitas dari ekstrak tersebut memiliki aktivitas yang lebih kecil, hal

ini menun-ukkan bah'a enzim tersebut masih belum murni dan memiliki tingkat

kemurnian ! kali. 9ingkat kemurnian enzim klorofilase sebanding dengan semakin

banyak proses pemurniannya. Aktivitas enzim didefinisikan kemampuan enzim dalam

! nanomol enzim menghidrolisis substrat klorofil a per menit per mg protein.

Proses pemurnian menggunakan kromatografi kolom dengan menggunakan

sephade? /:$. >raksi yang dihasilkan ada ):# fraksi protein. 6amun yang

terindentifilasi sebagai enzim klorofilase hanya dua fraksi di simbolkan dengan >!

dan >$. 3rafik yang dihasilkan adalah berikut8


9/15

etiga -enis tanaman ini menun-ukkan hasil filtrasi yang berbeda berupa

konsentrasi protein dan aktivitas spesifiknya. 9anaman 5ird cherry memiliki fraksi >!

lebih besar dari pada >$. 9anaman European plum dan &our cherry memiliki fraksi >!

lebih besar dari pada >$. Perbedaan fraksi ini menun-ukkan perbedaan massa molekul


10/15

enzim klorofilase yang diisolasi. Hasil massa molekul enzim klorofilase yang

dihasilkan adalah berikut8

Penentuan massa molekul enzim klorofilase sebagai hasil pengeplotan grafik

antara av (koefisien partisi pada kromatografi filtrasi gel% terhadap log massa

molekul. Perbedaan dapat dilihat hari hasil massa molekul tiap fraksi dalam satuan

k4a. >raksi ! memiliki ukuran molekul lebih besar dari pada fraksi $. >! akanterelusi bersama fase gerak terlebih dahulu dibandingkan >$.

&elan-utnya penentuan pH optimum enzim klorofilase dilakukan dengan

memvariasikan kondisi pH buffer yang digunakan selama proses hidrolisis. pH

divariasi 0C 1C C *C )C ),$C ),1C ),*C ),#C #C #,$C #,1C #,*C #,#C ", !, !!, dan !$.

&ebanyak ,0 ml ekstrak enzim, ,! ml klorofil a dalam aseton ,! mM dan ! ml

buffer kemudian diukur aktivitasnya. Hasil optimasi pH enzim klorofilase adalah8>raksi ! (>!%

: 5ird cherry pH #

: &our cherry pH ): European plum pH ),#

>raksi $ (>$%

: European plum pH )

: 5ird cherry pH ).#: &our cherry pH #


11/15

arakterisasi yang terakhir adalah penentuan nilai m. m adalah konsentrasi

substrat yang dibutuhan untuk mencapai setengah dari kecepatan reaksi maksimal.

6ilai m merupakan hasil pengeplotan pada persamaan linier inevear:5urk. &emakin

kecil mmaka kemampuan enzim menarik substrat semakin besar. Hasil penentuan

menzim klorofilase adalah berikut8

Pengaruh inhibitor dapat menurunkan aktivitas ker-a enzim klorofilase tersebut.

&ampel di preinkubasi $1 -am pada suhu 1 dera-at. 4itambahkan ! mM ion logam

dan modifikasi gugus fungsi, kemudian diinkubasi kembali dalam tempat gelap

selama 0 menit dengan suhu 0 dera-at dan diukur akifitasnya aktivitas diambil nilai

aktivitas yang tertinggi. Aktivitas yang dilihat adalah aktivitas relatif dari enzim

tersebut yang artinya nilai aktivitas enzim di catatan sebagai aktivitas paling tinggi.

Pengaruh inhibitor Mg$Dmemiliki aktivitas relatif paling besar, hal ini dimungkinkan

karena dalam substrat enzim klorofilase -uga mengikat Mg$D. &ehingga sisi katalitik

enzim klorofilase sudah mengenali ion tersebut. Hasil yang diperoleh saat pengu-ian

pengaruh inhibitor adalah berikut 8


12/15


13/15

". !ioinforma$i&a

5ioinformatika enzim klorofilase dibandingkan dari beberapa organisme

penghasil enzim klorofilase. 2rganisme tersebut antara lain Arabidopsis thaliana 1,

Arabidopsis thaliana , Chenopodium album, Citrus sinensis,danTriticum aestivum.

3ambar berikut merupakan hasil 5A&9 untuk mendeteksise!uencebatas kemiripan

homologi. enzim ini bukan diisolasi dari tanaman ceri tetapi tanaman gandum yang

memiliki presentase homologi kurang dari $; dan memiliki kemiripan dengan hasil

se!uence pada organisme mamalia penghasil hormone sensitive lipase. &ehingga

enzim klorofilase memiliki motif lipase. &elain itu dilaporkan adanya residu katalitik

enzim klorofilase yaitu serin !1, histidin $*$, dan aspartame !)$. 6omer pada

residu katalitik tersebut sebagai posisi urutan asam aminonya. Presentase homologi

dari beberapa organism Triticum aestivum Arabidopsis thaliana 1, Arabidopsisthaliana , Chenopodium album, danCitrus sinensisadalah $;, 1*,0;, 10,1;,

0),*;, dan 1,);.


14/15

3ambar . Hasil seFuence asam amino enzim klorofilase

".* Pn%$%+

".*.1 Ksim+%lan

: Enzim klorofilase termasuk -enis enzim hidrolase: Enzim klorofilase memiliki substrat klorofil, menghirolisis klorofil menghasilkan

klorofilide dan fitol.

: Enzim klorofilase optimum pada pH ),# dan #: Enzim klorofilase memiliki residu katalitik serin !1, histidin $*$, dan aspartame

!)$

DAF#AR PUS#AKA


15/15

Arkus, A.G., iani, dan Gez, M, Goseph., $*. "evelopment o# $igh- Troughput

puri#ication method and a continous assay system #or Chlorophyllase. %&A,

"onald"an#orth Plant &ciences, Elsivier8 Analytical 5iochemistry, 00, "0:

"#

hamessan, A., ermasha, &., dan Mollimard, ., !"". Optimi'ation o#

Chlorophllase-Cataly'ed $ydrolytic Activity in a (icellar Ternary &ystem,

)iotechnol, Appl.5iochem, $$, 0$):010

ehninger, A. . !"#$."asar-dasar )io*imia, Gilid !. Gakarta 8 Erlangga.

&ytykie'icz, Hubert dkk. $!0.)iochemical characterisation o# chlorophyllase #rom

leaves o# selected Prunusspecies + A comparative study. 4epartment of

5iochemistry and Molecular 5iology, &iedlce niversity of 6atural &ciences

and Humanities, &iedlce, Poland. Bol *, 1):1*

klorofilase (siti nur avida) new

Documents