kinetika enzimatik

Kinetika REAKSI ENZIMATIK

Kinetika reaksi enzimatik menyediakan informasi tentang mekanisme

dasar reaksi enzim dan parameter-parameter lainnya

Laju reaksi yang dikembangkan dari studi kinetik dapat digunakan untuk perhitungan waktu reaksi, perolehan dan kondisi operasi yang optimum

Kinetika reaksi enzimatik sederhana

S PE

Laju reaksi dituliskan :

atau

S : substrat /media/umpan/bahan bakuP : produk

Pengamatan perubahan konsentrasi

t

Cs

substrat

produk

t

Cs Laju reaksi

rS,1

t1 t2 t3

CS,1

CS,2

CS,2

rS,2 rS,3

CS1

t1

Penentuan Persamaan Laju Reaksi

Laju Reaksi vs Konsentrasi Awal

Jika dilakukan pengukuran laju pada awal reaksi pada konsentrasi substrat dan enzim berbeda:

CS

rS

rS,max

CSo rS

CS,1 rS,1

CS,2 rS,2

CS,3 rS,3

CS,4 rS,4

CS,5 rS,5

…… ……

…… ……

CS,n rS,n

Laju Reaksi vs Konsentrasi Awal

CS

rS

rS,max

Pada konsentrasi rendah, Laju reaksi proporsional Pada konsentrasi tinggi, laju reaksi tidak

dipengaruhi konsentrasi substrat rs,max bergantung pada konsentrasi enzim

Persamaan laju reaksi

Henri (1902) :

rmax dan KS ditentukan secara eksperimental

Jika KS = CS

𝐫𝐩=𝐫𝐦𝐚𝐱𝐂𝐒

𝐊𝐒+𝐂𝐒𝐫𝐩=𝐫𝐦𝐚𝐱

𝐂𝐒

𝐂𝐒+𝐂𝐒

Penentuan KS

CS

rp

rmax

KS

½ rmax

Persamaan laju berdasarkan mekanisme

S + E k1

k2

ES

ES k3 E + P

Brown (1902):

Model kinetika Brown telah menyimpulkan adanya senyawa komplek enzim-substrat, 40 tahun sebelum spektrofotometrik dapat mendeteksi senyawa kompleks

#

*

+E S ES

Teori Lock and Key

Asumsi:1. Konsentrasi enzim total, tetap

CEo = CES + CE

2. CE << CS, sehingga pembentukan ES tidak menurunkan CS secara signifikan

3. Konsentrasi produk cukup kecil sehingga inhibisi oleh produk diabaikan

Asumsi tersebut menghasilkan :1. Pendekatan Michaelis-Menten (1913)

2. Pendekatan Briggs-Haldane (1925)

3. Penyelesaian numerik

Pendekatan Michaelis-Menten (1913)

S + E k1

k2

ES

ES k3 E + P

1. Persamaan (1) mencapai kesetimbangan2. Persamaan (2) lebih lambat dari (1)3. Laju keseluruhan dikendalikan yang lambat

(1)

(2)

(3)

Pendekatan Michaelis-Menten (1913)

(3)

Dari kesetimbangan pada persamaan (1):

(4)

(5)

S + E k1

k2

ES

Pendekatan Michaelis-Menten (1913)

(3)

(6)

+E S ES

Jika konsentrasi enzim pada saat awal, CEo Enzim yang berikatan substrat, CES Maka enzim yang bebas:

(5)

(6)

Substitusi (6) ke (5):

(7)

(3)

Substitusi (7) ke (3):

(8)

(9)

𝐫=𝐤𝟑𝐂𝐄𝐒𝑪𝑬𝑺=

𝒌𝟏

𝒌𝟐𝑪𝑺𝑪𝑬

𝐂𝐄=𝐂𝐄𝐨−𝐂𝐄𝐒

𝐂𝐄𝐒=𝐤𝟏

𝐤𝟐𝐂𝐒(𝐂𝐄𝐨−𝐂𝐄𝐒)

𝐂𝐄𝐒=𝐤𝟏𝐄𝐨𝐂𝐒

𝐤𝟐+𝐤𝟏𝐂𝐒

𝒓=𝐤𝟑𝐤 𝟏𝐄𝐨𝐂𝐒

𝐤𝟐+𝐤𝟏𝐂𝐒

𝒓=𝐤𝟑

𝒌𝟏

𝒌𝟏𝐄

𝐨𝐂𝐒

𝒌𝟐

𝒌𝟏+𝒌𝟏

𝒌𝟏𝐂𝐒

(9)𝒓=𝐤𝟑

𝒌𝟏

𝒌𝟏𝐄

𝐨𝐂𝐒

𝒌𝟐

𝒌𝟏+𝒌𝟏

𝒌𝟏𝐂𝐒

𝒓=𝐤𝟑𝐄𝐨𝐂𝐒

𝒌𝟐

𝒌𝟏+𝐂𝐒

𝐫=𝐫𝐦𝐚𝐱𝐂𝐒

𝐊𝐌+𝐂𝐒(10)

Pendekatan Briggs-Haldane (1925)

AsumsiPerubahan konsentrasi intermediat (pada pers. 1 dan 2) terhadap waktu, diabaikan

Dari persamaan (1) dan (2)

(1)

(2)

(11)

Pendekatan Briggs-Haldane (1925)

Dari persamaan (1), (2) dan (10)

(12)

Substitusi (6) ke (11):

(6)

(13)

(13)

Substitusi (12) ke (1)

(10)

Contoh 2.1Konversi glukosa menjadi fruktosa oleh glukosa isomerase, tahap reaksi yang lambat juga merupakan reaksi reversibel seperti berikut:

S + E ES ES P + E

k1

k2 k3

k4

Turunkan persamaan laju menggunakan

a. Pendekatan Michaelis-Menten

b. Pendekatan Briggs-Haldane

a. Menggunakan pendekatan Michaelis-Menten

S + E ES P + Ek1

k2

k3

k4

rp = k3 CES – k4 CP CE 2.19

CEo = CES + CE 2.20CE = CEo – CES

rp = k3 CES – k4 CP (CEo – CES)

rp = k3 CES – k4 CP CEo + k4 CP CES

rp = (k3 + k4 CP)CES – k4 CP CEo

Reaksi 1 dianggap setimbang 2.22

2.21

a. Menggunakan pendekatan Michaelis-Menten

2.22

2.20

2.24

CE = CEo – CES

Substitusi (2.20) ke (2.22)2.23

b. Menggunakan pendekatan Briggs-Haldane

S + E ES P + Ek1

k2

k3

k4

2.25

2.26

Laju pembentukan produk antara, CES = 0

CE = CEo – CES Substitusi CE oleh:

b. Menggunakan pendekatan Briggs-Haldane

Menggunakan pendekatan Briggs-HaldaneEvaluasi parameter kinetik

Pers Michaelis-Menten:

Line-Weaver Burk

Menggunakan pendekatan Briggs-HaldaneEvaluasi parameter kinetik

Langmuir

CS

Pers Michaelis-Menten:

Menggunakan pendekatan Briggs-HaldaneEvaluasi parameter kinetikLangmuir :

Eadie-Hofstee

r/CS

SMmaks C

rK r r

r

rmaks

-KM

S

maks

Cr

S

maks

maks

M

maks

SS

Cr .r

rk

rC

rC

Cso (mmol/L)

ro (mmol/L.menit)

12357

101520

0,200,220,300,450,410,500,540,55

Contoh: Hasil pengamatan memberikan data hubungan laju reaksi sebagai berikut

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.20

1

2

3

4

5

6

f(x) = 3.4575111518788 x + 1.9450134226708R² = 0.846252339075781

1/CS

1/r

maksr1 = 1.945 rmaks = 0,514

maks

M

rK = 3,457 KM = 1,777

Metoda Line-Weaver Burk

CS

0 2 4 6 8 10 120

5

10

15

20

25

f(x) = 1.58660484596389 x + 4.64170920778974R² = 0.949654896508446

CS/r

rmaks = 0,630

KM = 2,926

Metoda Langmuir

r

r/CS

0.0 0.1 0.2 0.30

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

f(x) = − 1.89232077075659 x + 0.538602059129121R² = 0.661838206758566

Metoda Eadie - Hofstee

0 5 10 15 20 25 3005

101520253035

f(x) = 0.317283655759 x + 21.33459686912R² = 0.739705582168541

CSo/ro

CS

0

5

10

15

20

25

f(x) = 19.48405221442 x + 0.519136528724R² = 0.999675846523834

1/So

1/ro

0.03 0.035 0.04 0.045 0.05 0.0550

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

f(x) = − 44.35599284437 x + 2.242853309481R² = 0.705496198520464

r/CS

r

JAWABAN TUGAS

0 5 10 15 20 25 300

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

LangmuirLW-BE-H

So

ro

CSo Data LW-B Lang E-H (D - Eq)2 LW-B Lang E-H

1 0.05 0.050 0.046 0.049 6.3 10-12 1.4 10-05 3.2 10-07

5 0.23 0.227 0.218 0.227 1.2 10-05 1.4 10-04 8.1 10-06

10 0.38 0.405 0.408 0.413 6.4 10-04 7.9 10-04 1.1 10-03

15 0.52 0.550 0.575 0.567 9.1 10-04 3.0 10-03 2.2 10-03

30 1.03 0.856 0.973 0.905 3.0 10-02 3.3 10-03 1.6 10-02

Sum of Square 3.2 10-02 7.3 10-03 1.9 10-02

5 mL selobiosa (substrat) yang mengandung 100 mol/mL selobiosa + 44 mL buffer + 1mL enzim.

50)100(5CSo = 10 mol/mL

Aktivitas = mol glukosa yang dihasilkan per menit

t (menit) CG(umol/mL)0 01 0.055 0.23

10 0.3815 0.5230 1.03

0 5 10 15 20 25 300

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

f(x) = 0.0349320543565148 xR² = 0.997015724237278

waktu (menit)

CG (m

mol

/mL)

Pengukuran Aktivitas Enzim Selobiose

a. Dari grafik tampak bahwa glukosa yang dihasilkan rata-rata selama 30 menit adalah 0,034 mol/mL dengan enzim yang digunakan 1 mL dengan volume larutan 50 mL.

Glukosa yang dihasilkan = 50 x 0,034 = 1,7 mol/menit

Aktivitas glukosa = 1,7 mol/menit.mL = 1,7 Unit/mL

b. Data yang ada: konsentrasi produk (glukosa) terhadap vs waktu

Data yang dibutuhkan untuk menentukan laju adalah konsentrasi substrat vs waktu

reaksi: C12H22O11 + H2O 2C6H12O6

t (menit)

CG(umol/mL)

CS (mmol/mL)

0 0 101 0.05 9.9755 0.23 9.885

10 0.38 9.81015 0.52 9.7430 1.03 9.485

0 4 8 12 16 20 24 28 328

8.5

9

9.5

10

10.5

f(x) = 5.01993946414063E-05 x² − 0.0183229116985768 x + 9.9916496951528R² = 0.997234668539322

t (menit)

CS

Soal Latihan

2.1 Untuk menjamin aktivitas enzim dan laju reaksi awal, 5 mL selobiosa (100 mol) dan 44 mL larutan buffer larutan dicampur dalam CSTR. Reaksi diinisiasi dengan menambahkan 1 mL enzim (-glukosidase) yang mengandung protein 0,1 mg/mL. Sampel yang diperoleh sebagai berikut:

t (menit) 1 5 10 15 30C(mol/mL) 0,05 0,23 0,38 0,52 1,03

a. Tentukan aktivitas -glukosidase dalam mol/mL dan dalam mol/g. aktivitas didefinisikan sebagai mol glukosa yang dihasilkan per menit.

b. Tentukan laju reaksi awal.

Soal Latihan

2.5 Eadie (1942) mengukur laju reaksi awal pada hidrolisis asetilkolin (substrat) menggunakan serum (enzim) dan dihasilkan data sbb:

CSo (mol/L) 0,0032 0,0049 0,0062 0,0080 0,0095

ro (mol/L.mneit) 0,111 0,148 0,143 0,166 0,200

Tentukan parrameter kinetik Michaelis-Menten menggunakan metoda:a. Langmuirb. Line-Weaver Burkc. Eadie-Hofstee

Inhibisi pada reaksi enzimatik

ModulatorSubstrat yang dapat bergabung dengan enzim

Inhbitor modulator yang dapat menurunkan aktivitas enzim

Jenis Inhibisikompetitive dan nonkompetititve

Inhibisi kompetitive

Inhibitor kompetitive memiliki struktur molekul yang sangat mirip dengan substrat dan berkompetisi dengan substrat menempati sisi aktif

Mengurangi sisi aktif enzim yang dapat diisi oleh substrat

Umumnya reversibel Dapat diminimalkan dengan meningkatkan

konsentrasi substrat

Inhibisi kompetitive

E + S ESk1

k2

E + I EIk3

k4

ES E + Pk5

rp = k5 CES CEo = CE + CES + CEI

S1

2

ES

SE Kkk

CCC

I3

4

EI

IE Kkk

CCC

MIS

Smaksp KC

Crr

I

IsMI K

C1KK

Inhibisi nonkompetitive

E + S ESk1

k2

E + I EIk3

k4

ES E + Pk9 SS

Smaks,Ip KC

Crr

EI + S EISk5

k6

ES + I ESIk7

k8

IS5

6S

1

2 Kkk

Kkk

SI7

8I

3

4 Kkk

Kkk

II

maksmaks,I K/C1

rr

Lengkapi !!

Inhibisi kompetitive vs nonkompetitive

1/r

1/Cs

1/KM

1/KMI

1/r

1/Cs1/KM

1/rmaks1/rmaks

Inhibisi kompetitive Inhibisi nonkompetitive

II

maksmaks,I K/C1

rr

SS

Smaks,Ip KC

Crr

MIS

Smaksp KC

Crr

I

IsMI K

C1KK

Pengaruh lain terhadap aktifitas

Faktor yang paling berpengaruh terhadap aktivitas enzim: pH temperatur shear

Reaktor enzimatik reaksi sederhana

Bioreaktor:tempat berlangsungnya transformasi biokimia oleh enzim atau sel hidup

Reaktor batch = paling sederhana Dilengkapi pengaduk, pengendali pH Asumsi : pengadukan sempurna

Bio-Reaktor Batch

Pengisian : umpan dimasukkan seluruhnya sebelum reaksi berlangsung

Pengeluaran : dilakukan setelah reaksi dianggap selesai

Pereaksian : dilakukan sampai reaksi dianggap selesai

umpan

produk

Reaktor batch atau PFRKinetika reaksi: Michaelis-Menten

Reaktor batch

umpan

produk

Reaktor batch atau PFR

Suatu reaksi enzimatik memiliki rmax = 0,514 g/L.menit dan konstanta Michaelis-Menten 1,777 g/L.menit. Reaksi tersebut dilangsungkan dalam reaktor batch dengan konsentrasi awal substrat 5 g/L. Tentukan waktu yang diperlukan sampai substrat yang tersisa 1,2 g.

Bio-Reaktor PFR

F, CSo F, CSf

o p

Plug Flow Reactor = reaktor aliran sumbat = reaktor yangalirannya seperti sumbat

Umpan (reaktan) dimasukkan ke reaktor dan produk dikeluarkan secara terus menerus

: waktu ruang mirip dengan waktu reaksi untuk reaktor batch

Bio-Reaktor PFR

F, CSo F, CSf

o p

Reaktor batch atau PFR

Suatu reaksi enzimatik memiliki rmax = 0,6 g/L.menit dan konstanta Michaelis-Menten 1,5 g/L.menit. Reaksi tersebut dilangsungkan dalam reaktor batch dengan konsentrasi awal substrat 4 g/L. Berapa volume reaktor jika diinginkan konversi substrat 90% dengan laju alir 20 L/menit.

Steady state CSTR

F, CSo

F, CS

0dt

dCVrVCFFC SSSSo

)CK)(CC(Cr1D

VF

SMSSo

Smaks

MSSo

SmaksS K

CCCrC