rinaldi sjahril pembiakan in-vitro 2011

i

BAHAN AJAR 2011

MATA KULIAH: PEMBIAKAN IN VITRO

Tim Penulis

Penanggung Jawab:

Ir. Rinaldi Sjahril, MAgr., PhD

Anggota:

Prof. Dr. Ir. Enny Lisan Sengin, MS Prof. Dr. Ir. Yunus Musa, M.Sc.

Ir. Amirullah Dachlan, MP Ir. Katriani Mantja, MP

Ir. Hj. Feranita, MP

PROGRAM STUDI AGROTEKNOLOGI

JURUSAN BUDIDAYA PERTANIAN

FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS HASANUDDIN

2011

ii

Kata Pengantar

Bahan ajar memiliki peranan yang strategis dalam proses pembelajaran. Peranan bahan

ajar semakin vital dalam sistem pembelajaran berbasis SCL (Student Centered Learning).

Pengajar, keberadaan bahan ajar membantu proses belajar mengajar berjalan secara efektif,

efisien, dan interaktif, serta mengubah peran dari seorang pengajar menjadi fasilitator. Bagi

Mahasiswa bahan ajar memungkinkan peroses belajar dilakukan secara mandiri, proses belajar

tidak akan tergantung pada dosen saja, dan potensi mereka sebagai pembelajar mandiri

memiliki peluang yang lebih besar untuk diaktualisasikan. Karenanya keberadaan bahan ajar

yang baik akan sangat mendukung proses pembelajaran dan pada akhirnya meningkatkan

kompetensi mahasiswa.

Mata kuliah Pembiakan In-vitro merupakan salah satu mata kuliah yang disajikan pada

semester genap jurusan Agroekoteknologi, Fakultas Pertanian UH. Dalam mata kuliah ini

Mahasiswa diharapkan memperoleh tidak hanya pengetahuan konsep dan teoritis mengenai

kultur jaringan namun juga memiliki keterampilan yang memungkinkan mereka berhasil

melakukan teknik kultur jaringan. Keterampilan melakukan teknik ini akan menjadi nilai

tambah tersendiri bagi mahasiswa karena keterampilan ini banyak dibutuhkan terutama pada

balai-balai penelitian dan pengembangan. Bahan ajar ini diharapkan dapat memudahkan

mahasiswa untuk memahami materi kuliah pembiakan In vitro.

Kami menyadari bahwa bahan ajar ini masih memiliki berbagai kekurangan sehingga

saran dan masukan untuk perbaikan bahan ajar ini sangat kami harapkan. Kami juga

mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada pihak–pihak yang telah ikut

berpartisipasi dalam penyusunan bahan ajar ini. Akhirnya kami berharap agar bahan ajar ini

bermanfaat.

Makassar, 28 November 2011

Penyusun

iii

Daftar Isi

Kata pengantar ................................................................................................................ i

Daftar Isi ......................................................................................................................... iii

Daftar Tabel .................................................................................................................. vii

Glosarium ....................................................................................................................... ix

BAB I. Pendahuluan ....................................................................................................... 1

1.1 Gambaran Umum Mata Kuliah ................................................................................... 1

1.2 Mekanisme dan Rancangan Pembelajaran Bahan Ajar ............................................... 1

1.3 Garis Besar Rencana Pembelajaran (GBRP) ............................................................... 1

BAB II. Sejarah, Pengertian dan Prinsip Dasar Pembiakan In vitro ........................ 7

2.1 Pendahuluan ................................................................................................................ 7

2.2 Sejarah Singkat ............................................................................................................ 7

2.3 Pengertian .................................................................................................................... 8

2.4 Prinsip Dasar ................................................................................................................ 8

2.5 Aplikasi Pembiakan In vitro ........................................................................................ 9

2.6 Penutup ...................................................................................................................... 10

Daftar Pustaka ................................................................................................................. 11

BAB III. Tahapan Perkembangan dan Pelaksanaan Kultur Jaringan ................... 12

3.1 Pendahuluan .............................................................................................................. 12

3.2 Morfogenesis, Organogenesis, dan Embryogenesis .................................................. 12

A. Morfogenesis .......................................................................................................... 12

B. Organogenesis ......................................................................................................... 13

C. Embryogenesis ........................................................................................................ 13

3.3 Tahapan Pelaksanaan Kultur Jaringan ....................................................................... 15

A. Pemilihan dan Penyiapan Tanaman Induk Sumber Eksplan .................................. 15

B. Inisiasi Kultur ......................................................................................................... 15

C. Multiplikasi atau Perbanyakan Propagul ................................................................ 16

D. Pemanjangan Tunas, Induksi, dan Perkembangan Akar ........................................ 17

E. Aklimatisasi ............................................................................................................ 18

3.4 Terminologi dalam Kultur Jaringan .......................................................................... 18

3.5 Penutup ...................................................................................................................... 20

Daftar Pustaka ................................................................................................................. 21

iv

BAB IV. Teknik Aseptik Peralatan Kultur Jaringan dan Lab Biosafety................ 22

4.1 Pendahuluan .............................................................................................................. 22

4.2 Pengaturan Ruangan Laboratorium ........................................................................... 22

A. Ruangan Laboratorium ........................................................................................... 22

B. Ruang Persiapan ..................................................................................................... 23

C. Ruang Transfer ....................................................................................................... 24

D. Ruang Kultur .......................................................................................................... 24

E. Ruang Stok .............................................................................................................. 25

F. Ruang Timbang ....................................................................................................... 25

G.Ruang Aklimatisasi .................................................................................................. 26

4.3 Alat-Alat dalam Teknik Kultur Jaringan ................................................................... 26

4.4 Bahan yang digunakan dalam Kultur Jaringan .......................................................... 28

4.5 Sterilisasi Alat dan Bahan ......................................................................................... 30

4.6 Sterilisasi Peralatan ................................................................................................... 30

4.7 Sterilisasi Eksplan ..................................................................................................... 33

4.8 Laboratorium Biosafety ............................................................................................. 40

A. Aturan baku ............................................................................................................ 41

B. Rancangan laboratorium dan fasilitasnya ............................................................... 44

C. Pengawasan kesehatan dan medis ........................................................................... 47

D. Pelatihan .................................................................................................................. 48

E. Pembuangan limbah ................................................................................................. 49

F. Keselamatan dari bahan kimia, api, listrik dan radiasi ............................................ 53

4.9 Penutup ...................................................................................................................... 53

Daftar Pustaka ................................................................................................................. 54

BAB V. Media Kultur Jaringan .................................................................................. 55

5.1 Pendahuluan .............................................................................................................. 55

5.2 Sejarah nutrisi in vitro ............................................................................................... 55

5.3 Jenis Medium dan Komponen Penyusun Utamanya ................................................. 57

5.4 Hara tanaman ............................................................................................................. 58

A. Vitamin ................................................................................................................... 59

B. Asam amino dan amida ........................................................................................... 59

C. Suplemen organic kompleks ................................................................................... 60

D. Arang aktif .............................................................................................................. 60

E. Sumber karbon ........................................................................................................ 61

v

F. Osmotikum .............................................................................................................. 62

G. Air ........................................................................................................................... 62

5.5 Medium dalam Kultur Jaringan ................................................................................. 62

A. Matriks medium ...................................................................................................... 62

B. Keasaman medium .................................................................................................. 63

C. Pemilihan komposisi medium dasar ....................................................................... 64

D. Pembuatan medium ................................................................................................ 66

E. Pembuatan beberapa komposisi media ................................................................... 70

5.6 Senyawa Organik Kompleks ..................................................................................... 82

5.7 Penutup ...................................................................................................................... 88

Daftar Pustaka ................................................................................................................. 89

BAB VI. Kultur Organ ................................................................................................. 90

6.1 Pendahuluan ............................................................................................................... 90

6.2 Pengertian Kultur Organ ............................................................................................ 90

6.3 Kultur Meristem ........................................................................................................ 90

A.Perlengkapan ........................................................................................................... 91

B. Bahan dan pereaksi .................................................................................................. 91

C. Prosedur ................................................................................................................... 93

6.4 Kultur Embryo, Embryo Rescue ............................................................................... 97

A. Induksi Pembentukan Embrio (Embriogenesis) Pada Kultur In vitro .................... 97

B. Teknik Embryo Rescue ........................................................................................... 98

6.5 Kultur Anter/Ovul ..................................................................................................... 98

A. Metode Kultur Anter/Ovul ...................................................................................... 98

B. Prosedur Inisiasi Kultur Anter ................................................................................ 99

6.6 Penutup .................................................................................................................... 101

Daftar Pustaka ............................................................................................................... 103

BAB VII. Kultur Kalus .............................................................................................. 104

7.1 Pendahuluan ............................................................................................................. 104

7.2 Pengertian dan tujuan .............................................................................................. 104

7.3 Faktor yang mempengaruhi induksi kalus ............................................................... 105

7.4 Prosedur Pelaksanaan Kultur Kalus ........................................................................ 108

7.5 Penutup ..................................................................................................................... 111

Evaluasi ......................................................................................................................... 111

Daftar Pustaka ............................................................................................................... 112

vi

BAB VIII. Kultur Protoplas ...................................................................................... 113

8.1 Pendahuluan ............................................................................................................ 113

8.2 Pengertian dan tujuan kultur protoplas .................................................................... 113

8.3 Prosedur kultur protoplas ........................................................................................ 114

A. Persiapan dan sterilisasi eksplan. .......................................................................... 114

C. Isolasi Protoplasma. .............................................................................................. 115

A. Pemurnian protoplasma ........................................................................................ 117

B. Perhitungan konsentrasi dan test viabilitas protoplasma. ..................................... 118

C. Kultur protoplasma ............................................................................................... 118

8.4 Penutup .................................................................................................................... 122

Daftar Pustaka ............................................................................................................... 124

BAB IX. Variasi Somaklonal ..................................................................................... 125

9.1 Pendahuluan ............................................................................................................. 125

9.2 Pengertian dan mekanisme terjadinya variasi somaklonal ...................................... 125

9.3 Pengelompokkan Keragaman Somaklonal .............................................................. 127

9.4 Penutup .................................................................................................................... 128

Daftar Pustaka ............................................................................................................... 130

BAB X. Benih Sintetik ................................................................................................ 131

10.1 Pendahuluan .......................................................................................................... 131

10.2 Definisi dan keuntungan produksi benih sintetik .................................................. 131

10.3 Proses pembuatan benih sintetik dari embrio somatik .......................................... 133

10.4 Penutup .................................................................................................................. 138

Daftar Pustaka ............................................................................................................... 139

vii

Daftar Tabel

Tabel 1. Garis Besar Rencana Pembelajaran (GBRP) ................................................................ 3 Tabel 2. Bahan kimia yang digunakan untuk sterilisasi eksplan, konsentrasi, dan lama

perendaman ................................................................................................................ 37 Tabel 3. Berat Atom Unsur-Unsur Kimia yang Digunakan dalam Pembuatan Media Kultur

Jaringan ...................................................................................................................... 66

Tabel 4. Komposisi Medium Murashige dan Skoog (1962) pada pH 5,6 - 5,8 ............ ………74 Tabel 5. Komposisi Medium Vacin dan Went (1949) pada pH 5,6 – 5,8 ................................ 76 Tabel 6. Komposisi Medium B5 (Gamborg et. al., 1968) pada pH 5,6 – 5,8........................... 78 Tabel 7. Komposisi medium WPM (Woody Plant Medium (Lloyd dan McCown, 1968) pada

pH 5,6-5,8 ..................................................................................................... ………..79

Tabel 8. Komposisi Media Kultur Jaringan (mg/l)................................................................... 87

Tabel 9. Jumlah dan jenis vitamin dan hormon yang digunakan bersama medium garam

mineral untuk kultur agar dan kultur suspensi. .......................................................... 93

Table 10. Enzim yang tersedia secara komersial untuk isolasi protoplas……………………113

Tabel 11. Perubahan sifat tanaman hasil variasi somaklonal ............................................ ….128

viii

Daftar Gambar

Gambar 1. Dua tanaman seledri yang diregenerasikan secara kultur jaringan dari tanaman

donor yang sama...................................................................................................122

Gambar 2. Ilustrasi alur pembuatan benih sintetik…………………………………………..132

Gambar 3. Benih sintetik…………………………………………………………………….132

ix

Glosarium

Aklimatisasi

Tahap penyesuaian dari heterotrof ke autotrof

Aseptik

Bebas mikroorganisme (lingkungan yang steril)

Browning

Timbulnya warna coklat pada kalus akibat adanya kegiatan enzim oksidase atau

adanya okasidasi fenol, sehingga terbentunya persenyawaan fenol/phenolic compound

Cell line (lini sel)

Sel turunan dari kultur sel primer yang di subkultur pada periode yang cukup lama

Dediferensiasi

Pembentukan jaringan yang embrionik yang berasal dari jaringan atau dari organ yang

telah terbentuk

Diferensiasi

Terbentuknya jaringan, organ (akar, tunas) karena adanya perkembangan

Eksplan

Bahan tanaman, berupa sel, jaringan atau organ yang diisolasi dan siap untuk

ditanam/dipelihara pada medium yang steril

Embriogenesis

Pembentukan embrio baik dari zigot (embrio zigotik) atau sel-sel somatik (embrio

somatik)

Heterokarion(heterokaryon)

Sel yang didalam sitoplasmanya terdapat dua atau beberapa inti & merupakan hasil

peleburan dari dua sel yang berbeda secara genetis.

Homokarion (homokaryon)

Sel yang di dalam sitoplasmanya terdapat dua atau beberapa inti dan merupakan hasil

fusi dari dua sel yang identik

Jaringan embrionik

Jaringan yang sifat sel-selnya selalu membelah

x

Kalus (callus)

Kumpulan sel yang aktif membelah (meristem/embrionik), belum terorganisir, tidak

beraturan dan belum terdiferensiasi

Klonal (clone)

Hasil propagasi dari kultur sel, jaringan atau organ tanaman yang mempunyai sifat

genetik yang identik dengan induk

Kriopreservasi (kryopreservation)

Penyimpanan sel, jaringan, embrio atau biji dalam kondisi lingkungan temperatur

minus

Planlet (pinak)

Tanaman kecil sempurna (berdaun, batang dan akar) hasil kultur jaringan

Regenerasi

Pembentukan kembali organ atau jaringan menjadi tanaman utuh

Sibrid (cybrid)

Hasil peleburan dari sitoplasma (cairan plasma) ke sel yang lain.

Sinkarion

Sel-sel hybrid yang memiliki inti gabungan dari 2 atau beberapa sel yang melebur

Sub-kultur

Pemindahan eksplan dari medium lama ke medium baru

Variasi Somaklonal

Tanaman hasil perbanyakan melalui regenerasi sel somatik atau hasil diferensiasi sel-

sel somatik

1

BAB I. Pendahuluan

1.1 Gambaran Umum Mata Kuliah

Mata kuliah Pembiakan In vitro merupakan mata kuliah keahlian yang terdiri atas teori

dan praktikum yang membahas tentang sejarah pembiakan in vitro, bentuk-bentuk kegiatan

dan beberapa terminologi, serta tahapan-tahapannya. Juga akan dibahas tentang sarana dan

peralatan yang diperlukan serta teknik-teknik aseptik dan media yang dipergunakan. Jenis-

jenis pembiakan in vitro yang ada seperti kultur organ, kultur meristem, kultur embryo, kultur

anter dan ovul, kultur protoplas serta kultur kalus dan suspensi sel juga akan dibahas. Sebagai

tambahan pengetahuan dan wawasan juga akan dipelajari tentang teknik pembuatan benih

sintetik atau enkapsulasi, embryogenesis somatik (embriosomatik) pada kopi dan kakao, dan

teknik kriopreservasi pada kultur jaringan tanaman.

1.2 Mekanisme dan Rancangan Pembelajaran Bahan Ajar

Mekanisme pelaksanaan pembelajaran mata kuliah ini dalam bentuk pembelajaran SCL

(Student Centered Learning) yakni dilakukan kuliah secara interaktif, diskusi, presentasi dan

praktikum dengan metode PBL (Project Based Learrning). Kuliah interaktif dilakukan melalui

LMS dimana mahasiswa dapat mengunduh dan mengunggah bahan ajar dan jawaban maupun

pertanyaan melalui LMS. Setiap waktu untuk setiap kegiatan dinilai oleh pembelajar

berdasarkan kriteria penilaian yang sudah disepakati pada kontrak perkuliahan.

1.3 Garis Besar Rencana Pembelajaran (GBRP)

Nama mata kuliah : PEMBIAKAN IN VITRO / 405 PB3

Deskrispi singkat : Mata kuliah keahlian yang terdiri atas teori dan praktikum yang

membahas tentang sejarah pembiakan in vitro, bentuk-bentuk

kegiatan dan beberapa terminologi, serta tahapan-tahapannya. Juga

akan dibahas tentang sarana dan peralatan yang diperlukan serta

teknik-teknik aseptik dan media yang dipergunakan. Jenis-jenis

pembiakan in vitro yang ada seperti kultur organ, kultur meristem,

2

kultur embryo, kultur anter dan ovul, kultur protoplas serta kultur

kallus dan suspensi sel juga akan dibahas. Sebagai tambahan

pengetahuan dan wawasan juga akan dipelajari tentang teknik

pembuatan benih sintetik atau enkapsulasi, embryogenesis somatik

(embriosomatik) pada kopi dan kakao, dan teknik kriopreservasi pada

kultur jaringan tanaman.

Kompetensi Sasaran : Mampu menjelaskan dan memperagakan teknik-teknik dasar kultur

jaringan tanaman.

Sasaran Belajar : Mengerti dan mampu menjelaskan prinsip dasar mikropropagasi,

faktor-faktor yang berpengaruh dalam in vitro, kultur in vitro

vegetatif & generative.

Kompetensi Pendukung Paham tentang tujuan-tujuan khusus penggunaan metode pembiakan

in vitro seperti pada kriopreservasi, tanaman transgenik.

3

Tabel 1 Garis Besar Rencana Pembelajaran (GBRP)

Minggu SASARAN

PEMBELAJARAN MATERI PEMBELAJARAN

STRATEGI

PEMBELAJARAN

KRITERIA

PENILAIAN

Bobot

Nilai

(%)

1

Menjelaskan

pengertian

pembiakan in vitro,

manfaat atau

keuntungan dan

kelemahannya.

1. Penjelasan Kontrak Pembelajaran.

2. Pendahuluan: Pengertian, sejarah,

perkembangan dan peran dalam

pertanian. Prinsip dasar pembiakan

in vitro atau mikropropagasi.

3. Manfaat, keuntungan & kelemahan.

1. Kuliah & Diskusi

2. Penugasan dari masing-

masing dosen untuk

disetor pada waktu

yang akan ditetapkan.

2

Menjelaskan bentuk,

tahapan, prinsip dan

terminologi dalam

pembiakan in vitro.

1. Bentuk bentuk pembiakan in vitro:

Pembiakan yang berasal dari

jaringan atau bagian vegetatif dan

generatif.

2. Pengertian morfogenesis,

organogenesis dan embryogensis.

3. Tahapan pembiakan in vitro:

Inisiasi kultur, inkubasi, pra-

1. Quiz

2. Kuliah & Tugas Kajian

Pustaka + Kerja

Kelompok + Presentasi

1. Ketepatan Konsep

dgn contoh.

2. Kejelasan Uraian.

3. Kemutakhiran

Tugas Pustaka;

Ketuntasan gagasan

pada poster dari

model yang dipilih;

20

4

transplantasi, transplan/subkultur

dan inisiasi tunas/kallus,

multiplikasi tunas/kallus serta

aklimatisasi.

Kreativitas; Kerja

sama Tim.

4 – 5

Menjelaskan tentang

sarana, peralatan dan

bahan-bahan yang

diperlukan dan tata

cara teknik aseptik.

1. Ruang laboratorium Kultur

Jaringan Tanaman, Peralatan,

Bahan kimia, Sarana Penunjang.

2. Lab Safety dan Teknik aseptik:

Sterilisasi basah dan kering untuk

ruang, alat, aquades, media,

sterilisasi eksplan serta bahan

sterilan.

1. Quiz

2. Kuliah & Tugas Kajian

Pustaka + Kerja

Kelompok + Presentasi

(Collaborative

Learning)

1. Ketuntasan isi,

Kejelasan konsep

dan Penguasaan

istilah dan proses

pembiakan in vitro.

2. Kemampuan

menyelesaikan

Problem Set +

Kedisiplinan.

20

6 - 8

Menjelaskan tentang

jenis-jenis medium

sarana, peralatan dan

bahan-bahan yang

diperlukan dan tata

1. Jenis-jenis medium dan

penyanggah inert serta komposisi

medium (senyawa organik,

anorganik, nutrisi alami.

2. Zat pengatur tumbuh dan

Kuliah & Diskusi + Kerja

kelompok; Presentasi

(Collaborative Learning)

dan Project Based Learning

untuk Praktikum.

1. Kelengkapan dan

kejelasan isi serta

penguasaan model

yang dipilih;

2. Kerja sama tim pada

10

5

cara teknik aseptik

pembuatan media.

pengaruhnya.

3. Cara pembuatan larutan stok dan

media pembiakan padat / cair.

saat presentasi.

3. Kemutakhiran

pustaka.

9 – 11

Mampu menjelaskan

tentang pembiakan

in vitro dari organ

vegetatif dan

generatif tanaman

Pengertian morfogenesis,

organogenesis dan embryogensis

serta manfaat, media yang digunakan

dan cara pelaksanaan dari masing-

masing, hingga planlet:

1. Kultur Organ

2. Kultur Meristem

3. Kultur Embryo, embryo rescue

4. Kultur Anter/Ovul

1. Quiz

2. Kuliah & Diskusi

3. Menyusun presentasi

oral dan poster yang

memuat langkah-

langkah proses setiap

jenis kultur

1. Kelengkapan dan

kejelasan isi serta

kejelasan &

penguasaan model

yang dipilih;


saat presentasi.

3. Kemutakhiran

pustaka.

20

12 - 13

Mampu menjelaskan

pengertian dan cara

pelaksanaan kultur

kallus dan suspensi

sel, serta protoplas

Pengertian, manfaat, media yang

digunakan dan cara pelaksanaan dari

masing-masing, hingga planlet:

1. Kultur kallus dan suspensi sel

2. Kultur protoplas

1. Quiz

2. Kuliah & Diskusi.

3. Menyusun porto folio

yang memuat langkah-

langkah proses setiap

jenis kultur

1. Kelengkapan dan

kejelasan isi serta

kejelasan &

penguasaan model

yang dipilih.

2. Kemutakhiran

pustaka

15

6

PRAKTIKUM: 25%

14 - 16

Mampu menjelaskan

tujuan-tujuan khusus

penggunaan metode

pembiakan in vitro

Pengertian, manfaat, media yang

digunakan dan cara pelaksanaan dari

masing-masing:

1. Embriogenetik somatik.

2. Variasi somaklonal.

3. Kriopreservasi.

4. Enkapsulasi / Benih sintetik, dll.

1. Quiz

2. Kuliah & Diskusi

3. Tugas

makalah/kepustakaan

untuk diskusi.

1. Kelengkapan dan

kejelasan isi serta

kejelasan &

penguasaan model

yang dipilih;


saat presentasi.

3. Kemutakhiran

pustaka

15

7

BAB II. Sejarah, Pengertian dan Prinsip Dasar Pembiakan In vitro

2.1 Pendahuluan

Bab ini memberi gambaran mengenai sejarah singkat, pengertian, prinsip dasar, aplikasi

pembiakan kultur in vitro, serta keuntungan dan kelemahannya. Setelah mempelajari bab ini,

mahasiswa diharapkan mampu menjelaskan pengertian pembiakan in vitro, prinsip yang

mendasari teknik pembiakan ini, dan contoh penerapannya dalam pertanian.

2.2 Sejarah Singkat

Teknik pembiakan tanaman secara kultur jaringan atau pembiakan secara in vitro telah

berkembang dalam rentang waktu yang cukup panjang. Meskipun prinsip dasar teknik

pembiakan ini telah dikemukakan oleh Schwann dan Schleiden (1838), namun Haberlandt

yang kemudian dianggap sebagai pelopor dalam pembiakan In vitro.

Teknologi ini mulai dikembangkan oleh Haberlandt pada tahun 1902 berdasarkan teori

totipotensi sel. Haberlandt berspekulasi bahwa setiap sel mampu tumbuh dan berkembang

menjadi tanaman normal jika dikulturkan pada nutrisi dan lingkungan yang tepat.

Keberhasilan pertama dalam kultur in vitro dicapai dalam praktek kultur organ. Teknik

penyelamatan embrio (embryo rescue) mulai dikembangkan tahun 1900an, teknik ini

memungkinkan benih yang belum matang atau embrio diselamatkan untuk membentuk

tanaman baru, hal ini pada umumnya dilakukan untuk benih–benih yang memiliki masa

dormansi yang panjang. Menurut Shabde, Moses & Murhasige (1979), pada tahun 1904 telah

berhasil mendapatkan kecambah tanaman jenis cruciferae dari embrio-embrio yang diisolasi

dari biji yang belum matang.

White (1934) menunjukkan pertumbuhan organ yang tidak terbatas di dalam kultur In

vitro akar tomat. Kultur organ merupakan topik yang penting dalam penelitian antara tahun

1940-1960. Setelah itu penelitian dalam bidang ini berkurang, kecuali kultur pucuk/meristem.

Selain kultur pucuk, pada tahun 60-an, kultur akar mendapat perhatian lagi pada beberapa

tanaman tertentu sehubungan dengan tujuan produksi metabolit sekunder, terutama untuk

jenis-jenis persenyawaan yang berasosiasi dengan akar.

8

2.3 Pengertian

Pembiakan tanaman secara in vitro merupakan metode pengisolasian bagian tanaman (sel,

jaringan, atau organ) kemudian menumbuhkannya pada media buatan dalam wadah tembus

pandang dan kondisi aseptik, hingga bagian-bagian tanaman tersebut dapat memperbanyak

diri, tumbuh menjadi tanaman lengkap (plantlet) kembali. Pelaksanaan teknik ini memerlukan

berbagai prasyarat untuk mendukung kehidupan jaringan yang dibiakkan. Hal yang paling

esensial adalah wadah dan media tumbuh yang steril.

Media adalah tempat bagi jaringan untuk tumbuh dan memperoleh nutrisi yang

mendukung kehidupan jaringan. Media tumbuh menyediakan berbagai bahan yang diperlukan

jaringan untuk hidup dan memperbanyak dirinya. Media tumbuh dapat berupa media cair,

media padat atau semi padat. Untuk menentukan bentuk media yang akan digunakan, akan

sangat bergantung pada jenis eksplan dan spesies tanaman yang akan dibiakkan.

Teknik kultur jaringan memanfaatkan prinsip perbanyakan tumbuhan secara vegetatif.

Berbeda dari teknik perbanyakan tumbuhan secara konvensional, teknik kultur jaringan

dilakukan dalam kondisi aseptik di dalam botol kultur dengan medium dan kondisi tertentu.

Karena itu teknik ini sering kali disebut kultur in vitro. Disebut in vitro (bahasa Latin), berarti

"di dalam kaca" karena jaringan tersebut ditumbuhkan dalam botol kaca yang tembus

pandang. Selain botol kaca juga dapat digunakan botol plastik yang tahan panas hingga 125ºC,

pemanasan dilakukan untuk mensterilisasi wadah tanam.

Prinsip Dasar

Kemampuan dari bagian tanaman yang dikulturkan (eksplan) untuk memperbanyak diri

(beregenerasi, embriogenesis, organogenesis) hingga terbentuk individu/tanaman baru

(planlet) didasari oleh teori sel yang dikemukakan oleh Schleiden dan Schwann (1838). Teori

sel menyatakan bahwa sel tumbuhan maupun hewan merupakan suatu kesatuan biologis

terkecil yang mampu mengadakan segala aktivitas yang berhubungan dengan kehidupan,

sehingga setiap sel yang hidup mempunyai sifat yang disebut Totipotensi Sel (Total genetik

potensial dari sel). Totipotensi sel dapat diartikan bahwa setiap sel hidup mempunyai

potensi/kemampuan genetik secara otonom untuk tumbuh dan berkembang menjadi tanaman

yang sempurna bila ditumbuhkan pada lingkungan yang sesuai (Gamborg dan Shyluk, 1981).

http://id.wikipedia.org/wiki/Prinsip

http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Vegetatif&action=edit&redlink=1

http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Konvensional&action=edit&redlink=1

http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Aseptik&action=edit&redlink=1

http://id.wikipedia.org/wiki/Kultur

http://id.wikipedia.org/wiki/Bahasa_Latin

9

Selain totipotensi, kultur jaringan pada tanaman dimungkinkan karena sel tanaman

memiliki kemampuan rediferensiasi dan kompetensi. Rediferensiasi adalah kemampuan sel-sel

masak (mature) kembali menjadi ke kondisi meristematik dan dan berkembang dari satu titik

pertumbuhan baru yang diikuti oleh rediferensiasi yang mampu melakukan reorganisasi

manjadi organ baru. Kemampuan kompetensi menggambarkan potensi endogen dari sel atau

jaringan untuk tumbuh dan berkembang dalam satu jalur tertentu.

2.5 Aplikasi Pembiakan In vitro

Dalam perkembangan selanjutnya, teknik in vitro tidak hanya digunakan untuk

memperbanyak tanaman, tetapi juga digunakan untuk tujuan lain. Adapun kegunaan yang

dapat dicapai dengan teknik in vitro dalam aplikasinya dibidang pertanian adalah sebagai

berikut:

1. Perbanyakan tanaman secara massal.

Perbanyakan tanaman dapat dilakukan secara massal sehingga dapat dihasilkan bibit

tanaman dalam jumlah yang banyak dalam waktu yang relatif singkat dengan menggunakan

bahan tanam (eksplan) yang berukuran kecil (1 mm - 10 mm)

2. Menghasilkan bibit bebas patogen dan meyelamatkan klon dari kepunahan

Dapat dihasilkan bibit tanaman yang bebas patogen dan

untuk mendapatkan/menyelamatkan klon dari suatu tetua unggul yang langka

karena terserang suatu penyakit yang mematikan, misalnya induk tanaman jeruk yang

terserang CVPD (dengan menggunakan eksplan dari meristem apikal yang berukuran 0,1

mm 1,0 mm).

3. Seleksi tanaman terhadap kondisi tertentu.

Teknik in vitro dapat digunakan untuk melakukan seleksi terhadap berbagai jenis

galur/varietas tanaman untuk mendapatkan jenis yang tahan terhadaptingkat ketahanan

tertentu, misalnya tingkat ketahanan pada pH tertentu, tingkat salinitas dan lainnya.

4. Koleksi dan konservasi plasma nutfah.

Mengoleksi dan mengkonservasi berbagai jenis tanaman sebagai sumber keragaman

genetik dapat dilakukan dengan teknik in vitro hanya dalam suatu laboratorium yang

10

berukuran kecil dan mudah untuk dipertukarkan ke tempat lain/kota/negara lain karena

ukurannya yang kecil dan dalam wadah botol/tabung gelas yang aseptik.

5. Mendapatkan mutan-mutan harapan

Teknik in vitro dapat digunakan untuk menghasilkan mutan-mutan yang diharapkan

mempunyai sifat-sifat unggul, seperti tahan terhadap kekeringan, tahan terhadap kadar

Aluminium yang tinggi dsb.

6. Menghasilkan senyawa sekunder.

Dapat dihasilkan senyawa sekunder yang mempunyai manfaat dalam bidang kesehatan

(obat-obatan) dan industri hanya dengan menghasilkan sel-sel dari suatu tanaman tertentu

yang nantinya akan diekstrak untuk mendapatkan senyawa sekunder tersebut, misalnya

saponin dari tanaman ginseng.

2.6 Penutup

Tugas

1. Jelaskan secara singkat sejarah perkembangan kultur jaringan tanaman!

2. Jelaskan secara singkat apa yang dimaksud dengan pembiakan tanaman secara in vitro,

serta jelaskan prinsip dasar pengembangan tanaman secara in vitro!

3. Apa yang dimaksud dengan kemampuan totipotensi sel?

4. Apa perbedaan teknik pembiakan tanaman secara in vitro dengan pembiakan tanaman

secara konvensional.

5. Sebutkan dan jelaskan kegunaan yang dapat dicapai dengan teknik in vitro dalam

aplikasinya dibidang pertanian!

11

Daftar Pustaka

Keshavachandran, R dan Peter, KV. 2008. Methods in Tissue Culture and Gene Transfer.

India : Universities Press.

L.R. Wetter dan F. Constabel. 1982. Plant Tissue Culture Methods. Diterjemahkan oleh

Widianto, Mathilda. 1991. Metode Kultur Jaringan Tanaman, edisi kedua.Bandung:

Penerbit ITB.

Sandra, Edhi. 2010. Kultur Anter. http://eshaflora.blogspot.com/2010/03/kultur-anter.html,

diakses pada tanggal 18 November 2011.

Suhardi, Sri H, dkk, 2008. Pedoman Keselamatan Kerja di Laboratorium Mikrobiologi dan

Rumah Sakit. Jakarta: PT Multazam Mitra Prima.

Watimena, G.A, dkk. 2011. Bioteknologi dalam Pemuliaan Tanaman. Bogor: IPB Press.

Yuwono, Tribowo. 2006. Bioteknologi Pertanian. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press.

Yuliarti, Nurheti. 2010. Kultur Jaringan Tanaman Skala Rumah Tangga. Yogyakarta: Lily

Publisher.

Zulkarnain. 2009. Kultur Jaringan Tanaman, Solusi Perbanyakan Tanaman Budidaya. Jakarta:

Bumi Aksara.

http://eshaflora.blogspot.com/2010/03/kultur-anter.html

12

BAB III. Tahapan Perkembangan dan Pelaksanaan Kultur Jaringan

3.1 Pendahuluan

Pembiakan in vitro melibatkan serangkaian perubahan morfologis dan fisiologis yang

dipengaruhi oleh berbagai faktor. Bab ini menjelaskan tahapan perkembangan eksplan dan

tahapan pelaksanaan kultur jaringan. Setelah mempelajari bab ini mahasiswa diharapkan

memperoleh gambaran bagaimana tahapan perkembangan eksplan kembali menjadi tanaman

utuh dan bagaimana tahapan pelaksanaan teknik ini.

3.2 Morfogenesis, Organogenesis, dan Embryogenesis

A. Morfogenesis

Morfo berarti bentuk dan genesis berarti asal mula, sehingga morfogenesis bisa diartikan

dengan asal mula terjadinya suatu bentuk. Beberapa pendapat tentang morfogenesis adalah

sebagai berikut:

Menurut Strasburger (1978): Morfogenesis adalah proses pembentukan organisme yang

dipengaruhi faktor internal (endogen) dan fektor eksternal (exogen). Strassburger menyatakan

bahwa pengertian morfogenesis ada 2 kelompok, yatu:

Automorfose; yaitu proses pembentukan yang dipengaruhi gen, antara lain perkembangan

organ generatif angiospermae, yaitu selama pembentukan bunga yang dilengkapi dengan

pembentukan polen, maka kemudian dapat terbentuk biji, sedangkan yang tidak dilengkapi

oleh pembentukan polen, kemudian tidak berbiji.

Heteromorfose; yaitu proses pembentukan yang dipengaruhi oleh adanya induksi dari

luar, antara lain: oleh adanya cahaya (fotomorfose) adanya air (hidromorfose) dan oleh

pengaruh panas (termomorfose). Menurut Hill (1982): Morfogenesis adalah proses

pertumbuhan dan perkembangan bentuk, diferensiasi suatu organisme.

Morfogenesis dipengaruhi oleh dua faktor utama yaitu genotipe dan lingkungan tumbuh

tanaman. Genotipe tanaman akan menentukan bagaimana pertumbuhan jaringan tanaman, dan

morfogenesisnya secara in vitro. Faktor penting lain yang mempengaruhi morfogenesis adalah

llingkungan, yaitu aspek pertukaran gas, temperatur, cahaya, dan komposisi media kultur.

13

Morfogenesis baik secara langsung maupun tidak, sangat tergantung pada keseimbangan

komposisi yang tepat antara bahan organik, anorganik dan senyawa pengatur tumbuh tanaman.

B. Organogenesis

Organogenesis merupakan istilah yang merujuk pada proses terbentuknya organ (pucuk

dan/atau akar adventif) dari kalus. Keragaman genetis merupakan salah satu faktor penting

karena merupakan bahan baku dalam upaya pemuliaan tanaman tersebut. Dalam kultur

jaringan dapat diperoleh variasi somaklonal melalui kultur kalus. Variasi somaklonal dalam

kultur jaringan dapat terjadi karena adanya transposable genetic element yang menempel pada

sekuen DNA yang menyebabkan terjadinya perubahan fenotipik. Dalam bentuk kalus

perlakuan mutasi akan lebih mudah menampakkan hasilnya. Kalus yang telah diberi perlakuan

mutagen kemudian diarahkan kembali pertumbuhannya untuk membentuk pucuk dan/atau

akar adventif

Proses organogenesis ditandai dengan pembentukan struktur unipolar yaitu hanya

pembentukan titik tumbuh daun atau akar secara terpisah. Karena prosesnya mirip dengan

perkembangan pada biji, tanaman klonal yang dihasilkan dengan teknik SE secara

morfologis/arsitektural sangat mirip dengan tanaman asal dari biji, sedangkan tanaman dari

proses organogenesis bentuk tanaman mirip dengan tanaman asal setek.

Bhojwani dan Razdan (1983) menyatakan bahwa tanaman-tanaman yang diregenerasikan

dari kultur kalus dan kultur sel memperlihatkan ekspresi genetik yang tidak selalu stabil.

Ketidakstabilan genetik, seperti poliploidi, aneuploidi, yang umum pada kultur kalus dan

kultur sel (Reisch, 1983). Sebagai contoh, Asparagus officinalis yang diperbanyak melalui

kultur kalus memperlihatkan adanya poliploidi dan aneuploidi, sedangkan yang diperbanyak

melalui kultur tunas semuanya bersifat diploid (normal). Sementara itu, Mohamed et al.,

(1993) menyatakan bahwa morfogenesis pucuk dari jaringan kalus Phaseolus vulgaris

terkadang disertai oleh timbulnya keragaman somaklon. Keragaman somaklon tersebut dapat

dimanfaatkan sebagai sumber keragaman genetik. Oleh karena itu, teknologi kultur kalus dan

kultur sel dapat menjadi sarana penyediaan keragaman genetik bagi para pemulia tanaman dan

menawarkan pendekatan baru bagi perbaikan tanaman melalui seleksi in vitro.

C. Embryogenesis

14

Istilah ini digunakan untuk menyatakan perkembangan embrio lengkap dari sel-sel

vegetative yang dihasilkan dari berbagai sumber eksplan yang ditumbuhkan pada system

kultur jaringan (Hartmann et al., 1990). Fenomena perkembangan embrio dari jaringan

tanaman yang dikulturkan, pertama kali diamati oleh Stewart et al. (1958) pada kultur

suspensi Daucus carota dan Reinert (1959) pada kultur kalus spesies tanaman yang sama.

Sama seperti embrio zigotik yang berkembang dari penyatuan gamet jantan dan gamet

betina, embrio somatik pun tumbuh dan berkembang melewati tahapan-tahapan yang sama.

Tahapan-tahapan tersebut adalah oktan, globular, awal hati, hati, torpedo, dan embrio dewasa.

Rice et al., (1992) menyatakan bahwa embryogenesis somatik merupakan teknik yang

paling menjanjikan untuk perbanyakan dalam waktu cepat pada tanaman pertanian. Embrio-

embrio somatik dapat muncul langsung dari permukaan eksplan, misalnya pada eksplam

kotiledon Cucumis sativus (Ladyman dan Girard, 1992) dan tunas Foeniculum vulgare

(Theiler-Hedtrich dan Kagi, 1992) atau setelah fase penggandaan yang melibatkan

pembentukan kalus, seperti pada Iris pumila (Radojevic et al., 1987), Fuchsia (Dabin dan

Beguin, 1987), dan Swainsona formosa (Zulkarnain, 2003).

Kemampuan regenerasi embrio somatik pada kultur sel, memungkinkan untuk

diregenerasikannya tanaman lengkap bila regenerasi melalui organogenesis tidak

memungkinkan. Suatu keuntugan yang nyata dari embriogenesis somatik adalah embrio-

embrio somatik adalah embrio-embrio somatik yang dihasilkan bersifat bipolar, yakni

memiliki ujung-ujung akar dan pucuk yang diperlukan bagi pertumbuhan tanaman lengkap.

Pada organogenesis, perkembangan pucuk dan akar sering terjadi secara terpisah dan sangat

tergantung pada perubahan media. Disamping itu, kultur-kultur yang bersifat embriogenetik

dapat menghasilkan embrio dalam jumlah besar dalam satu wadah kultur, lebih banyak

daripada pucuk-pucuk majemuk yang diregenerasikan secara adventif melalui organogenesis.

Bila kultur tersebut dipindahkan pada medium cair maka embrio-embrio tersebut dapat

terpisah satu sama lain dan mengapung bebas dalam medium. Oleh karena itu, embrio-embrio

tersebut tidak perlu dipisahkan secara manual, sehingga sejumlah besar embrio dapat

dipindahkan dengan mudah ke dalam wadah baru yang sesuai untuk ditumbuhkan menjadi

tanaman lengkap.

15

3.3 Tahapan Pelaksanaan Kultur Jaringan

A. Pemilihan dan Penyiapan Tanaman Induk Sumber Eksplan

Sebelum melakukan kultur jaringan untuk suatu tanaman, kegiatan yang pertama harus

dilakukan adalah memilih bahan induk yang akan diperbanyak. Tanaman tersebut harus jelas

jenis, spesies, dan varietasnya serta harus sehat dan bebas dari hama dan penyakit. Tanaman

indukan sumber eksplan tersebut harus dikondisikan dan dipersiapkan secara khusus di rumah

kaca atau green house agar eksplan yang akan dikulturkan sehat dan dapat tumbuh baik serta

bebas dari sumber kontaminan pada waktu dikulturkan secara in vitro.

Lingkungan tanaman induk yang lebih higienis dan bersih dapat meningkatkan kualitas

eksplan. Pemeliharaan rutin yang harus dilakukan meliputi: pemangkasan, pemupukan, dan

penyemprotan dengan pestisida (fungisida, bakterisida, dan insektisida), sehingga tunas baru

yang tumbuh menjadi lebih sehat dan bersih dari kontaminan. Selain itu pengubahan status

fisiologi tanaman induk sumber eksplan kadang-kadang perlu dilakukan seperti memanipulasi

parameter cahaya, suhu, dan zat pengatur tumbuh. Manipulasi tersebut bisa dilakukan dengan

mengondisikan tanaman induk dengan fotoperiodisitas dan temperatur tertentu untuk

mengatasi dormansi serta penambahan ZPT seperti sitokinin untuk merangsang tumbuhnya

mata tunas baru dan untuk meningkatkan reaktivitas eksplan pada tahap inisiasi kultur

(Yusnita, 2003).

B. Inisiasi Kultur

Tujuan utama dari propagasi secara in-vitro tahap ini adalah pembuatan kultur dari

eksplan yang bebas mikroorganisme serta inisiasi pertumbuhan baru (Wetherell, 1976).

Ditambahkan pula menurut Yusnita, 2004, bahwa tahap ini mengusahakan kultur yang aseptik

atau aksenik. Aseptik berarti bebas dari mikroorganisme, sedangkan aksenik berarti bebas dari

mikroorganisme yang tidak diinginkan. Dalam tahap ini juga diharapkan bahwa eksplan yang

dikulturkan akan menginisiasi pertumbuhan baru, sehingga akan memungkinkan dilakukannya

pemilihan bagian tanaman yang tumbuhnya paling kuat,untuk perbanyakan (multiplikasi) pada

kultur tahap selanjutnya (Wetherell, 1976).

Untuk mendapakan kultur yang bebas dari kontaminasi, eksplan harus disterilisasi.

Sterilisasi merupakan upaya untuk menghilangkan kontaminan mikroorganisme yang

16

menempel di permukaan eksplan. Beberapa bahan kimia yang dapat digunakan untuk

mensterilkan permukaan eksplan adalah NaOCl, CaOCl2, etanol, Na2H2O2 dan AgCl2.

Kesesuaian bagian tanaman untuk dijadikan eksplan, dipengaruhi oleh banyak faktor.

Tanaman yang memiliki hubungan kekerabatan dekat pun, belum tentu menunjukkan respon

in-vitro yang sama (Wetherell, 1976). Penggunaan eksplan yan tepat merupakan hal penting

yang juga harus diperhatikan pada tahap ini. Umur fisiologis dan ontogenetik tanaman induk,

serta ukuran eksplan bagian tanaman yang digunakan sebagai eksplan, merupakan faktor

penting dalam tahap ini. Bagi kebanyakan tanaman, eksplan yang sering digunakan adalah

tunas pucuk (tunas apikal) atau mata tunas lateral pada potongan batang berbuku. Namun

belakangan ini, eksplan potongan daun yang dulunya hanya digunakan untuk tanaman-

tanaman herba, seperti violces, begonia, petunia dan tomat, ternyata dapat digunakan juga

untuk tanaman-tanaman berkayu seperti Ficus lyrata, Annona squamosa, dan melinjo. Eksplan

yang dapat digunakan untuk memperbanyak tanaman Anthurium sendiri diantaranya adalah

tunas pucuk, daun, tangkai daun muda, tangkai bunga, spate, spandik, biji, ruas batang dan

anthera.

Umur fisiologis dan umur ontogenetik jaringan tanaman yang dijadikan eksplan juga

berpengaruh terhadap potensi morfogenetiknya. Umumnya, eksplan yang berasal dari tanaman

juvenil mempunyai daya regenerasi tinggi untuk membentuk tunas lebih cepat dibandingkan

dengan eksplan yang berasal dari tanaman yang sudah dewasa.

Masalah yang sering dihadapi pada kultur tahap ini adalah terjadinya pencokelatan atau

penghitaman bagian eksplan (browning). Hal ini disebabkan oleh senyawa fenol yang timbul

akibat stress mekanik yang timbul akibat pelukaan pada waktu proses isolasi eksplan dari

tanaman induk. Senyawa fenol tersebut bersifat toksik, menghambat pertumbuhan atau bahkan

dapat mematikan jaringan eksplan.

C. Multiplikasi atau Perbanyakan Propagul

Tahap ini bertujuan untuk menggandakan propagul atau bahan tanaman yang diperbanyak

seperti tunas atau embrio, serta memeliharanya dalam keadaan tertentu sehingga sewaktu-

waktu bisa dilanjutkan untuk tahap berikutnya (Yusnita, 2004). Pada tahap ini, perbanyakan

dapat dilakukan dengan cara merangsang terjadinya pertumbuhan tunas cabang dan

percabangan aksiler atau merangsang terbentuknya tunas pucuk tanaman secara adventif, baik

17

secara langsung maupun melalui induksi kalus terlebih dahulu. Seperti halnya dalam kultur

fase inisiasi, di dalam media harus terkandung mineral, gula, vitamin, dan hormon dengan

perbandingan yang dibutuhkan secara tepat (Wetherell, 1976). Hormon yang digunakan untuk

merangsang pembentukan tunas tersebut berasal dari golongan sitokinin seperti BAP, 2-iP,

kinetin, atau thidiadzuron (TDZ).

Kemampuan memperbanyak diri yang sesungguhnya dari suatu perbanyakan secara in-

vitro terletak pada mudah tidaknya suatu materi ditanam ulang selama multiplikasi (Wetherell,

1976). Eksplan yang dalam kondisi bagus dan tidak terkontaminasi dari tahap inisiasi kultur

dipindahkan atau disubkulturkan ke media yang mengandung sitokinin. Subkultur dapat

dilakukan berulang-ulang kali sampai jumlah tunas yang kita harapkan, namun subkultur yang

terlalu banyak dapat menurunkan mutu dari tunas yang dihasilkan, seperti terjadinya

penyimpangan genetik (aberasi), menimbulkan suatu gejala ketidaknormalan (vitrifikasi) dan

frekuensi terjadinya tanaman off-type sangat besar.

D. Pemanjangan Tunas, Induksi, dan Perkembangan Akar

Tujuan dari tahap ini adalah untuk membentuk akar dan pucuk tanaman yang cukup kuat

untuk dapat bertahan hidup sampai saat dipindahkan dari lingkungan in-vitro ke lingkungan

luar. Dalam tahap ini, kultur tanaman akan memperoleh ketahanannya terhadap pengaruh

lingkungan, sehingga siap untuk diaklimatisasikan (Wetherell, 1976). Tunas-tunas yang

dihasilkan pada tahap multiplikasi di pindahkan ke media lain untuk pemanjangan tunas.

Media untuk pemanjangan tunas mengandung sitokinin sangat rendah atau tanpa sitokinin.

Tunas tersebut dapat dipindahkan secara individu atau berkelompok.

Pemanjangan tunas secara berkelompok lebih ekonomis daripada secara individu. Setelah

tumbuh cukup panjang, tunas tersebut dapat diakarkan. Pemanjangan tunas dan

pengakarannya dapat dilakukan sekaligus atau secara bertahap, yaitu setelah dipanjangkan

baru diakarkan. Pengakaran tunas in-vitro dapat dilakukan dengan memindahkan tunas ke

media pengakaran yang umumnya memerlukan auksin seperti NAA atau IBA. Keberhasilan

tahap ini tergantung pada tingginya mutu tunas yang dihasilkan pada tahap sebelumnya.

Disamping itu, beberapa perlakuan yang disebut hardening in vitro telah dilaporkan dapat

meningkatkan mutu tunas sehingga planlet atau tunas mikro tersebut dapat diaklimatisasikan

dengan persentase yang lebih tinggi. Beberapa perlakuan yang bisa dilakukan yaitu dengan

18

mengkondiskan kultur di tempat yang pencahayaannya berintensitas lebih tinggi (contohnya

10000 lux) dan suhunya lebih tinggi. Pemanjangan dan pemanjangan tunas mikro dilakukan

dalam media kultur dengan hara mineral dan sukrosa lebih rendah dan konsentrasi agar-agar

lebih tinggi (Yusnita, 2004).

E. Aklimatisasi

Dalam proses perbanyakan tanaman secara kultur jaringan, tahap aklimatisasi planlet

merupakan salah satu tahap kritis yang sering menjadi kendala dalam produksi bibit secara

massal. Pada tahap ini, planlet atau tunas mikro dipindahkan ke lingkungan di luar botol

seperti rumah kaca, rumah plastik, atau screen house (rumah kaca kedap serangga). Proses ini

disebut aklimatisasi. Aklimatisasi adalah proses pengkondisian planlet atau tunas mikro (jika

pengakaran dilakukan secara ex-vitro) di lingkungan baru yang aseptik di luar botol, dengan

media tanah, pakis, atau media lainnya sehingga planlet dapat bertahan dan terus menjadi bibit

yang siap ditanam di lapangan. Prosedur pembiakan dengan kultur jaringan baru bisa

dikatakan berhasil jika planlet dapat diaklimatisasi ke kondisi eksternal dengan keberhasilan

yang tinggi.

Tahap ini merupakan tahap kritis karena kondisi iklim mikro di rumah kaca, rumah

plastik, rumah bibit, dan lapangan sangatlah jauh berbeda dengan kondisi iklim mikro di

dalam botol. Kondisi di luar botol bekelembaban nisbi jauh lebih rendah, tidak aseptik, dan

tingkat intensitas cahayanya jauh lebih tinggi daripada kondisi dalam botol. Planlet atau tunas

mikro lebih bersifat heterotrofik karena sudah terbiasa tumbuh dalam kondisi berkelembaban

sangat tinggi, aseptik, serta suplai hara mineral dan sumber energi berkecukupan.

3.4 Terminologi dalam Kultur Jaringan

Kultur jaringan adalah istilah umum yang ditujukan pada budidaya secara in vitro

terhadap berbagai bagian tanaman yang meliputi batang, daun, akar, bunga, kalus, sel,

protoplas, dan embrio. Bagian-bagian tersebut yang diistilahkan sebagai eksplan, diisolasi dari

kondisi in vivo dan dikultur pada medium buatan yang steril sehingga dapar beregenerasi dan

berdiferensiasi menjadi tanaman lengkap (Street, 1973). Hartmann et. al (1990) menggunakan

istilah yang lebih spesifik, yaitu mikropropagasi terhadap pemanfaatan teknik kultur jaringan

19

dalam upaya perbanyakan tanaman. Dimulai dari pengkulturan bagian tanaman yang sangat

kecil (eksplan) secara aseptik di dalam tabung kultur atau wadah lain yang serupa.

Pemahaman terhadap istilah-istilah yang sering digunakan dalam kultur in vitro

merupakan suatu hal yang sangat mendasar. Oleh karena itu, disamping kultur jaringan dan

mikropropagansi, Hartmann et al. (1990) mengemukakan lima istilah yang diterapkan untuk

menunjukkan tipe-tipe dasar dari regenerasi tanaman secara vegetative (regenerasi somatik).

Kelima istilah tersebut didasarkan atas macam eksplan yang digunakan dalam kaitannya

dengan siklus hidup tanaman, yaitu kultur meristem, proliferasi pucuk aksilar, induksi tunas

adventif, organogenesis, dan embryogenesis somatik.

Kultur meristem adalah metode perbanyakan tanaman dengan mengkulturkan potongan

tunas dengan ukuran sangat kecil yang terdiri atas satu kubah meristem dengan dua atau tiga

primordial daun di bawahnya. Kultur meristem terutama dimanfaatkan dalam program

eliminasi penyakit, terutama penyakit yang disebabkan oleh partikel virus. Apabila meristem

yang dikulturkan tidak mampu bertahan hidup dan menghasilkan akar maka sebagai

alternatifnya dilakukan prosedur sambung mikro (micrografting) (Taji et al,. 2002).

Proliferasi pucuk aksilar ditujukan pada perkembangan pucuk pada titik tumbuh lateral

atau tunas samping, dimana pertumbuhan tunas terminal tertekan atau hilang sama sekali,

sedangkan pertumbuhan tunas samping mengalami peningkatan. Dengan proliferasi pucuk

aksilar akan diperoleh pucuk-pucuk mikro (microshoot) yag dapat dipotong dan selanjutnya

diperakarkan secara in vitro untuk mendapatkan tanaman-tanaman mikro microplant). Dapat

pula pucuk-pucuk mikro tersebut dipotong dan dijadikan setek mikro (microcutting) dan

diperakarkan secara in vivo dalam pot-pot kecil.

Induksi tunas adventif melibatkan inisiasi tunas-tunas adventif, baik secara langsung

permukaan eksplan yang dikulturkan atau secara tidak langsung pada permukaan kalus

eksplan yang terbentuk. Kalus adalah massa sel yang belum berdiferensiasi dan tumbuh dari

proliferasi sel-sel yang tidak berorganisasi. Terbentuknya kalus merupakan akibat dari adanya

perlukaan pada permukaan eksplan dan pengaruh perlakuan zat pengatur tumbuh yang

diberikan media kultur.

20

3.5 Penutup

Evaluasi

1. Dalam perkembangan kultur jaringan tanaman meliputi tahapan morfogenesis,

organogenesis dan embryogenesis. Jelaskan secara singkat ketiga tahapan

tersebut!

2. Menurut Strassburger morfogenesis ada 2 kelompok, sebutkan dan jelaskan kedua

kelompok tersebut!

3. Sebutkan 4 tahapan pelaksanaan kultur jaringan tanaman serta jelaskan tujuan dari

masing-masing tahapan tersebut.

4. Mengapa tahap Aklimatisasi pada pelaksanaan kultur jaringan tanaman dikatakan

sebagai tahap kritis?

5. Sebutkan dan jelaskan 10 istilah-istilah dalam kultur jaringan!

21

Daftar Pustaka



L.R. Wetter dan F. Constabel. 1982. Plant Tissue Culture Methods. Diterjemahkan oleh

Widianto, Mathilda. 1991. Metode Kultur Jaringan Tanaman, edisi kedua. Bandung:

Penerbit ITB.

Redenbaugh K [editor]. 1992. Synseeds : Application of Synthetic Seeds to Crop

Improvement. CRC Press: Boca Raton Florida.



Suhardi, Sri H, dkk, 2008. Pedoman Keselamtan Kerja di Laboratorium Mikrobiologi dan



Yowono, Tribowo. 2006. Bioteknologi Pertanian. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press.


Publisher.


Bumi Aksara.


22

BAB IV. Teknik Aseptik Peralatan Kultur Jaringan dan Lab Biosafety

4.1 Pendahuluan

Kondisi aseptik (suci mikro organisme/pathogen) merupakan salah satu prasyarat

keberhasilan teknik kultur jaringan. Setiap tahapan kegiatan dan sarana prasarana dalam teknik

kultur jaringan harus memenuhi kondisi aseptik tertentu. Bab ini akan menjelaskan berbagai

teknik untuk mengsterilkan peralatan dan bahan tanaman yang digunakan dalam kultur

jaringan. Bab ini juga menjelaskan mengenai prosedur keamanan di laboratorium. Setelah

mempelajari bab ini Mahasiswa diharapkan mengetahui dan mampu menjelaskan berbagai

teknik aseptik dan prosedur keamanan laboratorium.

4.2 Pengaturan Ruangan Laboratorium

A. Ruangan Laboratorium

Suatu laboratorium kultur jaringan tanaman hendaknya memiliki luas yang memadai agar

dapat berfungsi secara maksimal. Pengaturan ruangan laboratorium dapat mengakomodasi

berbagai kegiatan yang berbeda, seperti persiapan medium, sterilisasi, pencucian, dan

pengeringan alat-alat yang sudah dicuci, transfer bahan eksplan secara aseptik, pemeliharaan

kultur dalam kondisi lingkungan terkendali, penyimpanan stok media yang belum digunakan,

penimbangan bahan-bahan kimia yang bebas dari gangguan turbulensi udara, dan aklimatisasi

planlet ke kondisi in vivo (White, 1963). Pengelompokan berbagai fungsi tersebut sangat

bervariasi antara laboratorium yang satu dengan yang lainnya.

Dalam merancang suatu laboratorium in vitro maka fasilitas dan komponen pendukung

hendaknya disusun sebagai suatu garis produksi (Street, 1973). Ruangan tempat pencucian dan

penyimpanan perangkat gelas hendaknya menghadap ke ruangan yang terdapat fasilitas untuk

sterilisasi menggunakan oven dan fasilitas untuk persiapan media. Alat-alat dan bahan-bahan

yang sudah disterilkan dengan autoklaf, selanjutnya dipindahkan ke ruang transfer. Setelah

pekerjaan aseptik selesai, selanjutnya kultur dipindahkan ke inkubator atau ruang kultur

dengan kondisi lingkungan yang terkendali. Penempatan kultur tersebut hndaknya berdekatan

dengan fasilitas mikroskop dan fasilitas untuk pengamatan kultur. Kultur yang mengalami

kontaminasi hendaknya segera dikeluarkan dan dibawa ke tempat pencucian.

23

Urutan prosedur aseptik merupakan hal yang sangat peting untuk diperhatikan. Apabila

laboratorium tidak memiliki ruang steril yang terpisah maka dibutuhkan fasilitas kotak pindah

yang dapat berupa enkas ataupun laminar air flow cabinet (LAFC). Fasilitas tersebut harus

berada di tempat yang bebas dari hembusan angin dan juga bebas dari orang-orang yang

melintas.

B. Ruang Persiapan

Yang dimaksud dengan ruang persiapan adalah ruangan untuk segala aktivitas dalam

rangka persiapan pelaksanaan aplikasi teknik kultur jaringan. Kegiatan di ruangan ini antara

lain:

Pembuatan dan penyimpanan larutan stok (unsur hara makro, unsur hara mikro,

sumber besi, vitamin dan zat pengatur tumbuh).

Pembuatan media mulai dari pencampuran larutan stok, pengecekan dan

penentuan pH, sterilisasi sampai pada distribusi media ke dalam wadah-wadah

kultur.

Sterilisasi medium maupun alat-alat, seperti gelas dan alat tanam dengan

menggunakan autoklaf atau oven.

Sterilisasi tahap awal terhadap eksplan, misalnya pencucian dan perendaman di

dalam fungisida, bakterisida, ataupun larutan hipoklorit (CaOCl dan NaOCl).

Pencucian dan pengeringan alat-alat laboratorium.

Ruangan persiapan merupakan tempat untuk mempersiapkan segala sesuatu yang

berhubungan dengan pengerjaan kultur jaringan. Oleh karena itu, ruangan ini dilengkapi

dengan fasilitas-fasilitas, seperti tempat mencuci alat-alat, dan tempat menyimpan alat-alat

(lemari, rak-rak dan lemari pendingin).

Alat-alat yang lazim ditempatkan pada ruangan ini adalah alat-alat yang biasanya

digunakan dalam mempersiapkan kultur, seperti:

Autoklaf

pH meter

24

Alat-alat pecah belah, seperti labu takar, gelas ukur, tabung Erlenmeyer, cawan

Petri, pipet dan botol kultur.

Tabung gas dan kompornya

Lemari pedingin (kulkas) dan Freezer

Destilator/ Stok aquadest

Stok alkohol

Alat-alat dan bahan-bahan lain yang berhubungan dengan persiapan pelaksanaan

teknik kultur jaringan.

C. Ruang Transfer

Ruang transfer dikenal juga sebagai ruang inokulasi atau ruang tanam. Sesuai namanya, di

dalam ruangan ini dilakukan kegiatan transfer, inokulasi, atau pengkulturan, yakni

menanamkan eksplan ke dalam medium cair ataupun padat.

Di dalam ruangan ini ditempatkan alat utama yang dikenal sebagai laminar air flow

cabinet (LAFC) atau dalam bentuk sederhana berupa enkas yang dikenel sebagai kotak

pindah. Segala aktifitas penanaman dilakukan di dalam LAFC atau enkas. Di dalam ruang

transfer ditempatkan pula alat-alat lain, seperti:

Mikroskop stereo/mikroskop deteksi yang sering digunakan pada kultur meristem.

Lampu spiritus

Alat-alat inokulasi/ diseksi (pinset dan skalpel) yang sudah steril

Cawan-cawan Petri yang sudah disterilisasi

Lampu ultraviolet

Lampu neon

D. Ruang Kultur

Ruang kultur merupakan suatu ruangan untuk menempatkan botol-botol kultur yang

sudah terdapat eksplan di dalamnya. Botol-botol tersebut ditempatkan pada rak-rak kultur

yang dilengkapi dengan lampu neon dengan intensitas kira-kira 50 µmol m-2

s-1

. Ruangan ini

25

dilengkapi juga dengan AC (Air conditioner)untuk mendapatkan suhu udara yang

dikehendaki, yaitu 25±1oC. Di dalam ruagan ini terdapat pula peralatan lain, seperti:

Timer pengatur fotoperiodesitas (biasanya 16 jam per hari)

Termometer udara

Higrometer

Shaker (meja penggocok) untuk kultur yang diinokulasikan pada medium cair.

Ruang kultur harus selalu dibersihkan untuk menghindari kemungkinan terjadinya

kontaminasi terhadap kultur, bahkan bila perlu di dalam ruangan ini ditaburi

dengan tablet-tablet formalin.

E. Ruang Stok

Ruang stok merupakan suatu ruangan tempat menyimpan stok atau cadangan medium.

Stok medium perlu diinkubasikan terlebih dahulu, paling tidak selama 1 minggu sebelum

digunakan. Tujuan inkubasi adalah untuk memberikan kesempatan kepada spora jamur

ataupun bakteri yang tidak mati pada saat sterilisasi agar dapat berkembang lalu medium yang

nyata terkontaminasi dapat dibuang. Dengan demikian, kerugian waktu, biaya dan tenaga

akibat pemakaian medium yang terkontaminasi dapat dihindarkan.

Ruang stok ini dilengkapi dengan rak-rak untuk menempatkan stok medium dan lampu

neon yang dihidupkan bila ada kegiatan, misalnya pada waktu penyimpanan dan pengambilan

medium. Seperti halnya ruang kultur, ruang stokpun perlu di jaga kebersihannya, agar medium

yang diletakkan diruangan ini tidak terkontaminasi.

F. Ruang Timbang

Ruang timbang merupakan suatu ruangan tempat berlangsungnya aktivitas penimbangan

bahan-bahan kimia maupun penimbangan eksplan. Di ruangan ini, ditempatkan alat timbang

berupa neraca analitik untuk menimbang bahan dengan bobot yang kecil dan neraca digital

untuk menimbang bahan dengan bobot yang lebih besar. Selain itu, dilengkapi pula dengan

rak-rak tempat meletakkan botol-botol atau kaleng-kaleng bahan kimia yang tidak mudah

26

rusak pada suhu kamar, sedangkan bahan-bahan yang peka terhadap suhu tinggi, misalnya

beberapa jenis zat pengatur tumbuh disimpan di dalam lemari pendingin atau di dalam freezer.

Penimbangan bahan-bahan kimia dan eksplan hendaknya dilakukan seteliti mungkin di

dalam ruangan khusus yang bebas dari hembusan angin yang sedikit saja dapat menyebabkan

pergerakan pada angka penunjuk pada timbangan.

G.Ruang Aklimatisasi

Ruang aklimatisasi adalah ruangan untuk menempatkan tanaman-tanaman mini

(planlet) hasil perbanyakan melalui kultur jaringan sebelum dipindahkan ke lapangan. Di

dalam ruang atau area aklimatisasi ini, tanaman mini akan mengalami masa-masa penyesuaian

diri dengan keadaan in vivo, terutama terhadap suhu dan kelembaban yang yang jauh berbeda

dari keadaan in vitro. Oleh karena itu, suhu dan kelembaban di dalam ruang aklimatisasi perlu

mendapat perhatian yang serius. Suhu diusahakan lebih rendah daripada keadaan lapangan,

namun lebih tinggi dari keadaan in vitro, sedangkan kelembaban udara diatur antara 80-90%.

Agar keadaan demikian bisa diperoleh, maka di dalam ruang aklimatisasi perlu dibuat

naungan dari plastik sehingga intensitas cahaya yang masuk tidak terlampau tinggi dan suhu

pun cukup rendah. Oleh karena itu, pada ruangan ini ditempatkan termometer udara dan

higrometer untuk memantau kondisi optimal. Selain itu, untuk mengendalikan kelembaban

ruangan ini dapat dilengkapi dengan bak-bak air atau pipa-pipa sprinkler.

4.3 Alat-Alat dalam Teknik Kultur Jaringan

Dalam penerapan teknik kultur jaringan, laboratorium harus dilengkapi dengan berbagai

peralatan. Berikut ini adalah beberapa peralatan dasar yang dibutuhkan dalam pelaksanaan

kultur jaringan. Perlu diketahui bahwa peralatan-peralatan tersebut dapat disederhanakan

untuk pelaksanaan kultur jaringan skala rumah tangga, sepanjang pada prinsipnya peralatan

tersebut dapat menjalankan fungsi yang relatif sama.

1. Pengukur keasaman medium (pH meter)

Untuk mengukur keasaman medium dapat menggunakan pH meter.

27

2. Autoklaf

Pada umumnya kita mengenal 2 macam autoklaf, yaitu autoklaf yang menggunakan

sumber panas dari tenaga listrik yang disebut dengan autoklaf listrik. Ada juga autoklaf

yang menggunakan sumber panas dari pembakaran dari gas elpiji yang disebut dengan

autoklaf gas. Cara pengoperasian autoklaf listrik relatif mudah dan sederhana, namun

tergantung pada modelnya. Sekarang tersedia berbagai model dan ukuran autoklaf listrik

untuk berbagai keperluan dengan cara pengoperasian yang relatif sama dan aman.

Sedangkan autoklaf gas meskipun kelihatannya sederhana, namun dalam

pengoperasiannya harus lebih hati-hati karena menggunakan gas yang dikhawatirkan

mengalami kebocoran. Lagipula, sterilisasi bahan dan alat dengan autoklaf ini harus

senantiasa ditunggu karena tidak ada pengatur otomatis untuk lamanya sterilisasi

(semuanya diatur secara manual).

3. Laminar Air Flow Cabinet (LAFC)

Alat ini digunakan sebagai tempat untuk menanam eksplan. Disebut laminar air flow

cabinet karena ke dalamnya dialirkan angin dengan arah lurus (laminar) ke arah luar agar

menghembus spora-spora jamur yang mungkin beterbangan sehingga tida memasuki botol

kultur pada saat penanaman. Adapun cara pemakaian alat ini adalah sebagai berikut:

Sebelum dipakai, terlebih dahulu bagian dalam alat ini disemprot dengan alkohol

70%.

Setelah sterilisasi dengan alkohol, tutup pintu LAFC dan nyalakan lampu

ultraviolet (UV).

Setelah sterilisasi dengan lampi UV, pekerjaan menanam eksplan dapat segera

dimulai. Jangan lupa mematikan lampu UV dan menyalakan lampu neon, serta

menghidupkan kipas.

4. Neraca Analitik

Neraca analitik digunakan untuk menimbang bahan-bahan yang memiliki bobot dalam

jumlah yang kecil. Biasanya kapasitas maksimum hanya ± 600 mg dengan 4-5 digit angka

di belakang koma.

28

5. Hot plate dengan pengaduk bermagnet

Alat ini berfungsi sama dengan kompor, yakni untuk memasak dan memanaskan medium

dalam pembuatan media padat. Akan tetapi, selain memanaskan alat ini sekaligus dapat

mengaduk medium yang dimasak karena dilengkapi dengan magnetic stirrer (pengaduk

bermagnet).

6. Meja penggocok

Meja pengocok (shaker) adalah suatu alat yang sering digunakan pada kultur dengan

medium cair. Fungsi alat ini adalah sebagai meja penggocok untuk memberikan aerasi

yang baik pada media kultur.

7. Mikroskop/ fotomikrografi

Mikroskop ini penting untuk mengamati struktur mikroskopis seperti anatomi jaringan

tanaman, jaringan kalus yang tumbuh dari eksplan, ataupun struktur dari sel dan

mikrospora. Selain berfungsi untuk pengamatan biasa, objek yang berada di bawah lensa

dapat direkam atau difoto untuk keperluan dokumentasi atau sebagai bagian dari data

percobaan karena mikroskop ini dilengkapi dengan kamera.

8. Mikroskop diseksi

Mikroskop diseksi ini berfungsi untuk mengamati struktur kalus ataupun keadaan kultur

yang lebih jelas. Selain itu, alat ini sering digunakan pada kultur meristem, yakni sebagai

alat bantu dalam memotong atau mendapatkan meristem.

9. Distilator

Distilator merupakan alat yang digunakan untuk membuat aquadest atau biasa disebut

sebagai alat penyuling.

4.4 Bahan yang digunakan dalam Kultur Jaringan

29

Pada dasarnnya Pembiakan tanaman secara in vitro terdiri atas 4 kegiatan utama, yaitu

pembuatan media, sterilisasi eksplan, penanaman eksplan, dan tahap terakhir adalah

aklimatisasi. Secara umum bahan-bahan yang digunakan untuk setiap tahapan tersebut adalah

sebagai berikut:

a. Bahan untuk Pembuatan Media

• Bahan-bahan kimia untuk membuat media (jenis dan komposisi akan dijelaskan pada

sub bab lain)

• Gula

• Agar

• Aquadest

b. Bahan untuk Sterilisasi Eksplan

• Eksplan

• Aquadest

• Fungisida

• Bakterisida

• HgCl2

• Klorox/pemutih pakaian

• Alkohol

c. Bahan untuk Penanaman (Inokulasi)

• Alkohol

• Aquadest

• Eksplan

d. Bahan untuk Aklimatisasi

• Tanaman

• Air

• Fungisida

• Bakterisida

• Media (Spagnum mos, pakis, arang, sterofom)

30

4.5 Sterilisasi Alat dan Bahan

Salah satu pembatas dalam keberhasilan kultur jaringan adalah kontaminasi yang dapat

terjadi pada setiap saat dalam masa kultur. Kontaminasi dapat berasal dari eksplan, organisme

kecil yang masuk ke dalam media, lingkungan kerja dan ruang kultur yang kotor, kecerobohan

dalam pelaksanaan serta botol kultur atau alat-alat tanam yang kurang steril. Keanekaragaman

sumber kontaminasi menyebabkan prosedur aseptik yang harus diperhatikan meliputi:

sterilisasi lingkungan kerja, sterilisasi bahan tanam dan sterilisasi alat-alat dan media. Alat-alat

dan aquadest yang digunakan yang digunakan dalam penanaman harus dalam keadaan steril.

Alat-alat logam, gelas dan aquadest dapat disterilkan dalam autoklaf. Temperatur yang

digunakan untuk sterisasi adalah 121oC pada tekanan 17,5 psi (pounds per square inch) selama

1 jam. Perhitungan waktu sterilisasi dimulai setelah tekanan yang diinginkan tercapai.

Sterilisasi alat adalah proses mematikan bakteri, spora, cendawan dan virus. Sebelum

melakukan penanaman kultur jaringan, hal yang perlu dilakukan terlebih dahulu adalah

melakukan sterilisasi pada alat-alat logam dan gelas. Adapun alat-alat yang perlu disterilkan

sebelum penanaman yaitu pinset, gunting, gagang skapel, kertas saring, Petridish, dan botol-

botol.Alat-alat tersebut dapat disterilkan dengan menggunakan autoklaf. Alat tanam seperti

pinset dan gunting dapat juga disterilkan dengan pembakaran atau dengan pemanasan dalam

bacticinerator. Khusus untuk skapel, gagangnya dapat disterilkan dengan pemanasan, namun

pisaunya dapat menjadi tumpul bila dipanaskan dengan temperatur yang sangat tinggi. Bila

botol akan disimpan untuk beberapa lama, maka sewaktu sterilisasi mulut botol harus ditutup

dengan aluminium foil.

Autoklaf yang dapat digunakan ada bermacam-macam, mulai dari yang sederhana sampai

yang dapat diprogram. Autoklaf yang sederhana menggunakan sumber uap dari pemanasan air

yang ditambahkan ke dalam autoklaf. Kelemahan autoklaf ini yaitu perlu dilakukan penjagaan

dan pengaturan panas selama masa sterilisasi dilakukan secara manual. Tetapi autoklaf ini

mempunyai keuntungan yaitu, alat ini lebih sederhana, harga relatif murah, dan tidak

tergantung pada aliran listrik.

4.6 Sterilisasi Peralatan

31

Ada beberapa teknik yang dapat digunakan untuk sterilisasi alat-alat yang digunakan

dalam kultur jaringan seperti misalnya gelas, erlemeyer, alat pemotong, alat menanam,

cairan/larutan, bahan-bahan kimia, dan eksplan tanaman yang akan dikulturkan. Media dan

semua peralatan yang akan digunakan dalam kultur jaringan harus dalam keadaan steril. Jika

semua alat dan bahan tidak dalam keadaan steril, maka seluruh media akan tercemar oleh

jamur dan bakteri yang dapat mematikan eksplan yang diinisiasi atau sedang tumbuh. Ada

beberapa macam sterilisasi yang dapat dilakukan, namun jenis atau macam sterilisasi yang

digunakan tergantung dari alat dan bahan yang akan disterilisasi. Beberapa macam proses

sterilissasi misalnya adalah sterilisasi kering, sterilisasi basah, filtrasi, kimiawi, secara fisik

dengan ultra violet, maupun dengan teknik pendinginan dan pemanasan.

Beberapa jenis atau macam proses sterilisasi beserta contoh-contohnya akan dibahas di

bawah ini dan seyogyanya masih banyak cara lain yang bisa dilakukan dengan pencampuran

atau proses sterilisasi bertahap, sebagai berikut:

a. Sterilisasi kering

Sterilisasi kering ini hanya dapat digunakan untuk alat-alat yang terbuat dari logam atau

bahan lain yang tidak rusak dalam pemanasan dan temperatur tinggi. Metode ini juga dapat

digunakan untuk sterilisasi gelas dan juga botol-botol. Alat-alat yang berisi kapas, kertas atau

plastik tidak dapat disterilisasi dengan metode ini. Alat-alat lain yang dapat disterilisasi

dengan metode pemanasan kering ini adalah skalpel, pisau dan pinset.

Metode sterilisasi dengan pemanasan kering ini dilakukan dengan menggunakan oven

pengering. Temperatur yang digunakan pada sterilisasi ini kira-kira 160o C selama 3-4 jam.

Alat-alat yang akan disterilkan terlebih dahulu harus dibungkus dengan menggunakan

aluminium foil atau kertas. Setelah alat-alat tersebut dibungkus, barulah dimasukkan ke dalam

oven. Cara lain yaitu dengan membakar alat yang terbuat dari logam pada api bunsen hingga

berwarna merah, kemudian dicelupkan ke dalam alkohol dan dibakar kembali sebanyak 3 kali,

metode ini biasanya dilakukan di dalam Laminair Air Flow Cabinet pada waktu penanaman

eksplan.

32

b. Sterilisasi dengan pemanasan basah

Metode sterilisasi dengan pemanasan basah dapat dilakukan dengan alat autoklaf.

Autoklaf bekerja dengan menggunakan tenaga uap. Standar teknis untuk sterilisasi ini adalah

tekanan uap 17,5 psi dengan temperatur 121oC selama 15-20 menit. Pada waktu

mengoperasikan autoklaf jangan tergesa-gesa menutup klep pembuang sebelum semua udara

yang ada di dalam autoklaf tergantikan oleh uap air yang mendidih, yaitu agar temperatur

121oC dapat tercapai. Setelah 15- 20 menit klep pembuang dibuka pelan-pelan. Tekanan uap

di dalam autoklaf pelan-pelan akan sama dengan tekanan atmosfir. Pembukaan klep pembuang

yang tergesa-gesa dapat menyebabkan cairan atau media yang ada dalam botol akan tumpah

keluar. Penggunaan autoklaf lebih dari 20 menit dapat merusak bahan-bahan kimia yang ada

di dalam media.

Media dan aquades yang akan digunakan dalam kultur jaringan juga disterilisasikan

dalam autoklaf. Untuk aquades sebaiknya dimasukkan dalam wadah kecil misalnya

Erlenmeyer 250 ml dengan isi maksimum 100 ml, agar sterilisasi lebih efektif.

c. Sterilisasi dengan ultrafiltrasi

Komponen media memiliki sifat yang berbeda-beda. Ada beberapa komponen media yang

menjadi tidak stabil bila terkena panas yang terlalu tinggi sehingga harus disterilisasi dengan

ultrafiltrasi pada suhu ruangan. Dengan menggunakan ultraviltrasi, larutan yang berisi bahan-

bahan yang termolabil disterilkan terlebih dahulu dan kemudian dapat disimpan atau langsung

digunakan. Bahan hasil filtrasi dimasukkan ke dalam media agar-agar yang telah disterilisasi

terlebih dahulu dengan menggunakan autoklaf. Hal ini dikerjakan bila media agar-agar sudah

agak dingin, tetapi belum memadat.

Ada beberapa jenis ultrafiltrasi yaitu, nukleopore filter dibuat dari polyetilen, film sekali

pakai terus dibuang. Ada juga Millipore filter yang dapat dipakai berulang-ulang

(autoclavable). Porositasnya berbeda-beda, ada yang 0,22 mikron, ada yang 0,45 mikron.

Untuk larutan yang jumlahnya sedikit dapat dengan mudah disterilisasi dengan nukleopore

filter yang dipasangi siringe ( alat injeksi). Dalam jumlah besar, sterilisasi dengan metode ini

sulit dan mahal. Tidak ada rekomendasi soal baik tidaknya untuk digunakan dalam

laboratorium untuk produksi dalam skala yang besar.

33

d. Sterilisasi dengan bahan kimia

Metode yang sederhana untuk sterilisasi untuk substansi yang termolabil dengan alkohol

70% atau 95%. Larutan ini dapat berfungsi sebagai bahan sterilisasi yang baik. Hasil

penelitian menunjukkan bahwa penambahan 5 ml alkohol 70% per liter pada media tidak

menimbulkan efek yang merugikan pada kultur. Sterilisasi permukaan pada ruang kerja

laboratorium juga dapat dilakukan dengan melap permukaan tersebut dengan alkohol 70%.

Kontaminasi bakteri pada kultur jaringan umumnya bersifat internal. Menurut Santoso

dan Nursandi (2003) bakteri internal yang terdapat dalam eksplan, dimana umumnya sudah

terjadi induksi kalus. Salah satu metode untuk menangani kontaminasi yang sangat tinggi

adalah dengan penggunaan bahan kimia yang mempunyai kemampuan untuk menghambat dan

membunuh bakteri (Pierik, 1987).

e. Sterilisasi dengan menggunakan lampu UV (Ultraviolet)

Sterilisasi dengan menggunakan lampu UV biasanya dilakukan untuk mensterilkan

ruangan kultur jaringan dan juga laminar air flow. Ada beberapa tipe laminar air flow cabinet

yang dilengkapi dengan lampu ultra violet. Sebelum melakukan kegiatan kultur, lampu ultra

violet dinyalakan selama beberapa waktu antara yaitu sekitar 1 jam, namun juga terdapat tipe

laminair yang hanya membutuhkan waktu sekitar 15 menit untuk mematikan kontaminan

dipermukaan tempat kerja. Laminar air flow cabinet harus dijaga sebersih mungkin. Setelah

bekerja, permukaan tempat kerja dibersihkan dengan alkohol 70% atau dengan lampu ultra

violet selama 1-2 jam.

4.7 Sterilisasi Eksplan

Teknik aseptik merupakan salah satu kunci keberhasilan dalam kutur jaringan.

Keaseptikan harus dijaga dalam proses pengkulturan, selain itu juga termasuk sterilisasi bahan

tanaman (eksplan). Pada tahap ini dilakukan berbagai perlakuan untuk membersihkan kotoran

yang ada di permukaan bahan tanaman (disinfektasi).

Dari semua bahan kontaminasi, yang paling sulit diatasi adalah yang berasal dari eksplan.

Oleh karena itu, dalam memilih suatu metode sterilisasi haruslah selektif, kita hanya

mengeliminasi jamur dan bakteri yang tidak diinginkan dengan gangguan seminimal mungkin

34

terhadap bahan eksplan. Pada prinsipnya, sukar untuk menentukan suatu metode baku yang

berlaku untuk semua jenis tanaman dan semua bagian tanaman. Secara garis besar ada

ketentuan umum, namun secara spesifik metode sterilisasi yang paling tepat akan diperoleh

dari trial and error. Cara penanganan bagaimana tanaman yang lunak akan sangat berbeda

dengan bagian tanaman yang keras ataupun biji yang memiliki kulit keras.

Untuk menghilangkan sumber infeksi, bahan tanaman harus disterilkan sebelum di

tanamkan pada medium tumbuh. Jaringan ataupun organ yang terinfeksi oleh jamur atau

bakteri sistemik hendaknya dibuang. Problem terbesar yang dihadapi dalam pekerjaan

sterilisasi oleh para tissue culturist adalah kontaminasi mikroba pada kultur, baik oleh bakteri

maupun jamur. Ada 2 cara yang dapat digunakan untuk mengurangi kontaminasi pada kultur

jaringan, yaitu dengan menggunakan metode fisik dan metode kimiawi. Metode fisik

ditujukan untuk mengatasi kontaminasi mikroba dengan mengurangi populasi mikroba yang

ada menempel pada eksplan ataupun berada di dalam eksplan (endogenous). Beberapa cara

yang ada tersebut meliputi:

1. Mengekspos tanaman induk dengan kondisi kekeringan selama 3-4 minggu sebelum kultur

jaringan dimulai. Tanaman diberi air yang cukup, dipupuk, dan diberi pestisida atau

fungisida jika itu perlu untuk dilakukan. Kelebihan air perlu dihindari agar tanaman tidak

busuk.

2. Pada saat milai kultur jaringan, tanaman dicuci sampai bersih dan bagian yang tidak akan

dikulturkan segera dibuang. Pembersihan meliputi pencucian, penggosokan merata untuk

membuang semua partikel tanah dan jaringan yang mati, termasuk membuang sebagian

besar daun mengingat kebanyakan daun tidak digunakan dalam kultur. Bahan tanaman

kemudian dicuci di bawah air mengalir selama 20 menit sampai beberapa jam, tergantung

sumber bahan tanaman. Langkah ini sama artinya dengan membuang jutaan mikroba.

Metode sterilisasi secara kimia dapat dilakukan dengan larutan sodium hypochlorite

(NaOCl). Kebanyakan laboratorium menggunakan bleach (pemutih) yang mengandung 4%

klorin. Larutan pemutih 25 ml ang dibuat menjadi 100 ml dengan penambahan air distilasi

akan memberi konsentrasi 1% klorin. Karena kemurniannya, hypochlorite memiliki aktifitas

35

yang kecil pada pH melebihi 8,0 dan akan lebih efektif jika pH diatur menjadi 6,0 dengan

menambahkan HCl. Untuk meningkatkan keberhasilan dengan menggunakan klorin, langkah

berikutnya semestinya diikutsertakan:

a. Tambahkan deterjen ke larutan klorin misalnya beberapa tetes Tween-20 atau Triton.

b. Berikan sedikit tekanan pada perlakuan klorin. Ini dapat dilakukan dengan desikator

vakum yang disambungkan ke air atau pompa tipe lain.

c. Goyang-goyangkan (agitasi) larutan klorin secara manual atau dengan menggunakan

shaker selama periode disinfektasi.

Perlakuan tersebut akan meningkatkan kontak tanaman dengan larutan klorin. Lama

perlakuan dengan larutan berbeda-beda, tergantung tipe dan sensitivitas bahan tanaman.

Larutan klorin dapat membunuh mikroorganisme eksternal, namun tidak dapat mematikan

mikroorganisme internal (endogenus) dalam jaringan tanaman. Beberapa laboratorium

menggunakan antibiotik untuk membunuh kontaminan endogenus. Meskipun antibiotik rutin

digunakan dalam kultur jaringan hewan, penggunaannya pada kultur jaringan tanaman kurang

berhasil. Tidak ada antibiotik yang efektif untuk membunuh semua mikroorganisme penyebab

kontaminasi. Antibiotik dan produk-produk turunannya di metabolisme oleh jaringan tanaman

dengan hasil yang tidak dapat diperkirakan, jadi penggunaan antibiotik sebaiknya dihindari,

karena berbahaya untuk mengembangkan sistem kultur jaringan yang didasarkan atas

penambahan antibiotik ke dalam media. Alasannya adalah sebagai berikut:

a. Tanaman yang dihasilkan mungkin masih memiliki kontaminan endogenus.

b. Dengan menggunakan antibiotik spesifik akan dapat dihasilkan mutan tertentu

yang tidak dapat dikontrol dengan produk spesifik kimia.

c. Kontaminan non patogenik dapat menjadi patogenik, bisa karena mutasi atau fisik.

Sesungguhnya bakteri non patogenik yang berada pada kondisi tanpa kompetisi

dengan bakteri lain dapat berubah menjadi patogenik ganas.

d. Problem kamuflase in vitro bisa menjadi problem di kemudian hari pada kultur

(misalnya layu bakteri atau spot).

36

e. Kontaminasi bakteri dapat menjadi problem pada akhir proses perbanyakan mikro,

misalnya untuk sulit menghasilkan akar pada tunas yang terkontaminasi.

Langkah sterilisasi eksplan secara kimiawi adalah sebagai berikut:

a. Siapkan tunas muda tanaman.

b. Rendam dalam larutan fungisida dan bakterisida.

c. Rendam ke dalam larutan desinfektan (Chlorox/klorin).

d. Cuci dengan air steril hingga bersih dari desinfektan.

e. Tanaman dalam media inisiasi tunas in vitro.

Penggunaan merkuri klorida (HgCl2) telah terbukti efektif untuk sterilisasi bahan tanaman

yang berasal dari lapangan. Roy et al., (1990) menggunakan 0,5% HgCl2 sebagai bahan

sterilisasi eksplan nodus tanaman nangka dengan hasil yang memuaskan sedangkan Hadiyono

dan Zulkarnain (1991) menggunakan 0,05% HgCl2 untuk sterilisasi eksplan nodus tanaman

lada dengan hasil baik. Meskipun demikian, penggunaan HgCl2 merupakan pilihan terakhir

jika bahan-bahan lain ternyata tidak mampu memusnahkan mikroorgnisme yang menginfeksi

bahan tanaman. Hal itu dikarenakan sifat senyawa tersebut yang sangat beracun sehingga

memerlukan penanganan yang sangat berarti. Jika menggunakan HgCl2, sisa larutannya harus

dikumpulkan dalam suatu wadah kemudian dibuang di suatu tempat yang tidak akan

mencemarkan sumber air minum (jangan dibuang ke dalam wastafel).

Etil dan isopropil alkohol dapat pula digunakan untuk sterilisasi bahan tanaman. Setelah

direndam dalam etanol selama beberapa detik, bahan eksplan dapat dibiarkan terbuka di dalam

laminair air flow cabinet sampai semua alkohol menguap (Kao dan Michayluk, 1980) atau

dapat dibakar (Bhojwani, 1980). Etil alkohol dinyatakan kurang efektif untuk sterilisasi

eksplan tunas Coffea arabica dibandingkan dengan campuran fungisida-antibiotik-sticker

(Saldana et al.,1993). Hasil yang sama diperoleh pada tanaman Guichenotia macranatha,

hanya 90% dari eksplan biji yang bebas dari kontaminasi, sedangkan penggunaan natrium dan

kalsium hipoklorit mencapai 100% (Zulkarnain,1995).

Pada umumnya, jika eksplan yang digunakan keras dan cukup besar maka dapat segera

disterilisasi dengan disinfektan. Pada kultur biji atau endosperm dewasa tanaman

37

Euphorbiaceae, sterilisasi dilakukan terhadap seluruh biji atau biji-biji yang dikupas. Bilam

ovul, embrio, atau endosperm muda yang akan dikulturkan maka metode yang dipakai adalah

mensterilkan ovari atau ovul dan mengambil eksplan di bawah kondisi aseptik, sehingga

jaringan inokulum yang lunak terlindung oleh bahan sterilisasi yang bersifat racun. Sama

halnya denga kultur antera, tunas bunga disterilkan dan eksplan antera diisolasi secara

aseptik. Eksplan tersebut biasanya bebas dari kontaminasi jasad renik (Quak, 1977;

Zulkarnain, 2003).

Perendaman bahan tanaman dalam etanol 70% selama 30 detik sebelum disterilisasi atau

penambahan beberapa tetes surfaktan, seperti Triton-R, Tween 20, atau Tween 80 dapat

meningkatkan efektifitas bahan sterilisasi tersebut. Setelah perlakuan sterilisasi, bahan

tanaman harus dibilas dengan air steril 3 atau 4 kali untuk menghilangkan sisa-sisa bahan

sterilisasi (Quak, 1997). Beberapa bahan kimia yang dapat digunakan untuk sterilisasi eksplan,

beserta konsentrasi yang digunakan dan lama perendamannya disajikan pada Tabel 2.

Tabel 2. Bahan kimia yang digunakan untuk sterilisasi eksplan, konsentrasi, dan lama

perendaman

No Bahan Konsentrasi Lama

Perendaman

1 Kalsium hipoklorit 1-10% 5-30 menit

2 Natrium hipoklorit 1-2% 7-15 menit

3 Hidrogen peroksida 3-10% 5-15 menit

4 Perak nitrat 1,0% 5-30 menit

5 Merkuri klorida 0,1- 0,2% 10-20 menit

6 Gas klorin - 60-240 menit

7 Betadine 2,5-10 % 5-10 menit

8 Benlate 2 gram/l 20-30 menit

9 Antibiotik 50 mg/l 30-60 menit

10 Alkohol 70% ½-1 menit Sumber: Zulkarnain,2009. Kultur Jaringan Tanaman

Berikut ini adalah prosedur dasar yang dapat digunakan dalam sterilisasi eksplan:

1. Bahan sterilisasi

a. Tween 20 atau Tween 80 (dapat pula menggunakan deterjen biasa).

b. Fungisida (Benlate, Benlox atau Dithane M-45)

c. Bakterisida (Agrimycin atau Agrept )

38

d. Ca hipoklorit

e. Na hipoklorit (dapat juga menggunakan Bayclin®,yakni sejenis bahan pemutih

dengan bahan aktif Na hipoklorit 5,25%).

f. AgCl2

g. Betadine

h. Air steril

i. Medium prekondisi (suatu medium tumbuh yang hanya terdiri atas gula dan agar.

2. Alat-alat

a. Cawan Petri steril minimal 7 buah

b. Alat-alat inokulasi (tangkai tambah pisau skalpel dan pinset) yang sudah disterilkan

3. Mempersiapkan larutan bahan sterilisasi

a. Fungisida dan bakterisida

- Timbang bahan sebanyak 0,2 g

- Larutkan dengan air steril 100 ml

- Aduk dan siap digunakan

b. Ca hipoklorit

- Timbang bahan sebanyak 0,2 g

- Larutkan dalam HCl 1 N secukupnya

- Tambahkan air steril hingga volumenya 100 ml

- Aduk dan siap digunakan

c. Na hipoklorit

- Konsentrasi 0,1% dibuat dengan mengambil 1,9 ml bayclin lalu ditambahkan

aquadest sampai volume 100 ml

- Konsentrasi 0,5% dibuat dengan mengambil 9,5 ml bayclin, lalu ditambahkan


- Konsentrasi 1,0 % dibuat dengan mengambil 19 ml bayclin, lalu ditambahkan


- Larutan ini harus dibuat setiap kali melakukan sterilisasi dan langsung

digunakan karena Cl2 mudah menguap.

d. AgCl2

39

- Timbang bahan sebanyak 0,05-0,1 g

- Larutkan dengan 100 ml air steril lalu aduk hingga larut dan merata

- Tutup dengan plastik atau kertas steril (jangan menggunakan aluminium foil,

karena akan menimbulkan reaksi)

- Siap digunakan

e. Betadine:

- Pipet bahan sebanyak 0,25 – 0,50 ml

- Larutkan dalam air steril 100 ml

- Siap digunakan

4. Mempersiapkan bahan tanaman

a. Bagian tanaman (pucuk, bunga, umbi atau biji) dicuci bersih pada air mengalir.

Buang bagian-bagian yang tidak diperlukan, seperti daun-daun tua, pelepah, dan

daun-daun robek. Bagian yang sudah bersih direndam berturut-turut di dalam

fungisida dan bakterisida yang diberi tetes Tween-20 atau Tween 80 selama 30-60

menit tergantung pada bagian tanaman. Umbi atau rimpang dapat direndam

selama 60 menit. Bila yang digunakan adalah biji-biji yang cukup besar, perlu

direndam dalam deterjen encer kira-kira 10 menit, sedangkan pada biji-biji yang

sangat halus, langkah ini dapat dihilangkan. Apabila kontaminasi dinilai cukup

berat maka dapat diberi perlakuan tambahan dengan perendaman di dalam Ca

hipoklorit 0,2%.

b. Bilas dengan air steril dan potong menjadi bagian-bagian yang lebih kecil yang

dapat masuk ke dalam cawan Petri atau gelas piala 250 ml.

c. Rendam dalam larutan antibiotik (betadine) selama 60 menit.

d. Tahap berikutnya dilakukan dalam LAFC dengan beberapa alternatif sterilisasi

antara lain:

1. Alternatif pertama:

- Masukkan bahan tanaman ke dalam cawan Petri steril atau botol steril

tergantung ukuran eksplan yang digunakan.

- Tuangkan larutan Na hipoklorit 1,0 % dalam cawan Petri sampai bahan

tanaman terendam dan dibiarkan selama 5 menit.

40

- Bilas dengan air steril selama 5 menit

- Rendam dalam larutan betadine 3-5 menit

- Bilas 2 kali dengan air steril masing-masing 5 menit. Eksplan siap ditanam

2. Alternatif kedua:

- Masukkan bahan tanaman ke dalam Na hipoklorit 1,0% selama 5 menit

- Bilas dengan air steril selama 5 menit

- Rendam dalam larutan AgCl2 0,05-0,1 % selama 30 menit

- Bilas 3 kali dengan air steril masing-masing 5 menit. Eksplan siap ditanam.

3. Alternatif ketiga sterilisasi biji dengan kulit biji keras;

- Rendam biji dengan deterjen encer selama 15 menit

- Bilas dengan air steril

- Di dalam LAFC, biji-biji tersebut direndam dengan Na hipoklorit 1,0%

selama 15 menit

- Bilas 2 kali dengan air steril masing-masing 5 menit

- Rendam dalam larutan selama 5 menit

- Bilas 2 kali dengan air steril masing-masing 5 menit.

- Eksplan siap tanam pada medium 0 (tanpa zat pengatur tumbuh).

4.8 Laboratorium Biosafety

Laboratorim diagnostic dan pelayanan kesehatan ( kesehatan masyarakat, klinik/rumah

sakit)semuanya harus dirancang untuk tingkat I Biosafety 2 atau di atasnya. Oleh karena tidak

ada laboratorium yang memiliki pengendalian lengkap untuk setiap specimen yang diterima,

maka pegawai laboratorium mungkin saja secara tidak sengaja dan tidak diinginkan tercemar

organisme dari kelompok resiko yang lebih tinggi dari yang diduga. Kemungkinan ini harus

diwaspadai dan dikenali. Dibeberapa Negara, akreditasi laboratorium klinis diperlukan. Secara

global, tindakan pencegahan umum harus dipakai dan diterapkan.

Peraturan untuk laboratorium dasar – Biosafety tingkat 1 dan 2 yang akan dijelaskan

merupakan dasar untuk semua tingkatan laboratorium. Pedoman untuk laboratorium terkendali

– Biosafety tingkat 3 dan laboratorium dengan pengendalian maksimum – Biosafety tingkat 4

merupakan modifikasi dan tambahan dari peraturan pada laboratorium ini, yang dirancang

untuk pekerjaan yang lebih berbahaya.

41

A. Aturan baku

Aturan baku laboratorium merupakan aturan dan prosedur dasar untuk mempraktekkan

teknik-teknik yang baik. Pada banyak laboratorium nasional aturan baku ini digunakan untuk

mengembangkan prosedur dan praktek tertulis untuk pengoperasian laboratorium yang aman.

Setiap laboratorium harus mengadopsi sebuah “pedoman keselamatan atau pedoman

operasional” yang mengidentifikasi bahaya yang telah diketahui dan potensinya , praktek dan

prosedur yang rinci umtuk menghilangkan atau meminimalisasi bahaya yang mungkin ada.

Teknik mikrobiologi yang baik menjadi dasar untuk keselamatan laboratorium merupakan hal

yang utama walaupun adanya peralatan laboratorium yang baik bisa membantu untuk

peningkatan keselamatan. Ketentuan-ketentuan yang paling penting adalah sebagai berikut:

a. Jalan masuk

1. Symbol dan tanda peringatan bahan biologi berbahaya skala internasional dan

tandanya harus dipasang pada pintu dari ruangan dimana mikroorganisme dari

kelompok resiko 2 atau tingkat di atasnya digunakan.

2. Hanya orang yang berkepentingan diizinkan masuk ke daerah kerja laboratorium.

3. Pintu laboratorium harus selalu ditutup.

4. Anak-anak dibawah umur 16 tahun tidak diizinkan memasuki daerah kerja

laboratorium.

5. Akses untuk hewan peliharaan harus secara khusus diberikan kepada orang yang

berkepentingan.

6. Hewan yang tidak terlibat dalam kerja laboratorium tidak diperbolehkan ada di

laboratorium.

7. Peringatan “ Dilarang merokok”, “ Dilarang makan”, “Dilarang minum”, harus

diletakkan dengan jelas di dalam dan di luar laboratorium.

b. Proteksi diri

1. Jas laboratorium dan seragam yang ditetapkan harus selalu dipakai setiap bekerja

di dalam laboratorium.

42

2. Sarung tangan yang tepat harus dipakai untuk semua prosedur yang melibatkan

kontak langsung maupun tidak langsung dengan darah, materi infeksius atau

hewan infeksius. Setelah digunakan, sarung tangan harus dipindahkan tanpa

kontak dengan apapun dan harus mencuci tangan.

3. Pekerja harus mencuci tangan setelah menangani bahan-bahan infeksius dan

hewan, dan sebelum sebelum mereka meninggalkan daerah kerja laboratorium.

4. Harus menggunakan kacamata pelindung, pelindung wajah (visors) atau peralatan

pelindung lainnya jika diperlukan perlindungan mata dan wajah dari percikan,

objek bergerak dan sumber radiasi ultraviolet.

5. Dilarang memakai pakaian laboratorium diluar laboratorium, misal: kantin, ruang

minum kopi, kantor perpustakaan, ruang pegawai, dan kamar kecil (toilet).

6. Alas kaki terbuka dilarang dipakai di dalam laboratorium.

7. Tidak diperbolehkan di dalam daerah laboratorium untuk makan, minum,

memakai kosmetik, dan membersihkan atau melepaskan lensa kontak.

8. Tidak diperbolehkan untuk menyimpan makanan manusia dan minuman di

manapun di daerah kerja laboratorium.

9. Pakaian perlindungan laboratorium tidak boleh disimpan di laci atau lemari yang

sama dengan pakaian sehari-hari.

c. Prosedur

1. Penggunaan pipet dengan mulut dilarang sama sekali.

2. Materi tidak boleh ditempatkan di mulut. Label materi tidak boleh dijilat.

3. Semua prosedur pelaksanaan teknis harus dilakukan sedemikian rupa sehingga

meminimalkan pembentukan aerosol dan butiran.

4. Jika ada peningkatan pembentukan aerosol, pekerjaan harus dilakukan di dalam

cabinet Biosafety.

5. Penggunaan jarum hipodermik dan jarum suntik harus dibatasi. Benda-benda ini

tidak boleh digunakan sebagai pengganti pipet atau untuk keperluan lain selain

untuk injeksi parenteral atau aspirasi cairan dari hewan laboratorium.

6. Prosedur tertulis untuk pembersihan tumpahan harus dibuat dan ditaati.

43

d. Daerah kerja laboratorium

1. Laboratorium harus dijaga tetap rapi, bersih dan bebas dari bahan-bahan yang

tidak diperlukan dalam pekerjaan.

2. Seluruh permukaan kerja harus didekontaminasi setelah terjadi tumpahan dari

materi yang potensial berbahaya dan setiap akhir hari kerja.

3. Semua materi terkontaminasi, specimen dan kultur harus didekontaminasi sebelum

dibuang atau dibersihkam untuk dipakai kembali.

4. Pengemasan dan transportasi harus mengikuti peraturan nasional dan/atau

internasional.

5. Jendela yang dapat dibuka, harus dilengkapi dengan saringan anti artropoda.

e. Manajemen Biosafety

1. Direktur atau pimpinan laboratorium bertanggung jawab untuk memastikan

penyusunan dan adopsi dari rencana manajemen Biosafety dan operasi manual

yang aman.

2. Penyelia laboratorium (yang akan melapor pada direktur) harus memastikan

bahwa pelatihan pada keselamatan laboratorium diberikan secara rutin.

3. Staf harus diberi pengarahan mengenai bahaya tertentu dan diharuskan untuk

membaca petunjuk keselamatan dan mengikuti prosedur praktek standar. Penyelia

laboratorium harus memastikan semua staf mengerti dan memahami hal ini.

Salinan petunjuk opersional atau keselamatan kerja harus tersedia di laboratorium.

4. Jika perlu, harus ada program pengendalian hewan pengerat (rodensia) dan

arthropoda.

5. Evaluasi medis, kerentanan dan pengobatan yang memadai harus diberikan untuk

setiap staf jika doperlukan dan catatan medis yang memadai harus selalu disimpan

dengan baik.

6. Sampel serum dapat dikoleksi dari petugas laboratorium. Sampel ini harus

disimpan dengan baik sesuai dengan pedoman setempat atau pedoman nasional

44

yang ada. Specimen tambahan harus dikumpulkan secara berkala tergantung pada

organisme yang ditangani dan fungsi dari laboratorium itu sendiri.

B. Rancangan laboratorium dan fasilitasnya

Dalam merancang laboratorium dan menetapkan jenis-jenis pekerjaan yang akan

dilakukan di dalam laboratorium tersebut, harus diberikan perhatian khusus pada kondisi yang

dikenal sebagai penyebab masalah kesehatan dan keselamatan, yang mencakup:

Pembentukan aerosol

Pekerjaan dengan mikroorganisme dalam konsentrasi tinggi dan/atau volume

besar.

Terlalu penuh dan terlalu banyak peralatan.

Serangan hewan pengerat (rodensia) dan arthropoda.

Pintu masuk hanya untuk yang berkepentingan.

Alur kerja: penggunaan sampel yang spesifik dan bahan-bahan pereaksi.

a. Bentuk rancangan:

1. Ruang yang memadai harus tersedia untuk melakukan pekerjaan laboratorium yang

aman dan pembersihan dan pemeliharaan.

2. Dinding, langit-langit dan lantai harus licin, mudah dibersihkan, tahan cairan dan tahan

terhadap bahan kimia dan disinfektan yang biasa digunakan di laboratorium. Lantai

harus anti licin. Jika memungkinkan harus dihindari adanya pipa terbuka dan saluran-

saluran (ducting).

3. Meja laboratorium harus menempel pada dinding, tahan terhadap air dan tahan

terhadap disinfektan, asam, alkali, materi pelarut organic dan panas sedang.

4. Pencahayaan harus cukup untuk semua aktifitas. Refleksi yang mengganggu dan

menyilaukan harus dihindari.

5. Meja laboratorium harus kuat. Ruangan terbuka di antara dan di bawah bangku,

cabinet dan peralatan harus dapat dijangkau untuk memudahkan pembersihan.

45

6. Ruang penyimpanan harus cukup untuk menampung barang-barang yang akan

langsung digunakan. Bagian atas meja kerja dan lorong harus dijaga kerapiannya.

Harus disediakan ruang penyimpanan tambahan untuk jangka panjang dan terletak di

luar daerah kerja laboratorium.

7. Ruang dan fasilitas harus disediakan untuk penanganan dan penyimpanan bahan

pelarut, materiradioaktif dan gas cair serta gas bertekanan yang aman .

8. Fasilitas untuk penyimpanan termasuk jas dan barang-barang pribadi harus disediakan

di luar daerah kerja laboratorium.

9. Fasilitas untuk makan dan minum dan untuk istirahat harus disediakan di luar daerah

kerja laboratorium.

10. Bak cuci tangan kran air yang mengalir, harus disediakan disetiap ruangan

laboratorium, lebih baik apabila diletakkan di dekat pintu keluar.

11. Pintu harus memiliki panel untuk melihat keluar, dapat menutup automatis dan tahan

api.

12. Autoklaf harus tersedia dalam satu bangunan bersama laboratorium.

13. Sistem keamanan harus meliputi api, system elektrik darurat, pancuran darurat dan

fasilitas cuci mata.

14. Tersedia ruang pertolongan pertama pada kecelakaan yang dilengkapi dengan

peralatan yang memadai dan selalu mudah diakses.

15. Tidak ada persyaratan ventilasi untuk penanganan resiko mikroorganisme laboratorium

kelompok resiko 1 dan 2. Namun, untuk perancangan fasilitas baru, harus diperhatikan

mengenai sistem ventilasi mekanik yang menyediakan aliran udara ke dalam tanpa

sirkulasi balik. Jika tidak ada ventilasi mekanik, jendela harus dapat dibuka dan

dilengkapi dengan saringan anti artropoda.

16. Pasokan air berkualitas baik harus tersedia. Tidak disarankan adanya hubungan antara

sumber untuk laboratorium dengan pasokan air minum. Alat anti aliran balik harus

melindungi sistem air publik.

17. Harus tersedia pasokan listrik yang cukup dan peneranngan darurat untukpintu keluar

yang aman. Sebuah generator harus selalu siap untuk memenuhi keperluan berbagai

46

peralatan utama seperti inkibator, kabinet Biosafety , pendingin, dan untuk ventilasi

bagi kandang hewan.

18. Harus ada persediaan gas yang cukup. Instalas gas yang baik juga merupakan satu

keharusan.

19. Tiga aspek pembuangan limbah memerlukan perhatian khusus untuk memenuhi

persyaratan kontrol polusi; (i) autoklaf untuk pengolahan buangan padat memerlukan

rancangan khusus untuk perbaikan berkala, (ii) incinerator harus dirancang khusus,

dilengkapi dengan pembakaran lanjutan dan peralatan deteksi asap, (iii) limbah cair

yang terkontaminasi harus didekontaminasi.

20. Laboratorium dan rumah hewan biasanya merupakan sasaran pengrusakan. Keamanan

terhadap api harus diperhatikan. Diperlukan pintu yang kuat, jendela dengan teralis dan

pemberian kunci harus hanya pada petugas tertentu. Prosedur-prosedur lain harus

dipertimbangkan dan diterapkan untuk meningkatkan keamanan.

b. Peralatan laboratorium

Resiko Biosafety akan dapat diturunkan dengan mempraktekkan prosedur yang baik dan

menggunakan peralatan keselamatan secara baik akan dapat mengurangi resiko biosafety.

Bagian ini membahas prinsip dasar yang berhubungan dengan kesesuaian peralatan untuk

laboratorium pada semua tingkat biosafety. Persyaratan untuk peralatan laboratorium dengan

tingkat biosafety yang lebih tinggi akan dibahas pada bagian yang terkait.

Seorang direktur harus memastikan bahwaperalatan yang memadai telah tersedia dan

dapat digunaka dengan baik. Peralatan harus diseleksi untuk memenuhi beberapa prinsip dasar

sebagai berikut:

Dapat mencegah atau membatasi kontak antara operator dan bahan yang dapat

menginfeksi.

Dibuat dari bahan yang tahan cairan, tahan korosi dan memenuhi persyaratan

kekuatan.

Tidak runcing dan lancip dibagian ujungnya.

Dirancang, dibuat dan dipasang agar mudah untuk digunakan, mudah dipelihara

dan dibersihkan, mudah didekontaminasi dan mudah untuk diuji dalam rangka

47

sertifikasi. Kalau memungkinkan, peralatan tidak dibuat dari gelas atau bahan

yang mudah pecah.

Spesifikasi detil dan pembuatan peralatan sebaiknya dikonsultasikan kepada tenaga ahli

untuk memastikan peralatan tersebut memenuhi kriteria keselamatan.

c. Peralatan Biosafety yang baik

1. Alat bantu pipet diperlukan untuk menghindari pemipetan menggunakan mulut.

2. Kabinet Biosafety , perlu digunakan pada saat:

Menangani bahan yang bersifat infeksius atau menular

Adanya kenaikan resiko infeksi atau penularan lewat udara.

Digunakan prosedur yang mempunyai potensi tinggi untuk memproduksi aerosol;

mencakup sentrifugasi, penggilingan, pencampuran, pengocokan, sonikasi, pembukaan

kontainer dari materi mudah menular yang tekanan dalamnya berbeda dengan tekanan

ruang, inokulasi intranasal hewan dan pemanenan jaringan hewan dan telur yang

tertular.

3. Transfer loops plastik sekali pakai. Sebagai alternative gunakan transfer loop elektrik

di dalam Kabinet Biosafety (KB) untuk mengurangi produksi aerosol.

4. Tabung tertutup ulir dan botol.

5. Autoklaf untuk dekontaminasi bahan infeksius.

6. Pipet Pasteur plastik sekali pakai, jika mungkin hindarkan dari bahan gelas.

7. Peralatan seperti autoklaf dan kabinet keselamatan biologi harus divalidasi dengan

metode yang tepat (biasanya menggunakan penguji bersertifikat) sebelum digunakan.

Sretifikat ulang harus dilakukan secara regular sesuai ketentuan pabrik pembuatnya.

C. Pengawasan kesehatan dan medis

Melalui direktur laboratorium, personil yang berwenang bertanggung jawab untuk

memastikan bahwa staf laboratorium mendapatkan pengawasan yang memadai tentang

48

kesehatannya. Tujuannya adalah untuk mengawasi penyakit yang mungkin diderita. Kegiatan

yang perlu dilaksanakan adalah:

Menyediakan imunisasi aktif atau pasif jika diperlukan.

Memfasilitasi deteksi dini terhadap penyakit menular atau infeksi.

Tidak mengikutsertakan staf dengan tingkat kerawanan yang tinggi (misal wanita

hamil) ke dalam pekerjaan laboratorium berbahaya atau beresiko tinggi.

Menyediakan peralatan perlindungan diri yang efektif dan prosedur-prosedur yang

diperlukan.

c.1. Petunjuk untuk pengawasan pekerja laboratorium yang menangani mikroorganisme

yang beresiko – Kelompok resiko 1

Bukti historis menunjukkan bahwa mikroorganisme ini tidak menyebabkan penyakit pada

manusia atau hewan. Idealnya, semua pegawai laboratorium harus melewati tes kesehatan

pegawai, dimana sejarah kesehatan mereka di catat. Laporan mengenai sakit maupun

kecelakaan di laboratorium sangat diharapkan dan semua anggota staf.harus waspada

terhadap pentingnya memiliki teknik mikrobiologi yang baik.

c.2. Petunjuk untuk pengawasan pekerja laboratorium yang menangani mikroorganisme

yang beresiko – Kelompok resiko 2

1. Tes calon pegawai atau tes sebelum penempatan calon pegawai sangat penting untuk

dilakukan. Sejarah kesehatan seseorang akan dicatat dan direkomendasikan untuk

mengambil sampel serum.

2. Catatan sakit dan absensi harus disimpan oleh manajemen laboratorium ; merupakan

tanggung jawab dari pegawai laboratorium dan penasehat kesehatannya untuk member

I informasi kepada direktur laboratorium tentang absensi karena sakit.

3. Wanita usia produktif harus waspada terhadap ancaman resiko kematian bayi karena

pengaruh mikroorganisme tertentu, misal virus Rubella. Langkah yang tepat untuk

melindungi bayi, akan sangat beragam tergantung mikroorganisme yang digunakan

dalam pekerjaan wanita tersebut.

D. Pelatihan

49

Kesalahan manusia dan teknik yang buruk dapat mempengaruhi perlindungan yang

terbaik yang telah diberikan kepada pekerja laboratorium. Staf ahli keselamatan kerja, yang

memiliki pengetahuan yang baik mengenai pengetahuan dan kontrol terhadap bahaya atau

resiko pekerjaan laboratorium, merupakan faktor kunci untuk perlindungan terhadap infeksi

laboratorium yang mungkin terjadi, insiden dan kecelakaan kerja. Karena itu program

pelatihan lanjut dalam pengukuran keselamatan kerja menjadi sangat penting. Program

keselamatan kerja yang efektif diawali dengan manajer laboratorium, yang memastikan

praktek dan prosedur di laboratorium yang aman terintegrasi pada pelatihan dasar pegawai.

Pelatihan mengenai ukur yang aman merupakan bagian penting dari pengenalan pegawai baru

pada laboratorium. Pegawai harus diperkenalkan pada kode praktis dan peraturan yang ada.

Harus ada criteria standar tentang pemahaman pegawai terhadap petunjuk kerja. Penyelia

laboratorium memegang peranan penting dalam melatih staf tingkat menengah tentang

petunjuk teknis laboratorium yang baik. Pegawai biosafety dapat membantu pada pelatihan

dan pengembangan bantuan pelatihan dan dokumentasi.

Staf peseta pelatihan harus selalu siap dengan metode aman untuk hal-hal yang

berhubungan dengan prosedur menghadapi bahaya yang biasanya dialami oleh seluruh

personel laboratorium, terutama yang berhubungan dengan:

Resiko inhalasi (misal produksi aerosol), seperti penggunaan loops, pemipetan, membuat

pulasan cairan, pembukaan jaringan, mengambil sampel darah/serum dan sentrifugasi.

Resiko tertusuk jarum suntik pada waktu berhubungan dengan penanganan spesimen,

pemulasan cairan dan kultur jaringan.

Resiko penggunaan alat semprot dan jarum.

Penanganan hewan yang berakibat pada gigitan atau cakaran.

Penanganan darah dan materi patologis lainnya yang berbahaya.

Dekontaminasi dan pembuangan dari materi infeksius.

E. Pembuangan limbah

Limbah ialah segala sesuatu yang harus dibuang. Di laboratorium, dekontaminasi dari

limbah dan cara pembuangannya adalah sangat berhubungan. Untuk penggunaan sehari-hari,

50

hanya sedikit materi terkontaminasi yang terbuang dari laboratorium atau harus dimusnahkan.

Kebanyakan dari instrument, peralatan pecah belah dan pakaian laboratorium akan

digunakan kembali atau di daur ulang. Prinsip yang salah adalah bahwa semua materi

infeksius harus didekontaminasi, diautoklaf atau dibakar di dalam laboratorium. Prinsip dasar

yang harus dipertanyakan sebelum memusnahkan setiap objek atau materi dari laboratorium

yang berhubungan dengan mikroorganisme yang mudah menular atau jaringan tisu hewan

adalah sebagai berikut:

1. Sudahkah objek atau meteri didekontaminasi secara efektif atau didisinfeksi dengan

prosedur yang di akui?

2. Jika tidak. Sudahkah dikemas dalam bentuk yang disetujui untuk pembakaran di

tempat secara langsung atau pemindahan ke fasilitas lain dengan kapasitas

pembakaran yang tepat?

3. Apakah pembuangan dari bahan-bahan terdekontaminasi atau material berbahaya lain

ditangani di luar fasilitas lab?

a. Dekontaminasi

Autoklaf dengan uap adalah metode yang terbaik untuk semua proses

dekontaminasi. Materi untuk dekontaminasi dan pembuangan harus ditempatkan dalam

container misal kantong plastic. Autoklaf memiliki kode warna menurut isinya yang

harus memiliki proses autoklaf dan/atau dibakar.Metode alternative lainnya hanya

dapat dipakai jika mereka memindahkan dan/atau membunuh mikroorganisme.

Disinfektan dan bahan kimia

Aspek keamanan dan petinjuk tertulis tentang penggunaan disinfektan dari setiap

perusahaan pembuatnya harus terdokumentasi dengan baik. Perusahaan pembuat juga

harus mampu untuk menyediakan dokumen yang sesuai. Harus dipastikan setiap

disinfektan telah divalidasi untuk digunakan di laboratorium. Natrium hipoklorit dan

senyawa fenol adalah disinfektan yang umum direkomendasikan untuk digunakan di

laboratorium.

51

Untuk keperluan khusus dapat digunakan sebagai senyawa penghancur lemak,

termasuk alcohol, iodine, iodofor, dan berbagai senyawa teroksidasi lainnya, dengan

pH sangat tinggi atau sangat rendah.

Metode lain

Penggunaan udara kering seperti radiasi ion,microwave, ultraviolet tidak

disarankan karena variasi yang tidak dapat diprediki. Teknologi baru, termasuk

hidrolisis alkalin, dapat digunakan sebagai pengganti pembakaran pada penanganan

limbah infeksius.

b. Penanganan limbah dan prosedur pembuangan

Identifikasi dan system pemisahan bahan-bahan infeksius serta penampungnya

harus diberlakukan, dengan kategori sebagai berikut:

1. Limbah no-infeksius yang dapat digunakan kembali atau didaur ulang atau

dibuang seperti limbah buangan rumah tangga biasa.

2. Peralatan infeksius seperti jarum hipodermik, pisau bedah, pisau dan pecahan

gelas ; harus selalu disimpan dalam container dengan pentupnya dan diperlakukan

sebagai bahan yang mudah menular.

3. Material terkontaminasi yang akan didekontaminasi dengan autoklaf dan

selanjutnya melalui pencucian atau akan didaur ulang.

4. Material terkontaminasi yang akan diautoklaf dan dibuang

5. Material terkontaminasi yang akan dibakar secara langsung.

Benda-benda tajam

Setelah digunakan, jarum hipodermik tidak boleh ditutup kembali, dipotong atau

dipindahkan dari alat semprot sekali pakai. Seluruh rangkaian ditempatkan dalam

penampung. Tempat penampung benda-benda tajam harus tahan bocor dan tidak boleh

diisi melebihi kapasitas. Ketika mencapai tiga perempat penuh maka harus

ditempatkan dalam kontainer “limbah mudah menular” dan dibakar, dengan terlebih

dahulu melalui proses autoklaf. Tempat menampung benda-benda tajam tidak boleh

52

dibuang di tanah. Alat semprot sekali pakai digunakan sendiri atau menggunakan

jarum, harus ditempatkan pada container dan dibakar dengan autoklaf jika diharuskan.

Materi terkontaminasi untuk autoklaf dan daur ulang

Tidak perlu dilakukan pra pembersihan terhadap material terkontaminasi yang

akan diautoklaf dan digunakan kembali. Pembersihan harus dilakukan hanya setelah

proses sterilisasi uap air (autoclaving).

Material terkontaminasi (infeksius) untuk dibuang

Berbeda dengan benda-benda tajam, semua material berpotensi infeksius harus

diautoklaf pada bak penampung anti bocor. (contoh kantong plastic berkode warna)

sebelum dibuang. Setelah proses sterilisasi uap air (autoclaving), materi dapat

ditempatkan di container transfer untuk memindahkannya ke tempat

pembakaran/insinerator. Jika mungkin, materi yang di dapat dari aktifitas kesehatan

tidak boleh dimusnahkan di tanah bahkan setelah dekontaminasi. Jika

insineratortersedia di wilayah laboratorium, proses sterilisasi uap air boleh dilakukan:

limbah terkontaminasi harus ditempatkan di kontainer dengan rancangan khusus

(misal kantong kode warna) dan dipindahkan langsung ke autoklaf atau insinerator.

Pemindahan bak penampung harus anti bocor dan memiliki penutup yang ketat. Limbah

harus didisinfeksi dan dibersihkan sebelum dikembalikan ke laboratorium untuk penggunaan

selanjutnya tempat pembuangan atau wadah sejenis lebih disukai yang tiidak mudah pecah

(misal:plastic) dan memuat disinfektan yang cocok, depersiapkan setiap hari dan harus

ditempatkan disetiap tempat kerja. Materi limbah harus tetap kontak dekat dengan disinfektan

(misal: tidak dilindungu gelembung air) untuk waktu yang tepat, sesuai dengan disinfektan

yang digunakan. Disinfektan harus dituang ke dalam container untuk dilakukan proses

sterisasi uap air atau pembakaran. Panci buangan harus diautoklaf dan dicuci sebelum

digunakan kembali. Pembakaran adalah metode pilihan untuk pembuangan akhir dari limbah

terkontaminasi, termasuk bangkai dari hewan laboratorium. Pembakaran dari limbah

terkontaminasi harus mampu memenuhi standar kesehatan public dan kebijakan polusi udara.

53

F. Keselamatan dari bahan kimia, api, listrik dan radiasi

Pecahnya bak penampung mikroba patogen mungkin merupakan akibat tidak langsung

bahan kimia, api, listrik dan radiasi. Karenanya sangat penting untuk memenuhi standar

keamanan yang tinggi bagi pada setiap laboratorium mikrobiologi. Untuk pelaksanaannya

dapat mengacu kebijakan nasional yang ada.

4.9 Penutup

Pertanyaan

1. Jelaskan secara singkat cara pengaturan ruangan dalam Laboratorium Kultur Jaringan

Tanaman.

2. Sebutkan ruangan-ruangan yang terdapat dalam sebuah laboratorium kultur jaringan serta

sebutkan kegiatan apa saja yang dilakukan dalam ruangan tersebut.

3. Sebutkan alat-alat yang digunakan dalam teknik kultur jaringan serta jelaskan fungi dari

masing-masing alat tersebut.

4. Jelaskan secara singkat cara sterilisasi alat dan bahan yang akan digunakan dalam teknik

kultur jaringan.

5. Jelaskan perbedaan antara sterilisasi dengan pemanasan kering, sterilisasi dengan

pemanasan basah dan sterilisasi ultraviolet.

6. Jelaskan ketentuan-ketentuan yang paling penting yang harus ada dalam aturan

laboratorium biosafety

7. Sebutkan hal-hal yang mencakup perhatian khusus pada kondisi yang dikenal sebagai

penyebab masalah kesehatan dan keselamatan dalam merancang laboratorium dan

menetapkan jenis-jenis pekerjaan yang akan dilakukan di dalam laboratorium.

54

Daftar Pustaka




Wetter, L.R. dan F. Constable. 1982. Plant Tissue Culture Methods. Diterjemahkan oleh


Penerbit ITB.



Publisher.


Bumi Aksara.

55

BAB V. Media Kultur Jaringan

5.1 Pendahuluan

Salah satu faktor yang menentukan keberhasilan kultur jaringan adalah media kultur

jaringan. Komposisi media yang tepat akan menentukan arah perkembangan eksplan, oleh

karena itu pengetahuan mengenai komposisi media dan cara pembuatan media sangat penting

diketahui.. Komposisi nutrisi media kultur jaringan cenderung bersifat spesifik terhadap

spesies dan asal eksplan. Bab ini akan membahas secara mendetil mengenai berbagai jenis

media, komposisi, dan cara pembuatannya. Setelah mempelajari bab ini mahasiswa

diharapkan mengetahui berbagai jemis media kultur jaringan, komposisi, dan prosedur

pembuatannya.

5.2 Sejarah nutrisi in vitro

Ketika suatu eksplan dikulturkan , jaringannya mengalami perubahan-perubahan yang

dinyatakan oleh Hartmann et al. (1990) sebagai suatu „situasi krisis”. Di samping kehilangan

suplai air dan mineral sebagai akibat hilangnya tekanan akar, tanaman pun kehilangan

karbohidrat karena tidak ada daun-daun yang menyediakan gula ke dalam system floem, juga

terjadi gangguan yang menyeluruh pada system regulasi hormone tanaman. Pusat sintetik

auksin, seperti pucuk-pucuk dengan primordial daun menjadi berkurang bila terjadi poliferasi

kalus, demikian pula halnya dengan suplai sitokinin dari akar. Pertumbuhan kultur yang

normal dapat kembali diinduksi bila dilakukan restorasi suplai air, komponen-komponen

nutrisi, dan zat pengatur timbuh melalui medium tumbuh (Schwabe, 1984).

Sebagian besar medium mikropropagasi yang saat ini banyak digunakan merupakan hasil

modifikasi dari medium yang dikembangkan sebelumnya, yang telah terbukti sesuai untuk

kultur suatu jaringan ataupun organ tertentu. Gauteheret pada tahun 1939, memformulasikan

mediumnya dengan mengkombinasikan dua kali lipat unsure makro Knop dengan unsure

mikro Berthelot. Kombinasi antara medium Upenski dan Upenski untuk kultur alga dengan

larutan hara mikro Trelease dan Trelease merupakan dasar dari penyusunan medium White

yang digunakan untuk kultur potongan akar tanaman tomat. Medium White ini pun terbukti

cocok untuk kultur kalus tembakau hibrida Nicotiana glauca x N. Langsdorffii. Setelah

56

mengalaminya serangkaian modifikasi pada tahun 1943 oleh White sendiri dan peneliti

lainnya, medium ini semakin luas penggunaanya pada kultur in-vitro berbagai jaringan spesies

tanaman.

Hildebrandt, Riker, dan Duggar pada tahun 1946 merupakan teknik triangulasi pada

medium White untuk mendapatkan medium yang sesuai untuk kultur in vitro jaringan-jaringan

spesifik. Ketiga ahli tersebut menemukan dua formula baru yang dianggap optimumuntuk

kultur kalus Nicotiana glauca x N. langsdorffii dan untuk kultur kallus tumor crown gall

tanaman bunga matahari. Akan tetapi, mmenurut pengamatan Burkholder dan Nickel pada

tahun 1949, kedua media tersebut masih kurang sesuai untuk kultur in vitro jaringan tumor

yang diinduksi oleh partikel virus. Dengan menerapkan metode triangulasi pada studi awal,

dilanjutkan dengan pengujian serial terhadap setiap unsure secara bebas, didapatkan lagi satu

formula baru berdasarkan medium Hildebrandt, Riker, dan Duggar yang pada mulanya

diterapkan pada jaringan tanaman bunga matahari. Medium tersebut dilaporkan sangat sesuai

untuk kultur in vitro jaringan tanaman Rumex.

Pada tahun 1953, Heller melakukan penelitian yang mendalam terhadap kebutuhan

mineral pada kultur wortel. Pertama-tama, dilakukan induksi defisiensi beberapa unsure hara

melalui transfer secara berulang-ulang pada medium cair yang kekurangan suatu unsure

tertentu, kemudian memberikan kembali unsure tersebut pada konsentrasi serial untuk

menentukan takaran yang memuaskan. Pada uji komparatif, Heller mendapatkan bahwa

medium yang diformulasikannya memberikan hasil dua hingga tiga kali lebih tinggi daripada

medium White ataupun medium Gautheret yang digunakan sebagai control.

Nitsch dan NItsch pada tahun 1956, mengembangkan medium untuk tanaman Helianthus

tuberosus berdasarkan hasil-hasil penelitian terdahulu terhadap spesies ini dan juga melakukan

modifikasi sehubungan dengan pengujian keragaman secara terpisah terhadap setiap unsure.

Akan tetapi, medium yang dikembangkan oleh Heller memiliki kandungan besi dan beberapa

unsure mikro lain dengan takaran yang rendah. Berdasarkan sejarah perkembangan medium

dasar pada kultur in vitro ini, Murashige dan Skoog (1962) berkesimpulan bahwa

berkembangnya suatu formulasi medium nutrisi kultur jaringan tanaman didasarkan pada

formulasi-formulasi yang telah ada sebelumnya.

57

5.3 Jenis Medium dan Komponen Penyusun Utamanya

Medium yang digunakan untuk kultur in-vitro tanaman dapat berupa medium padat atau

cair. Medium padat digunakan untuk menghasilkan kalus yang selanjutnya diinduksi

membentuk tanaman yang lengkap (disebut sebagai plantlet), sedangkan medium cair

biasanya digunakan untuk kultur sel. Medium yang digunakan mengandung lima komponen

utama yaitu: senyawa anorganik, sumber karbon, vitamin, zat pengatur tumbuh, dan suplemen

organik.

Senyawa anorganik terdiri atas unsur-unsur makro dan mikro. Pada umumnya medium

mengandung nitrat dan potassium pada konsentrasi masing-masing 25 mM. ammonium

merupakan senyawa esensial untuk hampir semua kultur tetapi konsentrasi yang diperlukan

lebih rendah disbanding dengan nitrat. Konsentrasi kalsium, magnesium dan sulfat yang

diperlukan sekitar 1 – 3 mM. Unsur-unsur mikro yang diperlukan antara lain iodine (I), boron

(B), Mangan (Mn), zinc (Zn), molybdenum (Mo), tembaga (Cu), kobalt (Co) dan besi (Fe).

Sumber karbon yang digunakan dapat berupa glukosa, fruktosa, maltose atau sukrosa

dengan konsentrasi sekitar 2 – 4%, tetapi sukrosa merupakan sumber karbon yang banyak

digunakan dalam banyak system kultur.

Vitamin yang banyak digunakan anatara lain thiamin, pyridoxine dan asam nikotinat.

Suplemen senyawa organic yang digunakan adalah asam amino (biasanya digunakan

gliycinei), ektrak khamir, peptone, ekstrak malt. Meskipun demikian, biasanya medium

sintetik yang jelas komposisi kimiawinya lebih banyak digunakan sedangkan suplemen

organic yang tidak jelas komposisi kimiawinya hanya digunakan jika dianggap essensial.

Zat penagatur tumbuh juga diperlukan dalam kultur in-vitro untuk mendukung

pertumbuhan. Kombinasi zat pengatur tumbuh yang digunakan meliputi: (1) untuk

perbanyakan (proliferation) sel digunakan 2,4 dichlorophenoxy acetic acid (2,4 D) atau 1-

naphtalene acetic acid (NAA) dan sitokinin (kinetin, benzyl adenosine, 2-isopentyll adenosine,

zeatin, thidiaruzon), (2) untuk regenerasi diperlukan auxin adenosine (NAA, indole acetic

acid/IAA, indole butyric acid/IBA) dalam konsentrasi rendahdan sitokinin dalam konsentrasi

tinggi, tetapi bukan dalam bentuk 2,4 D. Senyawa 2,4 D diketahui menginduksi perbanyakan

58

sel tetapimenekan diferensiasi pada tanaman dikotil, tetapi 2,4 D dan 2,4,5-T (2,4,5

trichlorophenoxyacetic acid) diketahui bersifat efektif untuk menginduksi embryogenesis

somatik pada tanaman serealia (monokotil). Medium yang digunakan untuk kultur in vitro

sekarang dapat dibeli dalam bentuk jadi meskipun harganya lebih mahal dibanding kalau

dibuat sendiri di laboratorium.

5.4 Hara tanaman

Unsur-unsur esensial yang dibutuhkan tanaman dalam jumlah relative besar

diistilahkan sebagai unsure-unsur makro (Salisbury dan Ross, 1992). Unsure-unsur makro

karbon, hydrogen, dan oksigen tersedia bagi tanaman melalui air dan udara. Sementara itu,

kebutuhan akan unsure-unsur makro yang lain seperti nitrogen, fosfor, kalium, kalsium,

magnesium, dan belerang dipenuhi melaui medium tumbuh. Pada kultur in vitro, nitrogen

diberikan dalam jumlah terbesar dalam bentuk KNO3 atau NH4NO3. Kebutuhan akan

magnesium dan belerang dapat dipenuhi melaui pemberian MgSO4.7H2O. Sementara itu,

fosfor dapat diberikan dalam bentuk NaH2PO4.H2O atau KH2PO4. Kalium diberikan pada

medium dalam bentuk KCl, KNO3, atau KH2PO4. Sedangkan CaCl2.2H2O, Ca(NO3)2.4H2O,

atau bentuk-bentuk anhidrat dari kedua garam tersebut dapat diberikan untuk memenuhi

kebutuhan akan kalsium (Dodds dan Roberts, 1985).

Di samping unsur-unsur makro, sel-sel tanaman pun membutuhkan unsure-unsur mikro

tertentu. Unsure-unsur mikro yang dibutuhkan oleh semua tanaman tingkat tinggi meliputi

besi, mangan, seng, boron, tembaga, molibdat, dan klor. Walaupun natrium tidak umum

dibutuhkan oleh tanaman tingkat tinggi, unsure ini diperlukan oleh jaringan-jaringan yang

mengandung klorofil, seperti tanaman dengan lintasan fotosintesis C4 dan tanaman dengan

metabolism asam crasulacean (Crasulacean Acid Metabolism, CAM). Stok besi disiapkan

secaraterpisah karena adanya masalah pada kelalrutan unsure ini. Biasanya, larutan besi

disiapkan dalam bentuk kelat sebagai garam natrium ferric ethylenediaminetetra-acetic

(NaFeEDTA). Di samping unsure-unsur mikro yang telah banyak dikenal, beberapa medium

mengandung unsure-unsur mikro kobalt dan iodium (Dodds dan Roberts, 1985). Sementara

itu, unsure-unsur lain, seperti nikel, titianium, berilium, dan aluminium masih belum banyak

digunakan, kecuali untuk tujuan tertentu.

59

Hal yang belum dapat diatasi saat ini adalah kenyataan bahwa bahan-bahan kimia yang

murni sekalipun dapat mengandung kontaminan unsure-unsur mikro, unsure-unsur ini

merupakan sumber unsure mikro tersembunyi (Yeoman, 1973). Salah satu contoh yang dapat

dikemukakan adalah bahan pemadat agar yang mengandung sejumlah unsure-unsur mineral.

A. Vitamin

Vitamin memiliki fungsi katalitik pada system enzim dan dibutuhkan dalam jumlah

kecil. Satu-satunya vitamin yang dianggap esensial pada kultur in vitro adalah tiamin (Vitamin

B1). Pemberian niasin (asam nikotinat) dan piridoksin (vitamin B6) dapat meningkatkan

pertumbuhan kultur (Gambort et al., 1976). Tiamin diberikan pada medium kultur dalam

bentuk tiamin-HCl dengan takaran berkisar 0,1-30,0 mg L-1

. Perlunya kehadiran tiamin pada

kultur in vitro terutama pada kondisi kandungan sitokinin yang rendah di dalam medium.

Digby dan Skoog (1966) serta Linsmaier-Bednar dan Skoog (1976) membuktikan bahwa sel-

sel tembakau tumbuh dengan baik pada medium yang mengandung sitokinin konsentrasi agak

tinggi (0,1-10,0 mg L-1

) walaupun tanpa kehadiran tiamin. Ditambahkan oleh Dravnicks et al.

(1969) bahwa kultur tembakautersebut secara nyata mengembangkan kemampuannya untuk

memproduksi tiamin. Sementara itu, Eriksson (1965), menemukan bahwa niasin dan

piridoksin diperlukan pada kultur jaringan Haplopappus gracilis.

Beberapa vitamin lain yang digunakan pada kultur in vitro meliputi asam p-

aminobenzoat (PABA; vitamin Bx), asam askorbat (vitamin ), biotin (vitamin H), kolin

klorida, kyanokobalamin (vitamin B2) (Gamborg dan Shyluk, 1981). Asam askorbat yang

terkadang diberikan bersama-sama dengan asam-asam organic lain, berguna sebagai senyawa

antioksidan untuk menghindari terjadinya pencokelatan medium akibat adanya senyawa fenol

yang dikeluarkan oleh eksplan dari spesies tanaman tertentu, terutama tanaman bergetah

(Reynolds dan Murashige, 1979).

B. Asam amino dan amida

Kecuali glisin (asam aminoasetat), asam-asam amino lain tidak banyak diberikan pada

media kultur in vitro. Jika dianggap perlu untuk menambahkan suatu campuran nitrogen

organic maka medium dapat ditambah dengan 0,05-0,10% (w/v) hidrolisat kasein atau asam-

asam kasamino. Hidrolisis kasein yang mengandung protein susu dapat dilakukan melalui

60

beberapa cara, di mana hidrolisat mengandung suatu campuran yang terdiri atas paling sedikit

18 asam-asam amino yang berbeda (Klein dan Klein, 1970). Bila penambahan hidrolisat

memberikan pengaruh yang menguntungkan maka harus dilakukan penelitian lanjutan dengan

cara menggantikan hidrolisat tersebut dengan berbagai campuran asam-asam amino dan amida

sehingga kebutuhan nitrogrn organic yeng spesifik dapat ditentukan. Beberapa asam amino

atau amida yang sering memberikan hasil positif pda kultur in vitro adalah asam L-aspartat, L-

asparagin, asam L-glutamat, L-glutamin, dan L-arginin. Sejumlah kecil L-metionin yang

diberikan pada medium kultur untuk meningkatkan biosintesis etilen, ternyata berpengaruh

pada meningkatkan xylogenesis (Roberts dan Baba, 1978; Miller dan Roberts, 1984).

C. Suplemen organic kompleks

Di dalam teknik kultur in vitro senantiasa diupayakan untuk menentukan konstituen

penyusun medium semurni mungkin dan menghindari penggunaan ekstrak-ekstrak alami yang

masih mentah. Produk-produk, seperti pepton, ekstrak ragi, dan ekstrak malt belum banyak

digunakan. Ditinjau dari sudut pandang ilmiah, penggunaan ekstrak-ekstrak alami masih dapat

dianjurkan , dan kehadiran senyawa-senyawa tersebut tidak dapat diabaikan begitu saja

apabila ternyata senyawa-senyawa murni tidak dapat memenuhi apa yang diharapkan. Jus

buah pun merupakan suplemen organic yang penting. Einset (1978) menemukan bahwa

pertumbuhan eksplan beberapa spesies jeruk di dalam kultur in vitro sangat dipacu oleh

pemberian jus jeruk pada medium kultur. Straus (1960) menyatakan bahwa jus tomat dengan

konsentrasi 30% (v/v) efektif pula pada kondisi-kondisi tertentu. Ekstrak buah pisang (Arditti,

1968) dan emulsi daging ikan (Withner, 1959) sudah sejak lama digunakan sebagai suplemen

pada medium mikropropagasi anggrek pada berbagai laboratorium komersial.

D. Arang aktif

Arang aktif dapat mengikat molekul, baik organic maupun anorganik di dalam medium

kultur (Mattson dan Mark Jr, 1971), senyawa ini telah digunakan pada berbagai system

mikropropagasi. Walaupun pengaruh pasti dari arang aktif masih belum diketahui, ada

beberpa modus operasi yang mungkin terjadi. Arang aktif dapat menghilangkan kontaminan

dari agar (Kochlenbach dan Wernicke, 1978) dan produk-produk sekunder yang dikeluarkan

61

oleh jaringan (Wang dan Huang, 1976; Fridborg et al., 1978) atau mengatur suplai zat-zat

tumbuh endogen tertentu (Reinert dan Bajaj, 1977). Selanjutnya, beberapa pengaruh arang

aktif dikarenakan hitamnya matriks medium sehingga mendekati kondisi tanah (Proskauer dan

Berman, 1970). Arang aktif pun dilaporkan dapat merangsang embriogenesis (Kochlenbach

dan Wernicke, 1978). Sebaliknya, kehadiran senyawa ini dapat pula menghambat

pertumbuhan dan morfogenesis in vitro (Constantn et al., 1977; Fridborg et al., 1978).

Tipe arang aktif yang digunakan penting untuk diperhatikan karena karakteristik absorbtif

tergantung pada proses pembuatannya (Bonga, 1982). Arang kayu memiliki kandungan

karbon yang lebih tinggi daripada arang tulang. Arang tulang memiliki kandungan karbon

yang lebih tinggi daripada arang tulang. Arang tulang kemungkinan mengandung unsur-unsur

yang dapat mempengaruhi mikropropagasi tanaman.

E. Sumber karbon

Semua medium kultur in vitro dilengkapi sumber karbon dan energi. Sukrosa ataupun D-

glukosa biasanya diberikan pada konsentrasi 20.000-30.000 mg L-1

, namun konsentrasi yang

lebih tinggi kadang diberikan untuk tujuan-tujuan tertentu. Hampir semua kultur

memperlihatan respon pertumbuhan yang optimum dengan pemberian disakarida dalam

bentuk sukrosa. Apabila sukrosa digantikan oleh monosakarida atau disakarida lain maka akan

terlihat adanya keragaman yang nyata pada pertumbuhan kultur. Sukrosa bersifat labil

terhadap pemanasan, sterilisasi senyawa ini menggunakan otoklaf akan menghasilkan

kombinasi sukrosa, D-glukosa, dan D-fruktosa. Medium yang diotoklaf tersebut dapat

memberikan hasil yang jauh berbedadibandingkan dengan medium yang mengandung sukrosa

yang disterilkan secara filtrasi (Ball, 1953). Myo-inositol ditambahkan pada medium kultur

pada konsentrasi 100 mg L-1

. Pilihan dan takaran gula tergantung pada macam jaringan

tanaman yang dikulturkan dan tujuan dari pengkulturan tersebut. Misalnya, induksi

diferensiasi xylem sangat dipengaruhi oleh jenis karbohidrat yang diberikan pada medium

(Roberts, 1976). Kenyataannya, xilogenesis dapat diinduksi menggunakan gliserol (2% w/v)

ataupun myo-inositol (20% w/v) sebagai sumber utama karbon (Roberts dan Baba, 1978).

Karena selama proses kristalisasi sikrosa terjadi blockade sejumlah senyawa organic, terutama

62

asam-asam amino maka kemurnian karbohidrat masih perlu dipertanyakan (Schneider et. al.,

1975).

F. Osmotikum

Pengambilan air oleh sel-sel tanaman diatur oleh besarnya potensi air antara cairan

vakuola dan medium. Komponen utama medium yang mempengaruhi potensi air adalah

konsentrasi agar-agar, konsentrasi ion-ion dari garam anorganik, dan bahan-bahan non-

metabolit yang ditambahkan sebagai osmotikum. Suatu karakteristik koloid agar-agar pada

kondisi padat adalah adanya retensi imbibisi air di dalam misel gel (Levitt, 1974).

Karbohidrat tidak hanya berfungsi sebagai sumber karbon, tetapi mengatur pula potensi

osmotic medium. Seringkali gula dengan metabolit lemah, seperti manitol ataupun sorbotil,

digunakan sebagai osmotikum (Brown et al., 1979; Brown dan Thorpe, 1980). Selain itu,

polyethyleneglycol (PEG) digunakan pula sebagai osmotikum pada percobaan fusi protoplas

dan kreopreservasi.

G. Air

Air yang digunakan pada medium dan air yang digunakan selama prosedur kultur in vitro

hendaknya disuling dan didemineralisasi. Sangat dianjurkan menggunakan perangkat gelas

untuk mendapatkan air suling. Penyulingan air adalah suatu proses yang sangat rumit,

senyawa-senyawa organic dengan bobot molekul yang ringan seringkali terbawa bersama-

sama dengan air (Bonga, 1982). Perlu diperhatikan pula adanya senyawa-senyawa yang dapat

meracuni kultur yang diakibatkan oleh penyimpanan air suling untuk jangka waktu lama di

dalam wadah polyethylene (Roberts dan Harvey, 1974). Kurang baik pula menyimpan air

suling dalam wadah Pyrex untuk jangka waktu yang lama karena sejumlah bakteri dapat

terakumulasi selama penyimpanan dalam kondisi yang tidak steril (Street, 1973).

5.5 Medium dalam Kultur Jaringan

A. Matriks medium

63

Selain dikulturkan pada medium cair, eksplan dapat pula dikulturkan pada matriks

padat atau setengah padat. Kontaminan yang berasal dari matriks dapat pula menjadi sumber

nutrisi bagi bahan yang dikulturkan. Kebanyakan kultur statis menggunakan matriks agar-

agar, misalnya Bacto Agar atau substitusi agar-agar, seperti Gelrite atau Phytagel, dengan

konsentrasi anata 0,6 – 1,0% w/v. agar yang tersedia dipasaran untuk keperluan rumah tangga

banyak mangandung kontaminan baik organic maupun anorganik. Oleh karena itu, beberapa

perusahaan kimia saat ini telah memasarkan agar-agar untuk keperluan kultur in vitro. Analisis

yang dilakukan oleh Difco laboratories terhadap komposisi unsure yang dikandung oleh Bacto

Agar, Nobel Agar, dan Purified Agar, tidak memperlihatkan adanya kontaminan, seperti

senyawa-senyawa beracun, perangsang tumbuh, ataupun vitamin (Pierik, 1971). Romberger

dan Tabor (1971) menyatakan bahwa suatu “pengaryh penghambatan agar-agar” dapat

dihilangkan dengan mensterilkan medium yang mengandung sukrosa menggunakan otoklaf.

Suatu kopolimer pati dapat pula dimanfaatkan sebagai pengganti agar-agar (Cooke, 1977) dan

polimer sukrosa bertindak sebagai matriks pendukung (Tran dan Trinh, 1978).

Bahan pemadat sintetik diketahui dapat menimbulkan hiperhidrasi (vitrifikasi), yaitu

suatu kelainan fisiologis yang terjadi pada planlet selama masa kultur. Untuk mengatasi hal

tersebut, Sigma (produsen bahan-bahan kimia) mengembangkan suatu produk baru yang

disebut Agargel. Produk tersebut dibuat dengan mencampurkan agar-agar dengan pemadat

sintetik dan telah terbukti dapat mengurangi terjadinya hiperhidrasi (vitrifikasi). Produk yang

serupa Agargel dapat dibuat dengan mencampurkan 1 g Gelrite (Phytagel) dengan 4 g agar-

agar di dalam 1 L medium.

B. Keasaman medium

Keasaman medium adalah salah satu yang memengaruhi keberhasilan kultur jaringan

tanaman. Pada umumnya, keasaman medium ditetapkan antara 5,6 – 5,8. Medium yang terlalu

asam (pH < 4,5) atau terlalu basa (pH > 7,0) dapat menghambat pertumbuhan dan

perkembangan eksplan (Pierik, 1997). Hal itu mungkin disebabkan oleh tidak tersedianya

sejumlah unsure hara pada kisaran pH tertentu. Pada pH tinggi, unsur-unsur seperti besi, seng,

mangan, tembaga, dan boron mengalami presipitasi sebagai hidroksida sehingga tidak tersedia

bagi jaringan yang dikulturkan. Sedangkan pada pH rendah, unsur-unsur seperti kalsium,

64

magnesium, belerang, fosfor dan molibdat menjadi tidak tersedia. Akan tetapi, Winata (1987)

menyatakan bahwa tanaman, seperi Rhododenron tumbuh dengan baik pada medium dengan

pH 4,5. Medium dengan pH rendah seringkali digunakan dalam seleksi untuk mendapatkan

tanaman yang toleran terhadap keasaman tinggi.

Selain memengaruhi ketersediaan unsure hara, pH memengaruhi pula proses pemadatan

medium. Menurut Taji et al. (1997), medium akan menjadi terlalu keras bila pH > 6,0,

sedangkan pada pH < 5,2 medium akan sulit untuk menjadi padat.

C. Pemilihan komposisi medium dasar

Kebutuhan nutrisi untuk pertumbuhan kultur in vitro yang optimal bervariasi antarspesies

ataupun antarvarietas. Bahkan, jaringan yang berasal dari bagian tanaman yanag berbeda pun

akan berbeda kebutuhan nutrisinya. Oleh karena itu, tidak ada satu pun medium dasar yang

berlaku universal untuk semua jenis jaringan dan organ. Meskipun demikian, medium dasar

MS yang direvisi (Murashige dan Skoog, 1962) adalah yang paling luas penggunaannya

dibandingkan dengan media dasar lainnya. Taji et. al (1995) menambahkan bahwa medium

MS yang direvisi – selanjutnya disebut MS – banyak digunakan, terutama pada

mikropropagasi tanaman dikotil dengan hasil yang memuaskan. Hal itu dikarenakan medium

MS memiliki kandungan garam-garam yang lebih tinggi daripada media lain, di samping

kandungan nitratnya juga tinggi.

Seleksi terhadap konsentrasi total ion-ion unsur makro memiliki arti yang sama penting

dengan penentuan rasio ion-ion tersebut. George dan Sherrington (1984) mengemukakan

bahwa suatu rasio yang sama dari sejumlah ion belumtentu memiliki konsentrasi total yang

sama pula. Misalnya, rasio antara 15 µM NO3- terhadap 5 µM K

+ pada medium A dan 30 µM

NO3- terhadap 10 µM K

+ pada medium B masing-masing adalah 2:1. Akan tetapi, konsentrasi

total dari kedua ion tersebut tidak sama, konsentrasi total NO3- dan K

+ pada medium B lebih

tinggi daripada medium A.

Penelitian terhadap pengaruh komposisi medium kultur dapat dimulai, misalnya

menggunakan medium dasar MS dengan mencoba berbagai taraf unsur-unsur makro, seperti

65

1/2, 1/3, 1/4, atau konsentrasi penuh (full strength). Apabila telah diperoleh hasil yang

memuaskan maka dapat dilihat pula formulasi unsur-unsur makro atau komposisi ion dari

medium lain dan dicoba untuk melihat perbedaannya.

Telah dikemukakan bahwa sukrosa merupakan sumber karbon yang baik bagi sejumlah

besar kultur. Di samping itu, konsentrasi yang tepat dari sukrosa dan garam-garam mineral

merupakan faktor yang penting untuk diperhatikan supaya mendapatkan laju mikropropagasi

yang optimum. Metode penelitian spektrum luas (broad spectrum experiment) yang

diperkenalkan oleh de-Fossard (1976) menawarkan sejumlah keuntungan bagi penelitian

mikropropagasi tanaman yang dilakukan untuk pertama kali, saaat belum ada informasi yang

tersedia sebelumnya. Melalui metode ini tidak hanya dilakukan pengujian pengujian terhadap

faktor konsentrasi zat pengatur tumbuh, tetapi juga terhadap faktor konsentrasi garam-garam

mineral dan sukrosa pada waktu yang bersamaan. Dengan menggunakan kalus tembakau

sebagai eksplan, de-Fossard (1976) membuktikan bahwa morfologi (normal, kompak, atau

bergelombang), laju pertambahan berat, dan kapasitas morfogenetik tergantung pada faktor-

faktor di atas.

Pada penelitian pucuk tanaman anggur yang dikulturkan pada medium yang

diformulasikan oleh Murashige pada tahun 1974 dan dilengkapi dengan 100 mL-1

myo-inositol;

0,4 mg L-1

tiamin-HCl; 3 – 4 mg L-1

BAP; dan 30 g L-1

sukrosa diperoleh regenerasi pucuk

adventif yang terjadi dua kali lebih banyak pada medium dengan konsentrasi garam 3/4

dibandingkan medium dengan konsentrasi garam 1/2 atau konsentrasi penuh. Perbedaan

tersebut akan hilang bila medium ditambahkan 80 mg L-1

adenin sulfat (suatu sitokinin). Hal

itu menunjukkan bahwa konsentrasi medium menjadi faktor penting bila sitokinin tidak

diberikan pada tingkat konsentrasi yang optimum. Dengan demikian, dapat dikemukakan

bahwa untuk mendapatkan hasil yang maksimum dari perlakuan zat pengatur tumbuh maka

komponen medium lainnya harus berda pada kadar yang optimum.

Untuk menguji semua kombinasi garam, mineral, sukrosa, dan konsentrasi zat pengatur

tumbuh, seperti dianjurkan oleh de-Fossard perlu adanya suatu penelitian berskala besar.

Apabila telah diperoleh komposisi medium yang sesuai dengantujuan kultur, maka unsur-

unsur mikro dan pelengkap organiknya dapat digunakan dengan konsentrasi yang sama untuk

penelitian selanjutnya. Dua level unsur hara makro (misalnya, ½ dan konsentrasi penuh)

66

dikombinasikan dengan dua level sukrosa (misalnya, 2 dan 3 %) dapat diuji pada suatu

percobaan faktorial. Apabila diperlukan auksin dan sitokinin maka dua jenis senyawa ini dapat

diuji pada level yang dikehendaki sehingga diperoleh percobaan faktorial 2 x 2 x 2 x 2 = 16

kombinasi perlakuan. Jika hanya auksi yang diperlukan (misalnya untuk induksi akar) maka

dapat diuji pada tiga level yang menghasilkan 2 x 2 x 3 = 12 kombinasi perlakuan.

D. Pembuatan medium

Dalam pembuatan medium kultur, beberpa batasan yang berkaitan dengan konsentrasi

bahan-bahan terlarut, seperti mol dan molaritas, terlebih dahulu harus dipahami dengan baik.

Hal itu bertujuan agar medium yang dibuat memiliki kandungan bahan-bahan terlarut dengan

konsentrasi yang tepat dan sesuai dengan formulanya.

a. Molalitas (mol)

Mol adalah singkatan dari berat gram molekul yang merupakan berat formula dari suatu

senyawa yang dinyatakan dalam gram. Berat formula dari suatu senyawa adalah jumlah berat

atom-atom yang terdapat dalam rumus kimia senyawa tersebut. Berat atom dari unsur-unsur

didasarkan pada atom oksigen yang memiliki berat relatif 16,000 unit, misalnya unsur

belerang memiliki atom yang beratnya 2,004 kali lebih berat daripada atom oksigen, maka

berat atom belerang adalah 2,004 x 16,000 = 32,064. Berat atom sejumlah unsur disajikan

pada Tabel 3.

Tabel 3. Berat Atom Unsur-Unsur Kimia yang Digunakan dalam Pembuatan Media Kultur

Jaringan

Unsur Simbol Berat atom

Aluminium

Boron

Kalsium

Karbon

Klor

Kobalt

Tembaga

Hidrogen

Iodium

Besi

Al

B

Ca

C

Cl

Co

Cu

H

I

Fe

26,98000

10,81100

40,08000

12,01115

35,45300

58,93320

63,54000

1,00797

126,90440

55,84700

67

Magnesium

Mangan

Molibdat

Nitrogen

Oksigen

Fosfor

Kalium

Natrium

Belerang

Seng

Mg

Mn

Mo

N

O

P

K

Na

S

Zn

24,31200

54,93800

95,94000

14,00670

15,99940

30,93780

39,10200

22,98980

32,06400

65,37000

Misalnya, berat gram molekul gula (sukrosa) dihitung sebagai berikut, rumus molekul

gula adalah C12H22O11, berarti dalam setiap molekul sukrosa terdapat 12 atom karbon (C), 22

atom hidrogen (H), dan 11 atom oksigen (O). Berat dari masing-masing atom adal C = 12,010;

H = 1,008; O = 16,000. Maka berat formula (berat molekul) sukrosa (C12H22O11) adalah (12 x

12,010) + (22 x 1,008) + (11 x 16,000) = 342,300. Berat gram molekul sukrosa adalah berat

molekulnya dalam satuan gram, yakni 342,300 g.

Dengan demikian, satu mol sukrosa sama dengan 342,300 g sukrosa. Satu pon (1 lb)

sukrosa mengandung 1,330 mol sukrosa karena 1 lb = 452 g, dan 454 g : 342,300 g = 1,330

mol.

Dalam medium kultur jaringan, jumlah yang besar, seperti 1 mol senyawa kimia jarang

digunakan. Lebih umum menggunakan satu per seribu mol (satu milimol atau mmol) atau

satu per sejuta mol (satu mikro mol atau µmol), atau paling tidak menyatakan jumlah suatu

senyawa kimia dengan satuan mmol atau µmol. Oleh karena itu,

1 mmol sukrosa = 0,3423 gsukrosa

= 342,3000 mg sukrosa

1 µmol sukrosa = 0,0003423 g sukrosa

= 0,3423 mg sukrosa

= 342,3000 µg sukrosa

b. Molaritas (Mol)

Molar (M) adalah jumlah mol suatu senyawa yang terdapat dalam satu liter larutan.

Jadi, 1 Molar (1 M) larutan sukrosa terdapat 342,30 g sukrosa yang terlarut dalam 1 L air.

H2O

342,30 mg (1 mmol) sukrosa → 1 L = 1 mmol sukrosa L-1

(atau 1/1000 M atau 10-3

M

68

sukrosa atau 1 mM larutan)

H2O

342,30 µg (1 µmol) sukrosa → 1 L = 1 µmol sukrosa L-1

( atau 1/1.000.0000 M atau 10-6

M sukrosa atau 1 µM larutan)

H2O

Catatan: → berarti ditambah air (H2O) hingga volume yang ditentukan (dalam hal ini satu

liter)

Saat ini Asosiasi Fisiologi Tanaman Internasional (The International Plant Physiology

Association) telah menerbitkan panduan yang berjudul Tentative Recommendation of

Terminology, Simbols and Units in Plant Physiology. Panduan tersebut antara lain berisi

referensi mengenai deskripsi nutrisi medium sebagai berikut.

1. Konsentrasi unsur-unsur makro dan bahan-bahan organik dalam media cair dan

semipadat dinyatakan dalam mmol L-1

.

2. Konsentrasi unsur-unsur mikro, zat pengatur tumbuh, vitamin, dan konstituen

organik lainnya dinyatakan dalam µmol L-1

.

3. Apabila diperlukan nilai massa maka digunakan satuan-satuan berikut ini, dan

harus dicantumkan bersama-sama dengan nilai molnya dalam g L-1

, mg L-1

, atau

µg L-1

; bukan dalam %, ppm, dan sebagainya.

4. Unsur makro adalah unsur hara esensial yang biasanya dibutuhkan dalam

konsentrasi ≥ 0,5 mmol L-1

.

5. Unsur mikro adalah unsur hara esensial yang biasanya dibutuhkan dalam

konsentrasi ≤ 0,5 mmol L-1

.

Terminologi di atas digunakan dalam bahan ajar ini. Meskipun demikian, penulis

cenderung menggunakan simbol M sebagai mol L-1

, mM sebagai mmol L-1

, dan µM sebagai

µmol L-1

.

Alasan dianjurkannya pemakaian nilai mol daripada nilai massa, pertama adalah

kenyataan bahwa satu mol setiapa senyawa mengandung jumlah molekul yang sama,

sedangkan satu gram setiap senyawa mengandung jumlah molekul yang berbeda. Jadi, 1 mol

sukrosa (C12H22O11), natrium klorida (NaCl), dan magnesium sulfat (MgSO4) secara berturut-

turut mengandung 6,023 x 1023

molekul sukrosa; NaCl dan MgSO4 1 mmol terdiri atas 6,023 x

1020

molekul dan 1 µmol mengandung 6,023 x 1017

molekul; dan seterusnya. Sebaliknya, 1 g

69

sukrosa, natrium klorida, dan magnesium sulfat secara berturut-turut mengandung kira-kira

17,6 x 1020

; 103 x 1020

; 50 x 1020

molekul, 1 g NaCl memiliki molekul dengan jumlah lebih

kurang dua kali lipat jumlah molekul yang terdapat dalam 1 g MgSO4 dan hampir enam kali

lipat jumlah molekul yang terkandung dalam 1 g sukrosa.

Alasan kedua, bila menggunakan nilai mol masing-masing tidak perlu menyatakan jumlah

molekul kristalisasi air. Jadi, 1 mol masing-masing MgSO4.H2O dan MnSO4.5H2O

mengandung jumlah molekul (6,023 x 1023

) yang sama dengan molekul MgSO4. Jadi, jika

dinyatakan dalam suatu medium terkandung 10 mmol MnSO4.5H2O, kita dapat menyiapkan

larutan ini dengan melarutkan 10 mmol MnSO4.H2O ataupun 10 mmol MnSO4.5H2O.

Sebaliknya, jika dinyatakan 10 µg MnSO4.H2O maka akan terdapat lebih kurang 42% lebih

banyak MnSO4 daripada 10 µg MnSO4.H2O.

Alasan ketiga, dikarenakan reaksi-reaksi kimia terjadi di antara molekul (atau ion pada

senyawa-senyawa ionik), akan lebih baik menggunakan unit-unit yang mengacu pada jumlah

molekul daripada menggunakan unit-unit berdasarkan massa (misalnya gram).

c. Ion

Ketika senyawa-senyawa mineral dilarutkan dalam air maka senyawa-senyawa tersebut

akan mengalami pemisahan (disosiasi) maupun ionisasi membentuk ion-ion. Misalnya,

natrium klorida (NaCl) berdisosiasi dalam air membentuk ion-ion (Na+) dan (Cl

-). Pada saat

mempersiapkan medium kultur jaringan dengan cara mempercampurkan berbagai macam

larutan mineral, harus selalu diingat bahwa setiap larutan terdiri atas dua macam ion (positif

dan negatif) sehingga komposisi akhir dari medium tersebut mengandung berbagai macam

ion-ion. Dengan demikian, bila 100 mL NH4NO3 konsentrasi 10 mmol L-1

dicampur dengan

100 mL KNO3 konsentrasi 10 mmol L-1

dan 100 mL Ca(NO3)2 konsentrasi 10 mmol L-1

maka

dihasilkan 300 mL larutan yang mengandung 1 mmol NH4+, 1 mmol K

+, 1 mmol Ca

2+, dan 4

mmol NO3-.

Satu mmol NO3- berasal dari NH4NO3, 1 mmol NO3

- bersal dari KNO3, dan 2 mmol NO3

-

berasal dari Ca(NO3)2, 1dalam nutrisi kultur jaringan dari mana NO3- berasal tidak ada

bedanya. Misalnya, jika kita ingin mennsuplai medium kultur jaringan dengan 4 mmol NO3-,

dapat dilakukan menggunakan 400 mL NH4NO3 konsentrasi 10 mmol L-1

, 400 mL KNO3

70

konsentrasi 10 mmol L-1

, atau 200 mL Ca(NO3)2 konsentrasi 10 mmol L-1

. Akan tetapi,

pengaruh yang berbeda dapat terjadi bukan dikarenakan oleh NO3- saja, namun sebagai akibat

dari perbedaan jumlah dan macam-macam ion positif, seperti 4 mmol NH4+, 4 mmol K

+, atau

2 mmol Ca2+

, atau oleh tidak adanya dua macam ion positif.

E. Pembuatan beberapa komposisi media

a. Medium Murashige dan Skoog (MS) (1962)

Komposisi lengkap medium Murashige dan Skoog (1962) dapat dilihat pada Tabel 2.

1) Pembuatan larutan stok

a) Stok A: NH4NO3 82,5 g L-1

(1) Timbang NH4NO3 pada neraca analitik sebanyak 82,5 g;

(2) Pindahkan hasil timbangan pada gelas piala 600 mL yang bersih dan telah dibilas

dengan akuades;

(3) Tambahkan akuades secukupnya kemudian aduk sampai larut;

(4) Pindahkan larutantersebut ke labu takar 1000 mL yang sudah dibilas dengan akuades;

(5) Tambahkan akuades sampai hampir mencapai tanda tera;

(6) Kerungkan bagian atas tanda tera dengan kertas tisu;

(7) Penambahan dilanjutkan dengan pipet sampai meniskus bawah mencapai tanda tera;

(8) Larutan dicampur sampai merata dengan membolak-balikkan labu takar;

(9) Pindahkan larutan ke dalam botol reagen berwarna gelap yang bersih dan kering, lalu

tutup;

(10) Berilah label pada botol reagen tersebut dengan keterangan sebagai berikut:

71

Nama stok : A

Nama zat : NH4NO3

Volume pipet untuk 1 L medium : 20 mL

Tanggal pembuatan :

b) Stok B: KNO3 95 g L-1

(1) Timbang KNO3 pada neraca analitik sebanyak 95 g;

(2) Tahap selanjutnya sama dengan stok A [(2) – (9)];


Nama stok : B

Nama zat : KNO3


Tanggal pembuatan : 17 November 2011

c) Stok C: KH2PO4 34 g L-1

H3BO3 1,24 g L-1

KI 0,166 g L-1

Na2MoO4. 2H2O 0,05 g L-1

CoCl2. 6H2O 0,005 g L-1

(1) Timbang zat-zat di atas secara terpisah;

(2) Campurkan semua komponen dalam gelas piala yang sama;

(3) Tahap selanjutnya sama dengan stok A [(3) – (9)]


Nama stok : C

Nama zat : KH2PO4, H3BO3, KI,

Na2MoO4.2H2O,dan CoCl2.6H2O

* Volume pipet untuk 1 L medium : 5 mL


d) Stok D: CaCl2. 2H2O 88 g L-1

(1) Timbang CaCl2. 2H2O pada neraca analitik sebanya 88 g;

72



Nama stok : D

Nama zat : CaCl2. 2H2O



e) Stok E: MgSO4. 7H2O 74 g L-1

MnSO4. 4H2O 3,38 g L

-1

ZnSO4. 4H2O 1,72 g L

-1

CuSO4. 5H2O 0,005 g L

-1


(2) Campurkan semua zat-zat tersebut dalam gelas piala 600 mL;

(3) Tahap selanjutnya sama dengan stok A [(3) – (9)]


Nama stok : E

Nama zat : MgSO4.7H2O, MnSO4.7H2O,

ZnSO4.7H2O, dan CuSO4.7H2O

* Volume pipet untuk 1 L medium : 5 mL


f) Stok F: Na2EDTA.2H2O 3,72 g L-1

FeSO4. 7H2O 2,78 g L-1

(1) Timbang zat-zat di atas secarra terpisah;

(2) Masukkan Na2EDTA.2H2O ke dalam gelas piala 600 mL, lalu tambahkan sedikit air;

(3) Panaskan sampai hampir mendidih;

(4) Tambahkan FeSO4. 7H2O secara perlahan-lahan sambil diaduk sampai larut dan

larutan menjadi kuning;

(5) Biarkan larutan menjadi dingin dengan sendirinya;



73

Nama stok : F

Nama zat : Na2EDTA.2H2O dan FeSO4. 7H2O



(8) Simpan stok ini dalam lemari pendingin

g) Stok Myo-inositol 10 g L-1

(1) Timbang 1 g myo-inositol;

(2) Larutkan dalam 100 mL akuades;


Nama stok : myo-inositol

Nama zat : myo-inositol



h) Stok vitamin: Tiamin-HCl 0,01 g L-1

Piridoksin-HCl 0,05 g L-1

Niasin 0,05 g L-1

Glisin 0,2 g L-1


(2) Campurkan semua zat tersebut dan larutkan dalam akuades 100 mL;


Nama stok : vitamin

* Nama zat : Tiamin-HCl, Piridoksin-HCl, Niasin, Glisin

* Volume pipet untuk 1 L medium: 10 mL

Tanggal pembuatan :

i) Stok pengatur tumbuh (dibuat masing-masing secara terpisah)

(1) Timbang 2,4-D, BAP, IAA, Kinetin, IBA, dan NAA masing-masing 50 mg;

(2) – Larutkan 2,4-D, IAA dan NAA dengan sedikit KOH 1 N secara terpisah;

74

– Larutkan BAP dan Kinetin dengan HCl 1 N secara terpisah;

(3) Pindahkan masing-masing zat pengatur tumbuh tersebut ke dalam labu takar 100 mL;

(4) Tambahkan akuades ke dalam masing-masing labu takar hingga volumenya mencapai

100 mL;

(5) Simpan semua zat pengatur tumbuh ini di dalam wadah Erlenmeyer 100 mL dan tutup

dengan aluminium foil serta masing-masing diberi label;

(6) Simpan semua stok zat pengatur tumbuh dalam lemari pendingin.

Catatan

Cara melarutkan zat pengatur tumbuh selain yang dikemukakan di atas adalah

menggunakan alkohol atau pelarut organik lain. Jika cara ini digunakan, jumlah pelarut

jangan terlalu banyak, untuk menghindari efek meracuni terhadap media.

Stok zat pengatur tumbuh sebaiknya digunakan dalam keadaan masih baru.

Periksa stok yang akan dipakai setelah disimpan lama karena harus bebasdari

mikroorganisme.

Pada stok yang pekat, mungkin terjadi kristalisasi sehingga perlu dipanaskan untuk

melarutkan kembali senyawa yang mengkristal tersebut.

Tabel 4. Komposisi Medium Murashige dan Skoog (1962) pada pH 5,6 - 5,

Stok Senyawa Per liter stok (g)

Pemakaian

Stok (mL) Per liter

medium (mg)

A

B

C

D

E

F

NH4NO3

KNO3

KH2PO4

H3BO3

KI

Na2MoO4. 2H2O

CoCl2. 6H2O

CaCl2. 2H2O

MgSO4. 7H2O

MnSO4. 4H2O

ZnSO4. 4H2O

CuSO4. 5H2O

Na2EDTA

FeSO4. 7H2O

82,500

95,000

34,000

1,240

0,166

0,050

0,005

88,000

74,000

4,460

1,720

0,005

7,460

5,560

20,00

20,00

5,00

5,00

5,00

5,00

1.650,000

1.900,000

170,000

6,2000

0,830

0,250

0,025

440,000

370,000

22,300

8,600

0,025

37,300

27,800

Myo-inositol 10,000 10,00 100,000

75

Glisin

Niasin

Piridoksin-HCl

Tiamin-HCl

0,200

0,050

0,050

0,010

2,000

0,500

0,500

0,1000

Sukrosa

Agar

30.000,000

7.000,000

2) Pembuatan medium cair

Untuk membuat medium MS cair sebanyak 1000 mL, tahap yang dilakukan adalah

sebagai berikut:

a) Jumlah NH4NO3 yang diperlukan adalah 1650 mg, sehingga volume stok A yang perlu

dipipet adalah

b) Dengan cara perhitungan yang sama dengan stok A, didapat volume pipet untuk stok B,

C, D, E, dan F masing-masing 20 mL, 5 mL, 5 mL, 5 mL, dan 10 mL;

c) Myo-inositol dimabil dari stok myo-inositol sebanyak 10 mL;

d) Tiamin-HCl, Piridoksin-HCl, Niasin, dan Glisin diambil dari stok vitamin sebanyak 10

mL;

e) Jika medium yang dibuat perlu diberi zat pengatur tumbuh maka volume pipet yang

diambil berdasarkan kebutuhan. Misalnya, akan dibuat medium MS dengan BAP 2 ppm

(2 mg L-1

) dan NAA 4 ppm (4 mg L-1

):

- Jumlah BAP yang diperlukan 2 mg dan jumlah NAA 4 mg;

- Volume pipet dari stok BAP 500 ppm adalah

- Volume pipet dari stok NAA 500 ppm adalah

f) Masukkan semua larutan stok yang telah dipipet ke dalam labu takar 1000 mL yang telah

diisi akuades kira-kira 200 mL;

g) Timbang gula sebanyak 30 g, laritkan denga akuades secukupnya dalam gelas piala, lalu

pindahkan secara kuantitatif ke dalam labu takar;

76

h) Tambahkan akuades sampai volumenya mencapai 1000 mL;

i) Larutan diaduk dengan membolak-balikkan labu takar;

j) Tuangkan ke dalam gelas piala yang kering dan bersih;

k) Aturlah pH media menjadi 5,6 – 5,8 menggunakan HCl atau KOH;

l) Setelah pH ditetapkan, bagilah medium ke dalam Erlenmeyer kira-kira 20 mL setiap

Erlenmeyer

m) Tutup rapat-rapat dengan aluminium foil dan beri label sesuai dengan perlakuan;

n) Masukkan ke dalam otoklaf dan sterilkan selama 15 menit pada tekanan 17,5 kPa.

(tergantung jenis otoklaf yang digunakan)

3) Pembuatan media padat

Langkah-langkah pembuatan medium padat pada prinsipnya sama dengan pembuatan

medium cair. Akan tetapi, setelah pH medium ditetapkan, medium tersebut dipanaskan sampai

hampir mendidih sambil ditambahkan Bacto Agar dan diaduk beberapa menit. Langkah

berikutnya sama dengan pada medium cair.

b. Medium Vacin dan Went (VW) (1949)

Komposisi medium Vacin dan Went (1949) ini selengkapnya disajikan pada tabel 5.

Tabel 5. Komposisi Medium Vacin dan Went (1949) pada pH 5,6 – 5,8


Pemakaian

Stok (mL) Per liter

medium (mg)

A

B

C

D

E

F

(NH4)2NO3

KNO3

KH2PO4

MgSO4. 7H2O

MnSO4. 4H2O

(Ca)2 PO4

Fe3-Tartrat

25,000

26,250

50,000

50,000

1,560

50,000

2,800

20,00

20,00

5,00

5,00

5,00

5,00

500,000

525,000

250,000

250,000

7,000

250,000

28,000

Sukrosa

Agar

20.000,000

7.000,000


77

Langkah kerja pembuatan larutan stok VW sama dengan pembuatan larutan stok

Murashige dan Skoog (MS) (1962)


Langkah kerja pembuatan medium VW cair sama dengan pembuatan medium Murashige

dan Skoog (MS) (1962) cair.

3) Pembuatan medium padat

Langkah kerja pembuatan medium VW padat sama dengan pembuatan medium

Murashige dan Skoog (MS) (1962) padat, hanya saja jumlah sukrosa yang digunakan hanya 20

g L-1

.

78

c. Medium B5 (Gamborg et. al., 1968)

Komposisi mediumB5 (Gamborg et. al., 1968) ini selengkapnya disajikan pada tabel 6.

Tabel 6. . Komposisi Medium B5 (Gamborg et. al., 1968) pada pH 5,6 – 5,8


Pemakaian

Stok (mL) Per liter

medium (mg)

A

B

C

D

E

F

(NH4)2SO4

KNO3

NaH2PO4. 2 H2O

CoCl2.6H2O

H3BO3

KI

Na2MoO4.2H2O

CaCl2.2H2O

MgSO4.7H2O

MnSO4.4H2O

ZnSO4.7H2O

CuSO4.5H2O

Na2EDTA.2H2O

FeSO4.7H2O

25,000

95,000

26,100

0,005

0,600

0,150

0,050

3,000

5,000

2,000

0,400

0,005

7,460

5,560

5,36

26,30

5,00

1,70

5,00

5,00

134,000

2.500,000

130,500

0,025

3,000

0,750

0,250

150,000

250,00

10,000

2,000

0,025

37,300

27,800

Myo-inositol

Niasin

Piridoksin-HCl

Tiamin-HCl

20,000

0,200

0,200

2,000

5,00 100,000

1,000

1,000

100,000

Sukrosa

Agar

20.000,000

7.000,000


Langkah kerja pembuatan larutan stok B5 sama dengan pembuatan larutan stok



Langkah kerja pembuatan medium B5 cair sama dengan pembuatan medium

Murashige dan Skoog (MS) (1962) cair.


79

Langkah kerja pembuatan medium B5 padat sama dengan pembuatan medium


g L-1

.

d. Medium WPM (Woody Plant Medium (Lloyd dan McCown, 1968))

Komposisi medium WPM (Woody Plant Medium (Lloyd dan McCown, 1968)) ini

selengkapnya disajikan pada tabel 7.

Tabel 7. Komposisi medium WPM (Woody Plant Medium (Lloyd dan McCown, 1968)

pada pH 5,6-5,8


Pemakaian

Stok (mL) Per liter

medium (mg)

A

B

C

D

E

F

NH4NO3

Ca(NO)3.4 H2O

KH2PO4

K2SO4

H3BO3

Na2MoO4. 2H2O

CaCl2. 2H2O

MgSO4. 7H2O

MnSO4. 4H2O

ZnSO4. 7H2O

CuSO4. 5H2O

Na2EDTA.2H2O

FeSO4. 7H2O

82,500

11,120

3,400

19,800

0,140

0,005

1,920

74,000

4,460

1,720

0,005

7,440

5,560

20,00

20,00

5,00

5,00

5,00

5,00

1.650,000

1.900,000

170,000

6,2000

0,830

0,250

0,025

440,000

370,000

22,300

8,600

0,025

37,300

Myo-inositol

Glisin

Niasin

Piridoksin-HCl

Tiamin-HCl

10,000

0,200

0,050

0,050

0,010

10,00 100,000

2,000

0,500

0,500

0,1000

Sukrosa

Agar

30.000,000

7.000,000


Langkah kerja pembuatan larutan stok WPM sama dengan pembuatan larutan stok



80

Langkah kerja pembuatan medium WPM cair sama dengan pembuatan medium

Murashige dan Skoog (MS) (1962) cair.


Langkah kerja pembuatan medium WPM padat sama dengan pembuatan medium


g L-1

.

e. Medium dengan arang aktif

Pada medium dengan arang aktif, digunakan bahan pemadat Gerlite (sebagaipengganti

agar) untuk arang aktif konsentrasi tinggi (0,5-1,0%), sedangkan untuk arang aktif konsentrasi

rendah (0,2-0,4%) masih dapat digunakan Bacto Agar, hanya saja jumlahnya lebih banyak

daripada biasanya. Prosedur kerjanya adalah sebagai berikut.

1) Medium arang aktif konsentrasi rendah

a) Masukkan semua larutan stok medium yang akan dibuat ke dalam labu takar yang

sebelumnya telah diisi dengan akuades 200 mL;

b) Masukkan pula zat pengatur tumbuh (bila diperlukan);

c) Tambahkan sukrosa sesuai dengan kebutuhan;

d) Tambahkan akuades hingga volumenya mencapai 1000 mL;

e) Atur pH 5,8-6,0;

f) Panaskan sampai hampir mendidih;

g) Tambahkan Bacto Agar 8-10 g, lalu adauk selama 2-3 menit sampai medium tampak

bening;

h) Tambahkan arang aktif 2-4 g L-1

lalu aduk hingga merata;

i) Bagilah medium tersebut ke dalam botol kultur masing-masing 10 mL;

j) Sterilkan di dalam otoklaf selama 15 menit pada tekanan 17,5 kPa;

k) Keluarkan dari otoklaf dan kocoklah media tersebut sebelum memadat sehingga arang

tersebar merata di dalam medium;

l) Setelah suhu medium kembali ke suhu kamar simpanlah di dalam ruangan stok.

81

2) Medium arang aktif konsentrasi tinggi

a) Langkah kerja sama dengan medium arang aktif konsentrasi rendah [(a)-(e)];

b) Bagilah medium ke dalam dua gelas piala masing-masing 500 mL

c) Tambahkan 6 – 8 g Gelrite pada medium di dalam gelas piala pertama lalu panaskan

hingga larutan menjadi bening;

d) Tambahkan arang aktif 5 – 10 g L-1

pada medium di dalam gelas piala kedua lalu aduk

sampai rata;

e) Sterilkan kedua macam medium tersebut di dalam otoklaf selama 15 menit pada

tekanan 17,5 kPa;

f) Campurkan kedua macam medium tersebut di dalam laminar air flow cabinet lalu

kocok hingga merata;

g) Bagilah medium tersebut ke dalam botol kultur steril masing-masing 10 mL lalu tutup

dengan aluminium foil dan kocok lagi sambil didinginkan;

h) Setelah padat, simpan medium tersebut di dalam ruang stok.

f. Medium dengan pH rendah

Sebagian tahap pengerjaan pembuatan medium pH rendah dilakukan di dalam LAFC sehingga

perlu disiapkan peralatan yang sudah steril, yakni:

Botol kultur yang sudah ditutup dengan aluminium foil,

4 – 5 buah gelas piala 30 – mL,

Spatula steril, dan

Pipet steril

Langkah kerja pembuatan medium pH rendah adalah sebagai berikut.

1) Membuat stok Al:

a) Timbanglah Na2EDTA.2H2O sebanyak 6,89 g dan AlCl3.6H2O sebanyak 4,46 g;

b) Masukkan Na2EDTA.2H2O ke dalam gelas piala lalu tambahkan akuades;

c) Panaskan larutan Na2EDTA.2H2O, lalu tambahkan AlCl3.6H2O sambil diaduk;

d) Biarkan suhu larutan kembali ke suhu kamar;

e) Pindahkan larutan ke dalam labu takar 1000-mL;

f) Tambahkan akuades hingga volumenya mencapai 1000 mL;

82

g) Pindahkan larutan tersebut ke dalam botol reagen gelap lalu beri label dengan

keterangan sebagai berikut:

Nama stok : Al 500 ppm

Tanggal pembuatan :

2) Membuat medium pH rendah:

a) Masukkan semua larutan stok medium yang akan dibuat ke dalam labu takar 500-mL

yang telah diisi dengan akuades 200 mL;

b) Tambahkan sukrosa (sesuai dengan kebutuhan);

c) Tambahkan akuades sampai volumenya mencapai 500 mL;

d) Tambahkan Bacto Agar sebanyak 8 g atau Gerlite 5 g lalu aduk sampai larut dan

panaskan;

e) Siapkan stok Al sebanyak yang diperlukan dan masukkann ke dalam labu takar 500-

mL tambahkan air sampai tanda tera;

f) Masukkan larutan d) dan e) masing-masing ke dalam Erlenmeyer 1000-mL dan ditutup

dengan aluminium foil lalu sterilkan di dalam otoklaf selam 15 menit pada tekanan

17,5 kPa;

g) Bawa larutan yang sudah steril ke dalam LAFC lalu dicampurkan secara merata

h) Tetapkan pH 4,5 (tambahkan KOH atau HCl sesuai kebutuhan);

Perlu diingat bahwa pada saat memasukkan electrode, suhu medium jangan terlalu

tinggi; bila memungkinkan periksa dahulu suhu mediumdengan thermometer;

i) Bagilah larutan medium ke dalam botol-botol kultur steril lalu tutup dengan aluminium

foil;

j) Simpan medium tersebut di dalam ruangan stok.

5.6 Senyawa Organik Kompleks

Keberhasilan penggunaan metode kultur jaringan sangat tergantung pada jenis media.

Media kultur tidak hanya mengandung unsur hara makro dan mikro, tetapi juga vitamin atau

bahan organik lainnya. Penambahan ekstrak buah-buahan dan zat nabati lainnya yang

memiliki kandungan vitamin tinggi dapat meningkatkan pertumbuhan dan diferensiasi sel

83

pada tanaman tertentu. Penambahan bahan organik kompleks, merupakan salah satu cara

untuk memperkaya nutrisi pada media in vitro tanaman anggrek (Pramesyanti, 1999).

Sejumlah bahan alami dapat digunakan untuk mengganti bahan-bahan kimia untuk kultur

jaringan, diantaranya air kelapa, yang bisa digunakan untuk kultur jaringan pada anggrek. Air

kelapa memang tidak bisa langsung digunakan untuk kultur jaringan pada anggrek. Komposisi

untuk media anggrek dan kultur jaringan berbeda. Berbagai penelitian menunjukkan bahwa

takaran air kelapa yang pas adalah 150 ml air kelapa per liter media. Untuk mengehemat

biaya, pisang ambon juga dapat digunakan sebagai bahan media kultur jaringan. Pisang ambon

mengandung karbohidrat berenergi tinggi. Setiap 100 g berat kering pisang mengandung

energy 136 kalori (Yuliarti, 2010).

Air kelapa saat ini telah menjadi bahan tambahan tetap media VW di dunia kultur jaringan

anggrek Indonesia. Menurut Widiastoety et al., (1997), dalam penggunaannya, jenis kelapa

tidak memberikan efek yang berbeda terutama antara kelapa varietas genjah kuning dan

varietas genjah hijau. Apa yang perlu diperhatikan adalah tingkat ketuaan buah kelapa.

Widiastoety et al. (1997) menyatakan bahwa penambahan air kelapa umur muda dan umur

sedang sebanyak 150 ml/L media dapat mendorong pertumbuhan tinggi, panjang dan lebar

daun serta panjang dan jumlah akar plantlet anggrek Dendrobium, sedangkan pemberian

kelapa tua tidak memberikan efek yang berbeda dengan media tanpa air kelapa. Air kelapa

baik digunakan pada media kultur jaringan karena mengandung zat atau bahan-bahan seperti

vitamin, mineral, asam-asam amino, dan asam nukleat fosfor serta zat tumbuh auksin dan

asam giberelat yang berfungsi sebagai penstimulir proliferasi jaringan, memperlancar

metabolisme dan respirasi (Widiastoety et al., 1997).

Air kelapa adalah salah satu diantara beberapa persenyawaan kompleks alamiah yang

digunakan dalam kultur jaringan. Morel (1974) mengatakan bahwa air kelapa menstimulir

pembelahan epidermis dan mengarah pada pembentukan proto corm jaringan supaya

beregenerasi lebih lanjut dan lebih cepat. Air kelapa yang baik untuk campuran medium kultur

jaringan anggrek yaitu air kelapa muda yang manis rasanya dengan daging buah yang manis

putih serta masih mudah dikerok dengan sendok (Soeryowinoto, 1974 dalam Parera 1997).

Penggunaan air kelapa pertana kali dilaporkan Van Overbeek (1941) dalam kultur embrio

Stramonium. Para peneliti mendapatkan bahwa zat pengatur tumbuh tertentu dapat digantikan

84

dengan penambahan air kelapa dalam medium. Krikorian dan Kann (1981) pada kultur lily

dengan kultur suspense menggunakan medium MS ditambah 10 % air kelapa dan 2 mgper liter

2,4 D. Air kelapa dipakai sebagai pengganti sitokinin (George dan Sherrington, 1978 dalam

Parera, 1997).

Senyawa-senyawa yang terkandung dalam air kelapa dan telah berhasil diidentifikasi

adalah asam amino, asam organik, gula dan gula alkohol, vitamin dan zat pengatur tumbuh.

Asam amino bersama amidanya mempengaruhi pertumbuhan dan morfogenesis kultur

jaringan tanaman. Asam-asam organic terkandung dalam air kelapa diantaranya suksinat,

malat, sitrat. Senyawa-senyawa ini merupakan intermediet dalam proses respirasi aerobic dan

merupakan prekusor dari berbagai senyawa penting dalam tanaman. Vitamin yang terdapat

dalam air kelapa dengan konsentrasi yang cukup tinggi hanya asam nicotine yaitu 0,64 mg per

liter. Jika dibandingkan dengan konsentrasi yang biasanya ditambahkan kedalam medium MS

yaitu 0,5 mg maka konsentrasi vitamin tersebut telah memenuhi kebutuhan (Salisbury dan

Ross, 1985). Menurut George dan Sherrington (1984); Mantel et al (1985) gula terdapat dalam

air kelapa hampir dari setengah bagian adalah sukrosa dan sisanya adalah glukosa, fruktrosa

dan manitol. Sedangkan gula alcohol adalah sorbitoi, myo-inositol dan Scyllocinositol (Parera,

1997).

Berdasarkan hasil penelitian Parera (1997), memperoleh hasil perlakuan tingkat

konsentrasi air kelapa yang terbaik untuk pertumbuhan dan perbanyakan tunas mikro anggrek

Dendrobium spp. Adalah tingkat konsentrasi air kelapa 20%. Perlakuan tingkat konsentrasi air

kelapa 10 % memberikan respon yang baik terhadap perkembangan kultur jaringan anggrek

Dendrobium spp. Untuk sub kultur dan tahap aklimatisasi. Perlakuan t ngkat konsentrasi air

kelapa tidak berpengaruh terhadap pertumbuhan dan jumlah akar anggrek Dendrobium spp.

(Parera, 1997).

Khusus pada media padat untuk subkultur plantlet berupa plb dan tanaman kecil,

penambahan bubur pisang telah menjadi ”kebiasaan tetap” bagi banyak praktisi kultur jaringan

anggrek (penambahan bubur pisang dan sejenisnya tidak dilakukan untuk media cair dan

media inisiasi plantlet mata tunas dan sejenisnya). Menurut hasil penelitian Pramesyanti

(1999) di dalam Widiastoety dan Purbadi (2003), dari beberapa kultivar pisang ternyata pisang

ambon lumut (50 g/L) memberikan pengaruh terbaik terhadap pertumbuhan jumlah dan luas

85

daun plantlet anggrek Dendrobium. Penggunaan bubur pisang adakalanya diganti oleh bahan

lain seperti tomat dan ubi kayu. Widiastoety dan Purbadi (2003) menyatakan bahwa

penggunaan bubur ubi kayu berdaging putih (50 g/L) memberikan hasil yang sama baik

dengan pisang ambon lumut terhadap pertumbuhan tinggi plantlet, serta jumlah dan luas daun.

sedangkan ubi kayu berdaging kuning (50 g/L) memberikan pengaruh terbaik terhadap

pertumbuhan akar. Hasil positif tersebut disebabkan oleh kandungan vitamin B1 (0.12

mg/100g) ubi kayu yang dapat membantu mempercepat pembelahan sel pada meristem akar.

Selain itu, menurut Widiastoety dan Bahar (1995) pengaruh positif ubi kayu disebabkan oleh

kandungan karbohidrat yang tinggi pada ubi kayu (Widiastoety et al., 1997).

Pemanfaatan pupuk daun sebagai bahan dasar untuk membuat media kultur anggrek telah

banyak digunakan oleh para penganggrek untuk perkecambahan benih dan pertumbuhan

protocorm dari polong yang telah masak. Khusus untuk pertumbuhan benih yang berasal dari

polong hijau masih sangat terbatas, oleh karena itu perlu diteliti apakah komposisi media

untuk polong yang telah masak juga sesuai untuk benih dari polong hijau (Arsyad, 2008).

Keuntungan dari penggunaan pupuk daun ialah di dalamnya telah terkandung unsur hara

makro dan mikro. Umumnya tanaman sering kekurangan unsur hara mikro, dengan pemberian

pupuk daun yang berisi hara mikro maka kekurangan tersebut dapat diatasi. Di pasaran pupuk

daun terdiri atas dua bentuk, yaitu cair dan padat. Bentuk padat dapat berupa kristal halus

sampai berupa tepung. Beberapa jenis pupuk daun yang beredar di pasaran yaitu Hyponex,

Growmore dan Gaviota. Ketiganya mengandung hara makro dan mikro yang dibutuhkan oleh

tanaman (Lingga dan Marsono, 2004).

Kandungan kimia dalam buah buncis, batang, dan daun adalah alkaloid, saponin, polifenol,

dan flavonoid, asam amino, asparagin, tannin, fasin (toksalbumin). Sementara kandungan

kimia bijinya adalah glukoprotein, tripsin inhibitor, hemaglutinin, stigmasterol, sitosterol,

kaempesterol, allantoin dan inositol. Kulit biji mengandung leukopelargonidin, leukosianidin,

kaempferol, kuersetin, mirisetin, pelargonidin, sianidin, delfinidin, pentunididin dan malvidin.

Dan buncis segar mengandung vitamin A dan vitamin C (Hernani dan Raharjo, 2006 dalam

Erlina Budianto, 2009).

Dalam 100 gram berat buncis terdapat kandungan gizi, antara lain: protein 2.4 gram, lemak

0.2 gram, karbohidrat 7.7 gram, kalsium 6.5 mg dan zat besi 1.1 mg. Dari setiap buncis

86

mentah mengandung kalori, vitamin A, vitamin B, protein, lemak, vitamin C dan karbohidrat

(Heryawan, 2008).

Tauge kacang hijau merupakan jenis sayuran yang umum dikonsumsi, mudah diperoleh,

ekonomis, dan tidak menghasilkan senyawa yang berefek toksik. Tauge kacang hijau

mengandung makronutrien, mikronutrien, vitamin, asam amino, serta gula yang dibutuhkan

bagi pertumbuhan mikroalga (Prihartini dkk, 2007).

Kecambah adalah tumbuhan kecil yang baru tumbuh dari biji kacang-kacangan yang

disemaikan atau melalui perkecambahan. Kecambah yang dibuat dari biji kacang hijau disebut

tauge (Astawan, 2005). Vitamin yang ditemukan dalam tauge adalah vitamin C, thiamin,

riboflavin, niasin, asam pantothenik, vitamin B6, folat, kolin, β-karoten, vitamin A, vitamin E

(α-tokoferol), dan vitamin K. Mineral yang ditemukan dalam tauge adalah kalsium (Ca), besi

(Fe), magnesium (Mg), fosfor (P), potasium (K), sodium (Na), zinc (Zn), tembaga (Cu),

mangan (Mn), dan selenium (Se). Asam amino esensial bermakna yang terkandung dalam

tauge, antara lain: triptofan, treonin, fenilalanin, metionin, lisin, leusin, isoleusin, dan valin

(Amilah dan Astuti, 2006; USDA, 2009). Tauge juga mempunyai kandungan beberapa

antioksidan maupun zat yang berhubungan dengan antioksidan yaitu fitosterol, vitamin E (α-

tokoferol), fenol, dan beberapa mineral (selenium, mangan, tembaga, zinc, dan besi)

(Astawan, 2005; Shetty et al., 2000; Winarsi, 2007 dalam Maulana, 2010).

Namun demikian, semua bahan-bahan nutrisi baik berasal dari senyawa anorganik

maupun senyawa organik tersebut di atas, tingkat penyerapannya oleh bahan tanaman

(plantlet) sangat dipengaruhi oleh pH media itu sendiri. Untuk pertumbuhan, pH yang sesuai

adalah 5,0-6,5 sedangkan bila pH terlalu rendah (<4,5) atau terlalu tinggi (>7,0) dapat

menghambat atau bahkan menghentikan pertumbuhan dan perkembangan kultur secara in

vitro (Pierik, 1987 di dalam Widiastoety et al., 2005). Hasil penelitian Widiastoety et al.

(2005) menunjukkan bahwa kisaran pH terbaik terdapat pada kisaran 4,8 - 5,2 untuk

pertumbuhan tinggi plantlet, luas daun, jumlah daun, jumlah tunas anakan, panjang akar, dan

jumlah akar kultur anggrek Dendrobium (Widiastoety et al., 1997).

87

Tabel 8. Komposisi Berbagai Media Kultur Jaringan (mg L

-1)

Components Murashig

e and

Skoog,

1962

Gamborg

et al., 1968

White,

1963

Lloyd

and

McCown

1981

Vacin

and

Went,

1949

Modified

Knudson,

1946

Mitra

et al.,

1976

Nitsch

and

Nitsch,

1969

Macronutrients

Ca(PO4)2 200

NH4NO3 1650 400 720

KNO3 1900 2500 80 525 180 180 950

CaCl2.2H2O 440 150 96 166

MgSO4.7H2O 370 250 720 370 250 250 250 185

KH2PO4 170 170 250 150 150 68

(NH4)2SO4 134 500 100 100

NaH2PO4H2O 150 16.5

Ca(NO3)2.4H2O 300 556 200 200

Na2SO4 200

KCl 65

K2SO4 990

Micronutrients

KI 0.83 0.75 0.75 80 0.03

H3BO3 6.2 3 1.5 6.2 6.2 0.6 10

MnSO4.4H2O 22.3 7 0.75 0.075 25

MnSO4.H2O 10 29.43

ZnSO4.7H2O 8.6 2 2.6 8.6 0.05 10

Na2MoO4.2H2O 0.25 0.25 0.25 0.25 0.05 0.25

CuSO4.5H2O 0.025 0.025 0.25 0.025 0.05 0.025

CoCl2.6H2O 0.025 0.025 0.025

Co(NO3)2.6H2O 0.05

Na2EDTA 37.3 37.3 37.3 74.6 37.3 37.3

FeSO4.7H2O 27.8 27.8 27.8 25 27.8 27.8

MnCl2 3.9 0.4

Fe(C4H4O6)3.2H2O 28

Vitamins and other supplements

Inositol 100 100 100 100

Glycine 2 2 3 2 2

Thiamine HCl 0.1 10 0.1 1 0.3 0.3 0.5

Pyridoxine HCl 0.5 0.1 0.5 0.3 0.3 0.5

Nicotinic acid 0.5 0.5 0.5 1.25 5

Ca-panthothenate 1

Cysteine HCl 1

Riboflavin 0.3 0.05

Biotin 0.05 0.5

Folic acid

88

5.7 Penutup

Pertanyaan

1. Berikan contoh unsur hara (makro dan mikro) apa saja yang dibutuhkan

dalam pembiakan secara in vitro !

2. Berikan contoh senyawa organik apa saja yang sering digunakan dalam pembiakan

secara in vitro !

3. Berikan contoh minimal lima jenis media dasar yang dapat digunakan dalam

pembiakan secara in vitro !

4. Berikan contoh vitamin dan zat tumbuh apa saja yang sering digunakan

dalam pembiakan secara in vitro !

5. Jelaskan perbedaan antara komposisi media dasar yang satu dengan media dasar yang

lainnya!

89

Daftar Pustaka

Amilah dan Astuti, Yuni. 2006. Pengaruh Konsentrasi Ekstrak Taoge dan Kacang Hijau pada

Media Vacin and Went (VW) terhadap pertumbuhan Kecambah Anggrek Bulan

(Phalaenopsis amabilis, L). Universitas Mercu Buana.

Arsyad, Mirza A. 2008. Pertumbuhan Anak Semai Anggrek Dendrobium yang berasal dari

Protocorm Kultur Polong Hijau pada Berbagai Media secara In-Vitro. Makassar:

Universitas Hasanuddin.

Budianto, Erlita. 2009. Uji Penurunan Kadar Glukosa Darah Perasan Buah Buncis (Phaseolus

vulgaris L.) terhadap Kelinci Jantan yang Dibebani Glukosa. Surakarta: Universitas

Muhammadiyah Surakarta.

Parera, Dj.F, 1997. Pengaruh Tingkat Konsentrasi Air Kelapa Terhadap Pertumbuhan Dan

Perbanyakan Tanaman Anggrek (Dendrobium spp) Melalui Teknik Kultur Jaringan.

Jurnal Ilmu Pengetahuan Dan Teknologi Universitas Pattimura.

Prihartini, Nining B dkk. 2007. Pengaruh Konsentrasi Medium Ekstrak Tauge (MET) terhadap

Pertumbuhan Scenedesmus Isolat Subang. Depok: Departemen Biologi, FMIPA,

Universitas Indonesia.

Widiastoety, D. dan B. Marwoto. 2004. Pengaruh berbagai Sumber Arang dalam Media

Kultur In Vitro terhadap Pertumbuhan Plantlet Oncidium. J.Hort.(14(1):1-5.

Widiastoety, D. dan Purbadi. 2003. Pengaruh Bubur Ubi kayu dan Ubi jalar terhadap

Pertumbuhan Plantlet Anggrek Dendrobium. J.Hort. 13(1):1-6.

Widiastoety, D., S. Kusumo dan Syafni. 1997. Pengaruh Tingkat Ketuaan Air Kelapa dan

Jenis Kelapa terhadap Pertumbuhan Plantlet Anggrek Dendrobium. J. Hort. 7(3):768-

772.


Publisher.


Zulkarnain. 2009. Kultur Jaringan Tanaman. Solusi Perbanyakan Tanaman Budidaya. Jakarta:

Bumi Aksara

90

BAB VI. Kultur Organ

6.1 Pendahuluan

Kultur organ merupakan topik penelitian penting antara tahun 1940-1960. Setelah itu

penelitian dalam bidang ini berkurang, kecuali kultur pucuk/meristem. Kultur pucuk atau

meristem mempunyai aspek praktis sebagai cara perbanyakan klon yang cepat dan bebas

penyakit, sehingga teknik inilah yang kemudian dikembangkan oleh perusahaan-perusahaan

bibit/benih dalam skala komersil. Bab ini akan membahas mengenai pengertian, jenis, dan

prosedur pelaksanaan kultur organ. Setelah mempelajari bab ini, mahasiswa diharapkan

meemperoleh gambaran mengenai berbagai jenis kultur organ dan prosedur pelaksanaannya.

6.2 Pengertian Kultur Organ

Kultur organ merupakan kultur yang diinisiasi dari organ-organ tanaman seperti:pucuk

terminal dan aksilar, meristem, daun, batang, ujung akar, bunga, buah muda, dan embrio.

Berdasarkan asal eksplan, kultur organ dapat dibedakan menjadi kultur meristem, kultur tunas,

kultur anther/ovul, kultur akar dan kultur embrio. Pada bab ini akan dibahas lebih lanjut

mengenai masing-masing teknik kultur organ tersebut, dan beberapa dilengkapi contoh

prosedur pelaksanaannya.

6.3 Kultur Meristem

Teknik kultur meristem melibatkan pemotongan bagian pucuk tunas yang kemudian

dikulturkan dalam suatu medium hara, dan disinilah terjadi diferensiasi dan pertumbuhan

sempurna tanaman. Kultur meristem menggunakan eksplan berupa jaringan-jaringan

meristematik. Jaringan meristem yangdigunakan ialah meristem pucuk terminal atau meristem

tunas aksilar. Dalam kultur meristem kondisi yang dibutuhkan untuk tiap spesies tanaman

beragam dan harus dipastikan dengan percobaan. Kultur meristem pada umumnya digunakan

untuk perbanyakan tanaman hortikultura, eliminasi virus dari tanaman, dan penyimpanan

plasma nutfah yang bebas virus dengan cryopreservasi.

91

Prosedur yang dikemukakakan berikut ini memberikan petunjuk tentang pemilihan

medium, nisbah hormon pertumbuhan dan kondisi kultur yang diperlukan bagi kultur

meristem.

A. Perlengkapan

Perlengkapan yang digunakan pada kultur meristem antara lain:

1. Lemari aliran udara laminair atau ruang steril.

2. Lemari pertumbuhan

3. Mikroskop srereo dengan lampu luar

4. Sepasang pinset

5. Sepasang jarum runcing, nirkarat dengan pegangan kayu atau baja

6. Beberapa pisau bedah.

Catatan : pisau ini dapat dibuat dengan mematahkan silet cukur dan dipasang

padatangkai baja dan diasah supaya tajam. Silet yang digunakan harus mampu

memotong dengan baik tanpa bengkok, sebaiknyua diuji dulu beberapa merek sebelum

didapatkan silet yang betul-betul cocok untuk digunakan.

7. Tabung pyrex (12 x 100 mm) yang mengandung medium hara steril. Boleh digunakan

tabung bertutup alur atau tabung tersumbat kapas.

8. Kertas saring atau kertas serap steril.

Cara terbaik adalah dengan menumpukkan 12 lembar kertas dan digunakan lapisan

bagian dalam.

9. Etanol 70%.

10. Larutan natrium hipoklorit 6-7% atau larutan pemutih 50%.

B. Bahan dan pereaksi

B.1. Bahan tanaman

- Tanaman utuh

Bahan tanaman harus berasal dari bibit, kuncup baru dan tunas muda. Tunas dengan

bagian bunga tidak dapat digunakan.

- Bibit

92

Ini diperoleh dari benih yang baik seperti diutarakan pada prosedur pemotongan

ujung meristem.

B.2. Hormon pertumbuhan

1. Sitokinin

Gunakan kinetin atau benziladenin (BA) dalam medium dengan kadar masing-masing

10, 5, 0,5 dan 0,1 μM.

2. Auksin

Dalam medium dapat digunakan asam naftalenasetat (NAA), asam indolasetat (IAA)

atau asam indobutirat (IBA) dengan kadar seperti sitokinin. Lebih baik digunakan

NAA karena IAA tidak stabil.

Catatan : Kombinasi sitokinin dan auksin harus dibuat pada berbagai konsentrasi,

misalnya 25 kombinasi untuk 5 kadar yang disebutkan di atas.

3. Asam giberalin (GA3)

Di samping semua bahan di atas, senyawa ini juga mungkin diperlukan pada kadar

antara 1 sampai 0,01 μM.

Catatan : kadar di atas 1 μM dapat menekan pembentukan tunas pada meristem, tetapi

setelah terbentuk, pengembangan tunas dapat dipercepat.

B.3. Medium agar hara

1. Biasanya medium yang paling baik adalah medium MS, di samping itu dapat pula

digunakan medium B5. Medium B5 merupakan medium basa yang tidak mengandung

hormon pertumbuhan atau tambahan senyawa organik. Dimana susunan medium B5

dapat dilihat pada Tabel 9.

2. Tambahkan hormon pertumbuhan sesuai jumlah yang dibutuhkan.

Catatan : IAA dan IBA harus disterilkan dengan penyaringan.

3. Atur pH sampai 5,7 dengan KOH dan HCl.

93

4. Pada medium, tambahkan agar Difco-Bacto sebanyak 0,01%-0,8% dan panaskan

sampai agar larut.

5. Masukkan sebanyak masing-masing ke 2,5 ml ke dalam tabung berukuran 25 x 100

mm, sumbatlah tabung dengan kapas dan masukkan ke auotoklaf pada 17 psi (138 kPa)

selama 15 menit.

Catatan : Jika ada hormon pertumbuhan yang harus disterilkan dengan penyaringan,

maka hormon ini ditambahkan setelah dilakukan pemanasan dengan otoklaf. Tabung

reaksi disterilkan terpisah dan medium steril dibagikan dalam semua tabung tersebut.

6. Setelah pemanasan dengan auotoklaf, biarkan tabung menjadi dingin dengan suhu

kamar. Medium boleh disimpan selama 6-8 minggu pada suhu 4oC.

7. Kondisi pertumbuhan

Digunakan lemari pertumbuhan yang diprogram untuk memberi cahaya dengan

intensitas 30 – 40 W.m-2

, daur terang-gelap 16/8 jam, suhu yang beragam antara 22–

26oC, dan kelembaban nisbi 70%.

Tabel 9. Jumlah dan jenis vitamin dan hormon yang digunakan bersama medium garam mineral

untuk kultur agar dan kultur suspensi.

Senyawa M5 B5 M51

mg L-1

mg L-1

mg L-1

Inositol

Asam nikotinat

Piridoksin.HCl

Tiamin HCl

IAA

Kinetin

2,4-D

100

0,5

0,5

0,1

1 – 30

0,04 – 10

-

100

1,0

1,0

10,0

-

0,1

0,1-1,0

100

1,0

1,0

10,0

-

-

0,1 – 1,0

C. Prosedur

C.1. Penyiapan jaringan steril

a). Tanaman utuh

1) Potong bagian pucuk tunas kecambah muda sepanjang 3-5 cm dari tanaman asalnya

dengan pisau silet yang tajam.

94

2) Hilangkan semua daun dan dibilas dengan sempurna potongan pucuk tunas tadi

dengan etanol 70%.

3) Celupkan dalam larutan natrium hipoklorit 7% atau dalam larutan pemutih 50%

selama 5-10 menit. Ke dalam larutan desinfektan ini boleh ditambahkan Tween 20

atau Tween 80 (0,01%) untuk meningkatkan daya pembasahnya.

4) Cuci 5-6 kali dengan air suling steril.

b). Bibit

a) Rendam benih dalam air dan buang benih yang mengapung.

b) Bilas benih dengan sempurna dalam larutan etanol 70%.

c) Rendam benih dalam larutan pemutih 50% menggunakan labu Erlemeyer 250 ml

bertutup, lalu tempatkan pada pengocok selama 15-20 menit.

d) Dekantasi, lalu cuci 4-5 kali dengan air suling steril untuk menghilangkan sisa

desinfektan.

e) Kecambahkan benih secara aseptik diatas 2-3 lapisan kertas saring atau kertas

penyerap dalam cawan Petri. Tambahkan 5 ml air suling untuk melembabkan kertas

tersebut.

f) Tempatkan 5-10 benih pada setiap cawan (tergantung besarnya), dan inkubasikan

pada suhu kamar (19-21oC). Dua sampai tiga hari setelah pengecambahan, meristem

dapat dipotong dari ujung tunas.

C.2. Pemotongan ujung meristem

Pemotongan harus dilakukan secar aseptik, sebaiknya dalam lemari aliran udara laminar.

Dapat pula dilakukan dalam kondisi semi-steril, karena ujung meristem terlindung dalam

banyak gulungan daun dan biasanya bebas dari pencemaran.

1. Sterilkan perlengkapan yang digunakan (pisau, jarum dan pinset) dengan merendamnya

dalam larutan etanol70%, bilas dengan air suling dan keringkan dengan kertas saring atau

kertas penyerap steril.

Catatan : Tindakan ini harus dilakukan setiap saat akan memulai pemotongan dan

dilakukan sesering mungkin.

95

2. Bersihkan mikroskop dan tempat pemotongan dengan etanol 70%.

3. Peganglah pucuk tunas yang disucihamakan ini dengan pinset pada sebelah tangan di

bawah mikroskop dengan perbesaran yang layak (10-50x).

4. Hilangkan lapisan daun bagian luar dengan pisau steril yang tajam sampai pucuk

meristem terlihat. Di bawah mikroskop bagian ini terlihat mengkilat.

5. Dengan pisau, buat 4 irisan pada dasar pucuk meristem masing-masing pada sudut yang

benar, ambil hati-hati dan tanam segera pada medium agar.

Catatan : Pucuk meristem harus mengandung bagian jaringan prokambium. Daun

primordia tidak perlu dihilangkan kecuali jika kultur dimaksudkan untuk menghilangkan

virus sistemik.

6. Inkubasikan tabung yang berisi meristem dalam lemari pertumbuhan.

Catatan : sebaiknya lakukan juga uji kondisi pertumbuhan yang lain, misalnya 40 W.m-2

(cahaya lampu pijar), periode terang 16/8 jam pada suhu (beragam) berkisar antara 15-

24oC.

7. Jika cikal terbentuk, biasanya setelah 4-6 minggu, pindahkan dari tabung reaksi, buang

medium agar dari sistem akar di bawah air ledeng mengalir dan tanamkan dalam pot yang

mengandung vermikulit atau perlit. Tanaman sebaiknya tetap ditutupi dengan gelas piala

atau kantung plastik sampai tumbuh mapan. Sirami tiap minggu dengan larutan hara

Hoagland (Tabel 8).

Ukuran pucuk meristem akan menentukan kemampuannya untuk bertahan dalam medium

hara walaupun pada kondisi optimum. Jika pucuk meristem diisolasi bersama daun primordia

dan bagian jaringan prokambiumnya, daya hidupnya lebih besar. Untuk kebutuhan

perbanyakan umumnya, diajurkan untuk menggunakan meristem bersama daun primordianya.

Sebaliknya, jika tujuannya adalah menghilangkan infeksi virus sitematik, meristem harus

bebas dari daun primordia dan ukuran pucuk tidak boleh melampaui 0,2-0,5 mm.

Walaupun pada umumnya meristem yang berasal dari berbagai tanaman dengan genus

yang berbeda-beda dapat dikulturkan pada medium padat, anggrek tertentu seperti Cattleya

lebih baik tumbuh pada medium cair, karena meristem yang dipotong akan mengeluarkan

senyawa beracun ke dalam medium kultur. Karena itu dalam hal semacam ini dan barangkali

96

juga pada kasus tertentu lainnya, medium harus sering diganti (tiap 2-3 hari) dengan medium

segar.

97

6.4 Kultur Embryo, Embryo Rescue

A. Induksi Pembentukan Embrio (Embriogenesis) Pada Kultur In vitro

Dalam kultur in vitro tanaman banyak diarahkan untuk pembentukan embrio. Hal tersebut

dilakukan dengan cara memindahkan sebagian kalus yang terbentuk dari hasil sub-kultur ke

medium cair. Perbanyakan dalam medium cair dapat dilakukan berulang-ulang. Embrio dapat

dihasilkan dari kalus yang tumbuh pada medium padat, tetapi embriogenesis lebih sering

terjadi pada medium cair. Oleh karena itu, embrio yang dihasilkan pada kultur cair tersebut

kemudian dapat diisolasi dan dipindahkan ke medium padat sampai terbentuk planlet yang

siap dipindahkan ke medium tanah. Proses pembentukan embrio dari sel somatik atau jaringan

disebut sebagai proses embriogenesis somatik. Embriogenesis somatik umum terjadi pada

famili Ranunculaceae, Rutaceae, Solanaceae, Umbelliferae, dan Gramineae. Ada dua macam

embrio somatik yang dapat terbentuk yaitu :

1. Embrio yang terbentuk secara langsung dari sel atau jaringan tanpa melalui pembentukan

kalus. Embrio semacam ini dapat terbentuk misalnya dari sel-sel epidermis hipokotil

(misalnya pada Ranunculaceae sceleratus, Linum usitatissimum, Brassica napus). Sel-sel

yang dapat membentuk embrio semacam ini disebut Pre-Embryonic Determined Cells

(PEDC).

2. Embrio yang terbentuk secara tidak langsung yaitu melalui tahapan pembentukan kalus.

Embrio semacam ini misalnya dapat terbentuk dari eksplan daun Coffea arabica, Petunia

hibrida, Asparagus officinalis. Induksi pembentukan embrio dari kalus atau eksplan

memerlukan penambahan auxin ke dalam medium yang digunakan. Meskipun demikian

untuk beberapa tanaman seperti wortel, pembentukan embrio dari kalus tidak memerlukan

penambahan auxin. Sel-sel yang membentuk embrio setelah diinduksi semacam ini

disebut sebagai Induced Embryogenic Determined Cells (IEDC).

Senyawa yang biasanya digunakan untuk menginduksi pembentukan embrio adalah 2,4-D

(2,4-dichlorophenoxy acetic acid), 2,4,5-T (2,4,5-trichlorophenoxy acetic acid) dan picloram.

Beberapa tanaman dikotil dan monokotil dapat diinduksi untuk membentuk embrio dengan

senyawa semacam ini. Beberapa senyawa auxin lain yang juga dapat digunakan untuk induksi

98

embrio somatik adalah IAA dan IBA. Sebaliknya, gibberelin dan etilen biasanya menghambat

embriogenesis.

B. Teknik Embryo Rescue

Hibrid yang dapat hidup (viable) dihasilkan dari hasil persilangan seksual antara dua

varietas suatu spesies. Jika persilangan seksual dilakukan antar spesies dalam satu genus atau

bahkan antar genus, maka biasanya sukar untuk dihasilkan hibrid karena adanya beberapa

hambatan selama penyerbukan, pembuahan, atau embriogenesis. Dalam keadaan semacam ini

biasanya embrio yang dihasilkan tidak berkembang. Untuk menyelamatkan embrio semacam

itu maka dapat dilakukan pengambilan embrio yang belum matang dari biji dan

menumbuhkannya dalam medium buatan untuk menghasilkan planlet. Teknik untuk

menumbuhkan embrio yang belum matang semacam ini disebut embryo rescue. Dengan

teknik ini dapat dilakukan persilangan antar dua varietas liar dan varietas yang dikultivasi.

Persilangan semacam ini mempunyai potensi yang besar dalam pemuliaan tanaman karena

pada umumnya varietas liar mempunyai ketahanan yang lebih tinggi terhadap hama dan

penyakit dibanding varietas yang sudah dikultivar.

6.5 Kultur Anter/Ovul

A. Metode Kultur Anter/Ovul

Anter adalah kepala sari, pada kultur anter atau kultur tepung sari pada hakekatnya sama

yang diharapkan adalah kultur tepung sarinya. Pada anter anggrek, tepung sari masih terdapat

di dalam operculum. Kunci keberhasilan kultur anter adalah memacu tahap pertama untuk

terjadi pembentukkan kalus, setelah itu dilanjutkan pada tahap untuk menumbuhkan plantet

diantaranya yaitu dengan beberapa metode, yaitu:

1. Metode pertama adalah metode dimana media tersebut sanggup menumbuhkan eksplan

melalui kalus terus menjadi plantula, contohnya pada medium VW untuk kultur

jaringan anggrek.

2. Metode kedua adalah metode yang digunakan untuk menumbuhkan plantet menjadi

plantula dengan pindah media, karena pada media pertama hanya terbentuk kalus,

99

kemudian tidak berkembang menjadi tunas atau akar. Setelah terbentuk kalus, kalus

dipindahkan ke media baru dengan tujuan agar tejadi pertumbuhan yang sempurna.

Harus diperhatikan dalam kultur anther adalah zat-zat tambahan yang dibutuhkan pada

media induksi kalus dan media diferensiasi (menumbuhkan kalus menjadi plantula) adalah

berbeda. Zat tambahan atau hormon untuk induksi kalus adalah 2,4-D atau NAA pengganti

2,4-D. Sedangkan untuk media diferensiasi adalah kombinasi sitokinin dan auksin, 2,4-D tidak

digunakan dan kadar sukrosanya dikurangi.

Pada pelaksanaannya seringkali anthernya diikutkan untuk dikulturkan agar pertumbuhan

serbuk sarinya lebih baik. Hanya harus hati-hati karena setelah tumbuh membentuk kallus

maka kita harus dapat memastikan sel mana yang merupakan sel kalus yang berasal dari sel

gamet jantan (serbuk sari) dan mana yang merupakan sel somatik/anther. Setelah didapatkan

tanaman anggrek yang dapat tumbuh dengan baik maka tanaman tersebut dapat kita perbanyak

dengan multiplikasi biasa atau dengan teknik klon.

B. Prosedur Inisiasi Kultur Anter

Berikut ini adalah contoh prosedur inisiasi kultur anther asparagus.

1. Alat-alat yang digunakan :

a) Peralatan gelas (botol kultur, gelas piala, cawan Petri 100 x 15 mm, gelas ukur),

b) Laminar Air Flow (LAF) yang dilengkapi dengan lampu UV,

c) Ruang inkubasi dengan AC,

d) Peralatan diseksi seperti pinset, pisau dan skalpel,

e) Kertas tisue, kertas steril, lampu spiritus, botol sprayer, rak kultur dengan lampu 40

watt

2. Bahan yang digunakan :

a) Antera padi dan asparagus,

b) Aquades steril,

c) Bahan sterilan (Alkohol 70%, bayclin/Sunclin 20%),

d) Kertas saring steril,

e) Media induksi: MS + 2,4-D 1 mg/l

+ BAP 0,1 mg/l + NAA 0,5 mg/l + sukrosa 50 g/l +

agar swallow 8g/l, pH media 5,8.

100

3. Langkah Kerja

1. Siapkan peralatan dan bahan untuk sterilisasi antera padi dan asparagus di dalam

laminar air flow. Bahan tanaman berupa malai padi dan bunga asparagus sebelumnya

sudah dilakukan ”pretreatmen” dengan suhu dingin 5-10o C selama 5 hari.

2. Buka batang padi yang berisi malai dengan menggunakan pisau. Potong tangkai malai

dan masukan dalam botol steril. Begitu pula dengan bunga asparagus, pisahkan bunga

yang masih kuncup dan masukkan dalam botol steril.

3. Secara terpisah, sterilkan kedua bunga tersebut dengan merendam secara berurutan

dalam alkohol 70% selama 2 menit. Kemudian dilanjutkan dengan bayclin/Sunclin 20%

selama 20 menit. Setelah itu bilas dengan aquades steril sebanyak 3-5 kali.

4. Setelah dibilas pindahkan bunga pada cawan Petri steril yang beralas kertas kering.

5. Untuk memudahkan isolasi/penanaman antera padi pada media. Potong kurang lebih1/3

bagian bulir bunga padi dari bagian pangkal bulir. Demikian pula dengan bunga

asparagus.

6. Jepit bagian ujung bulir/bunga yang tidak dipotong dengan menggunakan pinset.

Arahkan bagian bulir/bunga yang telah dipotong pada permukaan media, kemudian

ketukkan pinset pada bibit cawan sehingga antera jatuh pada permukaan media.

7. Satu cawan Petri ukuran 100 x 15 mm sebaiknya berisi 100-120 anther.

8. Tutup cawan Petri dan rekatkan dengan menggunakan parafilm.

9. Inkubasi biakan antera pada suhu ruang dalam keadaan gelap. Setelah dua minggu,

amati pembentukan kalus setiap minggu.

Kultur anther tanaman asparagus dilakukan untuk menghasilkan tanaman homosigot yang

penting untuk menghasilkan hibrida terkendali karena tanaman asparagus nerupakan tanaman

dioecious yang menghasilkan bunga betina dan bunga jantan pada tanaman yang berlainan.

Tanaman jantan lebih disukai, karena produksi rebungnya lebih tinggi dan kwalitas rebungnya

lebih baik.

Sebelum melakukan penanaman anther asparagus, bunga asparagus dipilih yang masih

kuncup dan belum mekar. Bunga yang masih kuncup dipetik dan dimasukkan ke dalam botol

kemudian disterilkan dengan merendam dalam 70% alkohol dan 20% Bayclin. Setelah itu

bilas dengan aquades steril. Kuncup yang sudah steril dipotong kurang lebih1/3 bagian kuncup

101

asparagus dan dikumpulkan dalam cawan Petri steril. Kemudian diambil anther dalam putik

menggunakan skalpel. Setelah itu, ditanam di cawan Petri yang sudah berisi media.

Demikian juga terhadap eksplan anther padi, malai diseleksi untuk mendapatkan anther

yang berisi butir sari/mikrospora uninukleat. Malai terpilih kemudian disterilkan dengan

merendam dalam 70% alkohol dan 20% Bayclin. Spikelet yang sudah steril dipotong sepertiga

bagian dari pangkalnya dan dikumpulkan pada cawan Petri steril. Masing-masing spikelet

kemudian dijepit dengan pinset dan diketukkan pada tepi cawan Petri yang berisi 20 ml media

induksi kalus, sampai antera keluar dan jatuh ke atas media. Selanjutnya kultur diinkubasi

dalam ruang gelap (25 +/- 2oC) untuk menginduksi kalus dari butir sari di dalam anther.

Keberhasilan kultur anther dipengaruhi oleh berbagai faktor, yaitu genotipe tanaman,

komposisi media kultur, kondisi tanaman donor, tahap perkembangan pollen dan pra

perlakuan sebelum anther diinisiasi. Pra perlakuan yang diberikan pada eksplan anther padi

dan asparagus adalah ”preatreatmen” yaitu penyimpanan eksplan malai padi dan kuncup

bunga asparagus pada suhu dingin 5-10°C selama 5 hari. Beberapa kelemahan kultur anther

adalah kecilnya persentase regenerasi, albino, dan tidak semua genotipe responsif terhadap

kultur anter.

6.6 Penutup

Evaluasi

A. Kultur Organ

1. Jelaskan secara singkat proses pembentukan organ/organogenesis pada kultur jaringan

tanaman!

2. Jelaskan fungsi zat pengatur tumbuh dalam proses pembentukan organ/organogenesis

pada kultur jaringan tanaman!

3. Mengapa dalam teknik kultur in vitro, bahan eksplant sebaiknya menggunakan jaringan

dari tanaman muda yang sedang tumbuh aktif?

4. Jelaskan fungsi dari etanol 70% dan larutan Javex 20% (larutan natrium hipoklorit 1,2%)

dalam prosedur sterilisasi eksplant!

102

5. Sebutkan faktor-faktor yang mempengaruhi keberhasilan pertumbuhan tunas pada kultur

in vitro!

B. Kultur Meristem

1. Jelaskan apa yang dimaksud dengan kultur meristem!

2. Mengapa kultur meristem, tunas dengan bagian bunga tidak dapat digunakan?

3. Mengapa pada kultur in vitro, penggunaan hormon pertumbuhan dari jenis auksin

sebaiknya menggunakan NAA dibanding IAA?

4. Mengapa pada kultur meristem yang tujuannya untuk menghilangkan infeksi virus

sitematik, meristem harus bebas dari daun primordia?

5. Beberapa tanaman tertentu jika ditumbuhkan dengan metode kultur meristem,

pertumbuhannya lebih baik di medium cair. Jelaskan mengapa demikian!

C. Kultur Embrio

1. Jelaskan perbedaan antara embrio yang terbentuk secara langsung dengan embrio yang

terbentuk secara tidak pada Embriogenesis somatik!

2. Apa yang dimaksud dengan embryo rescue? dan jelaskan pula apa tujuannya!

3. Jelaskan pula apa yang dimaksud dengan kultur anther dan kultur ovul serta sebutkan

faktor-faktor yang mempengaruhi keberhasilan kultur anther/ovul!

4. Jelaskan secara singkat metode penumbuhan plantlet pada kultur anther/ovul!

5. Sebutkan faktor-faktor yang harus diperhatikan dalam kultur anther!

103

Daftar Pustaka










Wetter, L.R. dan F. Constabel. 1982. Plant Tissue Culture Methods. Diterjemahkan oleh


Penerbit ITB.



Publisher.


Bumi Aksara.


104

BAB VII. Kultur Kalus

7.1 Pendahuluan

Kultur kalus dilakukan untuk perbanyakan klon tanaman melalui pembentukan organ dan

embrio, regenerasi varian-varian genetika, mendapatkan tanaman bebas virus, sebagai sumber

untuk produksi protoplas, bahan awal untuk kriopreservasi, produksi metabolit sekunder, dan

biotransformasi. Bab ini akan menjelaskan mengenai pengertian, tujuan, faktor-faktor yang

menentukan induksi kalus, dan memberikan contoh prosedur pelaksanaan kultur kalus. Setelah

mempelajari bab ini mahasiswa diharapkan mengetahui pengertian, tujuan, dan faktor yang

menentukan induksi kalus serta memperoleh gambaran prosedur pelaksanaan kultur kalus.

7.2 Pengertian dan tujuan

Kalus merupakan kumpulan sel yang belum terdeferensiasi yang berasal dari sel-sel

jaringan parenkim yang membelah diri secara terus menerus. Secara alami di alam, kalus

umumnya terbentuk pada bekas luka akibat serangan serangga, nematoda, atau oleh

Agrobacterium tumefaciens. Dalam pembiakan in vitro kalus diperoleh dari potongan eksplan

yang steril. Kalus memiliki pertumbuhan yang tidak terkendali dan memiliki potensi untuk

berkembang membentuk organ (pucuk dan/atau akar dan embrioid) yang dapat membentuk

planlet.

Kultur kalus pada umumnya diinisiasi dari jaringan atau organ yang telah diinkubasi

selama periode tertentu di dalam media kultur. Laju perbanyakan sel yang sangat cepat pada

kultur kalus merupakan respon terhadap pelukaan atau pengaruh hormon pertumbuhan yang

diberikan ke media kultur. Sel kalus menunjukkan peningkatan dalam aktivitas sitoplasmik,

yang diikuti oleh meningkatnya sintesis protein dan laju respirasi. Secara umum berdasarkan

laju kecepatan pembelahannya sel tanaman dibagi atas:

1. Sel yang kecepatan membelahnya lambat (membutuhkan waktu kurang lebih satu bulan

untuk membelah)

2. Sel yang kecepatan membelahnya sedang (membutuhkan waktu sekitar 2 minggu untuk

membelah)

3. Sel yang cepat membelah (membutuhkan waktu sekitar 10 hari)

105

7.3 Faktor yang mempengaruhi induksi kalus

Pada umumnya untuk eksplan yang mempunyai kambium tidak perlu penambahan ZPT

untuk menginduksi terbentuknya kalus karena secara alamiah pada jaringan berkambium yang

mengalami luka akan tumbuh kalus untuk menutupi luka yang terbuka. Namun pada kasus

lain, menurut Kordan (1959 dalam Dodds & Robert, 1983) keberadaan kambium di dalam

eksplan tertentu dapat menghambat pertumbuhan kalus bila tanpa penambahan zat pengatur

tumbuh eksogen. Penambahan ZPT tersebut dapat satu macam atau lebih tergantung dari jenis

eksplan yang digunakan. Pembelahan sel di dalam eksplan dapat terjadi tergantung dari ZPT

yang digunakan, seperti auksin, sitokinin, auksin dan sitokinin, dan ekstrak senyawa organik

komplek alamiah.

Berdasarkan kebutuhan akan zat pengatur tumbuh untuk membentuk kalus, jaringan

tanaman digolongkan dalam 4 kelompok:

1) Jaringan tanaman yang membutuhkan hanya auksin selain gula dan garam-garam mineral

untuk dapat membentuk kalus seperti umbi artichoke

2) Jaringan yang memerlukan auksin dan sitokinin selain gula dan garam-garam mineral

3) Jaringan yang tidak perlu auksin dan sitokinin, hanya gula dan garam-garam mineral

seperti jaringan cambium

4) Jaringan yang membentuk hanya sitokinin, gula dan garam-garam mineral seperti

parenkim dan xylem akar turnip.

Pada umumnya kemampuan pembentukkan kalus dari jaringan tergantung juga dari:

1) Umur fisiologi dari jaringan waktu diisolasi

2) Musim pada waktu bahan tanaman diisolasi

3) Bagian tanaman yang dipakai

4) Jenis tanaman.

Kalus dapat diinisiasi dari hampir semua bagian tanaman, tetapi organ yang berbeda

menunjukkan kecepatan pembelahan sel yang berbeda pula. Jenis tanaman yang menghasilkan

kalus, meliputi dikotil berdaun lebar, monokotil, gymnospermae, pakis dan moss. Bagian

106

tanaman seperti embrio muda, hipokotil, kotiledon dan batang muda merupakan bagian yang

mudah untuk dediferensiasi dan menghasilkan kalus.

Suatu sifat yang diamati dalam jaringan yang membentuk kalus adalah bahwa

pembelahan sel tidak terjadi pada semua sel dalam jaringan asal, tetapi hanya sel di lapisan

perisfer yang membelah terus menerus sedangkan sel-sel di tengah tetap quiscent. Faktor-

faktor yang menyebabkan inisiasi pembelahan sel hanya terbatas di lapisan luar dari jaringan

kalus, adalah:

1) Ketersediaan oksigen yang lebih tinggi

2) Keluarnya gas CO2

3) Kesediaan hara yang lebih banyak

4) Penghambat yang bersifat folatik lebih cepat menguap

5) Cahaya

Dalam mempelajari proses pembentukan kalus sebagai akibat perlakuan, empat lapisan

sel yang berbeda dalam wortel yang dikultur pada berbagai media. Lapisan-lapisan sel yang

berbeda terlihat jelas tiga hari setelah kultur terdiri:

1) Lapisan luar dengan sel-sel yang pecah

2) Lapisan kedua terdiri dari dua lapisan sel dorman

3) Lapisan dengan sel yang aktif membelah, terdiri dari 1-6 lapis

4) Lapisan tengah (core) yang sel-selnya tidak membelah.

Induksi kalus dalam jaringan wortel ini, disertai dengan aktifitas enzim-enzim NAD-

diaphorase succinic dehydrogenase dan cytochrome oxidase yang meningkat. Kenaikan

aktifitas enzim terutama dalam lapisan sel yang sedang membelah. Dalam jaringan ini juga

ditemukan aktifitas asam fosfatase. Pada kultur artichoke, enzim fosfatase diditeksi pada

permukaan sel-sel yang tidak membelah. Menurut hipotesa Yeoman pada tahun 1970, asam

fosfatase berhubungan dengan sel rusak dan enzim ini adalah index autolysis sel. Pada sel

107

yang rusak tapi tidak pecah di lapisan perisfer, terjadi autolisis dan sel-sel yang rusak tersebut

mengeluarkan persenyawaan yang dapat memacu pembelahan sel di lapisan berikutnya.

Eksplan batang, akar dan daun menghasilkan kalus yang heterogen dengan berbagai

macam sel. Kadang-kadang jaringan yang kelihatannya seragam histologinya, ternyata

menghasilkan kalus dengan sel yang mempunyai DNA yang berbeda yang mencerminkan

level ploidi yang berbeda. Begitupun pada kultur akar kalus yang dihasilkan dapat berupa

campuran sel dengan tingkat ploidi yang berbeda.

Sel-sel yang heterogen dari jaringan yang komplek menunjukkan pertumbuhan yang

berbeda. Dengan mengubah komposisi media, terjadi seleksi sel-sel yang mempunyai sifat

khusus. Hal ini berarti bahwa media tumbuh menentukan komposisi kalus. Sel yang

jumlahnya paling banyak merupakan sel-sel yang paling cepat membelah dan sel yang paling

sedikit adalah sel yang paling lambat pertumbuhannya. Media seleksi dapat berdasarkan

unsur-unsur hara atau zat pengatur tumbuh yang ditambahkan ke dalam media.

Sel heterogen berasal dari materi asal yang heterogen pula, atau dapat terjadi karena

massa kultur yang panjang melalui sub kultur yang berkali-kali. Perubahan yang terjadi dapat

merupakan:

1) Aberasi kromosom

2) Endo-reduplikasi yang menghasilkan poloploidi

3)Amplifikasi gen, jumlah gen untuk suatu sifat tertentu per genome haploid bertambah

4) Hilangnya suatu gen (deletion)

5) Mutasi gen

6) Transposisi urutan DNA (DNA sequences transposition).

Kecepatan perubahan-perubahan dalam kromosom ini, tergantung juga dari macam media

yang digunakan, serta jenis tanamannya. Ketidakstabilan kromosom ini menyulitkan aplikasi

kultur kalus untuk perbanyakan maupun untuk produksi bahan-bahan/persenyawaan sekunder.

Sebaliknya ketidak-stabilan tersebut dapat dipergunakan dalam seleksi dan pemuliaan invitro,

untuk memperoleh sifat-sifat baru yang menguntungkan seperti resistensi terhadap penyakit,

hilangnya morfologi yang memang tidak diinginkan seperti duri atau warna pada bunga.

108

Kalus yang tumbuh secara invivo pada batang tanaman biasanya disebut dengan tumor,

ciri-ciri tumor adalah sebagai berikut:

1) Terjadi penyakit yang infeksinya melalui luka (Crown gall disease)

2)Jaringan tumor yang terjadi dapat tumbuh terus, walaupun penyebabnya yang berupa

bakteri Agrobacterium tumefacien telah dihilangkan

3) Tumor ini bila ditumbuhkan pada media buatan tidak memerlukan auksin maupun

sitokinin. Ketidaktergantungan jaringan tanaman untuk tumbuh dan terus membelah

disebut habituation.

Massa kultur yang ditumbuhkan terlalu lama dalam media yang tetap, akan menyebabkan

terjadinya kehabisan hara dan air. Kehabisan hara dan air dapat terjadi karena selain terhisap

untuk pertumbuhan juga karena media menguapkan air dari masa ke masa. Kalus tersebut

kecuali kehabisan unsur hara, kalus juga mengeluarkan persenyawaan-persenyawaan hasil

metabolisme yang menghambat pertumbuhan kalus itu sendiri. Untuk menjaga kehidupan dan

perbanyakan yang berkesinambungan, kalus yang dihasilkan perlu disubkulturkan.

Street (1969 dalam Dodds & Robert 1983) menyarankan massa sel yang dipindahkan

pada subkultur harus cukup banyak antara 5-10 mm atau seberat 20-100 mg, supaya ada

pertumbuhan yang cepat dalam media baru. Subkultur sebaiknya dilakukan 28 hari sekali (4-6

minggu sekali). Namun waktu yang tepat untuk memindahkan kultur, tergantung dari

kecepatan pertumbuhan kalus. Massa kalus ada 2 macam yaitu massa yang remah (friable) dan

kompak. Bila massa kalus remah maka pemindahan kalus cukup dilakukan dengan

menyendok kalus dengan spatula atau skapel langsung disubkultur ke media baru. Namun bila

kalus kompak mesti dipindah ke Petridish steril untuk dipotong-potong dengan skapel baru

disubkultur ke media baru. Kalus yang sudah mengalami nekrosis (pencoklatan) sebaiknya

tidak ikut disubkultur karena tidak akan tumbuh dengan baik.

7.4 Prosedur Pelaksanaan Kultur Kalus

Berikut ini adalah contoh prosedur pelaksanaan kultur kalus pada Nilam (Pogostemon

cablin):

1. Bahan dan Alat

109

Bahan-bahan yang diperlukan untuk aplikasi kultur kalus nailam, yaitu (1) kalus nilam

yang diperoleh dari kultur potongan batang, (2) alkohol 70%, (3) air steril, dan (4)

medium MS (murashige dan Skoog, 1962) padat yang mengandung 5 μM NAA + 5 μM

BAP.

Alat-alat yang digunakan, yaitu (1) laminar air flow cabinet (LAFC), (2) cawan Petri, (3)

lampu spiritus, (4) gelas piala, (5) pipet + pipet filler, dan (6) alat-alat tanama (pinset,

tangkai skalpel, dan pisau skalpel).

2. Cara kerja

Semua prosedur dilaksanakan secara aseptik dalam LAFC. Kalus nilam dikeluarkan dari

botol kultur dengan hati-hati, diletakkan dalam cawan Petri steril. Kalus dipotong dengan

ukuran kira-kira 0,5 cm3, lalu segera tanamkan pada medium yang telah disiapkan. Perlu

diperhatikan, agar sias-sisa medium dari botol yang lama tidak terbawa ke dalam botol yang

baru. Peliharalah kultur dalam ruang kultur dengan intensitas cahaya 50 μmol m-2

s-1

dan

fotoperiodesitas 16 jam.

Pengamatan dilakukan terhadap peubah-peubah, seperti pertambahan berat eksplan dan

embriogenesis somatik (Zulkarnain, 2009).

Regenerasi tanamana setelah melalui fase kalius, dapat terjadi melalui salah satu dari

keadaan di bawah ini.

1. Regenerasi melalui dua langkah prosedur :

a. Masa inkubasi pada medium yang mengandung auksin + sitokinin,

b. Masa regenrasi dengan memindahkan kalus ke medium tanpa auksin, tetapi

mengandung sitokinin.

2. Regenerasi terjadi melalui medium dengan perbandingan sitokonin lebih tinggi daripada

auksin yang tepat. Pada Solanaceae dibutuhkan sitokinin lebih tinggi daripada auksin.

3. Regenerasi terjadi pada konsentrasi absolut auksin dan sitokinin tertentu, misalnya NAA 2

μM + Kinetin 2 μM.

4. Regenerasi terjadi pada kalus yang diinduksi dengan jenis auksin tertentu, misalnya

asparagus dengan NAA atau IAA, bukan 2,4-D.

110

5. Regenerasi terjadi bila ada penambahan zat-zat tertentu, misalnya ABA atau giberelin

(Zulkarnain, 2009).

Contoh lain pada kultur kalus atau kultur sel yaitu pada kultur bibit wortel, dimana

tahapan pelaksanaannya adalah sebagai berikut :

1. Tempatkan 3-5 potong irisan akar atau petiolasi berukuran 0,5 cm dari bibit steril, pada

medium B5 yang mengandung 0,1 mg/l 2,4-D (0,1-B5) yang dipadatkan dengan agar

Bacto Difco 0,6%. Wadah yang cocok adalah botol gelas, labu atau bejana plastik dengan

tutup beralur yang telah di sterilkan.

2. Inkubasikan irisan tersebut di tempat yang gelap (redup cahaya) pada suhu 26-28oC.

3. Setelah 3-4 minggu, kalus akan berukuran sekitar 5 kali eksplannya.

4. Pindahkan kalus dari 2-3 wadah ke dalam medium cair 0,1-B5 sebanyak 20 ml dalam labu

125 ml

5. Inkubasikan labu pada pengocok putar dengan laju 150 rpm di bawah cahaya terus-

menerus dan suhu 26oC.

6. Pembuatan subkultur. Pada tahap awal mungkin perlu dilakukan dekantasi sebagian

medium yang terpakai tiap selang waktu 2 minggu dengan memipetnya dan menggantinya

dengan medium baru. Suspensi sel akan terbentuk dalam waktu 4-6 minggu. Pada tahap

awal pembentukan subkultur, sebaiknya digunakan pengenceran yang sangat rendah

misalnya dengan nisbah: medium segar (baru) 1 : 1 sampai 1 : 4.

Metode kultur pada wortel juga dapat digunakan untuk jaringan dengan menggunakan

beberapa modifikasi pada tanaman yang lain misalnya :

1. Kedelai

Akar dan irisan hipokotil lebih baik. Pembentukan kalus lebih cepat jika 2,4-D

ditambahkan sampai 1 mg L-1

(1-B5). Penambahan 1 μM kinetin mungkin juga

menguntungkan. Biasanya, jika sel ditumbuhkan dalam 2,4-D, tidak dibutuhkan kinetin

dalam medium cair.

2. Kacang Polong

Akar, irisan epikotil atau irisan tunas dapat digunakan untuk membentuk kalus kacang

polong. Medium B5 harus ditambah dengan kasein hidrolisat 2,0 g L-1

(1-B5C).

111

Pembentukan kalus lambat dan dibutuhkan waktu 2 bulan sebelum terjadi kultur suspensi.

Kultur suspensi dapat pula dimulai dengan memindahkan 10-15 irisan epikotil atau akar

berukuran 0,5 cm ke dalam medium cair 1-B5C sebanyak 10 ml dalam labu 50 ml dan

diinkubasi sesuai cara yang diperkirakan untuk produksi kalus akar.

3. Cemara Douglas (Pseudotsuga menziesii (Miirb) Franco)

Kuncup yang mengembang diambil dari pohon cemara Douglas yang dipelihara dalam

rumah kaca. Permukaan kuncup tersebut disterilkan selama 2 menit dalam etanol 70% dan

dalam cairan pemutih 20% selama 15 menit dengan pengocokan, lalu dibilas dengan air.

Ujung tunas tersebut diiris dengan skalpel, dan diletakkan dalam medium agar B5 yang

mengandung 1 mg L-1

2,4-D dan diinkubasi pada 26oC. Kalus akan terbentuk dalam

cahaya. Pada pemindahan ke medium cair 1-B5 akan diperoleh kultur suspensi yang akan

tumbuh dengan cara cepat dan bebas dari agregat sel.

4. Kultur sel gandum, jelai, dan jagung

Kalus akan terbentuk dalam gelap dari irisan akr atau irisan mesokotil yang berasal dari

bibit steril yang ditumbuhkan pada medium agar B5 yang mengandung 1 mg L-1

2,4-D (1-

B5). Kalus akan terbntuk dengan lambat. Prosedur untuk mendapatkan kultur kalus

seperti wortel namun membutuhkan waktu yang relatif lebih lama.

7.5 Penutup

Evaluasi

1. Jelaskan apa yang dimaksud dengan kultur kalus!

2. Apa yang dimaksud dengan kalus homogen dan bagaimana cara memperoleh kalus

homogen tersebut?!

3. Jelaskan tujuan pembentukan kalus!

4. Sebutkan zat-zat yang dapat merangsang pembentukan kalus!

5. Sebutkan faktor-faktor yang dapat mempengaruhi keberhasilan kultur kalus!

6. Buatlah skema yang menggambarkan proses kultur kalus hingga terbentuk tanaman

kembali!

112

Daftar Pustaka










Wetter, L.R., dan F. Constabel. 1982. Plant Tissue Culture Methods. Diterjemahkan oleh


Penerbit ITB.



113

BAB VIII. Kultur Protoplas

8.1 Pendahuluan

Istilah protoplasma diperkenalkan pertama kali oleh Hanstein pada tahun 1880. Istilah

tersebut merujuk pada sel tumbuhan yang telah dihilangkan bagian diding selnya atau sel

tumbuhan telanjang tanpa dibungkus oleh dinding sel. Protoplas dapat dimanfaatkan untuk

mendukung penelitian dasar biologi tanaman dan merupakan sarana penting di bidang

rekayasa genetik, misalnya untuk hibridisasi somatik untuk meningkatkan kualitas tanaman.

Bab ini akan membahas mengenai pengertian, tujuan, dan prosedur pelaksanaan fusi

protoplast.

8.2 Pengertian dan tujuan kultur protoplas

Istilah protoplas pertama kali digunakan oleh Hanstein pada tahun 1880. Istilah ini

mengacu pada semua bagian dari sel kecuali dinding sel. Dalam modifikasi genetic tanaman,

sering kali keberadaan dinding sel justru menyulitkan modifikasi tersebut, oleh karena itu pada

beberapa upaya modifikasi dinding sel harus dihilangkan. Isolasi protoplas pertama dilakukan

oleh Klercker (Pati, et al., 2008) yang mengisolasi protoplas Stratiotes aloides dengan

melakukan pemberdahan mikro pada sel. Protoplas yang duperoleh dari prosedur ini pada

umumnya digunakan untuk mempelajari fisiologi tumbuhana. Namun kelemahan teknik ini

adalah tingginya tingkat kerusakan sel dan rendahnya tingkat keberhasilan isolasi. Teknik

isolasi protoplast yang baru kemudian dikembangkan oleh Cocking (1960) dengan

menggunakan enzim.

Teknik isolasi protoplas secara enzimatik dilakukan dengan mempertimbangkan struktur

dasar dari dinding sel tumbuhan. Komponen utama dinding sel tumbuhan telahdiidentifikasi

terdiri atas tiga komponen, yaitu terdiri atas selulosa, hemiselulosa, dan pectin. Oleh karena

itu isolasi protoplas secara enzimatik dilakukan dengan menggunakan enzim yang

mendegradasi dinding sel, yaitu selulase, hemiselulase, dan pektinase. Isolasi protoplas secara

enzimatik memiliki beberapa keunggulan, yaitu:

a. Isolasi protoplas dalam jumlah besar dapat dilakukan dari jaringan yang bervariasi

114

b. Mengurangi dampak kerusakan sel akibat plasmolisis

c. Tidak terjadi kerusakan sel sebagaimana pada metode isolasi mekanis

d. Memungkinkan produksi protoplas dari sel meristematis yang tidak memiliki vakuola

dimana plasmolisis tidak terjadi

Kultur protoplas memberikan dasar yang penting untuk memanipulasi sel tanaman yaitu

dengan memungkinkan dilakukannya fusi protoplas antar spesies atau galur yang berbeda.

Fusi protoplas dapat dimanfaatkan untuk melakukan persilangan antar spesies atau galur

tanaman yang tidak mungkin dilakukan dnegan metode persilangan konvensional karena

adanya masalah inkompatibilitas seksual. Fusi protoplas membuka kemungkinan untuk

menghasilkan hibrid somatik amphidiploid yang fertil antar spesies yang secara seksual tidak

kompatibel, menghasilkan galur heterozigot dalam satu spesies tanaman yang secara normal

hanya dapt diperbanyak dengan cara vegetatif, misalnya pada kentang, memindahkan sebagian

informasi genetik dari satu spesies ke spesies lain dengan memanfaatkan fenomena yang

disebut penghilang kromosom (cromosome elimination), dan memindahkan informasi genetik

yang ada di sitoplasma dari satu galur atau spesies ke galur atau spesies yang lain. Regenerasi

dinding sel pada kultur protoplas juga memberikan system pendekatan baru dalam

mempelajari biosintesis dan mekanisme pembentukan kembali dinding sel.

8.3 Prosedur kultur protoplas

Pada dasarnya terdapat tiga tahapan utama dalam kultur protoplas, yaitu: isolasi protoplas,

kultur protoplast, dan regenerasi protoplas menjadi tanaman utuh kembali. Protoplas dapat

diisolasi dari beragam jaringan, baik yang bersifat meristematik maupun yang berada pada

fase pertumbuhan tertentu. Pada isolasi protoplas dengan menggunakan enzim, adalah penting

untuk memotong jaringan asal sel menjadi potongan berukuran kecil untuk memudahkan

penetrasi larutan enzim. Berikut ini adalah tahapan dalam kultur protoplas.

A. Persiapan dan sterilisasi eksplan.

Jaringan tanaman yang digunakan untuk isolasi protoplasma ini dapat berasal dari

berbagai bagian tanaman misalnya akar, daun, coleoptil, jaringan buah, tajuk bunga, serbuk

sari, dan sebagainya. Namun umumnya pada kultur protoplas digunakan jaringan yang lebih

115

muda dan berasal dari tanaman yang mempunyai umur fisiologis muda, seperti pucuk muda

(seperti dari kecambah, bibit, plantlet), pucuk adventif hasil pangkasan, hal ini disebabkan

karena protoplasma dari sel jaringan tersebut dinding selnya masih sederhana dan hanya terdiri

dari dinding sel primer saja dan jaringannya masih memiliki sel-sel parenkim (dindingnya

belum berlignin) sehingga lebih mudah diisolasi. Selain itu, ada juga yang menggunakan

jaringan yang telah dewasa, namun media untuk isolasi protoplasma dari jaringan ini lebih

kompleks karena dinding selnya telah berlignin, telah memiliki dinding sel primer dan dinding

sel sekunder.

Bagian tanaman yang akan digunakan sebagai eksplan terlebih dahulu dicuci kemudian

disterilkan, umumnya menggunakan sodium hypoklorit 1 – 2% selama 10 – 30 menit

tergantung jenis eksplan yang digunakan. Eksplan tersebut selanjutnya dicuci dengan air steril

(3 – 4 kali) untuk mencuci sisa sodium hipoklorit pada eksplan.

C. Isolasi Protoplasma.

Isolasi protoplasma dapat dilakukan melalui dua cara, yaitu:

1. Metode mekanikal.

Isolasi protoplasma menggunakan metode ini dikenalkan pertama kali oleh Klercker pada

tahun 1892. Isolasi protoplasma dilakukan dengan cara mengupas dinding sel menggunakan

alat bedah mikro. Kelebihan dari metode ini adalah bila sel yang digunakan mempunyai

vakuola sel yang relatif besar sedangkan kelemahannya adalah: 1) Keberhasilannya rendah; 2)

Pekerjaan yang membutuhkan tenaga banyak dan membosankan; 3) Viabilitas protoplasma

rendah, karena sering terjadi kerusakan protoplasma selama proses pengupasan dinding sel.

2. Metode enzimatik

Isolasi protoplasma dilakukan dengan menggunakan enzym yang dapat mengahancurkan

dinding sel. Enzym yang digunakan bervariasi jenis dan konsentrasinya tergantung kondisi

fisologis eksplan, terutama umur jaringan yang erat kaitannya dengan komposisi dinding

selnya. EnzIm yang digunakan untuk mengancurkan dinding sel tumbuhan umumnya ada 3

yaitu: Cellulase untuk menghancurkan sellulose, Hemicellulase untuk menghancurkan

hemisellulose, Pectinase untuk menghancurkan pektin. Terdapat berbagai jenis enzim yang

terlah diproduksi dan dikomersiliasikan untuk keperluan isolasi protoplast (Tabel 10).

116

Table 10. Enzim yang tersedia secara komersial untuk isolasi protoplas

Tipe Enzim Nama Komersial Sumber

Selulase

Onozuka cellulose R-10

Cellulase Onozuka RS

Meicelase P-1

Cellulysin

Driselase

Hemicellulase

Trichoderma viride

T. viride

T. viride

T. viride

Basidiomycetes spp

Aspergilus niger

Hemiselulase Hemicellulase H-2125

Rhozyme HP 150

Helicase

Rhizopus spp

A. niger

Helix pomatia

Pectinase Mecerase

Macerozyme R-10

PATE

Pectinol

Pectolyase Y-23

Zymolase

Rhizopus Arrhizus

R.arrhizus

Bacillus polymyxa

Aspergillus spp

A. japonicus

Arthobacter luteus

Sumber: Pati, et al (2008)

Tahapan pengerjaan isolasi protoplasma

a) Jaringan tanaman seperti disterilkan terlebih dahulu dengan cara merendamnya dalam

alkohol 70% selama 30 detik selanjutnya direndam kedalam larutan pemutih (misalnya

bayclin) 20% yang ditambah beberapa tetes Tween selama 15 menit. Selanjutnya daun

tembakau tersebut dibilas menggunakan aquadest steril sebanyak tiga kali.

b) Jaringan tanaman steril, diiris halus dan dikupas eidermis serta dihilangkan urat daunnya

dengan menggunakan mata skalpel runcing steril, untuk lebih memudahkan isolasi

protoplasmanya. Contoh campuran dan konsentrasi enzym yang digunakan untuk isolasi

protoplasma beraga, tergantung jenis jaringan yang digunakan sebagai eksplan, seperti:

Medium enzim untuk jaringan Akar, 2% rhozyme, 2 %meicellase, 0,03 % macerozyme

R10,

Medium enzim untuk daun Serealia: 2 % cellulysin, 0,2 % macerozyme R10, 0,5 %

hemicellullase, 11 % mannitol

117

Medium enzim untuk Daun Tembakau: 0,5 % Onozuka R10 cellulase, 0,1 % Onozuka

R10 macerozyme R10, 13,0 Mannitol, pH 5,8

Untuk mengurangi daya tarik menarik (adhesi) antara sitoplasma dengan dinding selnya,

Larutan enzim biasanya ditambahkan senyawa osmoticum. Senyawa osmoticum yang dapat

digunakan antara lain: Mannitol, Sorbitol, Glukosa, Fruktosa, Galaktosa, Sukrosa. Setelah

dinding sel lepas, selanjutnya eksplan direndam ke dalam 20 ml larutan media preplasmolisis

selama 1-8 jam. Medium preplasmolisis untuk setiap jenis eksplan berbeda, untuk tembakau

medium preplasmolisis tersusun atas medium isolasi protoplasma ditambah 13% mannitol.

Komponen Medium Isolasi Protoplasma (MIP) adalah sebagai berikut:

CaCl2.H2O 1480,0 mg/l

KH2PO4 27,2 mgl

KNO3 101,0 mg/l

MgSO4.7H2O 246,0 mg/l

CuSO4.5H2O 0,025 mg/l

KI 0,16 mg/l

pH 5,8

Eksplan dipindah larutam medium enzim (komposisi media ini juga berbeda-beda untuk

setiap jenis eksplan yang digunakan) untuk daun tembakau komponennya dapat dilihat di atas.

Eksplan dipindah ke tabung steril dan dituangi medium enzim sebanyak 10 ml, lalu tabung

ditutup dengan aluminium foil steril dan diisolasi menggunakan parafilm atau plastik wrap.

Tabung berisi eksplan tersebut digoyang pada shaker dengan kecepatan 40 rpm selama

semalam atau 4-16 jam.

A. Pemurnian protoplasma

Tahapan pemurnian Protoplasma adalah sebagai berikut:

Protoplasma dalam poin 5 disaring dengang filter steril, mess 63 μm, masukkan ke dalam

gelas piala volume 250 ml menggunakan pipet pastuer.

Medium pencuci (MIP ditambah + 10 %) sebanyak 3 ml ditambahkan ke dalam cawan

Petri yang berisi debris dari daun, digoyang perlahan dan kombinasikandengan protoplas/

campuran enzim dalam gelas piala vol. 250 ml.

118

Protoplas yang diperoleh dicuci dengan medium pencuci dan saring. Protoplas yang masih

tercampur dengan larutan enzim disentrifuge dengan kecepatan 50 x g selama 10 menit.

Pelet diresuspensi dalam medium pengapung (medium flotasi) 10 ml ditambah medium

pencuci 1 ml selanjutnya disentrifuge, protoplasma akan melayang-layang diantara

medium flotasi (MIP + 20%) dan medium pencuci.

Protoplasma yang melayang-layang dipindahkan ke dalam tabung ditambah 10 ml medium

pencuci, selanjutnya disentrifuge maka protoplasma akan mengendap sebagai pelet.

Supernatan dibuang dan pelet ditambah 10 ml medium pencuci dan diputar lagi.

Supernatan dibuang sisakan suspensi protoplasma sebanyak 1 ml.

Kerapatan suspensi protoplasma yang dikulturkan untuk setiap spesies tanaman berbeda-

beda seperti tembakau suspensi protoplas kerapatannya 50.000 sel/ ml dan 25000 sel/ ml

untuk protoplasma petunia, protoplasma tersebut dikulturkan dalam cawan Petri steril.

B. Perhitungan konsentrasi dan test viabilitas protoplasma.

Untuk menghitung kerapatan dapat dihitung dengan bantuan haemocitometer: jumlah sel /

grid x 10.000. Tes viabilitas protoplasma dilakukan dengan menggunakan senyawa flourescent

seperti fluresein diacetate (FDA). Medium kultur diambil 25 tetes selanjutnya ditambah 1 tetes

larutan pewarna FDA dan 1 tetes protoplasma suspensi tersebut agar protoplas tercat dengan

baik, selanjutnya dilihat di bawah mikroskop. Protoplas yang hidup (viable) akan berwarna

hijau-kuning, sedangkan protoplas yang mati akan berwarna merah. Warna hijau kekuningan

berasal dari enzim esterase yang aktif dan memotong FDA sehingga menghasilkan bahan yang

berpendar, enzim esterase aktif ini hanya dimiliki oleh protoplas yang hidup.

C. Kultur protoplasma

Protoplasma yang hidup diambil dalam jumlah memadai (frekuensi protoplas viable 100 –

200 sel) selanjutnya ditanam pada media yang telah disediakan dan dikulturkan dan disimpan

tempat gelap pada temperatur 28oC selama semalam. Kultur protoplasma dipindahkan pada

cahaya rendah (10 – 20 μmol.detik-1m-2

) dengan cahaya lampu putih yang dingin dan

fotoperiode 16 jam, selama 2 hari. Kultur dipindahkan pada intensitas cahaya yang lebih tinggi

(50 – 75 μmol.detik-1m-2

).

119

Media yang digunakan untuk kultur protoplasma dapat berupa media media cair yang

diletakkan dalam cawan Petri kecil atau media padat (dengan pemadat agarose). Media yang

digunakan untuk kultur protoplasma jauh lebih kompleks dibandingkan dengan media untuk

teknik kultur lainnya, karena protoplasma belum memiliki dinding sel sehingga perlu ditanam

pada media awal yang diperkaya dengan osmotikum (misalnya sorbitol atau mannitol) untuk:

menghindari plasmolisis.

Penanaman protoplasma ke dalam media dilakukan dengan cara mencampur protoplama

dengan larutan agarose. Campuran disedot dengan pipet pasteur steril kemudian diteteskan

pada cawan Petri steril (5 – 10 tetes per Petri). Cawan Petri ditutup dengan parafilm

selanjutnya kultur diletakkan pada ruang kultur dengan suhu 25C dan diberikan 16 jam

penyinaran. Setiap 2 minggu ditambahkan media baru ke bagian tetesan protoplasma tersebut.

Protoplasma yang telah dimurnikan biasanya dikulturkan dengan dalam medium agar

semisolid dan liquid. Protoplasma sering dikulturkan dalam media liquid untuk meregenerasi

dinding sel terlebih dahulu, sebelum dikulturkan ke media agar. Media semisolid agar, agar

yang digunakan untuk kultur protoplasma adalah khusus: yaitu gel agar lunak, salah satunya

agarose.

Teknik media liquid biasanya digunakan pada fase awal kultur, karena mudah larut dan

diserap, beberapa spesies, protoplasmanya tidak dapat membelah dalam media agar, tekanan

osmotik media direduksi secara efektif, kerapatan sel-sel dapat direduksi setelah beberapa hari

dikulturkan, kelemahan dari teknik ini tidak boleh diisolasi dari turunan koloni tunggal yang

berasal dari sel induk satu. Teknik media liquid dapat dibedakan menjadi dua metode:

a. Metode liquid tetes

Dengan menggunakan pipet ukuran 100-200 μl, suspensi protoplasma dalam media

diteteskan pada cawan Petri ukuran 60mx15m sebanyak 5-7 tetes. Cawan Petri ditutup dan

direkatkan dengan parafilm atau plastik wrap selanjutnya diinkubasikan. Setiap 5-7 hari

tambahkan medium segar baru dengan cara meneteskan langsung pada tetesan suspensi

protoplasma yang telah mengalami pertumbuhan. Metode ini biasanya baik untuk keperluan

pengamatan dengan mikroskop. Kelemahan dari metode ini adalah tetesan-tetesan suspensi

menyatu menjadi satu tetesan di pusat.

120

b. Metode tetes menggantung

Dengan menggunakan pipiet volume 40-100 μl, suspensi protoplasma diteteskan di dalam

tutup cawan Petri, selanjutnya cawan Petri, ditutup dengan menggunakan tutup yang telah

ditetesi suspensi protoplasma, sehingga tetesan suspensi tersebut akan menggantung di dalam

tutup cawan Petri tersebut.

Proses yang terjadi setelah kultur protoplas dilakukan:

1. Fusi protoplas. Peleburan protoplasma dari 2 genom yang berbeda dapat diperoleh baik

secara spontan ataupun dengan teknik pemacuan peleburan.

a. Metode peleburan spontan

Peleburan protoplasma secara spontan biasanya terjadi karena membran protoplas yang

sangat tipis dan lunak sehingga mudah sobek atau pecah yang dapat mengakibatkan

peleburan protoplasma. Biasanya terjadi pada protoplasma yang diisolasi dari kalus.

Perleburan protoplasma dengan teknik ini biasanya terjadi pada protoplasma yang

mempunyai asal tanaman yang sama sehingga tidak bernilai untuk perbaikan tanaman.

b. Metode pemacuan peleburan

Untuk mencapai peleburan protoplasma diperlukan adanya agensia untuk memacu

terjadinya peleburan protoplasma (dikenal sebagai fusagen) yang berbeda jenis

tanamannya. Larutan fusagen contohnya:

Perlakuan dengan sodium nitrat: 5,5% sodium nitrat dalam larutan 10% sukrose dan

kultur diinkubasikan dalam water bath bersuhu 35ºC selama 5 menit selanjutnya

disentrifuge dengan kecepatan 200 g selama 5 menit. Subernatan dibuang dan pelet

disimpan dalam water bath bersuhu 35ºC selama 30 menit. Pada beberapa saat

protoplasma akan terjadi peleburan. Agregat dituangkan secara hati-hati pada

medium kultur yang telah ditambah 0,1% NaNO3. Teknik ini akan dihasilkan dengan

frekuensi rendah bila asal protoplasmanya dari mesofil daun.

Perlakuan ion Kalsium padas pH tinggi . Teknik ini telah digunakan pada

protoplasma tembakau. Caranya protoplasma yang telah diisolasi ditambahkan

larutan fusagen berupa 0,5 M mannitol yang berisi 0,05 M CaCl2.2H2O pada pH

10,5 selanjutnya disentrifuge dengan kecepatan 50 g selama 3 menit. Selanjutnya

121

tabung sentrifuge disimpan dalam water bath bersuhu 37o C selama 40-50 menit

hingga protoplasma melebur.

Perlakuan polyethelene glycol (PEG). Dari sekian banyak metode peleburan

protoplasma, metode ini yang yang berhasil dengan baik untuk melebur

protoplasma. Suspensi protoplasma dilarutkan dalam larutan PEG: 1 ml suspensi

protoplasmadalam medium kultur dicampur dengan 1 ml 28-56% PEG (1500-6000

MW). Tabung digoyang selama 5 detik dan biarkan berhenti 10 menit. Selanjutnya

suspensi protoplasma tersebut dipindahkan dari larutan PEG dengan cara

mencucinya menggunakan medium kultur sebanyak 2 kali. Hasil peleburan

protoplasma ini berupa pembentukan heterokarion dengan frekuensi yang tinggi,

sedangkan kebanyakan tipe sel sitoplasmik dengan pembentukan hetekarion

binukleat rendah.

2. Pembentukan Dinding Sel. Perkembangan protoplasma diawali dengan regenerasi atau

terbentuknya dinding sel diikuti terbentuknya koloni sel menyerupai kalus. Pada beberapa

spesies, protoplasma membentuk kalus dan beregenerasi melalui organogenesis atau

embryogenesis.

3. Regenerasi Protoplasma. Regenerasi protoplasma membentuk koloni sel kemudian

tanaman lebih sulit dibandingkan dengan teknik kultur jaringan jaringan lain. Salah satu

teknik yang digunakan untuk merangsang regenerasinya adalah menggunakan sel-sel lain

(sebagai perawat) sehingga tekniknya disebut dengan teknik “Nurse Culture”. Untuk kultur

satu protoplasma, “nurse cells” diletakkan berdekatan dengan kultur protoplasmanya untuk

mendukung pertumbuhan dan perkembangan protoplasma. Tanaman yg dihasilkan dari

kultur protoplasma bisa seragam atau bervariasi, disebut “protoclonal variation”. Apabila

dalam penanaman protoplasma ditambahkan mutagen ke dalam media, maka hasil

regenerasi akan berupa generasi baru. Produksi tunas dapat dilakukan pada media cair,

umumnya ke dalam media ditambahkan hormon pertumbuhan sitokinin (misalnya 0,5 M

BAP). Setelah tunas terbentuk cukup besar, tunas selanjutnya dalat diakarkan. Salah satu

contoh media pengakatran protoplasma adalah 1/2 MS + 3-aminopyridine (untuk

tembakau) atau picloran (untuk tebu). Plantlet yang cukup besar selanjutnya diaklimatisai

kemudian ditanam di lapangan.

122

Perlakuan peleburan elektro (elektrofusion). Protoplasma diletakkan di dalam sel

kultur yang kecil dan berisi elektrode yang berbeda potensialnya, protoplasma diletakkan

diantara barisan elektrode-elektrode. Selanjutnya protoplasma diberi shok gelombang

pendek elektrik yang akan mengiduksi terjadinya peleburan protoplasma. Dalam metode ini

ada dua tahapan prosedur yang dimulai dengan penggunaan AC dari intensitas rendah

untuk suspensi protoplasma. Kolektor dielektroforetik diatur 1,5 V dan 1 MHz dan

konduktivitas elektirk dari medium suspensi kurang dari 10-5 detik/cm efek sebuah

elektroforesis dijalankan akan membuat masing-masing sel berbenturan sepanjang alur

barisan elektrode. Tahap kedua injeksi aliran listrik DC dengan intensitas tinggi (750-

1000V/cm) dengan waktu yang sangat singkat yaitu 20-50 μdetik menyebabkan membran

protoplasma robek dan akan menghasilkan peleburan yang selanjutnya membran akan

mengalami reorganisasi. Teknik fusi elektro sangat sederhana, cepat dan efisien. Sel-sel yang

telah difusikan secara eletronik tidak menunjukkan respon yang sitotoxit. Namun metode ini

jarang digunakan.

4. Identifikasi dan Seleksi Sel Hibrida. Setelah proses fusi dan regenerasi protoplas selesai,

tahap selanjutnya adalah mengidentifikasi dan menyeleksi sel hibrida hasil fusi. Sel hibrida

somatic dapat segera diseleksi menggunakan kombinasi micromanipulator dengan system

dual-flouresen (Waara., et al 1991 dalam Wattimena., et al 2011), namun pada banyak

kasus populasi sel harus ditumbuhkan terlebih dahulu menjadi tanaman.

8.4 Penutup

Evaluasi

1. Jelaskan yang dimaksud dengan protoplas dan bagaimana cara memperoleh protoplas?

2. Sebutkan faktor apa saja yang dapat mempengaruhi keberhasilan isolasi protoplas!

3. Apa yang dimaksud dengan fusi protoplas dan apa pula manfaat dari protoplas itu.

4. Jelaskan cara pemurnian protoplas

5. Jelaskan secara singkat skema isolasi dan fusi protoplas hingga hasil sel hasil fusi

kembali membentuk plantet

123

Tugas

Terdapat berbagai metode seleksi sel hibrida somatik hasil fusi, buatlah makalah singkat

mengenai berbagai metode tersebut.

124

Daftar Pustaka












Penerbit ITB.



Publisher.


Bumi Aksara.


125

BAB IX. Variasi Somaklonal

9.1 Pendahuluan

Keragaman genetik yang tinggi merupakan salah satu faktor penting untuk merakit

varietas unggul baru. Peningkatan keragaman genetik dapat dilakukan dengan memanfaatkan

plasma nutfah yang tersedia di alam dan dapat pula dengan melakukan persilangan. Sifat-sifat

tertentu sering tidak ditemukan pada sumber gen yang ada sehingga teknologi lainnya perlu

diterapkan.Salah satunya adalah memperoleh variasi somaklonal melalui teknik kultur

jaringan. Bab ini akan membahas mengenai mekanisme terjadinya variasi somaklonal melalui

kultur jaringan.

9.2 Pengertian dan mekanisme terjadinya variasi somaklonal

Kultur jaringan saat ini telah menjadi metode yang umum digunakan untuk produksi

tanaman secara komersil. Pada awalnya diharapkan tanaman yang diregenerasikan dari kultur

jaringan memiliki materi genetis yang identik dengan induknya, namun obeservasi lebih lanjut

menunjukkan bahwa variasi fenotipik dapat muncul di antara tanaman hasil regenerasi in

vitro. Variasi ini disebut sebagai variasi somaklonal dan dapat didefinisikan sebagai variasi

genetic dan fenotipik yang muncul di antara klon tanaman yang dipropagasi secara in vitro

(Sunderland, 1973; D‟ Amato; 1977; Scowcroft, 1985; Sun & Zheng, 1990; Kaeppler et al.,

1998; Olhoft & Philips, 1999; Kaeppler et al., 2000 dalam Rasheed et al., 2005).

Larkin dan Scowcroft (1981) dalam Kadir (2007), mendefinisikan variasi somaklonal

sebagai keragaman genetik dari tanaman yang dihasilkan melalui kultur sel, baik sel somatik

seperti sel daun, akar, dan batang, maupun sel gamet. Menurut Skirvin et al. (1993) dalam

Yunita (2009), variasi somaklonal merupakan keragaman genetik tanaman yang dihasilkan

melalui kultur jaringan. Variasi tersebut dapat berasal dari keragaman genetik eksplan yang

digunakan atau yang terjadi dalam kultur jaringan.

Menurut Skirvin 1978 dalam Wattimena et al., (2011) faktor-faktor yang mempengaruhi

variasi somaklonal melalui kultur jaringan antara lain:1) Tipe kultur yang digunakan (sel,

protoplasma, kalus, jaringan), 2) Penggunaan zat pengatur tumbuh, 3) Lamanya fase

pertumbuhan kalus, dan 4) Komposisi bahan kimia yang digunakan dalam media tanam.

126

Penelitian yang dilakukan oleh Orton (1982) pada tanaman seledri menunjukkan bahwa 70%

varietas seledri komersil yang diregenerasikan dari kultur jaringan kemudian ditumbuhkan di

lapangan menunjukkan penampilan yang normal, sementara 30% lainnya menunjukkan laju

pertumbuhan, bentuk dan warna daun serta pembungaan yang berbeda. Namun tidak satupun

dari karakter tersebut dianggap lebih baik dari pada penampilan tanaman normal. Penyelidikan

lebih lanjut pada seledri ini menunjukkan bahwa genotype jaringan donor, dan komposisi

media kultur adalah faktor yang mempengaruhi keragaman somaklonal secara signifikan.

Keragaman fenotipik seledri tersebut dapat terlihat pada gambar berikut.

Gambar 1. Dua tanaman seledri yang diregenerasikan secara kultur jaringan dari tanaman

donor yang sama. Seledri di sebelah kiri menunjukkan pertumbuhan yang

normal, sedangkan seledri di sebelah kanan menunjukkan seledri berukuran lebih

kecil, pertumbuhan yang lebih lambat, dan pembagian helaian daun yang lebih

banyak (Sumber: Orton, 1982. California Agriculture, 1982)

Variasi somaklonal dapat diinduksi dengan pemberian zat pengatur tumbuh. Zat pengatur

tumbuh kelompok auksin 2,4-D dan2,4,5-T biasanya dapat menyebabkan terjadinya variasi

somaklonal. Menurut Linacero dan Vazquez (1992) dan Jayasankar (2005) dalam Yunita

(2009) pada tanaman kelapa sawit, perlakuan 2,4-D pada kultur kalus yang mampu

beregenerasi membentuk tunas menyebabkan variasi somaklonal saat aklimatisasi di lapangan.

Variasi somaklonal yang terjadi dalam kultur jaringan merupakan hasil kumulatif dari

mutasi genetik pada eksplan dan yangdiinduksi pada kondisi in vitro. Variasi somaklonal

127

merupakan perubahan genetic yang bukan disebabkan oleh segregasi atau rekombinasi gen,

seperti yang biasa terjadi akibat proses persilangan. Keragaman ini dapat muncul akibat

penggandaan dalam kromosom (fusi, endomitosis), perubahan jumlah kromosom (tagging dan

nondisjunction), perubahan struktur kromosom, perubahan gen, dan perubahan sitoplasma.

Thrope (1990) dalam Yunita (2009) menggunakan istilah pre-existing cellular genetic, yaitu

keragaman yang diinduksi oleh kultur jaringan.

9.3 Pengelompokkan Keragaman Somaklonal

Variasi somaklonal dapat dikelompokkan menjadi keragaman yang diwariskan

(heritable), yaitu yang dikendalikan secara genetik, dan keragaman yang tidak diwariskan,

yakni yang dikendalikan secara epigenetik. Menurut Jayanti et al., (2011) berikut adalah

keragaman yang dihasilkan dari variasi somaklonal:

1. Genetik (Heritable Variations)

• Variasi terjadi dalam sel somatic tumbuhan

• Disebabkan oleh mutasi dan perubahan DNA lain

• Muncul dalam frekuensi yang tinggi

2. Epigenetik (Non-heritable Variations)

• Variasi terjadi pada umumnya pada regenerasi secara kultur jaringan

• Disebabkan oleh perubahan fenotipik sementara

• Muncul dalam frekuensi yang rendah

Pemuliaan tanaman melalui kultur jaringan bermanfaat dalam merangsang keragaman

genetik dan mempertahankan kestabilan genetik. Wattimena (2011) menyatakan, keragaman

genetic pada kultur jaringan dapat dicapai melalui fase tak berdiferensiasi (fase kalus dan

selbebas) yang relatif lebih panjang. Untuk mendapatkan kestabilan genetik pada teknik kultur

jaringan, dapat dilakukan dengan cara menginduksi sesingkat mungkin fase pertumbuhan tak

berdiferensiasi.

Beberapa sifat tanaman dapat berubah akibat variasi somaklonal, namun sifat lainnya

tetap menyerupai induknya. Dengan demikian, variasi somaklonal sangat memungkinkan

128

untuk mengubah satu atau beberapa sifat yang diinginkan dengan tetap mempertahankan

karakter unggul lainnya yang sudah dimiliki oleh tanaman induk. Mattjik (2005) dalam Yunita

(2009) menyatakan,dalam perbanyakan secara in vitro, yang terjadi adalah mutasi somatik. Sel

yang bermutasi saat membelah akan membentuk sekumpulan sel yang berbeda dengan sel

asalnya. Tanaman yang berasal dari sel-sel yang bermutasi akan membentuk tanaman yang

mungkin merupakan klon baru yang berbeda dengan induknya. Beberapa hasil pemanfaatan

variasi somaklonal untuk menghasilkan tanaman unggul baru disajikan pada Tabel 11.

Perbaikan tanaman melalui variasi somaklonal telah banyak dilakukan, antara lain untuk

sifat ketahanan terhadap cekamanbiotik dan abiotik. Cara tersebut bermanfaat bila dapat

menambah komponen keragaman genetik yang tidak ditemukan di alam serta mengubah sifat

dari kultivar yang ada menjadi lebih baik, terutama untuk tanaman yang diperbanyak secara

vegetatif atau menyerbuk sendiri.

Tabel 11. Perubahan sifat tanaman hasil variasi somaklonal

Tanaman Perubahan sifat Sumber

Anggur Menjadi tanaman tetraploid Kuskova et al. (1997)

Bawang Peningkatan ploidi Do et al. (1999)

Mawar Perubahan kelopak dan

warna bunga

Handayani et al. (2002)

Kedelai Toleran lahan masam Mariska et al. (2004)

Padi Toleran kekeringan Lestari et al. (2005)

Pisang Tahan penyakit fusarium Mariska et al. (2006)

Nilam Toleran kekeringan Kadir (2007)

Sumber: Yunita (2009)

9.4 Penutup

Pertanyaan

1. Jelaskan apa yang dimaksud dengan variasi somaklonal

2. Bagaimana cara meningkatkan keragaman genetik?

3. Jelaskan penyebab terjadinya keragaman genetik dalam kultur jaringan.

4. Sebutkan dan jelaskan pengelompokan keragaman somaklonal.

129

5. Jelaskan tujuan perbaikan tanaman melalui variasi somaklonal.

130

Daftar Pustaka

Kadir, A. 2007. Induksi Variasi Somaklon melalui Iradiasi Sinar Gama dan Seleksi In Vitro

untuk Mendapatkan Tanaman Nilam Toleran terhadap Cekaman Kekeringan. Disertasi.

Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.


India : Universities Press

Orton, Thomas J., 1982. Somaclonal variation. California Agriculture, hal: 20-21.

Rasheed, Sultana., Tahira Fatima, Tayyab Husnain, Khurram Bashir dan Shiekh Riazuddin.

2005. RAPD Characterization Of Somaclonal Variation In Indica Basmati Rice. Pak. J.

Bot., 37(2): 249-262.








Penerbit ITB.


Yunita, Rossa. 2009. Pemanfaatan Variasi Somaklonal Dan Seleksi In Vitro Dalam Perakitan

Tanaman Toleran Cekaman Abiotik. Bogor:Balai Besar Penelitian dan Pengembangan

Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian.


Bumi Aksara.


131

BAB X. Benih Sintetik

10.1 Pendahuluan

Dalam pengembangan pertanian secara luas, perbanyakan tanaman dengan menggunakan

benih merupakan cara yang paling praktis. Namun penggunaan benih yang merupakan hasil

reproduksi generatif memiliki kelemahan, yaitu untuk tanaman yang menyerbuk silang dan

bersifat heterosigot, perbanyakan dengan cara tersebut dapat menghasilkan keturunan yang

sifatnya tidak sesuai dengan induknya. Di sisi lain pada tanaman yang diperbanyak secara

vegetatif, propagul tanaman (bagian vegetatif sebagai bahan perbanyakan) umumnya tidak

dapat disimpan dalam waktu yang relatif lama.

Aplikasi teknik in vitro sangat potensial untuk tujuan propagasi dan manipulasi genetik

tanaman. Teknik somatik embriogenesis, yaitu pembentukan embrio bipolar yang memiliki

kemampuan untuk berkembang menjadi tanaman yang lengkap.

10.2 Definisi dan keuntungan produksi benih sintetik

Pada awalnya benih sintetik didefinisikan sebagai “embrio somatic yang dienkapsulasi

yang berfungsi untuk meniru benih alami dan dapat berkembang menjadi bibit tanaman dalam

kondisi yang sesuai. Namun definisi ini membatasi penggunaan benih sintetik pada embrio

somatic. Dalam perkembangannya, propagul (tunas aksilar, tunas apical, tunas, bulb, dan

bentuk jaringan meristem yang lain) juga telah digunakan untuk membuat benih sintetik. Oleh

karena itu saat ini batasan definisi benih sintetik telah berkembang menjadi “ embrio somatic,

tunas, atau jaringan meristem lain yang dienkapsulasi dan dapat ditumbuhkan menjadi

tanaman baik dalam kondisi in vitro maupun in vivo. Umbi mikro, rhizome, tunas aksilar,

tunas apical, primordial, agregat sel, dan jaringan meristematis lainnya dapat digunakan

sebagai benih sintetik. Teknologi benih sintetik memberikan berbagai manfaat dan

keuntungan, antara lain:

Perbanyakan secara cepat tanaman yang diinginkan

Mudah ditangani dan ditransportasikan

Keseragaman genetis tanaman

132

Dapat dimanfaatkan untuk membuat benih yang sekaligus memiliki mikoriza, zat

pengatur tumbuh, dan nutrisi lain

Melindungi benih dengan melapisi benih dengan komponen yang dapat

melindungi dari serangan hama dan pathogen

Transportasi bahan tanam yang steril

Mengurangi biaya dalam propagasi vegetative tanaman unggul

Persyaratan yang penting dalam produksi benih sintetik yaitu:

- Efisiensi yang tinggi dalam sistem produksi in vitro embrio somatic, tunas apical, atau

tunas aksilar sebagai bahan baku benih sintetik

- Metode enkapsulasi dan coating (penyelubungan) yang tepat untuk menjaga viabilitas

dan kemudahan dalam transportasi benih sintetis

- Kondisi tanah dan lingkungan terkait material yang digunakan untuk enkapsulasi.

-

Untuk memenuhi persyaratan yang dibutuhkan untuk memproduksi benih sintetik,

tanaman harus memiliki kapasitas untuk memproduksi propagul (embrio somatic atau jaringan

meristem lain) dalam jumlah besar, dan dapat tumbuh dan berkembang kembali secara sinkron

dan dapat mengatasi stress yang timbul akibat proses enkapsulasi dan mampu

mempertahankan kemampuannya untuk tumbuh dan berkembang menjadi tanaman kembali.

Telah banyak dilakukan studi untuk mempelajari bagaimana membuat, memelihara dan

menyimpan benih sintetik. Dalam pembuatan benih sintetik dengan menggunakan embrio

somatik, beberapa hal yang harus diperhatikan antara lain :

Kualitas embrio somatik harus dapat dijaga. Pembentukan embriosomatik dari

kultur in-vitro diharapkan mampu mencapai 95%.

Sorting embrio: dibutuhkan embrio yang homogen untuk membuat keseragaman

benih sintetik.

Proses kapsulasi :

Penentuan kekerasan gel yang ideal untuk kapsul benih tertentu yang terkait

dengan kemudahan handling

133

Komposisi nutrisi yang cukup untuk embrio dan fungsi kapsul sebagai pelindung

embrio dari serangan mikroorganisme

Preservasi: bagaimana mengkombinasikan metode preservasi (penyimpangan)

embriosomatik dengan metode kapsulasi.

Secara umum terdapat dua tipe benih sintetik yaitu hydrated synthetic seeds dan

dessicated synthetic seeds. Hydrated synthetic seeds terdiri atas satu embrio somatik yang

dienkapsulasi dengan hydrogel seperti calcium alginat. Desicated synthetic seeds diproduksi

dengan melapisi somatik embriogenesis campuran dalam polyoxyethylene glycol, dalam

metode ini benih yang telah diselubungi dibiarkan mengering selama beberapa jam pada

permukaan Teflon dalam Laminar Air Flow yang steril. Hydrated seeds lebih sering

digunakan dalam penelitian dibandingkan desiccated seeds.

10.3 Proses pembuatan benih sintetik dari embrio somatik

Berikut ini adalah proses pembentukan benih sintetik yang berasal dari embrio somatik:

a. Pembentukan Embriosomatik

Induksi embriogenesis membutuhkan perubahan pada fase pembelahan sel somatik.

Dibutuhkan treatment tertentu untuk dapat menginisiasi pembelahan sel dan polaritas yang

establish dari sel somatik yang baru. Pada umumnya, digunakan auksin untuk menginisasi

pembelahan sel untuk produksi sel embriosomatik antara lain auksin yang efektif adalah 2,4-D

dan 2,3,5-T. Auksin seperti IAA dan IBA kurang efektif karena sel yang membelah lebih

membentuk kalus dan tidak mengarah pada pembentukan embriosomatik. Komponen

inorganik dapat ditambahkan untuk memodulasi respon kalus memasuki tahap embriogenesis

tapi tidak dapat menggantikan peran auksin.

Pemeliharaan embriosomatik termasuk di dalamnya adalah subkultur pada interval waktu

tertentu dan seleksi sel tunggal. Selama fase proliferasi, jaringan embrionik membelah terus-

menerus sehingga dibutuhkan proses subkultur yang reguler pada media yang mengandung

auksin dan sitokinin dengan konsentrasi yang semakin menurun. Jika dianalogikan dengan

pembentukan embrio zigotik, pembentukan embriosomatik (inisiasi, pemeliharaan dan

proliferasi) merupakan fase awal embriogenesis (early stage).

134

Proses maturasi merepresentasikan embriogenesis tahap akhir dimana benih somatik telah

berkembang penuh dan dapat dikecambahkan. Beberapa hal yang berpengaruh terhadap

maturasi benih somatik adalah ABA eksogen, sukrosa, chilling, desikasi dan sizing/grading.

Desikasi merupakan tahapan transisi antara maturasi dan germinasi (perkecambahan).

b. Sorting Embryo

Dalam suspensi sel proembrionik dewasa yang terbentuk dapat dipisahkan menjadi single

sel dengan penyaringan pada membran nilon ukuran 500 and 224 mesh pore size. Kultur

suspensi tidak dapat memelihara sel dalam bentuk single sel karena dalam suspensi sel akan

membelah membentuk agregat dan suspensi. Sel-sel tunggal kemudian ditumbuhkan pada

medium perkecambahan membentuk embrio yang dapat digunakan sebagai embrio dalam

benih sintetik. Selain itu, pembuatan benih sintetik dapat juga dilakukan terhadap tunas pucuk

atau embrio zigotik yang tidak memiliki endosperm.

c. Kapsulasi

Kapsulasi pada dasarnya meniru fungsi endosperm benih secara alami. Oleh karena itu,

selubung (coat) haruslah mengandung cadangan makanan bagi embriosomatik sebagai tiruan

dari endosperm pada benih zigotik. Selubung ini antara lain mengandung sumber energi,

nutrisi, zat pengatur tumbuh, agen anti mikroba dll. Selubung harus dapat melindungi embrio

dari kerusakan mekanik selama penyimpanan dan handling, tidak menghambat proses

perkecambahan dan tidak menyebabkan perubahan genetik.

Bahan yang telah banyak digunakan untuk selubung benih sintetik merupakan suatu

kapsul hydrogel. Berbagai macam jenis hydrogel telah dicoba digunakan antara lain sodium

alginate, potassium alginate, carrageenan, guar-gum dan carboxymethylcellulose.

Sodium alginate dapat diaplikasikan dengan proses yang sangat sederhana menggunakan

pipet. Tetesan sodium alginate dari pipet akan membentuk gumpalan menyelubungi

embriosomatik tunggal. Sodium alginat dapat membentuk komplek dengan kation logam di-

dan trivalent membentuk calsium alginate melalui pembentukan ikatan ion antara grup asam

karboksilat dengan asam guluronat dari molekul alginate. Sodium alginat stabil pada suhu

135

ruang (25°C). Kekerasan kapsul tergantung pada rasio asam guluronat dan mannuronat, kation

dan waktu pembentukan ikatan kation. Jika waktu yang diberikan untuk pembentukan

komplek ikatan terlalu singkat maka bagian tengah kapsul tidak akan membentuk gel (masih

berupa liquid). Kekerasan kapsul untuk yang dapat ditembus oleh kecambah setara dengan

kekerasan kapsul yang mampu bertahan dengan tekanan 0,5-2 kg. Beberapa faktor yang

mempengaruhi struktur selubung dari gel alginate adalah lamanya proses gelatinasi,

konsentrasi alginate, tipe dan konsentrasi kation ionotropik, viskositas, tingkat polimerasasi,

rasio mannuronic dan guluronic, partikel internal, temperatur dan pH alginate.

Perbedaan bahan penyusun kapsul embriosomatik dari spesies tanaman tertentu akan

mempengaruhi viabilitas benih sintetik. Benih sintetik wortel dengan kapsul berbahan dasar

calcium alginate dapat berkecambah hingga 95% pada fiber polyester dalam medium cair MS.

Survival dari benih sintetik embriosomatik wortel menunjukan penurunan sejalan dengan

penurunan kekerasan dari gel (<0,2>).

Nutrisi dan sumber energi sebagai pengganti endosperm dicampurkan dengan bahan

selubung. Komposisi nutrisi yang digunakan adalah komposisi nutrisi biasa digunakan untuk

media kultur in vitro antara lain komposisi medium Murashige and Skoog dan Heller‟s.

Sementara sumber energi adalah sukrosa.

Coating adalah pelindung embrio dari serangan hama dan penyakit, maka untuk itu

ditambahkan suatu agent anti mikroorganisme pada campuran penyusun selubung benih

sintetik. Bahan yang ditambahkan antara lain fungisida, bakterisida atau insektisida tetapi

harus diperhatikan tingkat toksisitasnya terhadap embrio. Larutan copper hydroxyquinoline

dapat mengandung penicillin, streptomycin, atau zineb merupakan bakterida sedangkan

fungisida yang umum dipakai adalah benomyl atau carbendazim. Fungisida tersebut akan

bersifat nontoksik jika digunakan pada kisaran konsentrasi 1-5 mg/l.

d. Desikasi

Pada sebagian besar benih, desikasi adalah tahap akhir perkembangan benih. Desikasi

memegang peranan penting dalam perubahan benih menuju proses perkecambahan. Pada

somatik embrio yang dihasilkan dari developmental medium yang berupa liquid disubkultur

ke dalam medium maturasi untuk induksi desikasi. Pengeringan dan penyimpanan embrio

136

somatik dilakukan pada suhu 4°C. Embrio diberi perlakuan rehidrasi pada medium semi padat

kemudian plantlet in vitro di tanam dalam pot di greenhouse.

Sensitivitas embriosomatik terhadap stimulus dari luar untuk inisiasi desikasi sangat

tergantung pada tahap perkembangan embrio dan aspek morfologi dari embrio. Induksi

desikasi yang diberikan antara lain ABA, sukrosa konsentrasi tinggi, proline, triazoles, chilling

dan thermal shock. Dapat juga dilakukan kombinasi dari beberapa perlakuan.

Pengeringan embrio somatik tunggal dapat dilakukan secara lambat (slow drying) atau

cepat (rapid drying). Slow drying dilakukan dengan mentransfer selangkah demi selangkah

embrio somatik tunggal tanpa medium nutrisi pada suatu atmosfer yang kelembabannya

semakin menurun dari 97 ke 43% selama 7 hari. Rapid drying dilakukan dengan mengekspos

embrio dalam ruang udara selama 1 hari dengan kelembaban 45% dan suhu 4°C.

Embriosomatik yang telah mengalami proses desikasi dapat disimpan dalam jangka

tertentu. Embriosomatik kering dari tanaman wortel dapat disimpan pada suhu 4°C dan

kelembaban 45% selama 8 bulan tanpa terjadi penurunan viabilitas. Ilustrasi alur pembuatan

benih sintetik dan benih sintetik dapat dilihat pada gambar berikut.

137

Gambar 1. Ilustrasi alur pembuatan benih sintetik

Gambar 2. Benih sintetik

138

10.4 Penutup

Evaluasi

1. Apa yang dimaksud dengan benih sintetik?

2. Jelaskan latar belakang pembentukan benih sintetik!

3. Sebutkan hal-hal apa saja yang harus diperhatikan dalam pembuatan benih sintetik!

4. Sebutkan dan jelaskan dua tipe benih sintetik!

5. Jelaskan secara singkat proses pembentukan Embrio Somatik!

139

Daftar Pustaka












Penerbit ITB.



Publisher.

Zulkarnain. 2009. Kultur Jaringan Tanaman, Solusi Perbanyakan Tanaman Budidaya.

Jakarta: Bumi Aksara.


rinaldi sjahril pembiakan in-vitro 2011

Documents