KELOMPOK 3Laelatul Maghfiroh (126430)Mardhiyah Riasari (126438)

Mauludiah Dwi Agustin (126444) Meisya Destiana (126447)

Mochamad Rodjulun Kaffah (126455)Muhammad Hirfan Briantama (126459)

Nadia Yulika Munthe (126469)Nafildo Rahmat (126472)

Nindya Fortuna Rahma (126477)Oka Oktafiana (126494)

PENENTUAN KADAR GLUKOSA DAN FRUKTOSA PADA

MADU RANDU DAN MADU KELENGKENG DENGANMETODE KCKT

KROMATOGRAFI CAIR

KINERJA TINGGI

LATAR BELAKANG• Madu dihasilkan oleh lebah madu dengan

memanfaatkan tanaman. madu yang dihasilkan memiliki rasa dan aroma yang berbeda-beda.

• Kandungan zat yang ada didalam madu diantaranya adalah glukosa dan fruktosa yang kandungan menurut standar minimal 60%.

• Madu yang baik harus sesuai dengan standar Industri Indonesia (SII) tahun 1997 dan 1985. Madu yang sesuai dengan SII banyak ditemui pada madu murni, tetapi di pasaran dalam negeri masih banyak ditemui madu-madu yang dicampur dengan bahan-bahan lain sehingga kualitasnya berkurang dan tidak sesuai dengan SII.

ANALISIS MADU SECARA UMUM

Fruktosa 38,2 %

Glukosa 31,3 %

Maltosa 7,1 %

Sukrosa 1,3 %

Air 17,2 %

Gula paling tinggi 1,5 %

Abu ( analisis kimia ) 0,2 %

Lain – lain 3,2 %

TUJUAN

• Menganalisis manfaat dari glukosa dan fruktosa yang terdapat dalam madu randu dan madu kelengkeng

• Menentukan suhu optimal dalam kolom KCKT umtuk pemisahan pada madu randu dan madu kelengkeng

• Menetapkan kadar glukosa dan fruktosa pada madu randu dan madu kelengkeng secara KCKT

TINJAUAN PUSTAKA

• Penentuan kadar glukosa dan fruktosa dengan kromatografi mempertimbangkan :

1. pemilihan detektor, 2. Pemilihan kolom, 3. Pemilihan eluen, 4. Laju alir eluen 5. Penentuan suhu kolom.

Pemisahan masing-masing komponen dengan menggunakan alat KCKT harus dilakukan pada kondisi optimum. Pemisahan yang baik terjadi apabila kromatogram masing-masing komponen tidak saling tumpang tindih.

FRUKTOSA DAN GLUKOSA

• Karbohidrat merupakan kelompok senyawa yang terdiri dari karbon, hidrogen dan oksigen

• Gula dikategorikan sebagai karbohidrat, dan dikategorikan sebagai monosakarida, disakarida dan polisakarida

• Monosakarida adalah jenis sederhana karbohidrat, terdiri dari molekul tunggal (termasuk glukosa, galaktosa dan fruktosa)

INSTRUMENTASI KCKT

Wadah Fase Gerak

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Pada laboratorium biasanya digunakan botol kosong yang transparan ataupun Erlenmeyer yang memiliki tutup sebagai wadah fasa gerak. Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi.

Pompa KCKT

• Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, dan teflon

• Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 6000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit.

• Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit.

Injektor• Sampel dan standar disuntikkan secara

langsung ke dalam fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan syringe. Terdapat 2 metode penyuntikan sampel, yaitu inject-loud-inject dan loud-inject-loud.

• Ada 3 macam system injector pada KCKT, yaitu:1. Injector dengan memakai septum2. Injector tanpa memakai septum3. Injector dengan pipa dosis

Sistem dengan pipa dosis merupakan pilihan yang tepat pada KCKT khususnya untuk analisis secara kuantitatif. Sebab, ketepatan jumlah volume sampel yang diinjeksikan akan sangat penting untuk analisis kuantitatif dan keadaan ini hanya dapat diantisipasi dengan injector sistem pipa dosis (sample loop). Prinsip kerjanya adalah “Load-inject” ini berarti pada keadaan pertama sampel akan masuk loop dan akhirnya dengan volume yang tidak berkurang segera masuk ke dalam kolom untuk pemisahan.

KOLOM

• Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solut/analit.

• Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi.

Oven Kolom

Kolom KCKT diletakkan di dalam oven untuk menjaga temperature kolom supaya stabil (tetap sesuai dengan program). Hal ini sangat penting untuk memperoleh stabilitas dan keterandalan dalam analisis dengan metode KCKT. Oven kolom yang banyak dipakai adalah dengan system sirkulasi udara panas yang bertekanan. Oven kolom dapat memuat kolom KCKT sampai 4 kolom sekaligus dengan temperature kerja sampai 99oC.

Detektor

• Syarat detektor1. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel.2. Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang sangat kecil.3. Stabil dalam pengopersiannya.4. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita.

Lanjutan..

5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas (kisaran dinamis linier).

6. Dapat bekerja dari temperature kamar sampai 400oC

7. Tidak merusak sampel8. Tidak dipengaruhi perubahan temperature

dan kecepatan pelarut pengembang

METODE PENELITIAN• Bahan

1. Air deionisasi2. Larutan standar glukosa 5%3. Larutan standar fruktosa 5%4. Sampel madu randu5. Sampel madu kelengkeng

• Peralatan

1. Seperangkat alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)2. Labu ukur 20 mL, 25 mL, 50 mL3. Pipet volumetric 1 mL, 2,5 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL4. Alat sentrifugasi5. Kertas saring 0,45 µm

Pembuatan campuran glukosa dan fruktosa Dari larutan satandar, dapat dibuat campuran dengan

masing-masing konsentrasi 0,125%; 0,25%; 0,5% dan 1%, dengan cara :

1. Campuran glukosa dan fruktosa 1% Dipipet masing-masing larutan standar glukosa 5% dan

fruktosa 5% sebanyak 10 mL, dimasukkan ke dalam labu takar 50 mL dan ditera dengan aquadest, dihomogenkan.

2. Campuran glukosa dan fruktosa 0,5% Dipipet masing-masing larutan standar glukosa 5% dan

fruktosa 5% sebanyak 5 mL, dimasukkan ke dalam labu takar 50 mL dan ditera dengan aquadest, dihomogenkan.

3. Campuran glukosa dan fruktosa 0,25%Dipipet masing-masing larutan standar glukosa 5% dan fruktosa 5% sebanyak 2,5 mL, dimasukkan ke dalam labu takar 50 mL dan ditera dengan aquadest, dihomogenkan.

4. Campuran glukosa dan fruktosa 0,125%Dipipet masing-masing larutan standar glukosa 5% dan fruktosa 5% sebanyak 10 mL, dimasukkan ke dalam labu takar 50 mL dan ditera dengan aquadest, dihomogenkan.

Masing-masing campuran tersebut, disaring dengan kertas saring 0,45 µm.

Pembuatan Kurva Standar• Larutan standar glukosa dan fruktosa 0,125 % ;0,25 %;

0,5 % dan 1 % diinjeksikan20 μL • Plot hubungan antara konsentrasi larutan standar

dengan luas puncak dari masing-masing komponen, dibuatpersamaan regresi liniernya y = a + bx

Penentuan Kadar Glukosa dan Fruktosa

• Masing-masing madu dipipet 0,5 mL dan diencerkan volumenya tepat 50 mL, kemudian disentrifugasi selama 30 menit, disaring dengan kertas saring 0,45 μm.

• Sampel diinjeksikan sebanyak 20 μL

HASIL DAN PEMBAHASAN

• Sistem kromatografi tersebut adalah sebagai berikut :Kolom : Metacarb 87CEluen : Air deionisasiLaju Alir : 1 mL / menitSuhu Kolom : 80oCDetektor : Indeks biasTeknik elusi : Isokratik

• Tabel 1 menunjukkan bahwa glukosa muncul sebagai puncak pada waktu retensi yang lebih cepat daripada fruktosa. Hal ini disebabkan karena adanya interaksi yang lebih kuat antara fruktosa (yang mengandung gugus keton) dengan fase diam daripada interaksi antara glukosa (yang mengandung gugus aldehid) dengan fase diam.

• Sifat fruktosa yang memiliki gugus keton lebih suka tertahan pada fasa diam yang bersifat non polar, karena kesamaan sifat non polar.Sedangkan glukosa yang memiliki gugus aldehid lebih suka dengan fasa gerak yang bersifat polar karena kesamaan sifat polar.

Pemisahan glukosa dan fruktosa pada sampel madu ini dilakukan menggunakan kecepatan laju alir sebesar 1 mL/menit dengan suhu kolom 80°C, karena pada kondisi tersebut diperoleh pemisahan yang baik. Kedua komponen (glukosa dan fruktosa) dapat terpisahkan satu dengan yang lain mencapai baseline

Data luas area dari kromatogram campuran glukosa dan fruktosa pada berbagai

konsentrasi

Glukosa : y = -73545,652 + 1116023,791 x (r = 0,9960)

Fruktosa : y = -69966,565 + 990654,539 x (r = 0,9918)

KESIMPULAN

• Pada kondisi ini, senyawa standar glukosa dan fruktosa keluar sebagai puncak dengan waktu retensi masing-masing 6,212 menit dan 7,793 menit.

• Kolom yang digunakan adalah kolom metacarb 87C dengan eluen air deionisasi. Kondisi operasional yang terbaik diperoleh pada suhu kolom 80ºC dan laju alir 1 mL/menit

• Kadar glukosa pada madu randu adalah sebesar 27,31 % dan pada madu kelengkeng sebesar 28,09 %. Sedangkan kadar fruktosa pada madu randu sebesar 40,99 % dan pada madu kelengkeng sebesar 40,03 %.

• Sampel madu yang dianalisis telah memenuhi ketentuan SII, dimana kadar gula pereduksi total pada madu randu sebesar 68,12 % dan pada madu kelengkeng sebesar 68,12 %.

TERIMA KASIH