aktivitas sitotoksik dan apoptosis sel khamir … · penulisan skripsi ini dengan baik. shalawat...
TRANSCRIPT
AKTIVITAS SITOTOKSIK DAN APOPTOSIS SEL KHAMIR
EKSTRAK KLOROFORM KAPANG ENDOFIT
Evodia suaveolens
AZMI AZHARI
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
ABSTRAK
AZMI AZHARI. Aktivitas Sitotoksik dan Apoptosis Sel Khamir Ekstrak
Kloroform Kapang Endofit Evodia suaveolens. Dibimbing oleh WARAS
NURCHOLIS dan DIMAS ANDRIANTO.
Kanker dapat terjadi apabila jumlah sel tidak dapat dipertahankan dalam
jumlah tetap. Sel yang mengalami gagal apoptosis akan mengalami pembelahan
terus menerus. Apoptosis adalah suatu kematian sel terprogram. Apoptosis pada
sel khamir dapat dijadikan sebagai model, karena siklus sel khamir mirip dengan
sel manusia. Evodia suaveolens dapat menghasilkan senyawa evodiamin yang
dapat memicu apoptosis. Kapang endofit dapat menghasilkan senyawa bioaktif
yang mirip inang tanamannya. Sebanyak 8 isolat kapang endofit telah diisolasi
dari batang Evodia suaveolens. Kapang endofit lalu difermentasi dan diekstraksi
metabolit sekundernya dengan kloroform. Ekstrak diujikan sitotoksitasnya dengan
menggunakan metode BSLT (Brine Shrimp Lethality Test). Nilai LC50 dari setiap
kapang endofit Evodia suaveolens adalah kapang 1 bernilai 315 ppm, kapang 3
bernilai 270 ppm, kapang 5 bernilai 400 ppm, kapang 7 bernilai 19.7 ppm dan
kapang 8 bernilai 403 ppm. Kapang 2, 4, dan 6 tidak toksik pada konsentrasi 500,
100, 50 dan 10 ppm. Konsentrasi LC50 masing-masing isolat dipakai untuk
induksi apoptosis pada sel khamir. Secara berturut-turut persen frekuensi sel
khamir yang mengalami petit dari kapang 1, kapang 3, kapang 5, kapang 7, dan
kapang 8 adalah 69%, 75%, 86%, 90% dan 90.4%. Persen frekuensi ini
membuktikan isolat 1, 3, 5, 7 dan 8 kapang endofit Evodia suaveolens dapat
menginduksi apoptosis pada sel khamir.
ABSTRACT
AZMI AZHARI. Cytotoxic and Apoptosis Activities in Yeast of Chloroform
Extract from Endophytic Molds Evodia suaveolens. Supervised by WARAS
NURCHOLIS and DIMAS ANDRIANTO.
Cancer can occur if the cell cannot be sustained in the amount fixed. Cells that
have failed apoptosis, they will division continously. Apoptosis is the process of
programmed cell death. Apoptosis in yeast cell can be used as model because
yeast cell cycle similar to human cell. Evodia suaveolens produce evodiamine, it
trigger apoptosis. Endophytic mold produce bioactive compounds that similar to
its host plant. Eight isolates endophytic mold have been isolated from steam of
Evodia suaveaolens. Endophytic mold then was fermented and secondary
metabolites was extracted with chloroform. Then the extracts was tested using
cytotoxic activity with BSLT (Brine Shrimp Lethality Test) method. Values of
LC50 from each endophytic mold of Evodia suaveolens are 315 ppm (mold 1), 270
ppm (mold 3), 400 ppm (mold 5), 19.7 ppm (mold 7), and 403 ppm (mold 8).
Mold 2,4, and 6 is not toxic in 500, 100, 50, and 10 concentration. Each
concentration of LC50 used for apoptosis induction in yeast cell. Percentation of
yeast cell that have petite from mold 1, mold 3, mold 5, mold 7, and mold 8 are
69%, 75%, 86%, 90%, and 90.4% respectively. This percentation showed that
isolate 1, 3, 5, 7, 8 from endophytic mold Evodia suaveolens can induction
apoptosis in yeast cell.
AKTIVITAS SITOTOKSIK DAN APOPTOSIS SEL KHAMIR
EKSTRAK KLOROFORM KAPANG ENDOFIT
Evodia suaveolens
AZMI AZHARI
G84080050
Skripsi
sebagai salah satu syarat memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
Judul Skripsi : Aktivitas Sitotoksik dan Apoptosis Sel Khamir Ekstrak
Kloroform Kapang Endofit Evodia suaveolens
Nama : Azmi Azhari
NIM : G84080050
Disetujui,
Komisi Pembimbing
Diketahui,
Tanggal Lulus :
Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc
Ketua Departemen Biokimia
Waras Nurcholis, M.Si
Ketua
Dimas Andrianto, M.Si
Anggota
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala rahmat,
berkah, dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan
penulisan skripsi ini dengan baik. Shalawat serta salam semoga selalu tercurah
kepada Nabi Muhammad SAW, keluarga, sahabat, dan para pengikutnya sampai
akhir zaman. Penelitian ini berjudul Aktivitas Sitotoksik dan Apoptosis Sel
Khamir Ekstrak Kloroform Kapang Endofit Evodia suaveolens. Kegiatan
penelitian yang merupakan salah satu syarat memperoleh gelar sarjana sains pada
Departemen Biokimia ini dilakukan dari bulan Februari hingga Juni 2012,
bertempat di Laboratorium Biokimia Institut Pertanian Bogor.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah membantu
dalam penyelesaian penelitian ini baik secara langsung maupun tidak langsung.
Ucapan terima kasih kepada DIKTI selaku sumber pendanaan dari penelitian ini
yang merupakan PKM-P (Program Kreativitas Mahasiswa Penelitian) yang
berjudul Pemanfaatan Senyawa Metabolit Sekunder Evodia suaveolens sebagai
Antikanker yang disusun oleh Ridho Pratama, Affan Iqbal, dan Ayu Arthuria.
Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Waras Nucholis, M.Si. sebagai
ketua pembimbing dan Dimas Andrianto, M.Si. sebagai anggota pembimbing
yang telah memberikan bimbingan, motivasi, saran, dan kritiknya. Terima kasih
kepada kedua orang tua tercinta, adik, Laita dan seluruh keluarga atas segala kasih
sayang, perhatian, doa, dan dukungan yang tak henti-hentinya diberikan kepada
penulis dan sangat berarti bagi penulis.
Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada rekan-rekan selama penelitian
Affan, Ridho, Khoerotunnisa atas saran dan motivasi yang diberikan. Selain itu,
penulis ucapkan terima kasih kepada teman-teman seperjuangan Biokimia 45,
rekan penelitian satu lab, Ines, Mega, Didit, Dian, Aros, Anisa Utami, Daniel,
Elvita, Yoan, Rian, seluruh warga kosan Kingstone Perwira dan juga sahabat-
sahabat yang tidak dapat disebutkan satu persatu atas segala bantuan, saran, dan
motivasi yang diberikan. Penulis berharap semoga hasil penelitian dan karya
ilmiah ini dapat bermanfaat bagi semua pihak yang memerlukannya.
Bogor, Juni 2012
Azmi Azhari
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di kabupaten Cirebon pada tanggal 6 Maret 1990 dari ayah
bernama Drs. Khudlori dan ibu bernama Dra. Rodliyah Zaenudin M.Ag. Penulis
merupakan anak pertama dari dua bersaudara.
Pendidikan penulis dimulai dari TK Khatulistiwa dan SDN II Pegagan,
kemudian dilanjutkan ke SMP Negeri 1 Kota Cirebon. Tahun 2008 penulis
menyelesaikan pendidikan di MAN Darussalam Ciamis dan pada tahun yang
sama lolos seleksi masuk dan melanjutkan studi di Institut Pertanian Bogor
melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Di IPB penulis mengambil
mayor Biokimia di Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan penulis menjadi komti (ketua kelas) dari sejak
TPB (Tingkat Persiapan Bersama) hingga masuk departemen Biokimia. Penulis
juga aktif dalam kegiatan organisasi kemahasiswaan di IPB dan organisasi
mahasiswa daerah, diantaranya penulis pernah aktif sebagai Kordinator CIC
(Communication and Information Center) Community Research and Education of
Biochemistry periode 2009/2010, dan staf humas Ikatan Kekeluargaan Cirebon
2011/2012. Selain itu, penulis yang hobinya menulis ini menjadi ketua dan
tergabung komunitas FIKSI (Forum Imajinasi dan Kreativitas Sastra IPB) yang
baru dibentuknya untuk menampung bakat menulis sastra. Penulis juga sering
menulis di kompasiana.com dan mengikuti berbagai agendanya.
Penulis juga pernah aktif dalam beberapa kepanitiaan seperti panitia lomba
penulisan cerpen dan film dokumenter TPB IPB 2008, Masa perkenalan Kampus
Mahasiswa Biokimia tahun 2009, Pesta Sains Nasional 2008 dan 2009, Biokimia
Expo 2010, dan beberapa kepanitiaan lainnya. Penulis melakukan Praktik Lapang
di Laboratorium Bioteknologi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI)
Cibinong Bogor, dengan judul Uji Aktivitas Antidiabetes Ekstrak Kloroform
Kapang Endofit Kayu Manis (Cinnamomum burmanii) dengan Enzim α-
glukosidase. Penulis dalam bidang karya ilmiah pernah mendapat hibah dana
bersaing dari Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi (DIKTI) dalam Pekan
Kreativitas Mahasiswa (PKM) untuk kategori Bidang Penelitian pada tahun 2012
menggantikan Ayu Arthuria dengan judul Pemanfaatan Senyawa Metabolit
Sekunder Kapang Endofit Evodia suaveolens sebagai antikanker dan menjadi
pembicara makalah lomba karya ilmiah dalam kegiatan seminar kesehatan
nasional 2012. Penulis juga pernah memenangkan penghargaan setara emas PKM-
GT (Program Kreativitas Mahasiswa Gagasan Tertulis) pada PIMNAS (Pekan
Ilmiah Nasional) ke 25 pada tahun 2012 dengan judul Asuransi Pertanian Berbasis
Indeks Iklim sebagai Solusi Penyelamatan Petani dari Gagal Panen Akibat Iklim
Ekstrim di Indonesia.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL .................................................................................................. ix
DAFTAR GAMBAR ............................................................................................. ix
DAFTAR LAMPIRAN .......................................................................................... ix
PENDAHULUAN .................................................................................................. 1
TINJAUAN PUSTAKA ......................................................................................... 1
Kanker ................................................................................................................. 1
Apoptosis ............................................................................................................. 2
Sel khamir (Saccharomyces cerevisiae) .............................................................. 2
Evodia suaveolens ............................................................................................... 3
Kapang endofit .................................................................................................... 3
Fermentasi ........................................................................................................... 4
Ekstraksi .............................................................................................................. 4
BSLT (Brine Shrimp Lethality Test) ................................................................... 4
BAHAN DAN METODE ....................................................................................... 5
Alat dan Bahan .................................................................................................... 5
Metode ................................................................................................................. 5
HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................................... 6
Hasil Isolasi Kapang Endofit Evodia suaveolens ................................................ 6
Hasil Fermentasi dan Ekstrak Klorofom Kapang Endofit Evodia suaveolens .... 7
Hasil Uji Sitotoksik dengan BSLT (Brine Shrimp Lethality Test) ...................... 8
Kurva Pertumbuhan Sel Khamir ......................................................................... 9
Hasil Uji Induksi Apoptosis pada Sel Khamir .................................................. 10
SIMPULAN DAN SARAN .................................................................................. 11
Simpulan ............................................................................................................ 11
Saran .................................................................................................................. 11
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 11
LAMPIRAN .......................................................................................................... 14
DAFTAR TABEL Halaman
1. Rendemen ekstrak kloroform hasil fermentasi kapang endofit Evodia
suaveolens ...................................................................................................... 8
2. Hasil frekuensi sel khamir yang mengalami petite akibat induksi ekstrak
kloroform kapang endofit Evodia suaveolens ................................................ 10
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1. Sel khamir yang mengalami apoptosis ............................................................ 2
2. Saccharomyces cerevisiae pembesaran 10 x 40.............................................. 3
3. Tanaman Evodia suaveolens ........................................................................... 3
4. Kapang endofit A dan B Evodia suaveolens ................................................... 7
5. Isolat kapang endofit Evodia suaveolens ........................................................ 8
6. Fase kloroform pada proses ekstraksi kapang endofit Evodia suaveolens ..... 8
7. Nilai LC50 dari uji sitotoksik BSLT ekstrak kloroform kapang endofit
Evodia suaveolens ........................................................................................... 9
8. Kurva pertumbuhan sel khamir berdasarkan nilai bobot sel ........................... 9
9. Perbandingan ukuran sel normal (A) dan sel petite (B) .................................. 10
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1. Tabel kapang endofit Evodia suaveolens ........................................................ 15
2. Tabel khamir yang mengalami petite setelah perlakuan ekstrak .................... 17
3. Nilai LC50 ........................................................................................................ 19
4. Strategi penelitian............................................................................................ 21
5. Induksi apoptosis (pembuatan media) ............................................................. 22
6. Perlakuan induksi apoptosis ............................................................................ 23
1
PENDAHULUAN
Indonesia merupakan negara yang dikenal
dengan keanekaragaman hayatinya yang
tinggi. Salah satunya adalah tanaman yang
berkhasiat sebagai antikanker seperti Zodia
atau Evodia suaveolens. Tanaman ini berasal
dari daerah Papua (Kardinan 2007), dan dapat
digunakan untuk mengusir nyamuk. Studi
terbaru mengatakan Evodia suaveolens dapat
menghasilkan senyawa evodiamin (Humbert
et al. 2012). Senyawa ini mempunyai aktivitas
yang baik sebagai antikanker yang mana dapat
menghambat proliferasi, metastasis dan
mempercepat apoptosis beragam sel kanker
(Jiang 2009). Namun, pengembangan obat
yang berbahan dasar Zodia masih menghadapi
kendala, senyawa aktif yang diperoleh dari
tanaman ini tidaklah banyak sehingga
diperlukan tanaman yang banyak untuk
mendapatkan senyawa tersebut. Terbatasnya
sumber daya alam, dan waktu tumbuh
tanaman yang lama membuat efisiensi
produksi obat ini menjadi turun.
Kanker merupakan penyakit degeneratif
yang mematikan. WHO (World Health
Organization) (2012) memprediksi kasus
kanker dunia yang menyebabkan kematian
akan mengalami 13.1 juta jiwa tahun 2030.
Sebagian besar penyakit kanker disebabkan
oleh lingkungan dan gaya hidup. Faktor
lingkungan yang menyebabkan kanker antara
lain polusi, asap rokok, radiasi, dan infeksi
organisme. Faktor gaya hidup yaitu kebiasaan
merokok, konsumsi alkohol, makanan yang
mengandung bahan tambahan pangan yang
karsinogenik, dan makanan berlemak trans
serta obesitas (Jemal 2011). Teknologi untuk
terapi kanker seperti pembedahan, radiasi,
terapi hormon dan kemoterapi banyak
dikembangkan saat ini, tapi pengobatan ini
memerlukan biaya yang mahal dan memiliki
efek samping yang tidak baik bagi tubuh.
Oleh karena itu, perlu dikembangkan suatu
pengobatan yang dapat mengobati kanker
dengan kemampuan mengobati yang kuat dan
tanpa efek samping.
Pengembangan teknologi produksi
senyawa aktif dari tanaman obat merupakan
teknologi yang memiliki prospek yang baik.
Salah satu bioteknologi yang dapat digunakan
untuk menghasilkan senyawa obat dalam
skala besar adalah dengan menggunakan
metabolit sekunder yang diekstrak dari kapang
endofit. Penggunaan kapang endofit dapat
meningkatkan efisiensi produksi senyawa
antikanker, masa berkembang biak kapang
endofit yang relatif singkat dengan laju
pertumbuhan yang tinggi memungkinkan
produksi senyawa antikanker dan penginduksi
apoptosis semakin efisien dalam jumlah besar.
Senyawa bioaktif antikanker yang akan
digunakan untuk produk antikanker harus
diujikan terlebih dahulu dengan uji sitotoksik.
Uji sitotoksik merupakan salah satu
pengembangan metode untuk memprediksi
keberadaan senyawa yang bersifat toksik pada
sel (Kurnijasanti et al. 2008). Studi
eksperimental kanker dapat dilakukan
terhadap sel khamir melalui induksi apoptosis
sehingga akan memberikan informasi yang
berkaitan efek modulator apoptosis tersebut
terhadap sel (Sukardiman et al. 2006).
Penelitian ini menggunakan ekstrak kloroform
kapang endofit isolat dari batang Evodia
suaveolens. Tujuan penelitian ini adalah untuk
menguji aktivitas sitotoksik dan apoptosis sel
khamir dari ekstrak tersebut. Hipotesis dari
penelitian ini adalah ekstrak kloroform kapang
endofit Evodia suaveolens memiliki aktivitas
sitotoksik dan dapat menginduksi apoptosis
pada sel khamir. Manfaat penelitian ini adalah
untuk mengetahui aktivitas dari sitotoksik dan
apoptosis pada sel khamir ekstrak kloroform
kapang endofit Evodia suaveolens yang
nantinya dapat dipakai sebagai antikanker.
TINJAUAN PUSTAKA
Kanker
Kanker dapat disebabkan oleh beberapa
faktor yaitu penggunaan tembakau, infeksi,
radiasi, kurangnya aktivitas fisik, makanan
yang tidak sehat, obesitas, dan polusi
lingkungan (Anand et al. 2008). Kanker
merupakan penyakit kedua terbesar di dunia,
dan 80 % kematian akibat kanker terjadi pada
negara industri.
Penyakit kanker terus meningkat dalam
skala global. Kanker dapat menyerang
manusia pada segala usia yaitu dapat
menyerang anak-anak dan dapat beresiko
lebih tinggi dengan semakin bertambahnya
usia. Pada tahun 2007 kanker menyebabkan
13 % kematian terhadap jumlah penduduk
dunia (Mattias 2001).
Terdapat 150 tipe kanker yang dapat
dikategorikan menjadi kanker paru-paru,
prostat, kulit, perut, dan kanker kolon yang
disebut karsinoma dan yang dikelompokkan
sebagai tumor padat. Sarkoma adalah kanker
yang terbentuk pada tulang dan jaringan yang
meliputi organ, kanker ini padat yang jarang,
namun mematikan jika membentuk tumor
yang ganas. Leukimia terbentuk pada darah
dan tulang sumsum, kanker ini termasuk
2
tumor tidak padat yang disebabkan oleh
produksi sel darah putih yang tidak normal.
Lymphoma adalah kanker yang terjadi di
pembuluh limfa, kanker ini dibagi menjadi 2
katagori yaitu hodkin’s dan non-hodgkins.
Myeloma merupakan tumor-tumor yang
terbentuk di dalam antibodi yang membentuk
plasma sel pada beberapa jaringan.
Apoptosis
Apoptosis adalah suatu kematian sel
secara alami dan terprogram. Apoptosis dapat
terjadi jika sel mengalami suatu kerusakan
yang tidak dapat diperbaiki lagi diakibatkan
oleh terinfeksi virus, stress akibat kelaparan,
kerusakan DNA, dan radikal bebas. Fungsi
apoptosis adalah untuk melenyapkan sel-sel
yang mengalami kerusakan dan tidak dapat
lagi menjalankan fungsinya, serta mencegah
penularan virus dan berperan penting dalam
mencegah kanker. Sel yang mengalami
kegagalan dalam apoptosis, akan mengalami
pembelahan terus menerus dan berkembang
menjadi tumor. Tumor dapat terjadi jika
jumlah sel tidak dapat dipertahankan pada
jumlah tetap. Pada apoptosis terjadi
serangkaian transduksi sinyal akibat dari
serangkaian reaksi biokimiawi yang dapat
menyebabkan perubahan ciri morfologis yaitu
pengkerutan sel, fragmentasi inti sel,
kerusakan membran dan sel tersebut dapat
pecah menjadi beberapa vesikel yang disebut
badan apoptosis (Algiansyah 2009).
Apoptosis berbeda dengan nekrosis.
Nekrosis adalah suatu kematian sel yang
diakibatkan oleh infeksi. Pada nekrosis terjadi
perubahan pada inti sel yang pada akhirnya
menyebabkan inti menjadi lisis dan membran
plasma menjadi pecah. Pada apoptosis terjadi
kematian sel terprogram, membran sel tidak
pecah, dan inti mengalami fragmentasi yang
kemudian mengirimkan sinyal kepada sel
yang berada didekatnya untuk difagosit.
Proses apoptosis dikendalikan oleh berbagai
sinyal tingkat sel yaitu dari ekstrinsik dan
intrinsik. Sinyal ekstrinsik bisa berasal dari
hormon, faktor pertumbuhan, nitrit oksida,
dan sitokin. Sinyal tersebut harus bisa
menembus membran plasma ataupun
transduksi sinyal untuk mendapatkan respon.
Sinyal intrinsik apoptosis merupakan suatu
respon yang diinisiasi oleh sel sebagai respon
terhadap stress dan akhirnya dapat
mengakibatkan kematian sel. Pengikatan
reseptor nuklear oleh glukokortikoid, panas,
radiasi, kekurangan nutrisi, infeksi virus, dan
hipoksia merupakan keadaan yang dapat
menimbulkan pelepasan sinyal intrinsik
melalui kerusakan sel (Lumongga 2008).
Koloni khamir yang mengalami apoptosis
dapat dibedakan dari koloni normalnya.
Koloni yang mengalami apoptosis berubah
menjadi koloni petit akibat dari disfungsi
mitokondria (kehilangan kemampuan respirasi
pada mitokondria) sehingga laju pertumbuhan
sel khamir menjadi jauh lebih lambat dari sel
khamir normal (Gambar 1) (Madigan et al
2000). Sel khamir yang mengalami petite
mendapatkan energi dari proses glikolisis dan
tidak mampu menggunakan sumber karbon
yang tidak dapat difermentasikan, sedangkan
sel khamir normal tidak hanya memperoleh
energi dari glikolisis, tetapi juga dari proses
respirasi. Oleh sebab itu, koloni yang
mengalami petit terlihat lebih kecil. Koloni
khamir yang mengalami petit jarang terjadi
secara alami, karena jumlah glukosa di alam
melimpah sehingga bukan pembatas untuk
pertumbuhan khamir, apalagi oksigen yang
jumlahnya juga melimpah (Algiansyah 2009).
Sel khamir (Saccharomyces cerevisiae)
Khamir adalah suatu organisme
uniselular, eukariot yang bereproduksi secara
aseksual melalui pertunasan, bisa juga dengan
pembelahan biner dan memproduksi semacam
spora haploid untuk bereproduksi secara
seksual. Saccharomyces cervisiae adalah
organisme yang biasa dipakai oleh masyarakat
indonesia untuk dimanfaatkan pembuatan roti
dan tape singkong. Selain itu, khamir jenis ini
juga dipakai pada berbagai industri yaitu
proses produksi minuman beralkohol (Ahmad
2005).
Saccharomyces cerevisiae merupakan
khamir sejati secara morfologi hanya
membentuk blastospora berbentuk bulat
lonjong, silindris, oval atau bulat telur yang
dipengaruhi oleh strainnya (Gambar 2).
Penampilan makroskopik mempunyai koloni
a b
Gambar 1 Sel khamir yang mengalami
apoptosis: a. SEM (Scanning
Electron Micrograph) b. TEM
(Transmission Electron
Micrograph) (Granot 2003)
3
berbentuk bulat, warna kuning muda,
permukaan berkilau, licin, tekstur lunak dan
memiliki sel bulat dengan askospora 1-8 buah
(Ahmad 2005).
Taksonomi Saccharomyces cerevisiae
menurut Sanger (2004) diklasifikasikan
sebagai berikut super kingdom Eukaryota,
phylum Fungi, subphylum Ascomycota, kelas
Saccharomycetes, ordo Saccharomycetales,
family Saccharomycetaceae, genus
Saccharomyces, spesies Saccharomyces
cerevisae.
Evodia suaveolens
Tanaman Zodia (Evodia suaveolens
Scheff) merupakan tanaman asli Indonesia
yang berasal dari Irian (Papua) yang pada
umumnya ditanam di pekarangan rumah,
tanaman yang mempunyai tinggi antara 50 cm
hingga 200 cm (rata-rata 75 cm), dipercaya
mampu mengusir nyamuk dan serangga
lainnya dari sekitar tanaman. Oleh sebab itu,
tanaman ini sering ditanam pada pekarangan
rumah untuk menghalau nyamuk. Aroma yang
dikeluarkan oleh tanaman Zodia cukup wangi.
Tanaman ini dapat mengeluarkan aroma
apabila tanaman tergoyang oleh tiupan angin
sehingga diantara daunnya saling menggosok,
maka keluarlah aroma yang wangi. Saat ini
sebagian masyarakat menyimpan tanaman
Zodia pada pot di dalam ruangan sehingga
selain memberikan aroma yang khas, juga
aromanya dapat menghalau nyamuk dari
ruangan. Selain itu, manfaat yang lainnya
adalah sebagai antikanker (Kardinan 2007).
Evodia suaveolens diklasifikasikan ke
dalam kingdom Plantae (tumbuh-tumbuhan),
subkingdom Tracheobionta (tumbuhan
berpembuluh), super divisi Spermatophyta
(menghasilkan biji), divisi Magnoliophyta
(tumbuhan berbunga), kelas Magnoliopsida
(berkeping dua), sub kelas Rosidae, ordo
Sapindales, family Rutaceae (suku jeruk-
jerukan), genus Evodia, spesies Evodia
suaveolens Scheff.
Kapang endofit
Endofit secara bahasa berasal dari kata
endon yang berarti di dalam dan phyton yang
berarti tanaman (Schulz & Boyle 2005).
Secara umum, endofit adalah makhluk hidup
yang berada di dalam tanaman dapat bersifat
parasitik atau simbiotik. Kapang endofit
adalah fungi yang menginfeksi jaringan
tanaman yang sehat tanpa menyebabkan sakit
(Clay 2004).
Cendawan atau fungi adalah suatu
organisme heterotrof, dan memerlukan
senyawa organik untuk pertumbuhannya.
Organisme ini tidak berklorofil dan
mempunyai sel yang kaku. Cendawan dapat
dibagi menjadi dua bagian yaitu khamir
(yeast) yang berbentuk uniselular dan kapang
(mold) yang berbentuk benang (filamen). Fase
khamir timbul jika organisme itu hidup
sebagai parasit (merugikan) dalam jaringan
dan ada juga yang bersifat saprofit
(menguntungkan) dalam jaringan. Fase
kapang ini dapat tumbuh dalam organisme
tersebut, jika hidup sebagai saprofit (Gandjar
& Sjamsuridzal 2006).
Winarno (2006) menemukan bahwa
hasil pemurniaan mikroba endofit dari batang
kina Cinchona ledgeriana Moens diperoleh
dua jenis kapang yang dapat menghasilkan
senyawa alkaloid kinin dan sinkonin. Kedua
senyawa tersebut biasanya terkandung dalam
batang Kina yang memiliki aktivitas
antimalaria. Hubungan antara mikroba endofit
dan tanaman dalam menghasilkan metabolit
sekunder sangat menarik dipelajari. Sejak
tahun 1993 penelitian produksi taxol yang
merupakan obat kanker oleh kapang endofitik
Taxomyces andreanae dan Pestalotiopsis
microspora telah dilaporkan. Pada
perkembangan senyawa aktif yang dihasilkan
oleh kapang endofit ternyata tidak selalu sama
dengan senyawa yang dihasilkan oleh
tanaman inangnya sehingga kapang endofit
menjadi sumber senyawa aktif baru yang
sangat menjanjikan. Disamping itu pencarian
senyawa baru dari mikroba endofit diharapkan
Gambar 2 Saccharomyces cerevisiae
pembesaran 10 x 40 (Ahmad
2005)
Gambar 3 Tanaman Evodia suaveolens
(Anonim 2012)
4
dapat mengurangi kerusakan lingkungan
akibat pemanfaatan tanaman secara besar-
besaran untuk mendapatkan senyawa aktif
(Strobel et al. 2004).
Hasil penelitian terhadap kapang
endofit menunjukkan bahwa bagian tanaman
yang berbeda dari satu tanaman inang
memperlihatkan isolat kapang endofit yang
berbeda. Perbedaan habitat dan ekosistem
tanaman inang ini juga menunjukkan
perbedaan kapang endofit.
Fermentasi
Fermentasi adalah suatu proses
perubahan biokimia yang terjadi di dalam
substrat organik sebagai akibat kerja zat-zat
katalis kimia (enzim) yang diproduksi oleh
mikroba tertentu. Fermentasi secara teknik
dapat didefinisikan sebagai suatu proses
oksidasi anaerobik atau partial anaerobik
karbohidrat yang menghasilkan alkohol serta
beberapa asam, namun banyak proses
fermentasi yang menggunakan substrat
protein dan lemak (Muchtadi &
Ayustaningwarno 2010).
Fermentasi terbagi menjadi dua, yaitu
fermentasi spontan dan tidak spontan
(membutuhkan starter). Fermentasi spontan
adalah fermentasi yang biasa dilakukan
menggunakan media penyeleksi, seperti
garam, asam organik, asam mineral, dan pati.
Media penyeleksi tersebut akan menyeleksi
bakteri patogen dan menjadi media yang baik
bagi tumbuh kembang bakteri selektif yang
membantu jalannya fermentasi. Fermentasi
tidak spontan adalah fermentasi yang
dilakukan dengan penambahan kultur
organisme bersama media penyeleksi
sehingga proses fermentasi dapat berlangsung
lebih cepat (Rejeki 2011).
Mikroba yang melakukan fermentasi
membutuhkan energi yang umumnya
diperoleh dari glukosa. Dalam keadaan aerob,
mikroba mengubah glukosa menjadi air, CO2
dan energi (ATP). Beberapa mikroba hanya
dapat melangsungkan metabolisme dalam
keadaan anaerob dan hasilnya adalah substrat
yang setengah terurai. Hasil penguraiannya
adalah air, CO2, energi dan sejumlah asam
organik lainnya, seperti asam laktat, asam
asetat, etanol serta bahan-bahan organik yang
mudah menguap (Muchtadi &
Ayustaningwarno 2010).
Kapang endofit menyimpan potensi
ekonomi yang tidak terbatas dan belum
banyak diaplikasikan dalam industri farmasi
dan pertanian sumber bahan obat, enzim dan
senyawa biologis pengendali hama di masa
depan. Proses fermentasi memegang peranan
penting dalam produksi senyawa tersebut
secara masal dalam skala industri. Produksi
senyawa bioaktif melalui fermentasi jamur
endofit ini berpotensi besar bagi industri
karena reprodusibel, penyediaannya bisa tidak
terbatas karena tidak dibatasi jumlah tanaman
(Sugijanto 2008).
Ekstraksi
Ekstraksi adalah suatu proses pemisahan
beberapa zat atau senyawa dengan pelarut
tertentu. Pemisahan terjadi berdasarkan
kemampuan yang berbeda dari komponen-
komponen dalam campuran. Pelarut yang
digunakan adalah pelarut dengan kemampuan
menjerap bahan yang dibutuhkan (Purba
2011).
Proses ekstraksi terdiri dari beberapa
tahapan yaitu pencampuran bahan dengan
pelarut, pemisahan dan isolasi ekstrak. Pada
pencampuran bahan ekstrak dengan pelarut
dibiarkan saling berkontrak sehingga terjadi
perpindahan masa. Setelah terjadi penjerapan,
maka pemisahan dilakukan dengan alat
pemisah. Pemisahan bertujuan untuk
memisahkan larutan ekstrak dan pelarut.
Setelah didapatkan fase ekstrak pelarut, maka
pelarut lalu diuapkan dan didapatkan ekstrak
murni. Ekstraksi dilakukan berulang sehingga
zat yang dijerap lebih optimal (Dirjen POM
2000).
Ekstraksi dilakukan dengan menggunakan
pelarut kloroform. Kloroform adalah suatu
pelarut non polar yang dapat digunakan untuk
ekstraksi alkaloid (Winarno 2006). Evodiamin
adalah senyawa alkaloid yang dihasilkan oleh
Evodia suaveolens. Alkaloid dalam bentuk
bebas tidak dapat larut di dalam air, namun
dapat larut di dalam kloroform (Jiang 2009).
BSLT (Brine Shrimp Lethality Test)
Uji toksisitas adalah suatu uji pendahuluan
untuk mengetahui aktivitas farmakologi suatu
senyawa. Prinsipnya komponen bioaktif selalu
bersifat toksik jika diberikan dengan dosis
tinggi dan menjadi obat pada dosis rendah.
Brine Shrimp Lethality Test (BSLT)
merupakan salah satu uji untuk mengetahui
toksisitas suatu senyawa (Zebua 2011).
Artemia salina Leach merupakan
organisme sejenis udang-udangan yang
berukuran kecil dan dikenal dengan nama
brine shrimp. Artemia salina Leach digunakan
sebagai hewan uji untuk menentukan
ketoksikan suatu senyawa dalam ekstrak
tumbuhan yang diwujudkan sebagai racun
(Baraja 2008).
5
Metode Brine Shrimp Lethality Test
(BSLT) sering digunakan untuk praskrining
terhadap senyawa aktif yang terkandung
dalam ekstrak tumbuhan karena murah, cepat,
mudah dan dapat dipercaya. Suatu metode
yang menggunakan Artemia salina Leach
telah diperkenalkan sebagai metode bioassay
yang sederhana untuk penelitian produk alam.
Sifat toksisitas suatu senyawa dapat
dibandingkan dengan uji kultur sel sehingga
dapat diasosiasikan dengan aktivitas
antikanker (Baraja 2008).
BAHAN DAN METODE
Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan dalam
penelitian ini adalah Laminar Air Flow (LAF),
neraca analitik, autoklaf, oven, tabung reaksi,
cawan petri, labu Erlenmeyer, lempeng
pemanas, pengaduk magnetik, jarum ose,
pembakar spirtus, pinset, lampu UV,
inkubator bergoyang (shaker incubator),
sumur BSLT, sentrifus, tabung sentrifus,
homogenizer, lemari es, tabung Eppendorf,
kaca sebar, mikro pipet, tip (biru, kuning,
putih), kertas aluminium, colony counter, dan
plastik penyegel.
Bahan yang digunakan dalam penelitian
ini adalah tanaman Evodia suaveolens yang
didapatkan dari toko tanaman hias di
Baranangsiang Bogor, isolat kapang endofit
dari batang tanaman Evodia suaveolens,
ekstrak metabolit sekunder dari kapang
endofit Evodia suaveolens, khamir
Saccharomyces cerevisiase, akuades, etanol,
glukosa, kloroform, natrium hipoklorit 5.3%,
kloramfenikol, PDA (Potatos Dextrose Agar),
PDB (Potatos Dextrose Broth), air laut,
Artemia salina, YEPD (Yeast Extract,
Dextrose, Pepton) padat, cair dan petit.
Metode
Penelitian ini terdiri beberapa tahapan
yaitu isolasi dan pemurnian kapang endofit,
peremajaan kapang endofit, fermentasi,
ekstraksi senyawa metabolit sekunder, uji
sitotoksik dengan BSLT (Brine Shrimp
Lethality Test) LC50 dan induksi apoptosis
pada sel khamir.
Isolasi dan pemurnian kapang endofit
Batang tanaman Evodia suaveolens
dengan panjang 2 cm dan lebar 1 cm dicuci
dengan air mengalir, lalu disterilkan dengan
etanol 70% selama 1 menit, natrium hipoklorit
5,3% selama 5 menit, dan etanol 75% selama
0,5 menit. Bagian batang dibelah dua secara
longitudinal, lalu diletakkan di atas cawan
petri berisi PDA yang telah dicampur dengan
kloramfenikol 0,05 mg/mL (Theantana et al.
2007). Keduanya diinkubasi selama 3 hari
pada suhu 25oC. Koloni dipindahkan ke PDA
dalam cawan petri dan diinkubasi lagi pada
suhu 25oC dan dilakukan pengecekan secara
berkala untuk pemurnian lebih lanjut. Masing-
masing endofit diisolasi melalui beberapa kali
ditanam pada agar miring (PDA) dan
diinkubasi dalam inkubator suhu 25oC dan
diremajakan.
Peremajaan kapang endofit dari isolat
Inokulasi isolat kapang endofit dilakukan
secara aseptis di dalam laminar. Laminar
terlebih dahulu disterilkan dengan penyinaran
sinar ultraviolet selama 1 jam, dan kemudian
seluruh bagian dalam laminar dan bagian luar
kaca disemprot dengan etanol 70%. Isolat
kapang endofit dari agar miring diinokulasi ke
dalam media PDA kemudian diinkubasi
selama dua hari pada suhu kamar (Pelczar &
Chan 1996).
Fermentasi kapang endofit
Isolat kapang yang telah diremajakan
masing-masing diinokulasikan ke dalam
tabung Erlenmeyer berisi 50 ml media PDB.
Tiap tabung Erlenmeyer dilakukan fermentasi
dengan metode statik pada suhu kamar selama
12 hari dan diuji juga dengan fermentasi
dinamis dengan agitasi 171 rpm selama 5 hari.
Perbedaan ini untuk mengetahui perbandingan
fermentasi tersebut untuk menghasilkan
ekstrak lebih banyak (Kumala dan Muhamad
2005).
Ekstraksi metabolit sekunder
Kapang endofit dalam Erlenmeyer
diekstrak dengan pelarut kloroform masing-
masing sebanyak tiga kali ekstrak dan pada
tiap ekstraksi digunakan pelarut sebanyak 50
ml. Fase pelarut ditampung dalam botol yang
telah diketahui bobot kosongnya. Hasil
ekstraksi diuapkan dalam ruang asam hingga
tertinggal residunya. Bobot ekstrak diperoleh
dari selisih antara bobot botol berisi ekstrak
dan bobot botol kosong. Ekstrak di dalam
botol dipindahkan ke vial yang lebih kecil
dengan dilarutkan terlebih dahulu dengan
pelarutnya (Kumala dan Muhamad 2005).
Uji toksistas dengan BSLT (Brine Shrimp
Lethality Test)
Telur udang Artemia salina L
sebanyak 1 sudip dilarutkan dalam 250
ml air laut dalam sebuah gelas piala,
6
dimasukkan aerator, dan didiamkan
selama 1x24 jam agar menjadi larva
udang. Selanjutnya, disiapkan larutan
sampel dengan konsentrasi masing-
masing 500 ppm, 100 ppm, 50 ppm, dan
10 ppm setelah ditambah air laut dan
Artemia salina. Perhitungan larva yang
masih hidup dan yang mati dilakukan
setelah 24 jam untuk menentukan nilai
LC50 (Meyer et al. 1982).
Induksi apoptosis pada sel khamir
Induksi apoptosis pada sel khamir
meliputi beberapa tahapan yaitu pembuatan
media, peremajaan sel khamir, inkubasi dan
pemanenan sel khamir, serta perlakuan
induksi apoptosis pada sel khamir (Granot
2003).
Pembuatan Media (Campbell 1991).
Media yang digunakan untuk induksi
apoptosis pada sel khamir meliputi media cair
dan padat, serta media padat petit YEPD
(Yeast Extract Peptone Dextrose). Media cair
YEPD memiliki komposisi 1% yeast extract,
2 % pepton, 2% glukosa, 1.8% baktoagar, dan
akuades hingga 100 ml, lalu disterilkan
dengan autoklaf pada suhu 120°C selama 15
menit dengan tekanan 10 atm. Semua media
yang dibutuhkan dalam penelitian ini
memiliki komposisi dan cara pembuatan yang
hampir sama. Perbedaannya terletak pada
penambahan baktoagar di medium padat
YEPD. Sementara pada media petit dilakukan
pengurangan jumlah glukosa menjadi 0.1%,
penambahan etanol 2%.
Peremajaan Sel Khamir (Campbell
1991). Sel-sel khamir diremajakan pada media
YEPD padat dengan menggoreskan 2 ose
khamir dan diinkubasi pada suhu 27°C selama
2 hari. Hasil peremajaan akan digunakan
sebagai biakan perlakuan.
Inkubasi dan Pemanenan Sel Khamir
(Campbell 1991). Proses inkubasi ini
dilakukan untuk mengetahui kurva
pertumbuhan dari sel khamir. Kurva ini
didapatkan dengan menghitung bobot kering
sel khamir. Pada awalnya, sel-sel khamir
ditumbuhkan pada media padat YEPD,
kemudian sebanyak 1 ose sel khamir
dipindahkan ke medium cair YEPD dan
dipindahkan sebanyak 200 µl ke masing-
masing 5 tabung untuk diukur jumlah khamir
selama 5 hari. Sel dipanen dengan proses
sentrifugasi pada kecepatan 4000 rpm selama
10 menit dan peletnya dicuci 2 kali dengan
akuades secukupnya. Pelet yang sudah dicuci
kemudian diukur bobotnya dan dicatat,
selanjutnya dilakukan metode gravimetri
untuk didapatkan bobot kering sel. Bobot
akhir sel khamir kemudian didapatkan melalui
perhitungan sebagai berikut:
Bobot Akhir Sel Khamir = Bobot Basah –
Bobot Kering
Perlakuan Induksi Apoptosis (Granot
2003). Percobaan ini akan dilakukan pada
beberapa perlakuan, yaitu ekstrak metabolit
sekunder kapang endofit Evodia suaveolens
yang telah diseleksi dari uji toksistas BSLT,
glukosa 2% sebagai kontrol positif, dan
akuades sebagai kontrol negatif. Konsentrasi
yang dipakai untuk induksi adalah nilai
konsentrasi LC50 dari masing-masing kapang
endofit. Ekstrak metabolit sekunder sebanyak
400 µl lalu dimasukan ke dalam Eppendorf
yang berisi 100 µl kultur sel khamir dan
ditambahkan 500 µl YEPD. Campuran itu
dihomogenisasi terlebih dahulu, kemudian
diinkubasi pada 37°C selama 24 jam. Sama
halnya pada perlakuan ekstrak kapang endofit
Evodia suaveolens, perlakuan kontrol positif
ditambahkan glukosa 2% dan kontrol negatif
akuades untuk mengganti ekstrak pada
perlakuan.
Uji Frekuensi Petit (Granot 2003). Pada
24 jam dilakukan pengambilan sebanyak 15 µl
sel dari biakan perlakuan yang telah
diencerkan sebanyak 10-6
kali. Sel-sel khamir
tersebut disebar merata ke cawan petri yang
berisi media padat petit dan diinkubasi pada
suhu 28°C selama 24 jam, kemudian
dilakukan perhitungan koloni petit. Sel-sel
khamir yang berubah menjadi koloni petit
tampak berukuran lebih kecil dibandingkan
sel-sel khamir normal. Sel-sel khamir yang
berubah menjadi koloni petit dihitung
frekuensi petitnya dengan rumus :
x 100 %
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil Isolasi Kapang Endofit Evodia
suaveolens
Tanaman dan mikroorganisme saling
berhubungan erat satu dengan yang lain.
Mikroorganisme ada yang bersifat menyerang
tanaman tersebut dan menyebabkan penyakit,
sementara ada pula yang bersifat
menguntungkan. Kapang adalah cendawan
yang hidup pada tumbuhan, dan bersifat
menguntungkan (saprofit) bagi inangnya. Ada
dua jenis kapang yang berasal dari tumbuhan
yaitu epifit yang berasal dari luar tanaman,
dan endofit yang berasal dari dalam (Winarno
2006). Kapang endofit yang digunakan adalah
berasal dari dalam batang Evodia suaveolens.
7
Tahapan pertama penelitian ini adalah
isolasi dengan tujuan mengisolasi kapang
yang terdapat di dalam batang dari Evodia
suaveolens. Batang yang dicuci, sebelum
proses pemotongan dan isolasi dilakukan
bertujuan untuk menghilangkan kotoran yang
berada diluar batang. Setelah itu dilakukan
sterilisasi berurutan dengan menggunakan
etanol, sodium hipoklorit (NaOCl), dan
etanol. Hal ini dimaksudkan agar mikrob yang
berada di luar batang, tidak ikut tumbuh pada
media isolasi. Media PDA (Potatos Dextrose
Agar) ditambahkan kloramfenikol sebagai
antibakteri (Sukandar 2010). Beberapa
perlakuan tersebut berguna pada proses isolasi
kapang endofit yang berada pada batang
Evodia suaveolens.
Isolat kapang endofit yang didapatkan
dari Evodia suavelones beragam dan
dibedakan dari penyebaran hifa, warna
kapang, dan bentuk permukaan kapang
tersebut. Pada saat kapang tersebut telah
tumbuh, hifa diambil dan dipindahkan pada
media PDA yang baru. Pada Gambar 4,
kapang endofit A dan B dilakukan isolasi.
Kedua kapang tersebut bentuk morfologinya
berbeda sehingga dipindahkan pada media
PDA baru. Setelah kapang tersebut tumbuh
selama tiga hari, maka diamati lagi. Jika
kapang endofit tumbuh lebih dari satu, maka
dimurnikan lebih lanjut. Isolat kapang endofit
dari Evodia suavelolens yang telah
didapatkan, akan disamakan satu dengan yang
lain sehingga isolat kapang endofit diyakini
berbeda dari satu sama lain. Beberapa kapang
yang terlihat sama, dicoba ditumbuhkan lebih
lama untuk melihat warna pada saat umur tua.
Jika warnanya sama, maka isolat satunya
dieliminasi. Proses isolasi ini menghasilkan
kapang endofit Evodia suaveolens yang
beragam.
Banyaknya isolat yang akan dihasilkan
bergantung pada media yang digunakan.
Penggunaan media yang berbeda akan
menghasilkan kekayaan spesies yang berbeda
(Nurhasanah 2008). Dari media PDA
(Potatoes Dextrose Agar) terdapat 8 kapang
endofit (Gambar 5). Media ini bersifat tidak
selektif dan dapat digunakan untuk
menumbuhkan atau mengidentifikasi kapang.
Media ini mengandung sumber karbohidrat
dalam jumlah cukup yaitu terdiri dari 20%
ekstrak kentang dan 2% glukosa sehingga
baik untuk pertumbuhan kapang tetapi kurang
baik untuk pertumbuhan bakteri (Julianingsih
2012). Keterangan mengenai warna, bentuk
permukaan dan pola setiap kapang disajikan
pada Lampiran 1.
Hasil Fermentasi dan Ekstrak Klorofom
Kapang Endofit Evodia suaveolens
Fermentasi adalah suatu proses merubah
substrat menjadi produk. Tujuannya untuk
menumbuhkan dan menghasilkan produk
senyawa aktif. Isolat kapang endofit Evodia
suaveolens ditumbuhkan pada media PDB
(Potato Dextrose Broth) yang telah
disterilisasi sebelumnya pada autoklaf. Media
PDB biasa dipakai untuk pertumbuhan,
Gambar 4 Kapang Endofit A dan B Evodia
suaveolens
Kapang 1
Kapang 3
Kapang 2
Kapang 4
Kapang 5
Kapang 7
Kapang 6
Kapang 8
Gambar 5 Isolat Kapang Endofit dari
Evodia suaveolens
A
B
8
pemanenan dan produksi kapang
(Simanjuntak 2011). Fermentasi dilakukan
secara statis dan dinamis. Tujuannya untuk
mengetahui perbandingan ekstrak yang
didapatkan antara keduanya. Fermentasi statis
tanpa agitasi selama 12 hari dan fermentasi
dinamis selama 5 hari dengan agitasi 171 rpm.
Pada fermentasi substrat yang terdapat
pada media PDB (Potato Dextrose Broth)
dimanfaatkan kapang endofit tersebut untuk
kebutuhan pertumbuhannya. Setiap kapang
endofit, menghasilkan produk yang
kemungkinan berbeda. Fermentasi ini
diharapkan dapat memproduksi evodiamin
dari salah satu isolat kapang endofit Evodia
suaveolens. Kapang endofit dapat
menghasilkan senyawa yang mirip dengan
inangnya yaitu Evodia suaveolens sehingga
diharapkan senyawa evodiamin yang
didapatkan dapat menginduksi apoptosis pada
sel khamir (Jiang 2009).
Ekstraksi dilakukan setelah fermentasi
selesai dilakukan dengan tujuan mengekstrak
senyawa yang diinginkan. Ekstraksi ini
menggunakan kloroform karena dapat dipakai
untuk mengekstrak alkaloid (Winarno 2006).
Evodiamine adalah senyawa alkaloid yang
dihasilkan dari Evodia suaveolens sehingga
diekstraksi dengan kloroform. Pengocokan
dilakukan pada ekstraksi dengan tujuan agar
ekstrak terjerap secara menyeluruh.
Pengocokan ini menghasilkan dua fase yaitu
fase air dan fase kloroform. Fase kloroform
berada pada bagian bawah (Gambar 6) dan
dipisahkan dengan pipet. Ekstraksi dilakukan
tiga kali untuk memperbanyak senyawa yang
terjerap oleh kloroform. Kloroform diuapkan
sampai tertinggal residunya. Bobot residu ini
ditimbang dan didapatkan dari bobot botol
yang berisi ekstrak dikurangi dengan bobot
kosong.
Bobot ekstrak disajikan pada Tabel 1.
Dari tabel tersebut, didapatkan residu terbesar
dari ekstrak adalah kapang 1 untuk fermentasi
statis yaitu sebanyak 0.41 gram dan kapang 1,
2, 5, 6, dan 7 untuk fermentasi statis sebanyak
0.03 gram. Fermentasi statis menghasilkan
senyawa yang lebih banyak dibandingkan
fermentasi dinamis. Fermentasi secara
dinamis menghasilkan residu ekstrak yang
lebih sedikit, disebabkan oleh metabolit yang
dihasilkan kemungkinan dimakan kembali
oleh kapang tersebut (Simanjuntak 2002).
Ekstrak dilarutkan lagi dalam kloroform,
dipindahkan pada botol vial dan diuapkan
kembali untuk uji sitotoksik dengan BSLT
dan senyawa yang memiliki bioaktif dari
seleksi sitotoksik, diinduksi pada sel khamir
untuk mengetahui daya apoptosisnya.
Hasil Uji Sitotoksik dengan BSLT (Brine
Shrimp Lethality Test)
Senyawa bioaktif antikanker yang akan
digunakan untuk produk antikanker harus
diujikan terlebih dahulu dengan uji sitotoksik.
Uji sitotoksik merupakan salah satu
pengembangan metode untuk memprediksi
keberadaan senyawa yang bersifat toksik pada
sel (Kurnijasanti et al. 2008). Salah satu
metode uji sitotosisitas adalah Brine Shrimp
Lethality Test (BSLT) yang digunakan untuk
praskrining terhadap senyawa yang diduga
berkhasiat sebagai anti tumor (Widyastuti
2008). Uji BSLT merupakan uji pendahuluan
di National Cancer Institute (NCI) Amerika.
Hewan uji yang digunakan dalam BSLT
adalah Artemia salina L.
Tujuan utama dari tahapan ini adalah
untuk mengetahui ekstrak yang dihasilkan
oleh kapang endofit dari Evodia suaveolens
yang paling berpotensi. Selain itu, tujuannya
adalah mengetahui konsentrasi yang dapat
membunuh dari setengah populasi Artemia
salina. Nilai tersebut menggambarkan
bioaktivitas metabolit yang dihasilkan dari
kapang endofit Evodia suaveolens. Semakin
kecil nilai konsentrasi yang dapat membunuh
setengah populasi larva maka akan semakin
tinggi bioaktivitasnya, begitu pula sebaliknya.
Gambar 6 Fase kloroform (A) pada proses
ekstraksi kapang endofit Evodia
suaveolens
Tabel 1 Rendemen ekstrak kloroform hasil
fermentasi kapang endofit Evodia
suaveolens Nomor
Kapang
Bobot Ekstrak
(Gram)
Fermentasi
Dinamis
Bobot Ekstrak
(Gram)
Fermentasi
Statis
Kapang 1
Kapang 2
Kapang 3
Kapang 4
Kapang 5
Kapang 6
Kapang 7
Kapang 8
0.03
0.03
0.02
0.02
0.03
0.03
0.03
0.02
0.41
0.21
0.10
0.11
0.06
0.05
0.08
0.10
A
9
Pada uji ini akan dipilih ekstrak kapang
endofit Evodia suaveolens yang memiliki
bioaktivitas yang terbaik. Nilai LC50 (Gambar
7 dan lampiran 3) dari kapang endofit Evodia
suavelolens telah dibandingkan. Dari Gambar
7, diperjelas bahwa kapang 1 memiliki nilai
315 ppm, kapang 3 memiliki nilai 270 ppm,
kapang 5 memiliki nilai 400 ppm, kapang 7
memiliki nilai 19.7 ppm dan kapang 8
memiliki nilai 403 ppm. Nilai tersebut
menunjukkan konsentrasi yang dapat
membunuh dari setengah populasi Artemia
salina. Berbeda pada kapang 2, 4, dan 6,
ketiganya tidak memiliki daya toksik pada
konsentrasi 500, 100, 50 dan 10 ppm.
Ketiganya memiliki nilai toksik diatas 500
ppm
Kapang endofit tersebut memiliki nilai
Lethal Concentration (LC50) yang bervariasi.
Pada kapang 7 didapatkan 19.6 ppm.
Konsentrasi ini sudah dapat membunuh
setengah populasi Artemia salina. Beda
halnya dengan kapang endofit lainnya, yang
memiliki dosis konsentrasi kematian diatas
200 ppm. Kapang 7 paling berpotensi
digunakan sebagai agen penginduksi
apoptosis, karena memiliki bioaktivitas yang
tinggi dan kapang 2, 4, dan 6 (warna hijau)
memiliki bioaktivitas diatas 500 ppm sehingga
ketiganya tidak diuji lebih lanjut karena sudah
tidak berpotensial. Semakin kecil konsentrasi,
berarti bioaktivitasnyapun tinggi (Zebua
2011).
Konsentrasi yang dipakai dari nilai LC50
lima kapang endofit (kapang 1, 3, 5, 7, 8)
digunakan sebagai konsentrasi untuk induksi
apoptosis pada sel khamir dan tiga kapang
endofit yaitu kapang 2, 4, dan 6 tidak diuji
karena sudah tidak potensial.
Kurva Pertumbuhan Sel Khamir
Tahapan ini bertujuan untuk mengetahui
pertumbuhan pada sel khamir. Kurva
pertumbuhan pada sel khamir didapatkan dari
metode gravimetri dengan mengukur bobot sel
dengan mengurangkan bobot basah sel dengan
bobot kering. Laju pertumbuhan ini akan
berguna untuk membuat kurva pertumbuhan
dan akan dipakai untuk menentukan awal fase
stasioner dari sel khamir. Pada tahapan ini sel
khamir telah mencapai pertumbuhan dan
aktivitas yang maksimum (Granot & Snyder
1991). Fase ini dipakai pada saat induksi
metabolit sekunder pada sel khamir.
Sel khamir pada media YEPD (Yeast
Extract Peptone Dextrose) dipindahkan pada
media cair YEPD merupakan media starter
dengan tujuan agar khamir mengalami proses
adaptasi (Rizqiyanti 2012). Setelah adaptasi,
sel mengalami pembelahan yang sangat
rendah, karena baru selesai tahap penyesuaian
diri. Fase ini adalah fase pertumbuhan awal.
Setelah mengalami proses adaptasi sel
khamir akan memasuki fase log (fase
eksponensial). Fase ini ditandai dengan
pertumbuhan sel yang cepat. Hal ini terlihat
pada peningkatan jumlah sel khamir pada 0
Nilai LC50
K=Kapang Endofit
Gambar 7 Nilai LC50 dari uji sitotoksik BSLT
ekstrak kloroform kapang endofit
Evodia s.
315 270
400
19,6
403
0
100
200
300
400
500
K1 K2 K3 K4 K5 K6 K7 K8
Gambar 8 Kurva pertumbuhan sel khamir berdasarkan nilai bobot sel
Jam ke-
24 48 72 94 108 120
Bo
bo
t (G
ram
)
0.5
55 0.4
0.3
0.2
= 0.1
5
0
>500 >500 >500
10
jam sampai 48 jam. Pada fase ini sel khamir
memproduksi zat-zat metabolit yang
dibutuhkan untuk memenuhi nutrisinya.
Hasil penelitian menunjukkan fase
stasioner terjadi setelah inkubasi 48 jam. Pada
kurva tersebut (Gambar 8) laju pertumbuhan
tidak lagi pesat karena sel khamir memasuki
fase kematian. Hal ini sesuai dengan
penelitian Granot & Snyder (1991) dan
penelitian Rizqiyanti (2012) bahwa sel
mengalami fase stasioner pada waktu setelah
48 jam. Oleh sebab itu, fase ini adalah fase
yang tepat pada saat inkubasi dengan
perlakuan ekstrak. Pada fase ini, khamir juga
membutuhkan nutrisi untuk pertumbuhannya.
Perlakuan ekstrak juga ditambahkan medium
nutrisi baru sehingga sel khamir akan
mengalami pertumbuhan yang baik (Granot &
Snyder 1991). Hal ini ditunjukan juga pada
penelitian Granot et al. (2003), induksi
glukosa 2% menyebabkan apoptosis pada sel
khamir.
Hasil Uji Induksi Apoptosis pada Sel
Khamir
Sel khamir respirasi aerob dan anaerob.
Sel khamir pada kondisi normal memperoleh
energi dari glikolisis dan siklus krebs. Sel
yang mengalami petite (Gambar 9B)
berukuran lebih kecil dibandingkan dengan sel
normal (Gambar 9A). Hal ini disebabkan sel
telah kehilangan kemampuan untuk
berespirasi akibat rusaknya mitokondria
akibat mekanisme apoptosis sehingga laju
pertumbuhan menjadi lebih lambat (Madigan
et al. 2000). Sel khamir memiliki kemampuan
untuk tetap hidup meskipun dalam keadaan
kekurangan nutrisi serta kerusakan organel
mitokondria. Hal ini disebabkan karena sel
khamir masih menjalankan proses glikolisis
(respirasi anaerob) tanpa mitokondria dengan
mengubah glukosa menjadi ATP melalui
fermentasi etanol (Muray et al. 2006). Hal ini
menjadikan mekanisme apoptosis khamir
dapat dideteksi dengan visualisasi pada cawan
sebar.
Ekstrak metabolit sekunder dari kapang
endofit Evodia suaveolens yang diujikan
adalah dari kapang 1, kapang 3, kapang 5,
kapang 7 dan kapang 8 dengan konsentrasi
berturut-turut 315 ppm, 270 ppm, 400 ppm,
19.7 ppm dan 403 ppm. Konsentrasi dari
kelima kapang endofit tersebut berasal dari
nilai LC50 uji toksisitas BSLT (Brine Shrimp
Lethality Test). Konsentrasi ini dipakai untuk
induksi apoptosis pada sel khamir dengan
tujuan untuk mengetahui frekuensi jumlah sel
yang mengalami petite akibat induksi senyawa
aktif tersebut.
Berdasarkan Tabel 2, frekuensi sel
khamir yang mengalami petite tertinggi adalah
berasal dari senyawa aktif kapang 7 dan 8
yaitu 90%. Keduanya dapat menginduksi
apoptosis 90% dengan konsentrasi 19.7 ppm
dan 403 ppm. Frekuensi petite sel khamir
terkecil berasal dari induksi senyawa kapang 1
yaitu 69% dengan konsentrasi 315 ppm. Pada
penelitian Rizqianti (2012), ekstrak flavonoid
murni dari daun salam dapat menginduksi
apoptosis pada sel khamir sebesar 99.1%.
Jumlah frekuensi petite sel khamir ini lebih
besar, karena flavonoid yang diekstrak dari
daun salam telah murni, berbeda dengan
ekstrak alkaloid (evodiamin) yang belum
murni sehingga ada senyawa lain yang dapat
berpengaruh terhadap apoptosis sel khamir.
Pada saat ekstraksi kloroform senyawa dari
A
B
Gambar 9 Perbandingan ukuran sel normal
(A) dan sel petite (B)
Tabel 2 Hasil frekuensi sel khamir yang
mengalami petite akibat induksi
ekstrak kloroform kapang endofit
Evodia suaveolens
Nomor
Kapang
Konsentra
si
Sel
Peti
te
Sel
Nor
mal
Persen
Petite
K 1
K 3
K 5
K 7
K 8
Kontrol
+
Kontrol
–
315 ppm
270 ppm
400 ppm
19,7 ppm
403 ppm
(Glukosa
2%)
(Akuades)
32
42
167
36
19
69
0
14
14
67
4
2
20
32
69%
75%
86%
90%
90.4%
77%
0%
11
kapang endofit kemungkinan tidak hanya
alkaloid, namun bisa juga senyawa lain
terekstrak (Winarno 2006). Selain itu,
flavonoid dan alkaloid kemungkinan berbeda
khasiatnya dalam menyebabkan apoptosis.
Sel-sel khamir yang ditumbuhkan pada
media petite padat (semua perlakuan) tidak
semuanya menjadi menjadi koloni petite. Hal
ini disebabkan oleh sel khamir yang dapat
beradaptasi pada kadar glukosa yang terbatas,
walaupun pada media petite sumber utama
karbon pada media petit adalah etanol (sumber
karbon yang tidak dapat difermentasikan).
Sel-sel khamir yang berubah menjadi koloni
petite hanya mampu menggunakan glukosa
yang jumlahnya sangat terbatas (karena
mengalami disfungsi mitokondria akibat
proses apoptosis). Hal ini mengindikasikan
bahwa glukosa sebagai sumber karbon utama
pada media yang memiliki nutrien lain yang
terbatas dapat menginduksi terjadinya
apoptosis seperti yang dilaporkan Granot
(2003). Pada kontrol positif dengan pemberian
glukosa dapat memicu apoptosis lebih banyak
disebabkan oleh khamir kurang mampu
beradaptasi dengan sumber karbon yang
terlalu banyak (Algiansyah 2009).
Pelarut yang digunakan untuk melarutkan
ekstrak adalah akuades steril yang pada
dasarnya tidak menginduksi apoptosis seperti
diperlihatkan pada kontrol negatif.
Penggunaan glukosa sebagai kontrol positif
disebabkan karena glukosa 2% dapat
menginduksi apoptosis yang ditunjukan
dengan perubahan sel menjadi petit (Granot et
al. 2003). Pada penelitian Granot (2003)
bahwa pemberian glukosa dengan konsentrasi
tinggi dapat memicu apoptosis dengan
perubahan morfologi menjadi sel yang
berukuran kecil (petit), fragmentasi DNA,
tingginya produksi spesies oksigen reaktif dan
membran blebbing (kerusakan membran).
Dari penelitian ini, ekstrak kapang endofit
yang potensial adalah kapang endofit 7
dengan konsentrasi 19.7 ppm dapat memicu
apoptosis dengan frekuensi 90%. Kapang 1, 3,
5, dan 8 juga mampu menginduksi apoptosis
pada konsentrasi diatas 200 ppm. Kapang 2,
kapang 4, dan kapang 6 tidak diujikan pada
induksi apoptosis, sebab sebelumnya telah
diujikan pada BSLT (Brine Shrimp Lethality
Test) tidak memiliki daya toksik pada
konsentrasi 500 ppm. Oleh sebab itu, kapang
2, 4 dan 6 tidak perlu lagi diujikan.
Pertumbuhan koloni yang mengalami
petit yang disebabkan oleh induksi ekstrak
metabolit sekunder dari kapang endofit
Evodia suaveolens yaitu kapang 1, 3, 5, 7 dan
8 merupakan salah satu indikasi adanya
mekanisme apoptosis. Hal ini menunjukkan
metabolit sekunder tersebut memiliki suatu
senyawa yang dapat memicu apoptosis pada
sel khamir.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Simpulan dari penelitian ini adalah isolasi
terhadap kapang endofit dari Evodia
suaveolens menghasilkan 8 isolat. Hasil
aktivitas sitotoksik menunjukkan toksik
tertinggi terdapat dari kapang 7 yaitu 19.7
ppm. Kapang ini juga mampu menginduksi
apoptosis pada sel khamir dicirikan dengan
frekuensi petite sebesar 90%. Nilai ini
membukitkan ekstrak kloroform kapang
endofit dari Evodia suaveolens memiliki daya
toksiksitas yang cukup baik dan dapat
menginduksi apoptosis pada model sel
khamir.
Saran
Perlu dikaji lebih lanjut jenis kapang
endofit yang diisolasi dari Evodia suaveolens,
dan senyawa metabolit sekunder yang
dihasilkan dari masing-masing kapang.
Penelitian mengenai mekanisme induksi
apoptosis perlu diujikan lebih lanjut dengan
isolasi DNA dan elektroforesis untuk
mengetahui fragmentasi DNA, visualisasi
dengan mikroskop pemindai (SEM) untuk
melihat kerusakan membran, dan uji aktivitas
enzim caspase yang memiliki peran penting
dalam peristiwa apoptosis.
DAFTAR PUSTAKA
Ahmad RZ. 2008. Pemanfaatan khamir
Saccharomyces cerevisiae untuk ternak.
Wartazoa 15 (1): 49-55
Algiansyah. 2009. Kemampuan ekstrak
dedaunan berpotensi antioksidan untuk
memodulasi apoptosis pada sel khamir
[skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika
dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut
Pertanian Bogor.
Anand P, Sundaram C, Jhurani S,
Kunnumakkara AB, Aggarwal BB. 2008.
Curcumin and cancer an old-age disease
with an age-old solution. Cancer Letters
267 : 133–164.
Anonim. 2011. Zodia tanaman anti nyamuk
[terhubung berkala] http://ccd.co.id/wp-
content/uploads/2011/02/zodia.bmp [20
Juni 2012].
12
Baraja M. 2008. Uji toksistas ekstrak daun
Ficus elastica Nois ex Blume terhadap
Artemia salina Leach dan profil
kromatografi lapis tipis [skripsi].
Surakarta: Fakultas Farmasi, Universitas
Muhammadiyah Surakarta.
Campbell I, Duffus JH. 1991. Yeast a
practical approach. Leeds : IRL Press.
Clay K. 2004. Fungi and the food of the gods.
Nature 427: 401-402
Ditjen POM. 2000. Parameter Standar Umum
Ekstrak Tumbuhan Obat. Jakarta:
Departemen Kesehatan RI
Gandjar I, Sjamsuridzal W. 2006. Mikologi
Dasar dan Terapan. Ed 1.
Jakarta:Yayasan Obor Indonesia
Granot D, Levine A, Dor-Hefetz E. 2003.
Sugar-induced apoptosis in yeast cells.
FEMS Yeast Research 4:7-13.
Granot D, Snyder M. 1991. Glucose induces
cAMP-independent growth related
changes in stationery-phase cells of
Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl
Acad. Sci. 88:5724-5728
Humbert et al. penemu: United States Patent
Application Publication. 19 Jan 2012.
Extract of Evodia suaveolens scheff
repellent compositions and use thereof.
US 20120015054A1
Jemal A et al. 2011. Global cancer statistics.
CA Cancer J Clin 61 (2): 69–90.
Jiang J, Hu C. 2009. Evodiamine: A Novel
Anti-Cancer alkaloid from Evodia
rutaecarpa. Molecules 14: 1852-1859
Julianingsih D. 2012. Sterilisasi dan Media
Mikroba. [terhubung berkala]
http://tekpan.unimus.ac.id/index.php?opt
ion=com_content&view=article&id=105
:sterilisasi-dan-media-mikroba-olehdewi
-julianingsih&catid=34:tugas mahasiswa
&Itemid=55 [4 Juni 2012]
Kardinan A. 2007. Tanaman Pengusir dan
Pembasmi Nyamuk. Jakarta: Agromedia
Pustaka.
Kumala S, Muhammad G. 2005. Isolasi dan
Penapisan Kapang Endofit Tanaman
Secang (Caesalpinia sappan L.) sebagai
Penghasil Senyawa Antibakteri.
MEDICINUS (Scientific Journal of
Pharmaceutical Development and
Medical Application) 21 :15 [terhubung
berkala] http://lib.atmajaya.ac.id/
default.aspx?tabID=61&id=129265&src
=a [28 September 2011].
Kurnijasanti R, Hamid IS, Rahmawati K.
2008. Efek sitotoksis in vitro dari
ekstrak buah mahkota dewa (Phaleria
macrocarpa) terhadap kultur sel kanker
mieloma. J. Penelit. Med. Eksakta 7 ( 1)
: 48-54.
Lumongga F. 2008. Apoptosis. [terhubung
berkala] repository.usu.ac.id/bitstream/1
23456789/2061/1/09E01457.pdf [10
Juni 2012]
Madigan MT, Martinko JM, Parker J. 2000.
Brock Biology of Microorganisms. Edisi
ke-9. New Jersey: Prentice Hall.
Matthias R. 2001. Cancer. First edition. Sta
Clara: MR publishing
Mayer A, Gustafson K. 2008. Marine
Pharmacology in 2005–2006:
Antitumour and Cytotoxic Compounds.
European Journal of Cancer 44: 2357–
2387
Melliawati et al. 2006. Pengkajian bakteri
endofit penghasil senyawa bioaktif
untuk proteksi tanaman. Biodiversitas
7(3): 221-224.
Meyer BN et al. 1982. Brine shrimp: a
convenient general bioassay for active
plants constituent. J Medical Plant Res
45:31-34.
Michael L. 2003. Beating cancer with natural
medicine. USA: Bloomington.
Muchtadi TR, Ayustaningwarno F. 2010.
Teknologi Proses Pengolahan Pangan.
Bandung: Alfabeta.
Murray et al. 2006. Harper’s Illustrated
Biochemistry 27th
Edition. USA: The
McGraw-Hill Companies.
Nurhasanah. 2008. Isolasi mikroba endofitik
penghasil senyawa antimikroba pada
tanaman ciremai (Phyllanthus acidus)
dan meniran (Phyllanthus niruri). Warta
Akab 19:20-32
Pelczar JR, Chan ES. 1996. Dasar-dasar
Mikrobiologi. Jakarta: UI Pr.
Purba CYC. 2011. Bioaktivitas ekstrak kayu
teras suren (Toona sinensis Roemor) dan
profil kromatografi lapis tipis fraksi
aktifnya [Skripsi]. Bogor: Fakultas
Kehutanan, Institut Pertanian Bogor
Rejeki YS. 2011. Pengaruh kondisi kultivasi
terhadap produksi antibakteri dari
bakteri asam laktat asal bekasam ikan
sepat rawa (Trichogaster trichopterus)
13
[Skripsi]. Bogor: Fakultas Perikanan dan
Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor.
Rizqianti AA. 2012. Ekstrak flavonoid daun
salam (Syzygium polyanthum Wight.)
Sebagai agen proapotosis sel khamir
[skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika
dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut
Pertanian Bogor.
Sanger 2004, diacu dalam Ahmad Riza
Zainuddin. 2008. Pemanfaatan Khamir
Saccharomyces cerevisiae untuk Ternak.
Wartazoa 15 (1), 49-55
Schulz B, Boyle C. 2005. The endophytic
continuum. Mycol 109 (6) : 661-686
Simanjuntak P. 2011. Indonesia Gudang
Mikroba Antikanker dan Antidiabetes.
[terhubung berkala] http://www.biotek.
lipi.go.id/index.php/news/biotek/755ind
onesia-gudang-mikroba-antikanker-dan-
antidiabetes-?PHPSESSID=275d90261d
f7e82c864cb9992fb7a347 [4 Juni 2012]
Simanjuntak P. et al. 2002. Produksi alkaloid
kuinina oleh beberapa mikroba endofit
dengan penambahan zat induser (studi
mikroba endofit tanaman Cinchona sp.
(2)). Majalah Farmasi Indonesia 13(1):
1-6
Strobel G, Daisy, Castillo, Harper J. 2004.
Natural product from endophytic
microorganism. J. Nat. Prod. 67 : 257-
268
Sugijanto NE, Indrayanto G, Zaini NC. 2008.
Paradigma baru produksi antibiotika
menggunakan jamur endofit dari
tanaman Alyxia Reinwardtii [terhubung
berkala] http://repo.unair.ac.id/data/
richfiles/abstrak%20EKSAK%200610%
20_upload_(81).pdf [19 Juli 2012].
Sukandar et al. 2010. Karakterisasi senyawa
aktif antibakteri ekstrak air bunga
kecombrang (Etlingera elatior) sebagai
bahan pangan fungsional. Valensi 2
(1):333-339
Sukardiman et al. 2006. Uji antikanker dan
induksi apoptosis fraksi kloroform dari
daun pepaya (Carica papaya) terhadap
kultur sel kanker. Media Kedokteran
Hewan 22 (2): 110-113
Theantana T, Hyde S, Lurnyong. 2007.
Asparaginase production by endophytic
fungi isolated from some thai medical
plants. KMITL Science Technology·
Journ 7 (1): 13-18
[WHO] World Health Organization. 2012.
Cancer [terhubung berkala].
http://www.who.int/mediacentre/factshe
es/fs297/en/ [18 Juni 2012].
Widyastuti S. 2008. Uji toksisitas ekstrak
daun iprih (Ficus glabella Blume)
terhadap Artemia salina Leach dan profil
kromatografi lapis tipis. Jurusan Farmasi
Universitas Muhamadiyah Surakarta
Winarno EK. 2006. Produksi alkaloid oleh
mikroba endofit yang diisolasi dari
batang kina Cinchona ledgeriana Moens
dan Cinchona Pubescens Vahl
(Rubiaceae). Jurnal Kimia Indonesia.
(2):8-15
Zebua NI. 2011. Aktivitas hambatan
gabungan ekstrak kunyit (Curcuma
domestica Va), temulawak (Curcuma
xanthorrhiza Roxb), dan Lempuyang
(Zingiber zerumbet) terhadap proliferasi
sel kanker usus besar HCT (ATCC-CCL
116) [Skripsi]. Bogor: Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan
Alam, Institut Pertanian Bogor
14
LAMPIRAN
15
Lampiran 1 Tabel Kapang Endofit Evodia suaveolens
No
Kapang
Warna Permukaan Pola Foto
Tengah Samping Belakang
1 Putih Putih Putih Tidak rata Tumbuh
seperti kapas
dan tersebar
tidak merata
2 Putih Putih Putih Tidak rata Kapas
tersebar
dengan
merata
3 Putih Putih Putih Tidak rata Kapas tumbuh
lebat
ditengah
4 Putih Putih Putih Rata Tumbuh
seperti kapas
dan tersebar.
5 Kehitaman Putih Hitam
keabuan
Rata Kapas tumbuh
acak
6 Putih Putih Putih Rata Tumbuh
banyak
disamping
samping
cawan seperti
kapas putih
16
7 Hijau Hijau Hijau Rata Kapas
berwarna
hijau yang
tersebar
8 Hitam Putih Hitam Rata Seperti kapas
yang tersebar
merata
17
Lampiran 2 Tabel Khamir yang mengalami petite setelah perlakuan masing-
masing ekstrak
No. Jenis
Perlakuan
Konsentrasi Foto Khamir
1 Kapang 1 315 ppm
2 Kapang 3 270 ppm
3 Kapang 5 400 ppm
4 Kapang 7 19.7 ppm
18
5 Kapang 8 403 ppm
6 Kontrol
positif
Glukosa 2%
7 Kontrol
negatif
Akuades
19
Lampiran 3 Nilai LC50
Nomor Kapang Konsentrasi (ppm) Persen Udang Mati Nilai LC50 (ppm)
Kapang 1
Kapang 2
Kapang 3
Kapang 4
Kapang 5
Kapang 6
Kapang 7
Kapang 8
500
100
50
10
500
100
50
10
500
100
50
10
500
100
50
10
500
400
300
200
100
50
10
500
100
50
10
500
100
50
10
8
6
4
2
500
100
50
10
80
20
0
0
0
0
0
0
100
10
0
0
20
10
0
0
100
20
20
0
0
0
0
20
0
0
0
100
100
100
80
20
20
10
0
60
20
10
10
315
-
270
-
400
-
19.7
403
Contoh perhitungan:
Kapang 3= Y= -7.765+0.1659x
50= -7.765+0.1659x
X=270 ppm
20
Gambar 10 Grafik LC50 Kapang 3
y = -7.765+0.1659X
0
100
200
300
400
500
600
0 20 40 60 80 100 120
Ko
nse
ntr
asi
(p
pm
)
Persen Udang Mati
21
Lampiran 4 Strategi Penelitian
Isolasi dan Pemurnian Kapang Endofit
Peremajaan Kapang Endofit dari Isolat
Fermentasi Kapang Endofit
Ekstraksi Metabolit Sekunder
Induksi Apoptosis pada Sel Khamir
Uji Sitotoksitas dengan BSLT (Brine
Shrimp Lethality Test)
22
Lampiran 5 Induksi Apoptosis (Pembuatan Media)
Pembuatan media
terdiri dari media cair
YEPD, media padat
YEPD dan media
padat petit
Media cair YEDP
dibuat dari 1% yeast
ekstrak, 2% pepton,
2% glukosa, dan
akuades hingga 100 ml
Media padat YEDP
dibuat dari 1% yeast
ekstrak, 2% pepton,
2% glukosa, 1.8%
baktoagar, dan
akuades hingga 100 ml
Sterilisasi
autoklaf suhu
1200C, 15 menit
10 atm.
Media petit YEDP
dibuat dari 1% yeast
ekstrak, 2% pepton,
0.1 % glukosa, 1.8%
baktoagar, etanol 2%,
dan akuades hingga
100 ml
23
Lampiran 6 Perlakuan Induksi Apoptosis
Ekstrak
dihomogenisasi
terlebih dahulu,
kemudian diinkubasi
pada 37°C selama 24
jam.
Ekstrak kapang endofit:
Tambahkan 400 µl ekstrak dengan
konsentrasi LC50 dari masing-masing
kapang endofit ke eppendorf seberisi
100 µl kultur sel khamir, 500 µl YEPD
cair Perlakuan terdiri dari
ekstrak metabolit
sekunder kapang endofit,
glukosa 2% sebagai
kontrol positif dan
akuades sebagai kontrol
negatif
perlakuan kontrol positif:
ekstrak kapang endofit diganti dengan
glukosa 2%
perlakuan kontrol negatif : ekstrak
kapang endofit diganti akuades 400 µl
24