ISOti'Sl aLIIOPllOTEIN MEMBRAN PERMUKAAN ~ .. ' '

TRIPANOSOMA EV ANSI

DENGAN PENGECATAN COOMASSIE ·BLUE

Oleh :

Tasmini.

Laboratorium Biokimia Fakultas Kedokteran UGM

MenQetahui

ktUIIl UGM

-1.,

Kl<!

~lb. JJ3 7i4'

1' .. . '

ISOLASI GLIIOPROTEIN MEMBRAN PERMUKAAN

TRIPANOSOMA EV ANSI

DENGAN PENGECATAN COOMASSIE BLtlf

Oleh :

Tasm1n1.

Penel1tlan 1n1 dib1aya1 oleh PAU B1oteknolo91 UGM Yo9yakarta

th. 1969/1990

Laboratorium Biokimia FaKultas KedoKteran UGM

YOGYAKARTA

1989

P R A K A T A

Pwji 5yukur kami panjatkan kupada Tuhan Vang Maha

Kuasa atas bimbinganNya, suhingga penelitian dan laporan

dapat diselesaikan dan berjalan lancar.

Pada kesempatan ini peneliti mengucapkan terima

kasih kepada bapak Dr. Wayan T. Arthama, Bapak Dekan dan

berbagai pihak yang tidak kami sebutkan satu persatu yang

telah bany~k membantu terlaksananya penelitian ini.

Semoga hasil penelitian ini dapat bermarifaat.

i i

Vogyakarta, 16 Nopember 1989

Peneliti.

D F T A R I S I

PF<A~~ATA • • . . . • • • • • • • . . . . . . ii

DAFTAH ISI. • • . . . . . . ij. t

DAFTAR GAI'lBAR •

INTISARI •• . . . . . . . . ..

PENDAHULUAN • . . . . . . . . . . . 1

TINJAUAN PUSTAKA. . . . 3

CARA PENELITIAN . • • . 16

HASIL DAN PEMBAHASAN. 17

KESIMPULAN DAN SARAN. . . . . . . . . 19

2(1

U~l'lP I liAN . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

iii

D A F T A R G A M B A R

Gamba..- I. Bl oodst.ream Form T..t:.Y.1?..~3.0.n.f:in.m..:1. -c·. •

J=C)[lg.ol en~g <Vic: kermc::1n, 1 969'> • ~ .• ·~ • 16

II. Gambaran ele~(tn::mmi~:n::lskopi~: dari ·~ .... T r y P.5lUQ.a.Q.!.!la £Q.UHQ.J..~n.§.fi:. < pot n n g c.m melintang, pembesaran 257.000 M). Pada gambar nampak selubung (surface coat> berupa lapisan pro-· ·· tein yang kompak, menutupi permuka-an tubuh dcm ·f 1 agell a • . • • • • • • • • • • 17

III. Bentuk kurva standard dari 1% BSA dan 1X Tripsin Inhibitor •••••••••

IV. Gambar hasil elektroforesis sampel glikoprotein membran permukaan Tripanosoma pengecatan coomassie

36

blLte ............................... ~)7

INTI BARI

Tripanosomisia merupakan penyakit pada hewan dan ffi~nY~~~ y~ng g~DV~~~k~n QIWh prg~~~Q~ tr&p~ng~QmM•

Ir.:.Yn . .@.!lQ?JQ.ill.!EI_ ~.Y . .@.!H~i. menyeb;:.bkan p•:~ny<:'lki t ~~~~t.wrc-," pc.1da hewan, terutama hewan-hewan piaraan. Tubuh tripanosoma berbentuk furiform, mempunyai dua lapis membran yaitu membran permukaan <luar) dan membran dalam. Glikoprotein merupakan senyawa yang ikut menyusun membran tripanosoma.

PenE.:>l it. i .: .. \n i ni bE·r·tujuc:.1n l.tnt:.uk fh(;!niJ.::,n<:il i !:~.:~ fJ 1 i ko-pr-t:l'tt::d n membran I.r.:YJ?...~D.n.2.9.!!h~ .. ~Y..ii~.ru~~ .. L mE.-nquni..:d,an el+:?ktnJ­foresis dengan pengecatan coomassie blue.

Darah kerbau yang mengandung tripanosoma disuntik­kan ke tikus, dan setelah terjadi parasitemia darah diambil untuk sampel. Darah dilewatkan kolom kromato­grafi kemudian disent.rifugasi untuk mendapatkan t.ripa­nosoma. Membran tripanosoma diperoleh dengan jalan melisiskan tripanosoma dengan dioksan. Identifikasi glikoprotein membran dilakukan dengan elektroforesis.

Hasil yang diperoleh pada isolasi glikoprotein dengan elektroforesis gel poliakrilamid 10% adalah berupa pita-pita. Hasil ini dibandingkan dengan protein standar, maka didapatkan berat molekul glikoprotein tersebut + 62.000 Dalton

·\J

P E N D A H U L U ~ N

Tripanosoma merupakan salah satu jenis protozoa

parasit baik pada hewan maupun manusia. Protozoa ini

te~masuk kelas Flagellata yang dapat menyebabkan penya-

kit tidur yang disebut tripanosomiasis. Penyakit terse-

but t er j c:id i secara endemis dibeberapa daerah yang

sampai saat ini belum bisa disembuhkan.

Banyak sekali spesies tripanosoma yang menginfeksi

hewan dan mam.tsi a. F•adt.1 hewan, I!!.. ld.r..b!..G.ei IJ.r.J::~f .. ~J.i.s.. I..!!..

tidur pada ternak yang disebut Nagana, sedangkan pada

menyebabkan penyakit tidur yang disebut Human sleeping

sickness, terjadi di daerah Afrika. Di beberapa daerah

di Amerika Latin terdapat penyakit Chagas yang disebab-

Pengobatan terhadap tripanosomiasis sampai sa at

ini belum memuaskan. Pemberian kemoterapi dengan obat-

obat antiparasit hingga sekarang tidak banyak berarti,

bahkan terlalu toksis dan menimbulkan efek samping yang

berbahaya. Karena begitu ganasnya parasit tripanosoma

yang cepat mengakibatkan anemia, maka sangat diperlukan

pt:•11 angc.'\nan yanc..;~ c.::>er·ius;. £3,-:i\l.:~h ~::..::,tu Ci:ill'"iiil y.::,nc;;t d.s\pat

• c:~l·.j,:_~·.Lal .. , p~.~_ 1·1-1 1·.·.1 t~rian vaksin. Untuk itu perlu di har·;apr(i:."H1 a ,, " -

1.

kepada tripanosoma terutama mengenai komponen tubuhnya,

termasuk senyawa- senyawa penyusun membrannya. Penel i -·

tian ini untuk mengetahui jenis glikoprotein penyusun

£~v.:~nsi -··-·-·---·' i tt..l y.::1ng

bekerja sebagai antigen.

Di Indonesia penelitian tentang tripanosoma masih

masih sangat minim. Oleh kar~na itu masih sangatlah

perlu penelitian mengenai glikoprotein membran permu-

ka<:tn I.r..Y!HilD.Q§.Q!Jl€! ~eH§.i..· Gl i kopr·ot.f~i n i ni merupr..1kan

salah satu penyusun membran berbagai spesies tripanoso-

r i c:1si.

Penelitian ini diharapkan dapat menambah luasnya

cakrawala ilmu pengetahuan serta dapat menambah kepus~

" takaan mengenai tripanosoma sehingga·akan mempermudah

penelitian-penelitian lebih lanjut. I 1 mu b.::'\ru yang

terkandung dalam hasil penelitian ini akan mendukung

usaha penanggulangan penyakit tripanosomiasis yang

sangat merugikan masyarakat Indonesia. Banyaknya hewan

ternak yang musnah karena serangan tripanosoma merupa-

kan salah satu hambatan tegaknya ekonomi rakyat Indone-

sia, sementara negaranya sedang giat membangun disegala

bidang, sehingga kerugian rakyat ini juga m£~rt.tpakan

kerugian negara, maka perlu mendapatkan per·hati an

ten:amdi ri.

T I N J A U A N P U 8 T A K A

I.H i lH~fH"t-"·lol r1 .lldOAl ah pl"'rl'bai t' y,tHH1 lfltcm(l.IA11f1Uf1(J ~(~f'"IJO'~'

hidrat yang terikat secara kovalen, merupakan monosaka­

r·ida tunggal atau oliso!iHi\kiiArid;a y<:Ar.IJ rel;.:\ti f penclek.

Bagi~n karbohidrat dapat mencapai 1-30% atau lebih.

Glikoprotein mempunyai satu atau beberapa macam karbo­

hidrat, yang lain mempunyai sejumlah rantai samping

oligosakarida yang berbentuk linier atau bercabang.

Hampir semua protein pada permukaan luar hewan adalah

glikoprotein.

Glikoprotein mempunyai berat molekul 15.000 - 1

juta Dalton atau lebih •. Glikoprotein terdapat hampir

disemua organisme termas~k tumbuh-tumbuhan, bakteri,

fungi, virus da~ hewan lainnya. Sebagian besar protein

membran yang disekresikan adalah glikoprotein (9).

Sembilan residu gula yang ditemukan pada rantai

oligosakarida yang terikat pada glikoprotein adalah

glukosa, galaktosa, manosa, N-asetilglukosamin, N­

asetil- galaktosamin, fukosa, arabinosa, xilulosa dan

asam sialat. Pada umumnya N-asetilheksosamin terletak

pada ujung proksimal protein. Residu fukosa terlatak

lebih distal dari rantai. Fukosa adalah derivat dari

Rantai oligosakarida terikat pada rangka pQJ. i pep 'I:. :i. c:l.r~

dari glikoprotein pada salah satu dari lima asam

amino yaitu asparagin, serin, treonin, hidroksiliein

atau hidroksiprolin. Ikatan kimianya berupa ikatan 0-

glikosidik dan ikatan N-glikosidik. Ikatan 0-glikosidik

adalah bila karbohidrat yang ada diikat oleh atom

oksigen sebagai rantai samping daripada residu serin

atau threonin. Ikatan N-glikosidik adalah bila gugus

karbohidrat diikat oleh rantai samping nitrogen dari

residu asparigin (10>.

Glikoprotein permukaan membran eel tidak hanya

dijumpai

juga pada

pada sel organisms tingkat tinggi melainkan

sel tanaman, bakteri dan

tertentu. Membran sel dengan ketebalan 60-120 A (1 A -

10-8 em> dijumpai hampir pada semua sel prokariotik

maupun sel eukariotik. Protein membran sel vertebrata

dan protein serum mengandung karbohidrat, dan resid~

karbohidrat seperti antene mengarah keluar permukaan

sel (4).

F~antai karbohidrat pada permukaan sel mempunyai

fungsi struktural penting bagi sel itu sendiri, antara

lain untuk menjaga stabilitas protein, penentuan lipa­

tan yang cocok, penempatan posisi yang sesuai dalam sel

dan berbagai pelindung terhadap prrtease. Di ~:>ampi nrJ

fungsi struktural, karbohidrat juga mempunyai sifat

fungsional seperti misalnya pembebasan oligosakarida

pektin dapat menginduksi

tancMn.:u-.. Per·•~nan 1 c:li n de:.~ I'" i

Pl-.,ytoal £·?>: i ne

k i:~r- bol-. i d1·· at

glikoprotein adalah meningkatkan kelarutan

didalam air· <4>.

pc:.~da

p.::ida

Akhir-akhir ini integral protein yang terdapat

4

baik pada plasma membran maupun membran seluler banyak

mendapat perhatian khusus, karena karakteristika struk-,

turnya, fungsi maupun sintesanya. Protein ini walaupun

mt::.•mpunya:l i tiil i f .r:1t urnum y •. ,,nq m i , ... :1. p ~ mEil'"t.tp ,,.,, 1.: ,:·,,n l:!>tJ ii:l t 1.1 I·( e 1 ""' ~:~

protein dengan nama glikoprotein membran <8, 9).

Glikoprotein disintesis pada retikulum endoplas-

mik kemudian dibebaskan ke permukaan sel melalui apara-

tus golgi dengan N-terminus mengarah ke permukaan sel.

Sintesis glikoprotein pada ribosome~ dan setelah gliko-

silasi (penambahan residu gula) dalam komplek golgi

kemudian dilepas melalui vesikel-vesikel, dan di trans-

port ketempat tujuan masing-masing dengan jalan pinosi-

tose terbalik pada membran atau dengan jalan fusi

vesikel dengan membran. Banyak protein membran dan

sekret protein mempunyai satu atau lebih gugus .karbohi-

drat. Protein ini dikatakan mengalami glikosilasi. Oleh

ka~ena adanya gugushidroksil, maka terikatnya karbohi-

drat pada protein akan meningkatkan kelarutan protein

<4, 6). Unit karbohidrat dari protein membran dapat

berupa oligosakarida dan polisakarida. f<t~·!::;i du gul a

berfungsi sebagai antene seluler pada permukaan membran

sel dan merupakan kontak penghubung dengan dunia luar,

seperti misalnya kontak dengan sel sekitarnya. P.;:'lda

kebanyakan transformasi sel untuk menjadi tumor maka

sering kali dimulai dengan hilangnya struktur ini,

sehingga komunikasi antar sel terganggu. Dari analisa

kimia diketahui bahwa perubahan terjadi pada residu

karbohidratnya (6).

Analisa protein dapat dilakukan dengan gel poli-

akrilamid elektroforesis dalam keadaan terdenaturasi.

Campuran protein pertama dilarutkan dengan SDS <Sodium

Dodesil Sulphata>. Merkaptoethanol ditambahkan untuk

mereduksi ikatan disulfida. SDS komplek dengan protein

terdenaturasi pada elektroforesis gel poliakrilamid

akan membentuk pita tipis secara visual dapat dilihat

denc,:;Jc.m pengecatan perak d<.-~n £':.9..n!ll.i:~ssi 1£. 1211,!£. < 1; , 11 >.

Elektroforesis adalah pemisahan substansi campu­

ran dalam medan listrik. Pemisahan terjadi berdasarkan

perbedaan kecepatan bergerak dari masing-masing sub­

stan, tanpa terjadi pengaruh timbal balik secara kimt

~awi atau absorpsi gel dengan sampel. Kecepatan berger­

ak secara individu adalah proporsional dengan mobilitas

relatif secara elektroforesis dari s~uatu mol f~kul.

fisiko-kimia dari molekul dan ini bisa dibandingkan

dengan mobilitas dari substansi standar, seperti m1sal-

nya Bromfenol biru, Silensianoi, Bromkresol hij.:~u.

Mobilitas elektroforesis suatu molekul sangat tergan­

tung pada muatannya, sedangkan muatannya sendiri ter­

gantung pH larutan, pH bufer, konsentrasi ion dari bu­

fer dan temperatur. Apabila molekul dan pori-pori gel

mempunyai kesamaan diameter maka pergerakan larutan da­

lam gel ditentukan pula ol~h kuat gesekan masing-masing

molekul, sehingga molekul yang kecil bergerak lebih

J .•

cepat dari molekul besar. Dalam hal ini kecepatan

bergerak suatu molakul ditentukan baik oleh muatan,

di~meter, m~upun bentuk molekul

tarsier dari protein).

s t r 1..1 t> t ur

Poliakrilamid gel terbentuk dari polimerisasi

monomer poliakrilamid manjadi rantai linier. Poliakril-

amid yang panjang dihubungkan satu dengan lainnya oleh

crossl in ker ~1 N 1 -metl.l:'Ll.!me::.U.iJi!E~.Gt:Y!..fM.!li..f.l~ iJh ~~.2..., t£~t .::1p i

bisa juga senyawa lain seperti etilen diakrilamid,

N1N1-Bisacrylylsystamine CBAC) atau N1N1-dialyltartard­

ia- mide CDATD>. Dengan adanya ammoniumpersulfat seba-

qc:d katal i satcw d.::tn

<Temed> sebagai inisiator maka terjadi polimerisasi.

Reaksi polimerisasi secara random menghasilkan rantai

poliakrilamid sedangkan dengan penambahan bis secara

pr·opon~i onal berf.:?c~ksi denc;;J<M1 qugus ·funq~.d onal dari

bagian terminal rantai polia~rilamid. Konsentrasi dari

akrilamid menentukan panjang rantai polimer, sementara

itu konsentrasi dari bis menentukan ragam dari cross-

linking. Oleh karenanya konsentrasi dari akrilamid. dan

rasionya dengan bis adalah sangat menentukan sifat

fisik, elastisitas, kekuatan mekanis dan ukuran pori

serta network tiga dimensicmal dari gel. Penambahan

Sodiumdodesilsulfat <GDS> pad.::\ f.Hll i al·r.d. 1,:\m:i d gel

·elektroforesis memberikan kemungkin•n ~k•n pemi~ahan

protein yang lebih efektif. SDS"hanya bisa memisahkan

ikatan hidrogen dari molekul, t:idak dapat memisah

7

ikatan disulfida, sehingga pemisahan total struktur

tertier diperlukan penambahan reduktor th i c:lreag£:ln

seperti 2-merkaptoethanol kedalam sampel yang akan

dipi sah~~cm. Dengan demikian maka rantai ami no c1ari

pol i pept ida secara bersama membfmt.ul' eli psoi d dengan

jarak rata-rata yang konstan, sehingga masa molekul

menjadi proporsional. Penambahan urea juga sering

dipakai sebagai suatu disosiasi agen yang dapat memu-

tuskan ikatan hidrogen. Pemberian urea dengan konsen-

trasi tinggi (8M) sangat diperlukan dan harus permanen

ada selama elektroforesis untuk menetapkan suasana

denaturasi, tetapi tiol masih diperlukan untuk mendena-

secara komplet molekul protein dengan ikatan

disulfidanya. Keuntungan menggunakan urea adalah tidak

berpengaruh pada muatan intrinsik sehingga sebagai

basis pemisahan poliakrilamid didasarkan baik atas

ukuran molekul dan juga muatannya. Untuk mendeteksi

pita sering digunakan cara pengecatan.

g_!.llg sang at. seru~i t if dan dc~pc:\t menc:leteksi pita protein

yang berkadar 0,2- o,5fg, sedangkan penggunaan perak

nitrat lebih sensitif.

· Tripanosoma adalah suatu protozoa yang termasuk

kelas Flagellata yang dapat menyebabkan suatu penyakit

infeksi yang dikenal dengan Tripanosomiasis. Penyakit

ini sangat menular baik pada hewan maupun pada manusia,

dengan perant~ra lalat gigit sejenis Glossina. Di d.:\1 .:\m

tubuh lalat, parasit-parasit mengalami siklus perkem-

bangan. Trypaoosom2. f:?V.S.f.la! .• merupakan penyebab ~H~~nyaki t

8

menyerang berbagai jenis hewan piaraan seperti kuda,

7).

Tripanosoma mempunyai :tuti.Ht1. f.!J.si fqr:J.n, tumpul,

bentu~c oval dan masing-masing meruncing.

Tripanosoma mempunyai ~:.atu ·fl.a~lt:dlt:\ r::.ebt:~gai .:d.:~t ~Jerc:\k.

Flagella ini diikat oleh tubuh pada membran undulan

yang berasal dari kutikula atau eksoplasma. l<i nf.~t.opl .::ts

merupakan kumpulan dari bleparoplas anterior.

dari flagella terletak di sebelah samping. Tahap ini

di bentu~c didalam plasma dar·ah P.:.1da

invertebrata bentuk lain ditemukan. Perkembangan dalam

invertebrata terletak pada bagian posterior ( postr~r i or

station) bila vertebrata terinfeksi k~rena kontaminasi,

bagian posterior dari traktus alimentaris atau glandula

sal:i.varia <anterior station) i nfeksi

melalui fJigitan. Bent.uk yang mengirifeksi disebut

tripanosoma metasiklik <2, 7).

Didalam tubuh lalat (jenis Glossina) tripanosoma men-

galami daur pertumbuhan, yakni didalam alat digesti dan

didalam alat digesti dan sungut penghisap < I.:!... f..9.D.9.Q.::

atau hanya didalam sungut penghisap saja

vlvax>. Trif3anosoma ini dalam bentuk kritidial, kineto---· plas terletak dibagi.an anterior nukleus. St:tel ah

beberapa waktu.mereka menjadi bentuk infektiv dan siap

9

meninggalkan kelenjar saliva menuju aliran darah verte-

brata yang sesuai. Serangga yang telah ditulari

kira~kira 10% serangga ditulari

darah) berdaya memindahkan penyakit seumur hidup.

Pemindahan secara langsung dan mekanik mungkin juga,

tetapi tidak banyak berarti. Anjing dan kucing dapat

ditulari secara oral. Pada unggas, sapi dan kerbau

ser i ng di temukan tri'panosoma yang besa1'" dal am darc.'lhnya

( 2) •

Tripanosoma secara mikroskcpis merupakan binatang

.bersel satu yang sangat kecil (20- 30ftm>, yang seba-

gian dari siklus hidupnya sebagai parasit pada cairan

darah manusia dan binatang, yang merupakan suatu penya-

kit yang pada stadium akhirnya biasanya diikuti dengan

kematian penderitanya. Dikawasan Afrika penyakit ini

secara endemis menyerang manusia dan hewan piaraannya,

menyebabkan kerugian ekonomis yang sangat besar. Di

Indonesia penyakit ini hanya menyerang ternak yang

dikenal dengan penyakit surra, yang disebabkan oleh

atau kumparan yang bergerak secara bebas dalam plasma

darah dan cairan badan lain. Intinya mempunyai kariosom

yang besar terletak hampir sentral. Dekat satu ujung

ditemukan bleparoblast. Tripanosoma mempunyai claye:1

gerak karena memiliki membran undulan.

adalah sebagian dari selubung atau periplas tubuh

par·asi:t. Pinggir dari selaput ini dibentuk oleh suatu

l.O

cambuk yang berasal dari bleparoplas.

jeni~~ tripanosoma tertr.;mtu c<~mbuk ini lebih panjanrJ

~~ra ~~oan p~r~~lt ltu ~endlrl sehingga tripanosoma

mempunyai cambuk bebas. Di dalam protoplasma yang

bed:lintilc-bintil< halt.m didc:ip.atlc.::m ~:.atu at.:n.t be:·ber.::ipa

vakuola kecil dan besar disamping granula-granula beaar

yang banyak <2, 7).

Pertambahan parasit ini terjadi dengan pembelahan

membujur langsung. Tripancsoma mempunyai daya gerak

aktif, tetapi daya gerak dan cara gera~ ini karakteris-

tik untuk masing-masing spesies, sesuai dengan letak

bleparoblast, morfologi, paiogenitas terhadap hewan,

daur pertumbuhan dan sebagainya. Kraneveld dkk. (19~51)

elektron dan mereka menenrukan bahwa periblast terdiri

dari serabut-serabut membujur yang berjalan sejajar.

Flagella terdiri dari 9 serabut-serabut isodiametrik

yang diselubungi oleh selubung sitoplasmatik (7).

Tripanosoma dapat dibiakkan dalam

aseluler, padat atau setengah padat, tetapi juga dalam

biakan Ja(ingan atau didalam telur eraman.

untuk pembenihan ini digunakan hewan-hewan laboratorium

hidup. Trl panosf.)ffia pad a i ntf~lat :i nt.lm bag :ian tfJnqah dar· i

lalat didalam 3~ - 48 jam, ket:ika terjadi multiplikast.

hari ke 10 - 12 memanjing dan l~ng5ing (3~ )J),

dengan parabasal body telah didapatkan disini.

kemudian berm:igrasi kearah proventikulus dimana mereka

1 1

melanjutkan multiplikasi di hari ke 12 20, jadi

melewati hipofaring ke kelenjar saliva. Mereka perla­

han-lahan berubah bentuk kedalam kritidial dan berepro-

duksi dengan pembelahan longitudinal. Akhirnya mereka

ben.tbah b~·ntuk menjadi pf.mdelc dt:H"r qE~muk, t.r·i pano~:>oma

infektif · metasiklUc. Tripi:HH)~:>om<:!' yanfJ bel""parasd.t pada

manusia dan mamalia dibagi dalam golongan Lewisi,

Evansi, Vivax, Congolense, Brucei dan Avium <ungg.::"s,

cenderawasih, burung gagak dsb). Banyak sarjana yang

menrJancJgap bahwa h cb.Q1.€ill.~.J ... gn .. ?.tl. adal ah vad. etat::. · T.

l:!.!:..!:!.f.Ed y.:mg tel ah menyesuc.:d kc:m di I'' i paclc.1 manusi <.':i.

Tripanosoma mempunyai dinding luar per·mul(a<.'ln

se·l nya <surface coat> merupakan glikoprotein

sangat kompak teranker ke plasma membran dari sel.

Protein membran tersebut adalah glik8protein dengan

berat molekul 55.000- 65.000 Dalton (8, 9).

adalah sakarida utama dari glikoprotein

Struktur glikoprotein dengan manose sebagai

Golongan trlpanosoma yang telah dipelajari

komponf.m

<J~dal ah

Ir:.~!~8H.Q.lb1Q.!!.l.§.. tl!:.!::!.£.§:.1. pt?nyt:::·bc?.lb pt:.•nyc:\k it t i c:ILw pHd a or .::u·li;..l

<Human Sleeping Sickness>. Pada golongan ini membran

glikoproteinnya sangat variabel, karena organisme ini

mempunyai mekanisme yang unik yaitu kemampuan merubah

membr·an pHF'IliUkcHc:\n <antigenic variation), walaupun

tampak selalu sama, namun mempunyai sifat antifjenik

yang berlainan. Variasi antigenik seperti :i n:i. y.:u·1g

menyebabkan tripanosoma mampu menghindarkan diri dari

1.2

re~pon ui~tem imun induk ~emangnyQ don bert~han hidup

d~ngan jalan mengubah glikoprotain pormukaannya satiap

Olken~l olen 1mun ~lstem 5enlngga a~nlrnya induM semang

mati. Protein permukaan yang bertanggung jawab pada

proses ini adalah Variabel Surfate Glycoprotein <VSG).

Proses pergantian VSG diatur secara genetik, dimana

didalam genom terdapat lebih dari 100 gen VSG, yang

bergantian bisa di ekspresikan. Membran protein inilah

yang a~can diisolasi sec:ara pr-epare:\tip <8, 12).

VSG dari golongan 11 African Trypanosom!~" b,?lah

banyak diketahui dan bahkan dapat mengungkapkan era

baru dalam molekuler biologi, baik mengenai struktur

maupun 11 struktur anc::hor "ny~\ kede:\1 am mf~mbran sel, yang

ternyata diketahui berlaku untuk kebany.::'lkan sel

eu ~car i ot.i k •

13

ll"v•IIYt awellln1

,lhulllv••lcul .. , luul,. ~

grunulut

..... ,

lua&lllllarno den•• . 1•onular ltadr '-...

t••lllcular

nolu atubul111''

AIHfNION INU

Gambc~r· I. <V:i ckennan,

Bl c::sod t:.t r €~am 1.969) •

14

Fc)rm

ftuc.leut ""

' lluuellutn.

nuuduted

rellcufurn

Gambc."'r I I. Gambaran elE.:-kt.ronmU,ros~mpi k clari J~ l,;i~M.Ql.~!l§.g_ (potonl]c-an mr:?l i ntang, pembesaran 257.000 x). Pacla gambar nampak selubung (surface coat> berupa lapisan protein yang kompak, menutupi permuka~n tubuh dan flc:igella. (A•·-thama, ·1909>.

15

--~-,·---- - - -- -..---~--

CARA PENEL... IT I '-'N

Tripanogom~ darah kerbau dibiakkan pada tikus,

juml ah bi a~( an ~~t:~>l alu di i ~wt.i dc:.m bPtol ah 't£:~r jt:HI:i pt.tr·,r..:\k

parasitemia darah tikus diambil sebagai sampel. Darah

dilewatkan kolom kromatografi DEAE-sellulose. L...arutan

yang diperoleh disentrifugasi 4000 x g dengan tempera­

tur 4°C selama 10 menit. Endapan trip2~osoma ditambah

dioxan untuk melisiskan membrannya. Larutan ini kemud~

~an disentrifugasi lagi. Terhadap filtrat yang mengan­

dung membran membran tripanosoma dilakukan elektrofor~­

sis gel plate poliakrilamid 10~, kemudian dicat dengan

COOIIli:.'ISEii e bl Ul-:?.

Pi ta·-pi ta yan~J t.:Hnpc.:d~ pada £21 e~ktr·ofc,re~.;i s di ·foto

dan dibandingkan dengan pita-pita protein standar yang

dijalankan bersama-sama dengan sampe1.

I HASIL DAN PEMBAHASAN

tihts

terinfeksi/parasitemia (terjadi setelah kira-kira 72

jam dari penyuntikan>, Spl darah diencerkan dengan 1,5

ml bufer PSG adalah : 239 X 300 X 104 /ml darah = 7,17 X

108 /ml. Oarah yang diperoleh dari 5 ekor tikus sebanyak

ml. Jumlah tripanosoma yang diperoleh = 1,'7925 X

Setelah darah tripanosoma dielusi melalui kolom

DEAE-sellulose diperoleh tripanosoma sebanyak :

257 X 185 X 104 = 4,75 X 108 .

Tripanosoma yang diperoleh ini ternyata lebih sedikit

bila dibandingkan dengan jumlah sebelum dielusi, hal

ini mungkin disebabkan karena DEAE-sellulose dalam

kolom kr~natografi terlalu padat sehingga tripanosoma

sulit untuk turun atau dapat pula mengalami kematian.

Hasil elektroforesis dengan gel poliakrilamid,

setelah dicat dengan Coomassie

band/pita pada gel tersebut. Volume sampel 20/Jl dija­

.lankan bersama dengan protein standar yang terdiri dari

campuran berbagai protein yang telah diketahui berat

molekulnya. Setelah dibandingkan antara band sampel

dengan band dari standar, maka dapat diketahui bahwa

band dari sampel terletak diantara band ke 3 dan ke 4

dari standar, berarti bahwa glikoprotein yang didapat

l.7

kan m8mpunyai berat molekul P•::11:l ;,,,

penelitian-penelitian yang telah dilakukan tarhad~p T.

bii:lhwa

dinding permukaan sel tripanosoma tersusun atas suatu

lapisan protein yang sangat kompak dan homogen, serta

k ar-tmh i dr r..'lt. ~~ec:luanya tf:-:nnas~uk kompont':)n

membran antigen. Antigen permukaan yano

p1:nyu~~un

br::-1'· -f uno !:?• :i

ini tersusun homogen oleh 1 macam

( 1904) '

protf~i n y.:miJ ter· dc.'lpat p ad.:.:1 mt:!mb1··· an rl 1 a~~ma dan mE~mbr· rM'l

SE~l ul (~r· sang at. k ar .:~kt e1 .. i ~~t. i k ba :i k ~:; t , ... u k t t~r· , f ur ... qsi d ;:u-.

sintesanya. Protein ini walau berasal dari berbagai

sumber, namun mempunyai si-fat umum yang mirip. Prot.ed. n

yaitu l::it?l'" i kat an dengan

karbohidrat. Karbohidrat pembentuk glikoprotein membran

dapat berupa oligosakarida atau polisakarida

ber-fungsi sebagai antene seluler dan merupakan kontak

penghubung antara sel dengan dunia luas

198~5). Pada penelitian ini belum diketahui

me·mbr·.::tn tripanosoma telah dapat dianalisa

lS

KESIMPULAN DAN SARAN

Dari hasil p£melitie:.u1 ini d;::~pat disimpuU<i:H1 bahvJi:."\

glikoprotein yang diperoleh mempunyai berat molekul +

62 k D.:.1lton. Elf?ktr·ofm·i~:ds fJt::!l plat:H pnli;::~k•··il.:.~mid 10/.

t.el'"had.:.ip samp.:d gl i kop•··ottd n metllbr·.::m T. ev.:,m~:;i d""'"<;F~n

pengecatan coomassie blue, menunjukkan gambaran pita

protein yang cukup jelas. Gambar 4 memperlihatkan bahwa

pita protein sampel terletak di antara pita protein

standar yang ke-3 dan ke-4. Dari sini dapat disimpulkan

bahwa glikoprotein yang diperoleh dari membran T.

~m:;i mempunyai bel~c:\t mc1l ekul :~:. 62000 Dalton.

Untuk mengetahui macam glikoprotein dan berbagai

senyawa penyusun membran permukaan tripanosoma perlu

penelitian lebih lanjut. Hal ini mengingat bahwa pene­

litian masih jarang sementara protozoa tersebut sangat

merugikan. Dengan diketahuinya seluk bRluk tripanosoma

mudah-mudahan dengan cepat dapat memberantas penyakit

yang disebarkannya.

19

DAFTAR PUSTA~~A

1. Arth.-ama, W.T., 1(.?89. Chara~(tf.?riHit:~rung Immundominanter· Epitope von drei Vari.:~n:z glykor:wot£2inen aus T.r::.Y!lB nm;oJn~i r.onnalen~fl mii: Hi.l·fl? monoklonah~r Antilwnj

r 1' l 1 N 14~~ ~ " ~~I"' • rln.r:._!..tL.L !.-.. .. PU.t:.D..i.L .. :: •.• !:.• .... t • -~' , ...,. •

2. C.;.\mer·on T. M. ' 1951. II1.~. E.~r~ .. ~ .. aJ: .. tt~~.kL v.£. !2n!!!ll.J!i!":.J..r:. enJl~.0t.·, A 1'1.:.H1Ui:."-d ·f m· Veb:?r· i n;.n· y t:ih.~~:hm I:!:; iM"Id Elu•···~Jf.?Dn s>, 2r•< , J.B., Lippincott Company, East Wa5hington Square Phi 1 adt:::l phi a pp. 23 - :~::1.

3. Cross G.A.M., 1984. Structure of The Variant Glycopro tei ns and Surf ace Coat: of Tr:.YrlanoQtJma Brt.ICf.?.j.

E·t· . 1 T ,. . . C" R s . .. L .. ., -=\(1'7 -:· -- 1 ''} ... ..!.!..-. .!... •• .L.E!.l.:i.!..!!.. -.!- !::.. Q.L .. ~.. ..:::.0-.D.L • ·-· - • ... ~ ..: .. •

4. Darnf:? ,J., H. LtJdish and D. Bal·titno•··t:::, 1986. 1.1 . .!21§.{.;_\-..!.lf:~.r.::. Ct:?.Ll. B i o 1 og_x:_. Sc: i en t i f i c t~rnt:.~r- i c •m Books , Inc • Nt:?li'J Yod(.

5. Lehn i nt;;}er A. L. , 1970. ~.! .. 9.fJ.:!.Q.f.!.!.i.~!.:tf:.Y .. : ... IJF'-" M.c•l.§:.SIJ.!.ill: t~§.\.E.t.S. 9..i G~ll. f]t[l.tc_.:\;.!J!:..@. !a!J.Q. "fJJ.m~:t.J ... rlLL· TtH? ,Johns; Hopkin~; Univerty Sc:ool of Medicine. Worth Publisher, Inc. p. 2:36.

6. Reinwald E., 1985. Role of Carbohydrate Within Variant Sur·f ace Gl yc:opl~ott:?i n o·f Tr·yf!.@.D.9!30ITI~'I Cor!._Qol £'?nsf.?..

L~:!r:...!!.. !I . .l!- t!.i .. 9.sb.§:.!.!.t • 1 ~:; 1 • :::.' El ~:'; -· :::.~ ct 1 •

7. RessantJ A.A. , ~-'-' ~lli f.:gl..§j..e.r.:..~l[L f.:.f.:iJ:,g.J..nnA. l.~t!.U.~~!:-.!..2. ~_g_.t.f~T :l!J .. fJJ:.• D.:1par·temen l..lr·t.tsc:m f~E!~":.r::·:•.::u··ch .. ··I\1;;,\Eii on.:d f\£;:-publ i k Indonesia. Bogor. 401 - 415.

8. Richards F.F., 1984. The Surface of The African Trypa nosom!s. J .. :.. !::r.u:t.9.l; .. Q.Q.L· :~; 1 ( :L > • 60 -·· 64.

9. Savage A., R. Geyer, S. Stirm, E. Reinwald and H.J. Risse~ 1984. Struktural Studies of The Mayor Oligosac:harides in A Variant Surface Glycoprotein 0 ·f T r· y p c::\ n 0 f:2.0 Ill i"'~ G.!2!J.99.l E~n !'?-Q • 1.'.'!9 .. L~-- .Q .. Lf!f,;J.:t.!?..!.!!.!•... e.i:I!.C.S!.J?. .. L i£1· 11. 309 - 328.

10. Stryer L. , .t 988. !Itn!~~.!:te.m.J ... atct...• :::;r·d. St.:.::u-,fon:j Uni v+:.1nsi ty W.H. Freeman and Company, New York. 44 - 48. 298 -302.

11 •. · s w i t z e r R • L. • ~ n d ~J • 1'1 • c J. c.~, .. k , 1 9 7 7 • ~~~~tii..§:.r: . ..i.I.f!.~n f!j __ Q.!.; . .t:H~.m..i.~?.. -:t!:Y· 2n · • Un j_ Vf":r s:>i t y t::of I 11 i noi !:!>, t.-J. H. Fn:~·Hman c:md Company, San Francisco. 15, 44 - 49.

12. William5>, R.Cl., ,J.R. Yc:lttng <:mel P.?). t•I.:.1.Hw.::1, l979. Genomic rearangements correlated with antigenic v .::.r·· i .::1 t i on :i n T r· y p r.:m or::.-o m ii:l b , ... u c f."! i . N.f::l.:t.J.,!.C~~-. 2 El2 • El4 7 ·- B49.

20

L A M P I R A N

B~han 1

DEAE-sellulose

Gephadex a50

Bovine serum albumin

Tripsin inhibitor

Sodium Clarida

Sodium monophosphate

Sodium diphosphate

Agarose

Glisin

Gliserin

Glukosa

Sodium asetat

Tris <hidroxymethyl> aminomethan GR

Heparin

Ammonium asetat

Sodium EDTA

Acrylamide

Bis acrylamide <N 1N1-methylen diacrylamide)

Temed <N 1N1N1N1-Tetramethylethyllendiamin>

2-Merkaptoetanol

Ammoniumpersulphate

Coomassie brilliantblue

Sodium dod~gil sulph~t~

Sodium hidroksida

Ammonium Clorida

21

------------

Trichloro acetic acid

1'1t?t 11 .:m o 1

Ethanol

Cllpr i Ch 1 tJr ida

Kalium permanganat

Form.:.-~1 dehi de

Argentum ni trat.

Nattp i urn k<arbona't.

Etht?r·

f.)quc:\d£-?st

Aquab i def~t

Trypanosoma dari darah kerbau

l'lf.:mc it

Ti ku~:;

Ker·i:as timbani;J

Ti s~:.ue

Alat :

pH meter

Timbangan mikrc analitik

Magnetic stirrer

Refrigerated Centrifuge

Spektrophotometer

Mikroskop

Kolom khromatography

Fraction collector

Kemper listrik

Perangkat elektroforesis

Shakker

Vortex

Eppendorf tube

Counting chamber

Gunting

Spuit

Labu vacuum

Gelas ukur

Pipet ukur

Pipet tetes

Beker gelas

Tabung reaksi

Gelas pengacluk

Pinset

Sendok

Pipet mikro

Klem

CARA KERJA

1. Pembiakan tripancsoma

Darah diambil dari kerbau yan~ menderita

- tripanosomiasis, kemudian dihitung jumlah

tripanosomanya.

Mencit (20 - 25 g) disuntik dengan darah

tripanosoma tersebut (3 X 107 tripanosoma/

tikus), secara intraperitoneal.

- Jumlah tripanosoma dalam darah mencit diikuti,

untuk mengetahui fluktuasi/ puncak parasitemia-

nya.

+ 72 jam terjadi parasitemia, mencit dieutana

si dan darah yang mengandung tripanosoma

diambil, kemudian dihitung volume darah dan

kandungan tripanosomanya.

- Tikus (240 - 280 g) disuntik dengan

tripanosoma darah diatas sebanyak 3 X 108

tripanosoma/ekor.

Setelah 72 jam tripanosoma dipanen.

b. Pada stabilat <stock)

- Larutan 10% gliserin dalam 1% BSA <Bovine

Serum Albumin) dilarutkan dalam PSG <Phosphate

Saline Glucose) pH 8,0.

- 1,5 ml darah ditambah 1,5 ml larutan di atas

kemudian dicampur.

-Setiap 0,5 ml dimasukkan ke eppendorf,

menit.

a. Kolom kromatografi DEAE-sellulo&e

- 25 g DEAE-aellulose dilarutkan dalam 300 ml bu-

fer PS <Phosphat Saline) pH 8,0.

DEAE kemudian dicuci dengan larutan PS 2

l(al i sambi 1 di ac:luk ~H?l an clan di sar·i ng Yi:\cu,n.

- DEAE-sellulose dilarutkan kembali dengan 300 ml

buf£:?r PS, kemudi c-m c:l i l.t kur·· T-nya d£;:·n<;ran

menggunakan rumus T=fxL. T adalah waktu/menit, f

adalah faktor = 2,8 clan L adalah tinggi larutan

clal.:.1m c:m.

- Larutan tersebut climasukkan ke c:lalam kclom, dan

dibiarkan satu malam agar DEAE-sellulose memadat

- kolom dielusi dengan bufer pH 8,0 dan kolom siap

dipakai untuk isolasi tripanosoma.

b. Kolom kromatografi sephadex G50

- 20 g sephadex G.0 dilarutkan dalam bufer ""J ..

ammonium asetat, dicuci beberapa kali dengan

bufer tersebut agar kotoran hilang dan

diusahakan tidak ada udar denoar1 .·1·~.1,~.r·1 ffi0fliJ~c·ILt~ ::1 .. , ., k ~ c~ . r~

per· I ah.:m.

- Larutan sephadex c:limasukkan ke dalam kolom

Cpanjang 1 meter, diameter 1,8 em> sec:ara hati-

hati Hup.aya tidak .:~d.;,, ud.::\r··.:~ y.::'\ng masuk.

Kolom clib:ir.H·I:.::m ~ nh:tl.:.~m, la;:mud:ian dielusi dl?rlfJi.Hl

t11.rf t:r •

- Fraksionasi/orientasi penentuan tetesan atau

volume airan yang keluar tiap menitnya.

Larutan protein standar yang terdiri atas 1 mg

trlpbin inhibitor yang dilarutkan dalam 1 ml

akuades dan 5 mg BSA yang dilarutkan dala~ 5 ml

akuades, masing-masing diambil seb~nyak 0,5 ml

kamudian dicampur.

- Larutan di atas dilewatkan kolom untuk menentu­

kan peak Cpuncak) ·konsentrasi larutan dengan

menggunakan fraction collector.

OD-nya dilihat dengan spektrofotometer dengan

panjang gelombang 280 nm.

3. Isolasi tripanosoma

- Tikus dibius menggunakan eter, kemudian dieutan

asi. Darah yang mengandung tripanosoma ini

diambil, dengan menggunakan heparin sebagai

antikoagulan.

- Darah disaring dengan menggunakan kain kasa

untuk menghilangkan jar:ingan dan kotoran lain

yang ikut di dalamnya dan diukur volumenya.

Banyaknya tripanosoma dalam darah dihitung.

- Darah tripanosoma dilewatkan kolom DEAE-sel~lose

khromatography yang telah disiapkan dan dielusi

dengan bufer BSA 1% dalem PSG, maka tripanosoma

50~1 larutan ~embran tripanosoma ditambah

deng~n 150 ml bufer sampel yang mengandung

b. Pambuatan gel poliakrilamid

- Seperangkat alat dibersihkan dengan aseton.

- Plat kaca yang telah dibersihkan dirakit, diusa-

agar pada tiap-tiap sisi.

- 16 ml larutan campuran gel akrilamid. 10% dengan

temed, lalu dicampur perlahan-lahan.

- Dengan pipet pasteur campuran dimasukkan ke

dalam plat dan jangan sampai terbentuk udara,

hingga tinggi gel mencapai 1,5 em dari tepi atas

permukaan kac::ii:\.

- Gel ditutup dengan n-butanol agar permukaannya

'rata dan tidak ada udara di dalamnya.

-_Dibiarkan 1 malam agar terjadi polimerisasi.

- 5 ml larutan untuk stacking gel ditambah "") ·=­. .: .. , ,_,

temed dan 25fl ammonium persulfat 10%, diaduk

pew 1 c.'than·-1 ahan.

- n~butanol yang terdapat pada plate gel yang

sudah didiamkan 1 malam dibuang dan dibilas

- L~rut~n Gtackino ~al dituangkan pada

tersebut dengan menggunakan pipet pasteur secara

hati-hati agar tidak terbentuk udara.

2El

- Sisir pembentuk aumur dipasang untuk aplika&i

sampel.

- dibiarkan hingga terjadi polimerisasi.

c. Aplik3si sampel dan menjalankan elektroforesis

- Tangki elektroforesis diisi dengan bufer

elektroda.

- Plat yang berisi gel dipasang pada tangki

elektroforesis tersebut.

- Sisir pada plate dibuka.

- Sampel dimasukkan pada masing-masing sumur

beserta protein standar.

- Elektroda dihubungkan dengan power suplai dan

disambungkan kelistrik.

~ Ditunggu sampai sampel dan protein standar

mencapai jarak yang ditentukan.

- Setelah aliran listrik diputus, plat diambil

dan gel dikeluarkan, difiksasi dengan TCA 10%

dan dibiarkan 1 malam.

- Pengecatan dilakukan dengan menggunakan coo

massie blue.

29

1 'l~) mM NaCI •

10 mM Na Phosphate.

2. Buffer Phosphat Saline Glukosa <PSG> pH_.s,o.

~i5 mM Glukosc:~.

44 mM NaCl.

60 mM Na Phosphate.

3. Buffer phosphat Saline <PS> pH 8,0.

44 mN N,,,cl •

60 mN Na Phosphate.

4. Buffer elektroda pH 8,3.

25 ml"1 Tri s.

10/. SDB.

5. Buffer Tris-Cl pH 8,8 dan pH 6,8.

1,5 M Tris, tambahkan HCl tetes demi tetes hingga pH

1 g Ccomassie Briliant Blue R. 250 dalam 1 1

1. GE?l :L 0'1..

·- ?~A 1 '2 g.

- Bis AA o ,o::52 9 •

·- 1 9 ~J Trio ~5 ml (pH t:l~t:l).

·- 10/. EIDS 0, 1.2 ml •

-· H·.,D .L.

B,H rnl.

2. Stacking 9!!!.

- AA 0 7 9 IJ.

- D:i.s AI\ <)' (1.24 ~·

- 1 '::; Tris ,..,. ''')t::'

""" ' .1.-;.) ml <pH t,, B > •

-· 1(11. SDS 0,3 ml.

- H2o 27' 18 ml.

·- 2 mg/ml Phosphoryl a~;e (91.-J. (l(l(l).

- 1 mg/ml Ccm albumin (76.000).

- 1 mr.J I ml BSA ( 6~3. (l(l(l) •

- 1 mg/ml Katal c:\se < 1.:,0. 000 > •

- 1 mg/ml 1:::1;;J1].:.1l bumi n ( 4~). (H)(l) •

- 1 mg/ml Cal'" bonr.:tnhydr· c\1~51? ( ~~c; • (l(l(l) •

- 1 mo/ml 1'1yoglobin ( 1 7. 000) •

- 1 mg/ml Cytokh1··om c ( 12. (l(l(l) •

- 4,17 ml 1,5 Tris-HCl pH 6,8

- 2 1J BDS.

- 5 mg Bromphenol blue.

- 5 ml Mercaptoethanol.

. Gambar III. Bentuk Standardisasi dari BSA 1% dan Tripsin

Inhibitor 1 %. ·

2 t ) 4

Gambar V. Gambaran hasil. elektroforesis sampel glikoprotein membran permukaan trip~nosoma, pengecatan coomassie b 1 UE!.

S.fl.t.• : 1. ProtE•in E"lt<~ndt.11'" 2, :::.:;, 4. 5:-i:ilffiPE:'l qlikopr·otein. m£;:mbl··an tr· i panosom.:Z~.