bab 3 percobaan 3 - · pdf filekadar air, penetapan kadar abu total, kadar sari larut air,...
Post on 06-Feb-2018
250 Views
Preview:
TRANSCRIPT
18
BAB 3
PERCOBAAN
3.1 Bahan
Bahan uji : Ekstrak air umbi bawang putih (Allium sativum L.), ekstrak etanol rimpang
kunyit (Curcuma domestica Val.), ekstrak etanol rimpang jahe merah (Zingiber officinale
Rosc. var. sunti Val.), ekstrak etanol buah mengkudu (Morinda citrifolia L). Bahan-bahan
lain: etanol 95 %, amil alkohol, serbuk magnesium, kloroform, pereaksi Dragendroff,
pereaksi Mayer, besi (III) klorida, natrium hidroksida 1 N, eter, pereaksi Liebermann-
Burchard, amoniak, toluena, asam asetat anhidrida, asam klorida pekat, asam klorida 2 N,
gelatin, pereaksi Steasny, asam sulfat pekat, isopropanol, asam asetat glasial, etil asetat, n-
heksan, natrium karboksimetilselulosa, 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH), metanol, basa
tris, kalium klorida, asam klorida 0,1 N, asam 2-tiobarbiturat (TBA), natrium lauril sulfat.
3.2 Alat
Alat penetapan kadar air, alat refluks, lampu Ultraviolet (Desaga Sarstedt-Guppe), pelat
silica gel GF254, alat timbang mencit, jarum oral, alat bedah, tangas air, tabung reaksi, alat
sentrifuga suhu dingin (GS-15R Centrifuge Beckmann), mikropipet, inkubator suhu,
tabung sentrifuga, alat sentrifuga biasa, alat vortex, spektrofotometer UV-Vis (Hewlett-
Packard AP 8452), kuvet.
3.3 Hewan Uji
Mencit betina Swiss Webster usia 6-8 minggu dengan bobot 20-30 g yang diperoleh dari
Laboratorium Hewan Sekolah Farmasi Institut Teknologi Bandung.
3.4 Pengumpulan Bahan Uji
Ekstrak air bawang putih diperoleh dari industri obat herbal Finzelberg, sedangkan ekstrak
etanol kunyit diperoleh dari PT. Phytochemindo Reksa. Simplisia rimpang jahe merah
diperoleh dari Kebun Percobaan Manoko, Lembang pada bulan Januari 2007, setelah itu
dikeringkan dalam oven bersuhu 60-70°C kemudian diserbuk.
19
3.5 Pembuatan Ekstrak Uji
Ekstraksi jahe merah dan mengkudu dilakukan di Sekolah Farmasi Institut Teknologi
Bandung menggunakan metode refluks kemudian dipekatkan dengan menggunakan
penguap vakum berputar.
3.6 Karakterisasi Ekstrak
Karakterisasi ekstrak yang dilakukan meliputi penentuan susut pengeringan, penetapan
kadar air, penetapan kadar abu total, kadar sari larut air, kadar sari larut etanol, dan
pengujian Kromatografi Lapis Tipis (KLT) senyawa identitas. Dilakukan pula penetapan
bobot jenis khusus untuk ekstrak kental.
3.6.1 Susut Pengeringan
Ekstrak ditimbang sebanyak 1 gram dan dimasukkan ke dalam botol timbang yang
sebelumnya telah dipanaskan pada suhu 105 ºC selama 30 menit dan telah ditara. Sebelum
ditimbang, ekstrak diratakan dalam botol timbang dengan menggoyangkan botol hingga
menjadi lapisan dengan tebal lebih kurang 5-10 mm. Jika ekstrak yang diuji berupa ekstrak
kental, ekstrak diratakan dengan bantuan batang pengaduk. Botol dimasukkan ke dalam
ruang pengering dengan tutup dibuka, lalu dikeringkan pada suhu 105 ºC hingga bobot
tetap. Setiap sebelum pengeringan, botol dibiarkan dalam keadaan tertutup mendingin
sebelum eksikator dalam suhu kamar.
3.6.2 Penetapan Kadar Air
Sejumlah ekstrak yang diperkirakan mengandung 2-4 ml air ditimbang dan dimasukkan ke
dalam labu kering. Jika ekstrak berupa ekstrak kental, ekstrak ditimbang dalam sehelai
lembaran logam dengan ukuran yang sesuai dengan leher labu.
Tabung penerima pendingin dibersihkan dengan asam, dibilas dengan air, lalu dikeringkan.
Ke dalam labu kering dituangkan 200 ml toluena dan 2 ml air, disuling selama 2 jam,
didinginkan selama 30 menit, kemudian volume dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Hasil
yang diperoleh disebut sebagai volume destilat pertama.
Ekstrak dan batu didih dimasukkan ke dalam labu destilasi kemudian dipanaskan perlahan
hingga mendidih. Kecepatan penyulingan diatur lebih kurang 2 tetes tiap detik, setelah
sebagian besar air tersuling, kecepatan penyulingan dinaikkan hingga 4 tetes tiap detik.
20
Setelah semua air tersuling, bagian dalam pendingin dicuci dengan toluena. Tabung
penerima dibiarkan mendingin hingga suhu kamar. Lapisan air dan toluena dibiarkan
memisah, kemudian dibaca volume airnya. Volume yang terbaca disebut sebagai volume
destilat kedua. Kadar air dinyatakan dalam persen dengan persamaan :
( )W
nn100(%)airKadar 1 −=
W menyatakan berat ekstrak (g), n1 sebagai volume destilat kedua atau volume total air dan
n sebagai volume destilat pertama atau volume air setelah penyulingan pertama (Ditjen
POM, 1978).
3.6.3 Penetapan Kadar Abu Total
Sebanyak 2 gram ekstrak ditimbang dan dimasukkan ke dalam krus silikat yang telah
dipijarkan dan ditara, lalu diratakan. Krus yang telah berisi ekstrak dipijarkan perlahan-
lahan hingga arang habis, lalu didinginkan. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah
dikeringkan di udara (Ditjen POM, 1978).
3.6.4 Penetapan Kadar Sari Larut Air
Sebanyak 5 g ekstrak dimaserasi dengan 100 ml air kloroform (larutan 2,5 ml kloroform P
dengan air hingga 100 ml) selama 24 jam menggunakan labu bersumbat sambil berkali-
kali dikocok selama 6 jam pertama dan kemudian dibiarkan selama 18 jam. Hasil maserasi
disaring lalu 20 ml filtrat diuapkan hingga kering dalam cawan dangkal berdasar rata yang
telah ditara. Kemudian cawan tersebut dipanaskan pada suhu 105 °C hingga bobot tetap.
Kadar sari larut air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara (Ditjen POM,
1978).
3.6.5 Penetapan Kadar Sari Larut Etanol
Sebanyak 5 g ekstrak dimaserasi dengan 100 ml etanol 95 % selama 24 jam menggunakan
labu bersumbat sambil berkali-kali dikocok selama 6 jam pertama kemudian dibiarkan
selama 18 jam. Hasil maserasi disaring cepat dan dihindarkan dari penguapan etanol.
Filtrat sebanyak 20 ml diuapkan hingga kering dalam cawan dangkal berdasar rata yang
telah ditara. Kemudian cawan tersebut dipanaskan pada suhu 105°C hingga bobot tetap.
Kadar sari larut etanol dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara (Ditjen
POM, 1978).
21
3.6.6 Pengujian Kromatografi Lapis Tipis Senyawa Identitas
Pola kromatogram dibuat dengan cara kromatografi lapis tipis (KLT) pada lempeng silika
gel GF254 dengan berbagai fase gerak sesuai dengan golongan kandungan kimia sebagai
sasaran analisis. Senyawa pembanding pola kromatogram menggunakan senyawa identitas
alliin untuk ekstrak air umbi bawang putih (Allium sativum L.), kurkuminoid untuk ekstrak
etanol rimpang kunyit (Curcuma domestica Val.), dan skopoletin untuk ekstrak etanol buah
mengkudu (Morinda citrifolia L.). Sistem KLT menggunakan pelat silica gel GF254 dengan
pengembang butanol-asam asetat glasial-air (4:3:3) dan penampak bercak asam sulfat 10 %
dalam metanol, dipantau di bawah sinar UV 254 dan 366 nm untuk ekstrak bawang putih.
Untuk ekstrak kunyit digunakan pengembang kloroform-etanol 95 %-asam asetat glasial
(95:5:1) dan penampak bercak asam sulfat 10 % dalam metanol, dipantau di bawah sinar
UV 254 dan 366 nm (Rustyawati, 1991). Untuk ekstrak jahe merah digunakan
pengembang toluena-etil asetat (93:7) dan penampak bercak asam sulfat 10 % dalam
metanol, dipantau di bawah sinar UV 254 dan 366 nm. Untuk ekstrak mengkudu
digunakan pengembang n-heksan-etil asetat (6:4) dan penampak bercak asam sulfat 10 %
dalam metanol, dipantau di bawah sinar UV 366 nm.
3.7 Pemeriksaan Kandungan Kimia Ekstrak
Pemeriksaan kandungan kimia ekstrak meliputi pemeriksaan terhadap golongan senyawa
alkaloid, flavonoid, saponin, tanin, kuinon dan steroid/triterpenoid.
3.7.1 Pemeriksaan Alkaloid
Sebanyak 2 g ekstrak dilembabkan dengan 5 ml amonia 25 %, digerus dalam mortir,
kemudian ditambahkan 20 ml kloroform dan digerus kuat-kuat. Campuran disaring lalu
filtrat diteteskan pada kertas saring kemudian ditetesi pereaksi Dragendorff. Reaksi positif
jika terbentuk warna merah/jingga. Filtrat yang sama diekstraksi dua kali dengan larutan
asam klorida 10 %, dimasukkan ke dalam dua tabung masing-masing 5 ml dan diuji
dengan pereaksi Mayer dan Dragendorff.
3.7.2 PemeriksaanFlavonoid
Sebanyak 5 ml filtrat air dalam tabung reaksi ditambahkan serbuk magnesium, 2 ml
campuran etanol-asam klorida pekat (1:1) dan 3 ml amil alkohol. Tabung dikocok kuat dan
22
dibiarkan memisah. Jika terbentuk warna merah, jingga, atau kuning pada lapisan amil
alkohol, berarti filtrat mengandung senyawa flavonoid.
3.7.3 Pemeriksaan Saponin
Sebanyak 10 ml filtrat air dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan dikocok vertikal selama
10 detik. Jika busa yang terbentuk di tabung stabil selama tidak kurang dari 10 menit
dengan tinggi 1-10 cm dan busa tidak hilang dengan penambahan asam klorida 2 N
pengujian menunjukkan adanya saponin.
3.7.4 Pemeriksaan Tanin
Sebanyak 10 g ekstrak dicampur dengan 100 ml air panas, kemudian dididihkan selama 15
menit. Campuran tersebut setelah dingin kemudian disaring dan filtrat air dibagi menjadi
tiga bagian. Ke dalam filtrat pertama ditambahkan larutan besi (III) klorida 1 %.
Terbentuknya warna biru tua atau hitam kehijauan menunjukkan adanya golongan senyawa
tanin. Ke dalam filtrat kedua ditambahkan larutan gelatin 1 %. Terbentuk endapan
menunjukkan adanya senyawa tanin. Ke dalam filtrat ketiga ditambahkan 15 ml pereaksi
Steasny dan dipanaskan dalam penangas air suhu 90 °C. Terbentuknya endapan warna
merah muda menunjukkan adanya tanin katekat. Kemudian endapan dipisahkan dan filtrat
dijenuhkan dengan natrium asetat, kemudian ditambahkan beberapa tetes larutan besi (III)
klorida 1 %. Terbentuknya warna biru tinta menunjukkan adanya tanin galat.
3.7.5 Pemeriksaan Kuinon
Sebanyak 5 ml filtrat air ditambahkan dengan beberapa tetes larutan natrium hidroksida 1
N. Terbentuknya warna merah menunjukkan adanya golongan senyawa kuinon.
3.7.6 Pemeriksaan Steroid/Triterpenoid
Sebanyak 1 g ekstrak dimaserasi dengan 20 ml eter selama 2 jam. Hasil maserasi disaring
dan diambil filtratnya. Sebanyak 5 ml filtrat diuapkan dalam cawan penguap hingga
diperoleh residu. Residu tersebut ditambahkan 2 tetes asam asetat anhidrida dan 1 tetes
asam sulfat pekat. Terbentuknya warna merah-ungu menunjukkan adanya golongan
senyawa triterpenoid dan warna biru-hijau menunjukkan adanya golongan senyawa steroid.
23
3.8 Pengujian Aktivitas Antioksidan
Pengujian aktivitas antioksidan yang dilakukan meliputi uji peredaman radikal bebas
DPPH, uji peredaman peroksidasi lipid secara in vitro, dan uji peredaman peroksidasi lipid
secara ex vivo.
3.8.1 Uji Peredaman radikal bebas DPPH
Ekstrak atau pembanding dilarutkan dalam air suling atau metanol sehingga diperoleh
konsentrasi 2, 25, 50, 100, 200 dan 500 μg/ml untuk melihat kisaran konsentrasi yang
diperlukan agar serapan DPPH dapat terukur dengan baik. Konsentrasi ekstrak dipersempit
sedemikian rupa agar diperoleh serapan untuk mendapat nilai EC50 yang lebih akurat.
Larutan pereaksi DPPH dibuat dengan melarutkan DPPH dalam metanol yang telah
didestilasi dengan konsentrasi 40 μg/ml, dibuat segar dan dijaga pada suhu rendah serta
terlindung dari cahaya. Sebanyak 1,5 ml larutan uji atau pembanding direaksikan dengan
3,0 ml larutan DPPH dan diinkubasi pada suhu ruangan selama 30 menit, kemudian diukur
serapannya pada λmax 516 nm. Sebagai kontrol digunakan 1,5 ml metanol yang direaksikan
dengan 3,0 ml larutan pereaksi DPPH. Persen peredaman radikal bebas dihitung dengan
rumus:
(Akontrol - Auji)
% peredaman =Akontrol
x 100 %
3.8.2 Uji Peredaman Peroksidasi Lipid secara in vitro
Ekstrak atau pembanding dilarutkan dalam suspensi natrium karboksimetilselulosa 0,5%
sehingga diperoleh konsentrasi 50, 100, 250, 500, 750, dan 1000 μg/ml. Sebanyak 1 g hati
mencit betina dihomogenasi dalam 10 ml dapar tris-kalium klorida 150 mM:50 mM pH 7,2
yang dijaga pada suhu dingin kemudian disentrifuga dengan kecepatan 3000 rpm pada
suhu 4 ºC selama 10 menit. Sebanyak 0,2 ml supernatan homogenat diinkubasi pada suhu
37 ºC selama 1 jam, lalu ditambahkan 2 ml asam klorida 0,1 N, 0,1 ml natrium lauril sulfat
10 % b/v dan diaduk dengan vortex selama 2 menit. Ke dalam campuran tersebut
ditambahkan 2 ml asam 2-tiobarbiturat 0,5 % b/v dan setelah diaduk dengan vorteks
selama 30 detik, dipanaskan selama 1 jam dalam penangas air suhu 95 ºC, kemudian
didinginkan dengan air es. Sampel disentrifuga dengan kecepatan 3000 rpm selama 10
menit, kemudian serapan supernatan diukur pada λmax 532 nm. Semakin banyak TBARS
(Thiobarbituric Acid Reactive Substance), yaitu hasil reaksi malondialdehid dengan asam
24
2-tiobarbiturat yang terbentuk maka serapan akan semakin besar dan ekstrak yang
memiliki efek antioksidan paling tinggi akan memberikan serapan yang paling rendah.
Persen peredaman peroksidasi lipid dihitung dengan rumus seperti pada pengujian
peredaman DPPH. Dari hasil percobaan ditentukan EC50, yaitu konsentrasi efektif larutan
uji yang mampu meredam 50 % radikal bebas peroksidasi lipid. (Yang, 1991; Navarro,
1993).
3.8.3 Uji Peredaman Peroksidasi Lipid secara ex vivo
Mencit dikelompokkan menjadi tiga kelompok yaitu kelompok uji, kelompok kontrol dan
kelompok pembanding. Ekstrak uji dan pembanding diberikan secara oral satu kali sehari
selama 7 hari berturut-turut. Pada hari ke-8 mencit dikorbankan untuk diambil hatinya.
Prosedur selanjutnya sama seperti pada uji peroksidasi lipid in vitro. Sebanyak 1 g hati
mencit betina dihomogenasi dalam 10 ml dapar tris-kalium klorida 150 mM:50 mM pH 7,2
yang dijaga pada suhu dingin kemudian disentrifuga dengan kecepatan 3000 rpm pada
suhu 4 ºC selama 10 menit. Sebanyak 0,2 ml supernatan homogenat diinkubasi pada suhu
37 ºC selama 1 jam, lalu ditambahkan 2 ml asam klorida 0,1 N, 0,1 ml natrium lauril sulfat
10 % b/v dan diaduk dengan vortex selama 2 menit. Ke dalam campuran tersebut
ditambahkan 2 ml asam 2-tiobarbiturat 0,5 % b/v dan setelah diaduk dengan vorteks
selama 30 detik, dipanaskan selama 1 jam dalam penangas air suhu 95 ºC, kemudian
didinginkan dengan air es. Sampel disentrifuga dengan kecepatan 3000 rpm selama 10
menit, kemudian serapan supernatan diukur pada λmax 532 nm. Persen peredaman
peroksidasi lipid dihitung dengan rumus seperti pada pengujian peredaman DPPH. Data
kelompok uji dibandingkan menggunakan uji statistik ANOVA.
top related