KELOMPOK 7

Off H

RIKA ARDILLA

YUNITA NUR AGUSTININGSIH

The “Growing-Point Paradox” dan Sintesis DNA Diskontinyu

Penyelidikan dari molekul DNA dengan autoradiografi dan mikroskop elektron

mengindikasikan bahwa dua untai progeni disintesis pada masing-masing replikasi yang

bercabang menjadi dua yang diperpanjang pada keseluruhan arah yang sama, kurang lebih

pada level makromolekul. Sejak untai komplemen dari double helix memiliki polaritas yang

berbeda, ini berarti sintesis terjadi pada akhir untai 5’(atau 3’ 5’) dan pada akhir

untai 3’ (5’ 3’). Seperti pada diskusi terdahulu, meskipun semua tahu beberapa

polimerase memiliki persyaratan absolut untuk gugus hidroxyl bebas 3’ hanya mengeluarkan

sintesis (5’ 3’). Paradoks ini telah hidup selama beberapa tahun yang mana

pencarian biokimia yang sia-sia untuk beberapa polimerase baru yang bisa mengeluarkan

sintesis 3’ 5’. Tidak ada polimerase yang belum ditemukan. Malahan, bukti kuat

muncul yang terkumpul mengindikasikan bahwa semua sintesis terjadi pada arah 5’

3’. Resolusi dari paradoks muncul dari demonstrasi bahwa sintesis untai DNA adalah

Diskontinyu (terputus).

Autoradiografi dan mikroskop elektron menunjukkan bahwa 2 untai DNA yang mulai

muncul disintesis pada masing-masing replikasi yang bercabang menjadi dua telah

diperpanjang pada arah yang sama pada level makromolekul. Sejak untai komplemen dari

sebuah DNA rantai ganda memiliki polaritas kimia yang berlawanan, satu untai telah

diperpanjang pada semua arah 5’ 3’ dan pada untai lain diperpanjang pada semua arah

3’ 5’(Fig. 5.28, atas). Pada level makromolekul, bagaimanapun, sintesis sebenarnya

terjadi pada arah yang berlawanan (Fig. 5.28, bawah).

Figur 5.28. Sintesis DNA diskontinyu. (1) teknik resolusi lemah relatif seperti autoradiografi dan mikroskop elektron menunjukkan bahwa kedua rantai DNA yang baru muncul diperpanjang pada semua arah yang sama pada replikasi yang bercabang menjadi dua. Sejak dua rantai memiliki polaritas yang berlawanan, semua atau arah pemanjangan makromolekular harus 5’ 3’ pada satu rantai dan 3’ 5’ pada rantai lain. Keduanya diperpanjang dari kiri ke kanan, seperti contoh pada bingkai replikasi yang bercabang dua. (2) resolusi teknik biokimia yang lebih tinggi seperti pulse-labeling dan analisis kepadatan gradien menunjukkan bahwa replikasi sebenarnya diskontinyu untuk rantai yang diperpanjang pada semua arah 3’ 5’. Fragmen-fragmen pendek disintesis pada arah 5’ 3’ dan dengan subsekuen yang bergabung dengan polinukleotida ligase.

Pada level molekular, kedua untai baru disintesis pada arah 5’ 3’. Untai-untai

diperpanjang pada arah 3’ 5’ tumbuh oleh sintesis segmen-segmen pendek

(disintesis 5’ 3’), dan subsekuen yang bergabung pada segmen-segmen pendek ini oleh

polinukleotida ligase. Bukti untuk mode diskontinyu dari replikasi DNA datang dari

penelitian yang mana sintesis DNA intermediet yang berlabel dengan radioaktif oleh

pertumbuhan sel-sel untuk periode waktu yang sangat pendek pada medium yang berisi [3H]

thymidine(“pulse-labeling”). Ketika sel E.Coli pulse-labeled untuk 15 detik, seperti contoh,

semua label telah ditemukan pada potongan-potongan kecil, panjangnya 1000-2000

nukleotida. Potongan-potongan kecil ini atau segmen-segmen DNA, sering disebut “Okazaki

fragments” setelah R. Okazaki orang yang pertama mengidentifikasi mereka yang lebih kecil

panjangnya sekitar 100-200 nukleotida pada eukariot. Ketika periode pulse-labeling yang

lebih panjang digunakan, label lebih banyak ditutup kembali pada molekul DNA besar-

mungkin ukuran molekul berisi semua DNA yang hadir di kromosom utuh. Pada periode

pulse-labeling pendek, radioaktif hadir di fragmen pendek DNA menjadi disatukan pada

ukuran kromosom molekul DNA selama pertumbuhan subsekuen dari sel-sel pada medium

yang berisi thymidine nonradioaktif. Ini penting karena mengindikasikan bahwa “okazaki

fragments” adalah benar pada sintesis DNA intermediet daripada beberapa macam metabolik

oleh produk. Bukti ekstensif telah menunjukkan bahwa sintesis DNA adalah kontinyu untuk

pertumbuhan semua arah untai 5’ 3’ (kadang-kadang disebut untai “leading”) dan

diskontinyu untuk pertumbuhan untai arah 3’ 5’ (kadang-kadang disebut untai

“lagging”) seperti ditunjukkan pada fig. 5.28

Inisiasi dan Masalah Primer

Seperti yang telah dijelaskan sebelumnya, semua polimerase DNA dikenal memiliki

syarat mutlak untuk 3’-OH bebas pada DNA primer ditambah dengan DNA template yang

untainya tepat untuk aktifitas. Dengan demikian, tidak ada DNA polymerase yang dikenal

dapat memulai sintesis DNA untaian baru. Sejak bersintesis masing-masing “fragmen

Okazaki” membutuhkan sebuah acara inisiasi, dan berlangsung sebuah mekanisme efisien

inisiasi rantai penting untuk replikasi DNA. RNA polymerase merupakn enzim kompleks

yang mengkatalis sintesis molekul RNA dari DNA template, yang telah lama diketahui

mampu memulai sintesis rantai RNA baru di bagian spesifik DNA. Ketika hal ini terjadi,

hibrida RNA-DNA terbentuk, dimana RNA yang baru lahir adalah ikatan hydrogen DNA

template. Sejak polymerase DNA mampu memperpanjang rantai polinukleotida yang

mengandung RNA primer dengan 3’-OH bebas, maka para ilmuwan dibeberapa laboratorium

mulai menguji gagasan bahwa sintesis DNA diinisiasi oleh RNA primer. Sekarang ada bukti

definitive yang mendukung proposal sintesis DNA primer oleh segmen pendek RNA, yang

kemudian dihapus oleh 5’ 3’ exonuklease dan diganti dengan DNA sebelum kovalen

disegel oleh polinukleotida ligase (Gb. 5.29). Pada E. coli, RNA primer dipotong oleh

aktivitas 5’ 3’ exonuklease DNA polymerase I. Hal ini terjadi bersamaan dengan sintesis

untaian DNA baru (menggantikan helai RNA primer yang dipotong) oleh aktivitas enzim

5’ 3’ polymerase ini. (Gb. 5.29).

Sintesis RNA primer merupakan katalisis oleh enzim yang disebut primease, yang

memiliki sifat berbeda dari RNA polymerase.E. coli primease adalah hasil dari RNA yang

memiliki 10-60 nukleotida panjang. Pada eukariotik mereka cukup sedikit, sekitar 10

nukleotida panjang. RNA primer digunakan hampir setiap mekanisme, yang paling umum

digunakan untuk memulai sintesis DNA. Namun demikian, virus tertentu tampaknya telah

berevolusi sehingga mekanismenya sangat berbeda untuk inisiasi sintesis DNA (lihat

Kornberg, 1980).

Gb. 5.29 Ilustrasi skema inisiasi sintesis DNA melalui RNA primer. Sebuah RNA untai

pendek disintesis untuk memberikan 3’-OH primer untuk sintesis DNA. RNA primer ini

kemudian dihapus dan diganti dengan DNA oleh 5’ 3’ exonuklease ganda dan 5’ 3’

polymerase, kegiatan tersebut dibangun di dalam DNA polymerase I. DNA ligase kemudian

menutup rantai DNA yang baru lahir, dan mengkatalisis pembentukan hubunganantara

fosfodiester yang berdekatan dengan 3’-hidroksil dan 5’fosfat.

Kelengkapan “Aparat Replikasi” yang Kompleks

Ketika Watson dan Crick bekerja di luar struktur rantai ganda DNA, mereka segera

diakui bahwa sifat saling melengkapi dari dua helai rantai disediakan secara sederhana untuk

tetap menduplikasi materi genetik. Demonstrasi Meselson dan Stahl dari replikasi

semikonservatif dari kromosom E.coli didapatkan konsep bahwa dua untai dari percabangan

rantai ganda berfungsi sebagai template untuk sintesis untai komplementer. Dengan

demikian, rantai induk ganda mengarahkan sintesis dua heliks ganda identik keturunan.

Isolasi Kornberg dari enzim DNA polimerase I, mampu mensintesis DNA in vitro muncul

untuk memberikan link akhir dalam apa yang dianggap mekanisme sederhana untuk replikasi

genetik bahan tetapi seperti tidak terjadi. Dua puluh tahun kemudian, para ilmuwan masih

mencoba untuk bekerja keluar rincian mekanisme replikasi DNA.

Replikasi DNA yang kompleks itu dilakukan oleh kompleks multienzim, sering

disebut aparat replikasi atau replisome. Pada eukariota, komponen pembuatan replikasi baru

mulai diidentifikasi, bahkan dalam prokariota, replikasi DNA membutuhkan banyak protein

yang berbeda, dan rincian tentang bagaimana beberapa protein ini berfungsi dalam replikasi

DNA masih diselidiki hari ini. Misalnya, replikasi DNA pada E. coli memerlukan setidaknya

dua lusin produk gen yang berbeda. Banyak dari produk gen ini telah dimurnikan dan peran

mereka dipelajari dalam replikasi DNA secara in vitro. Gambar 5,30 menunjukkan

keterlibatan beberapa protein E.coli dalam replikasi DNA, hal ini dimaksudkan untuk

menggambarkan kompleksitas dari proses replikasi bukan untuk menggambarkan peran

spesifik dari produk gen individu.

Gambar 5.30.

Kompleksitas aparat replikasi E.coli. Hanya terjadi pada protein yang telah dimurnikan (atau

sebagian dimurnikan) dan penelitian secara in vitro ditunjukkan. Gen produk lainnya, seperti

produk-produk gen dnaJ, dnaK, dnaL, dnaP, dan dnaT yang diketahui diperlukan untuk

replikasi. Namun gen produk ini belum di identifikasi.

Pertama, dua untai komplementer dari double helix induk harus dipisahkan sehingga

masing-masing dapat seve sebagai template untuk sintesis untai anakan baru. Pembukaan dan

gerakan percabangan replikasi terjadi secara processively dengan untai menjadi transiently

dibatalkan menjelang percabanagn ketika bergerak di sepanjang kromosom. Tiga jenis

protein muncul untuk berkontribusi membuka untaian double heliks. (1) DNA protein

pembuka atau helicases DNA secara langsung terlibat dalam mengkatalisis pembukaan untai

double heliks. Pada E. coli, terdapat dua helicases yang berbeda yang terlibat. Satu helikase,

produk dari gen rep, mengikat dan merangsang pemisahan untai yang memiliki 3 'ke 5'

polaritas dalam arah gerakan replikasi fork. Helikase lainnya (identitas yang sebenarnya

masih belum pasti) mengikat dan membantu pembukaan dari untai yang memiliki 5 'ke 3'

polaritas dalam arah perpindahan percabangan. (2) DNA untai tunggal yang mengikat

protein (SSBPs) mengikat erat daerah DNA beruntai tunggal yang dihasilkan oleh helicases

dan membantu menstabilkan perpanjangan untai tunggal template yang dibutuhkan untuk

polimerisasi. SSBPs mengikat DNA sebagai tetramer, dan mengikat secara kooperatititas

(yaitu, pengikatan satu tetramer merangsang pengikatan tetramers tambahan untuk segmen

yang berdekatan dari DNA beruntai tunggal). Pengikatan SSBP untuk DNA beruntai tunggal

cenderung untuk menahan DNA yang dalam konfigurasi perpanjangan dan mencegah dari

melipat kembali pada dirinya sendiri. DNA tunggal yang jenuh dengan SSBP terikat

mereplikasi lebih dari 100 kali lebih cepat dari uncomplex DNA beruntai tunggal in vitro.

Sepertinya, uncomplex DNA alur tunggal membentuk struktur sekunder yang mengganggu

pergerakan polimerase DNA atau komponen lain dari kompleks replikasi sepanjang molekul

dengan cara processive normal. (3) Akhirnya, gyrases DNA, yang mengkatalisis

pembentukan superkoil negatif dalam DNA (lihat Gambar. 5.36), sangat penting untuk

replikasi dan diyakini memainkan peran kunci dalam proses pembukaan. Supercoil telah

diusulkan untuk membantu "drive" proses pembukaan, namun, kami masih tidak tahu

bagaimana ini bekerja. Baru-baru ini, telah menyarankan bahwa DNA girase dapat berfungsi

dengan menghapus superkoil positif yang menumpuk di depan percabangan replikasi sebagai

helicases yang membuka heliks ganda. Dalam kasus apapun, gyrases DNA sangat penting

untuk replikasi DNA dan entah bagaimana mempertahankan DNA sebelum dan sesudah

replikasi dalam struktur topologi yang tepat.

Untai DNA yang baru terbentuk mengiinisiasikan RNA primer dengan mekanismenya

terlebih dahulu. Sitesis RNA primer dikatalis menggunakan enzim khusus yang disebut

dengan primases. Enzim ini diaktifkan dengan formasi yang kompleks dari primases sendiri

dan stidaknya ada 6 protein lainnya , kompleks ini disebut dengan primosome. Pada

penggunaan primase, primosome terdiri protein dasar yang membentuk protein i, n, n’, dan

n” ditambah dengan produk gen dnaB dan dnaC (Table 5.4) primosome membawa keluar

awalan reaksi untuk untaian awal (untaian diperpanjang secara terus menerus pada seluruh

arah 5’ ke 3’) dan proses pengulangan priming (pembentukan) dari sintesis “Okazaki

fragment” untuk menghentikan pembentukan untaian (sintesis dihentikan pada seluruh arah

3’ ke 5’, tp untuk 5’ ke 3’ untuk di level molekular, lihat gambar 5.28). fungsi dari protein

tunggal dalam primosom masih belum tentu.

Pada perpanjangan kovalen (lihat gambar 5.26) dari pembentukan rantai DNA saat

replikasi kromosom di E coli membawa keluar DNA polimerase III. Tidak sepeti DNA

polimerasi I (yang merupakan polipeptida tunggal, lihat gambar 5.25), DNA Polimerase III

merupakan kompleks enzim yang terdiri dari 7 polipeptida yang berbeda (gambar 5.31) dan

seluruh polipeptida tersebut pasti digunakan untuk membantu fungsi replikasi. Aktivitas

polimerase 5’ ke 3’ dan aktivitas ektranuklease 5’ ke 3’ dua-duanya ditemukan pada α

polipeptida yang ada pada DNA polimerase III. Pengkoreksian cetakan pertama dari

polimerase III ditemukan pada € polipeptida. Fungsi untuk setiap subunit lain masih belum

tentu. Melanjutkan aktivitas DNA polimerase III pada replikasi garpu , DNA polimerase I

mengkatalis pemindahan dari RNA primer dengan aksi yang terpadu dari 5’ ke 3’ aktivitas

eksonuclease dan 5’ ke 3’ polimerase, dan DNA ligase mengkatalis penutupan dari hasil

untaian tunggal “nick” (gambar 5.30)

Beberapa komponen penting untuk replikasi DNA telah diidentifikasi secara genetik,

yaitu strain E. coli yang termutasi sehingga mengakibatkan ketidakmampuan untuk

mereplikasi DNA dalam kondisi tertentu (biasanya pada suhu tinggi) telah diidentifikasi.

Mutasi ini memiliki karakter gen tertentu , mereka ditemukan untuk mengidentifikasi satu set

gen (dnaA, dnaB, dsb) yang produknya diperlukan untuk sintesis DNA in vivo. Produk dari

beberapa gen tersebut telah diketahui. Contohnya adalah dnaE, dnaN, dnaX, dan dnaZ yang

merupakan kode untuk empat dari tujuh subunit enzim DNA polymerase III lengkap, dan

dnaG yang khusus untuk Primase. Produk dan fungsi dari protein lainnya masih belum

diketahui. Komponen lain untuk replikasi enzim (beberapa subunit DNA polimerase III) yang

ditemukan dengan analisis biokimia, dan gen-gen yang mengkode protein tersebut sampai

saat ini masih belum bisa diidentifikasi.

Diharapkan bahwa fungsi yang tepat dari banyak produk gen yang terlibat dalam

replikasi akan bekerja selama beberapa tahun ke depan. Sehingga dilakukan percobaan untuk

mengisolasi replisomes functional, namun telah banyak yang belum berhasil. Sedangkan

untuk pemulihan dari replikasi subcomplexes aparatur yang dimurnikan hasilnya lebih

sukses. Hal ini tidak diragukan lagi, hasil dari fakta bahwa kompleks yang diselenggarakan

bersama oleh interaksi protein-protein yang relatif lemah, yang terganggu selama prosedur

isolasi. Sebagai tambahan, kompleks replikasi mungkin berikatan dengan membran dan

membutuhkan struktur membran untuk perakitan mereka. Hal ini mebuktikan bahwa

replikasi garpu berhubungan dengan membran sel pada prokariota dan dengan nuclear

envelope di eukariota.

Pertanyaan

1. Bagaimana proses inisiasi sintesis DNA melalui RNA primer?

Jawab: sebuah RNA untai pendek disintesis untuk memberikan 3’-OH primer untuk

sintesis DNA. RNA primer ini kemudian dihapus dan diganti dengan DNA oleh 5’

3’ exonuklease ganda dan 5’ 3’ polymerase, kegiatan tersebut dibangun di dalam

DNA polymerase I. DNA ligase kemudian menutup rantai DNA yang baru lahir, dan

mengkatalisis pembentukan hubunganantara fosfodiester yang berdekatan dengan 3’-

hidroksil dan 5’fosfat.

2. Bagaimana konsep replikasi semikonservatifbdari kromosom E. coli?

Jawab: dua untai dari percabangan rantai ganda induk berfungsi sebagai template

untuk sintesis untai komplementer. Rantai induk ganda mengarahkan sintesis dua

heliks ganda yang identik ( keturunan).