STUDI PENGARUH PENAMBAHAN SORBITOL TERHADAP STABILITASENZIM SELULASE DARI Rhizopus oryzae

(Skripsi)

Oleh

JURUSAN KIMIAFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS LAMPUNG2017

Diani Iska Miranti

ABSTRACTSTUDY THE EFFECT OF ADDITION SORBITOL TOWARD STABILITY

OF CELLULASE ENZYME FROM Rhizopus oryzae

By

Diani Iska Miranti

This research aims to study the effect of addition sorbitol toward stability celluloseenzyme from Rhizopus oryzae. To approach this aims, the enzyme has been doneto produce, to isolate and to purify. The purification of cellulose enzyme wasdone by fractination using the ammonium sulfat and dialysis. The purified enzymewas mixed by sorbitol. Determination of the cellulose enzyme activity performedby the method of Mandels, while the measurement of protein concentrationperformed by the method of Lowry.

The results showed that the purified enzyme has specific activity 9.18 U/mg,increased 4.03 times than the native enzyme. The test of thermal stability of theenzyme at temperature 50°C for 60 minutes has ki = 0.02 min-1; t1/2 = 34.65 minand ΔGi = 99.7 kJ mol-1. The test of thermal stability of the enzyme mixed bysorbitol 0.5; 1.0; and 1.5 M at temperature 50°C for 60 minutes each has t1/2 = 49.5min, ki = 0.014 min-1 and ΔGi = 100. kJ mol-1;t1/2= 24.75 min, ki = 0.028 min-1 and ΔGi = 101.8 kJ mol-1; t1/2 = 22.35 min,ki = 0.031 min-1 and ΔGi = 100.8 kJ mol-1.

The results showed that the purified enzyme has Km and Vmax values74.02 mg/mL substrate and 6.57 μmol/mL.min, and the enzyme mixed by sorbitol0.5; 1.0; and 1.5 M each has 24.89 mg/mL substrate and 0.92 μmol/mL.min;18.39 mg/mL substrate and 0.82 μmol/mL.min; 14.83 mg/mL substrate and 0.42μmol/mL.min.

Although the optimum of pH and temperature of the mixed enzyme by sorbitol didnot changed, at pH 7 and at temperature 60oC but the thermal stability ofmodified enzyme was increased and showed by the decrease in the value of kiin accordance with the increase half life and ΔGi.

Key word: Cellulase enzyme, sorbitol, Rhizopus oryzae

ABSTRAK

STUDI PENGARUH PENAMBAHAN SORBITOL TERHADAPSTABILITAS ENZIM SELULASE DARI Rhizopus oryzae

Oleh

Diani Iska Miranti

Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari pengaruh penambahan sorbitol terhadapstabilitas enzim selulase dari Rhizopus oryzae. Untuk mencapai tujuan tersebutdilakukan produksi, isolasi, dan pemurnian enzim. Pemurnian enzim selulase dilakukandengan menggunakan fraksinasi dengan ammonium sulfat dan dialisis. Enzim hasilpemurnian kemudian ditambahkan sorbitol dengan konsentrasi 0,5 M; 1,0 M; dan 1,5 M.Penentuan aktivitas enzim selulase dilakukan dengan metode Mandels sedangkanpengukuran kadar protein dilakukan dengan metode Lowry.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa enzim hasil pemurnian memiliki aktivitas spesifiksebesar 9,18 U/mg, meningkat 4,03 kali dibandingkan ekstrak kasar enzim. Uji stabilitastermal enzim hasil pemurnian pada suhu 50oC selama 60 menit memiliki ki = 0,02 menit-1

;t1/2 = 34,65 menit; dan ∆Gi = 99,7 kJmol-1. Uji stabilitas termal enzim setelahpenambahan sorbitol 0,5; 1,0; dan 1,5 M pada suhu 50oC selama 60 menit memilikiberturut-turut t1/2 = 49,5 menit, ki = 0,014 menit-1 dan ∆Gi = 100 kJmol-1; t1/2 = 24,75menit, ki = 0,028 menit-1 dan ∆Gi = 101,8 kJmol-1; t1/2 = 22,35 menit, ki = 0,031 menit-1

dan ∆Gi = 100,8 kJmol-1.

Enzim hasil pemurnian memiliki nilai Km dan Vmaks berturut-turut sebesar 74,02mg/mL substrat dan 6,57 μmol/mL.menit, sedangkan enzim setelah peambahan sorbitol0,5; 1,0; dan 1,5 M memiliki nilai Km dan Vmaks berturut-turut sebesar 24,89 mg/mLsubstrat dan 0,92 μmol/mL.menit; 18,39 mg/mL substrat dan 0,82 μmol/mL.menit;14,83 mg/mL substrat dan 0,42 μmol/mL.menit.

Walaupun suhu optimum dan pH optimum enzim setelah penambahan sorbitol tidakmengalami perubahan, yakni tetap pada pH 7 dan suhu 60oC tetapi terjadi peningkatanstabilitas termal karena adanya penurunan nilai ki serta peningkatan waktu paruh dan∆Gi.

Kata Kunci: Enzim selulase, sorbitol, Rhizopus oryzae.

STUDI PENGARUH PENAMBAHAN SORBITOL TERHADAP STABILITASENZIM SELULASE DARI Rhizopus oryzae

Oleh

Diani Iska Miranti

Skripsi

Sebagai salah satu syarat untuk mencapai gelar Sarjana Sains

Pada

Jurusan Kimia

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS LAMPUNG

BANDAR LAMPUNG

2017

Penulis dilahirkan di Sukabumi pada tanggal 30

Desember 1994, sebagai bungsu dari dua bersudara

putri dari Bapak Ujang Juhaeni dan Ibu Sumiyati.

Jenjang pendidikan diawali dengan SDN 1 Cikembar

yang dimulai pada tahun 2000 hingga tahun 2006.

Setelahnya, penulis melanjutkan ke jenjang SMPN 1

Cikembar yang diawali tahun 2007 hingga tahun 2009.

Pada tahun 2009, pendidikan dilanjutkan ke SMAN 1

Cibadak dari tahun 2010 hingga tahun 2012. Pada tahun yang sama, penulis diterima

sebagai Mahasiswa Jurusn Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

di Universitas Lampung.

Pada tahun 2015, penulis telah melaksanakan Kuliah Kerja Nyata (KKN) di Desa

Bujung Dewa Kabupaten Tulang Bawang Barat dan pada tahun 2015 penulis telah

melaksanakan Praktik Kerja Lapngan (PKL) di Laboratorium Biokimia Jurusan

Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung.

Selama menjadi mahasiswa, penulis pernah menjadi asisten praktikum Biokimia

untuk Jurusan Biologi tahun ajaran 2015-2016.

Dalam bidang organisasi, Penulis terdaftar sebagai Kader Muda Himpunan

Mahasiswa Kimia (KAMI) Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam periode

2012-2013, sebagai sekretaris Biro penerbitan Himpunan Mahasiswa Kimia

(HIMAKI) periode 2014-2015.

MOTTO

LAKUKAN, JALANI, TANGGUNG JAWAB

KERJA IKHLAS, KERAS, TUNTAS, DAN CERDAS

Kamu sungguh-sungguh akan diuji terhadap hartamu dan dirimu. Dan (juga) kamu benar-benar akanmendengar dari orang-orang yang diberi al-Kitab sebelum kamu dan dari orang-orang yang

mempersekutukan Allah, gangguan yang banyak yang menyakitkan hati. Jika kamu bersabar danbertakwa, maka sesungguhnya yang demikian itu termasuk urusan yang patut diutamakan [Âli

‘Imrân/3 : 186]

Karya Tulis ini sebagai sebuah persembahan yang juga sebagaisuatu pembuktian untukmu

Ayahanda

UJANG JUHAENI

“Pah, neng bisa mewujudkan mimpi yang dulunya dianggap tak mungkin”

SANWACANA

Segala puji hanya milik Allah SWT yang telah memberikan begitu banyak nikmat,

sehingga penulis dapat menyelesaikan penyusunan skripsi dengan judul ”Studi

Pengaruh Penambahan Sorbitol Terhadap Stabilitas Enzim Selulase dari

Rhizopus oryzae” sebagai syarat untuk mencapai gelar Sarjana Sains pada Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Lampung.

Dalam pelaksanaan dan penulisan skripsi ini tidak lepas dari kesulitan dan rintangan.

Namun, dengan kehendak Allah SWT maka skripsi ini terselesaikan. Penulis

menyadari sepenuhnya bahwa terselesaikannya penyusunan skripsi ini tidak

terlepas dari bantuan berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis mengucapkan terima

kasih kepada:

1. Bapak Dr. Ir. Yandri AS M.S., selaku pembimbing utama yang telah banyak

memberikan ilmu pengetahuan, bimbingan, gagasan, bantuan, dukungan,

semangat, kritik dan saran kepada penulis dalam proses perencanaan dan

pelaksanaan penelitian serta dalam penulisan skripsi ini.

2. Ibu Prof. Dr. Tati Suhartati, M.S selaku pembimbing kedua yang telah

memberikan kritik, saran dan arahan kepada penulis sehingga skripsi ini

terselesaikan dengan baik.

3. Ibu Nurhasanah M.Si selaku pembahas yang telah memberikan semangat, kritik,

saran dan bimbingan kepada penulis sehingga skripsi ini terselesaikan dengan

baik.

4. Bapak Andi Setiawan Ph.D., selaku Pembimbing Akademik atas kesediaannya

untuk memberikan bimbingan, bantuan, nasehat dan informasi yang bermanfaat

kepada penulis.

5. Prof. Sutopo Hadi, selaku dekan FMIPA Universitas Lampung yang telah

memberikan bantuan kepada penulis dalam menyelesaikan skripsi ini.

6. Dr. Eng. Suripto Dwi Yuwono, M. T., selaku Ketua Jurusan Kimia FMIPA

Universitas Lampung yang telah memberikan bantuan kepada penulis dalam

menyelesaikan skripsi ini.

7. Seluruh dosen FMIPA Unila yang telah mendidik dan memberikan ilmu

pengetahuan yang sangat berguna kepada penulis selama kuliah.

8. Papa Ujang Juhaeni dan Mama Sumiyati tercinta yang telah memberikan

kasih sayang, do’a, dukungan, semangat dan motivasi serta menantikan

keberhasilanku.

9. Ibu Erni dan Ayah Sudarinto yang senantiasa mengawal semangat dan kerja

keras penulis dan menyelesaikan pendidikan ini.

10. Yandri’s Research Group Fifi, Thira, Anay, Mia, Maya, Abang Atun, Fika, Mba

Putri Julita Jahara, bu Arum, mba Surtini S. Si. Terimakasih atas kerjasama,

motivasi dan keceriaannya.

11. Kesayangan-kesayangan yang tak henti menyemangatiku, memberikan saran

serta membagi bahagia dan kesedihannya selama 4 tahun ini yaitu “Cupu Squad”

Meta Fosfi Berliyana S. Si dan Wiwin Esti Sarwita S. Si.

12. Teman-teman seperjuangan angkatan 2012, terimakasih atas kebersamaannya

dalam menuntut ilmu menggapai impian juga canda-tawa-bahagia yang selalu

kita hadirkan. Biokimgroup’s: Ayu Imani, Rijal.

Organikgroup’s: Radius. Fisikgroup’s: Ruliana Juni Anita S. Si Analitikgroup’s:

Febita, Kardus, Ubay, dan Debi.

13. Keluarga Besar Bimbingan Belajar Sony Sugema dan Smart Global Education

Om Rizky, Nadiyah, Mba Lily, Kak Lia, Mba Widi, Upin, Miss Syifa dan Miss

Novi yang selalu memberikan semangat pantang menyerah.

14. Teman-teman KKN kelurahan Pagar Alam Tulang Bawang Barat. Terimakasih

sudah menjadi pendatang yang sangat berkesan. Semoga persaudaraan ini tetap

terjaga.

15. Kakak dan adik tingkat penulis : 2005, 2006, 2007, 2008, 2009, 2010, 2012,

2013, 2014, dan 2015, 2016.

16. Yang terselalu ada Yunizar Bagus Dewanto S. Pi.

17. Teman-teman Komunitas Jendela Macipam, Rengga, Mba Septi, Kak Opik, Mba

Ayu yang selalu sedia candaan saat terpuruk dan merasa hilang semangat.

Semoga segala bentuk bantuan dan dukungan yang diberikan mendapat balasan

pahala dari Allah SWT dan semoga skripsi ini bermanfaat.

Bandar Lampung, Desember 2017

Penulis,

Diani Iska Miranti

DAFTAR ISI

DAFTAR TABEL……………………………………………………... vi

DAFTAR GAMBAR…………………………………………………... vii

DAFTAR LAMPIRAN………………………………………………… viii

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang…………………………………………… 1

B. Tujuan……………………………………………………. 3

C. Manfaat Penelitian………………………………………... 3

II. TINJAUAN PUSTAKA

A. Enzim………………………………………………………….. 4

1. Struktur Enzim………………………………………… 42. Fungsi Enzim………………………………………….. 73. Faktor yang Mempengaruhi Aktivitas Enzim………… 8

a. Substansi Protein dalam Enzim………………... 8b. Kondisi Lingkungan Optimal………………….. 9c. Inhibitor………………………………………… 11

B. Enzim Selulase………………………………………………….12

C. Rhizopus oryzae……………………………………………… 16

D. Inokulasi……………………………………………………….. 18

E. Isolasi…………………………………………………………... 22

F. Sorbitol………………………………………………………….22

G. Uji Aktivitas…………………………………………………… 23

iv

III. METODE PENELITIAN…………………………………... 25

A. Waktu dan Tempat…………………………………………….. 25

B. Alat dan Bahan………………………………………………… 25

C. Prosedur Penelitian…………………………………………….. 26

1. Penentuan kondisi optimum Rhizopus oryzae untuk

memperoleh enzim selulase………………………...……. 26

2. Produksi dan isolasi enzim selulase……………………… 27

3. Pemurnian enzim selulase…………………………...……. 27

4. Uji aktivitas enzim selulase………………………………. 27

5. Penentuan kadar protein enzim selulase…………………. 28

6. Penambahan sorbitol……………………………………… 29

7. Karakterisasi enzim selulase……………………………… 29

a. Penentuan pH dan suhu optimum……………………. 30b. Penentuan data kinetika enzim………………………. 30c. Uji stabilitas enzim…………………………………. 30d. Penentuan waktu paruh, konstanta laju inaktivasi dan

perubahan energi akibat denaturasi…………………… 31

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN……………………………… 33

A. Penentuan Waktu dan pH Optimum Produksi Enzim Selulase 33

B. Pemurnian Enzim Selulase…………………………………... 35

C. Karakterisasi Enzim Selulase………………………………… 40

1. Penentuan pH optimum enzim selulase sebelum dansetelah penambahan sorbitol 0,5 M; 1,0 M dan 1,5 M…… 40

2. Penentuan suhu optimum enzim selulase sebelum dansetelah penambahan sorbitol 0,5 M; 1,0 M dan 1,5 M…… 42

3. Penentuan km dan vmaks enzim selulase sebelum dansetelah penambahan sorbitol 0,5 M; 1,0 M dan 1,5 M…… 43

D. Uji Stabilitas Termal Enzim Selulase Sebelum dan SetelahPenambahan Sorbitol 0,5 M; 1,0 M dan 1,5 M……………… 451. Penentuan konstanta laju inaktivasi, waktu paruh dan

perubahan energi akibat denaturasi……………………… 47

V. SIMPULAN DAN SARAN………………………………… 49

DAFTAR PUSTAKA……………………………………................ 51

DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

1. Pemurnian enzim selulase dari Rhizopus oryzae……………………….. 39

2. Penentuan data ki (konstanta laju inaktivasi termal) enzim selulase tanpasorbitol pada suhu 50oC………………………………………………… 47

DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

1. Grafik hubungan antara laju reaksi dan energi bebas............ 5

2. Situs aktif enzim…………………........................................ 6

3. Enzim mengikat substrat sebagai katalis............................... 7

4. Struktur nonprotein enzim..................................................... 9

5. Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim................................ 10

6. Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim................................... 11

7. Penghambatan enzim oleh inhibitor........................................ 12

8. Sporangium Rhizopus oryzae................................................. 17

9. Struktur Sorbitol……….….................................................... 23

10. Diagram alir………..…...…………………………………… 32

11. Kurva hubungan antara waktu, pH, dan aktivitas unit.…...... 34

12. Kurva hubungan waktu, pH, dan kadar protein……………… 35

13. Aktivitas unit enzim hasil fraksinasi pada beberapa pola 0-100% 36

14. Kadar protein enzim hasil fraksinasi pada beberapa pola 0-100% 37

15. Aktivitas unit enzim hasil fraksinasi pola 0-10% dan 10-95%… 37

16. Kadar protein enzim hasil fraksinasi pola 0-10% dan 10-95%…. 38

17. Perbandingan aktivitas unit setiap pemurnian……………………. 39

viii

18. Karakterisasi pH sebelum dan setelah penambahan sorbitol………… 40

19. Karakterisasi suhu sebelum dan setelah penambahan sorbitol………. 42

20. Karakterisasi Km dan Vmaks sebelum dan setelah penambahan sorbitol.. 44

21. Grafik hubungan aktivitas sisa tanpa sorbitol dan setelah penambahansorbitol 0,5; 1,0; dan 1,5 M terhadap waktu………………………….. 46

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran Halaman

1. Hubungan antara aktivitas unit enzim selulase pada variasi pH awalmedia fermentasi dan waktu inkubasi……………………………….. 56

2. Hubungan antara aktivitas unit enzim selulase sebelum dansesudah pemurnian ………………………………………………….. 57

3. Hubungan antara pH, suhu dengan aktivitas enzim selulasetanpa sorbitol……………………………………………………….. 58

4. Hubungan antara pH dengan aktivitas sisa (%) enzim selulasesebelum dan setelah penambahan sorbitol 0,5 M; 1,0 M; dan 1,5M... 59

5. Hubungan antara suhu dengan aktivitas sisa (%) enzim selulasesebelum dan setelah penambahan sorbitol 0,5 M; 1,0 M; dan 1,5 M..... 60

6. Data untuk penentuan Km, Vmaks enzim selulase sebelum penambahansorbitol 0,5 M; 1,0 M; dan 1,5 M………………………………………. 61

7. Data untuk penentuan Km, Vmaks enzim selulase setelah penambahansorbitol 0,5 M; 1,0 M; dan 1,5 M berdasarkan persamaan LineweaverBurk…………….................................................................................. 62

8. Hubungan antara Aktivitas unit enzim selulase tanpa sorbitol danSetelah penambahan sorbitol 0,5 M; 1,0 M dan 1,5 M selamainaktivasi termal pada suhu 50oC……………………………………… 63

9. Penentuan ki (konstanta laju inaktivasi termal) enzim selulase setelahpenambahan sorbitol 0,5 M; 1,0 M dan 1,5 M selama inaktivasitermal pada suhu 50oC…………………………………………… 65

10. Data penentuan ki (konstanta laju inaktivasi termal) enzimSelulase tanpa sorbitol pada suhu 50oC………………………… 64

11. Perhitungan ΔGi enzim selulase hasil pemurnian……………….. 66

ix

12. Perhitungan ΔGi enzim selulase dengan penambahan sorbitol 0,5 M…….. 67

13. Perhitungan ΔGi enzim selulase dengan penambahan sorbitol 1,0 M…….. 68

14. Perhitungan ΔGi enzim selulase dengan penambahan sorbitol 1,5 M……… 69

15. Kurva Standar Glukosa………………………………………………… ….. 70

16. Kurva Standar BSA………………………………………………………… 71

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Fungsi enzim dalam mempercepat reaksi memberikan manfaat dalam bidang

industri karena menghemat waktu dan biaya. Enzim merupakan unit protein

fungsional yang berperan mengkatalisis reaksi-reaksi dalam metabolisme sel dan

reaksi-reaksi lain dalam tubuh. Spesifikasi enzim terhadap substratnya sangat

tinggi dalam mempercepat reaksi kimia tanpa produk samping (Beguin, 1994).

Salah satu enzim yang banyak diaplikasikan dalam dunia industri adalah enzim

selulase yang di antaranya terdapat dalam industri pakan ternak, tekstil, air

limbah, pembuatan bir dan anggur (Zaldivar et al., 2001).

Enzim selulase mampu menguraikan selulosa dengan cara memutus ikatan β-1,4-

glikosida menghasilkan oligosakarida turunan selulosa untuk diubah menjadi

glukosa. Mikroorganisme yang terlibat dalam penguraian selulosa beragam antara

lain jamur, dan bakteri. Dari penelitian yang berkesinambungan ada beberapa

jamur yang menghasilkan enzim selulase diantaranya adalah Rhizophus oryzae, R.

oligosphorus, Fusarium soloni, Aspergillus niger, A. oryzae, Penicillium sp. dan

Trichoderma sp. (Murashima et al., 2002).

2

Rhizopus oryzae merupakan jamur yang banyak digunakan dalam pembuatan

tempe, namun data menyatakan R. oryzae menghasilkan pula enzim selulase

(Coughlan, 1983). Enzim selulase umumnya diaplikasikan dalam dunia industri,

terutama dalam industri pakan ternak, tekstil, air limbah, pembuatan bir dan

anggur. Enzim yang digunakan dalam industri harus memenuhi syarat tertentu

terutama pada kondisi suhu dan pH yang ekstrim, sedangkan pada umumnya

enzim hanya bekerja pada kondisi fisiologis dan tidak pada kondisi ekstrim

(Suhartono, 1989). Syarat tersebut dapat terpenuhi dengan cara mengisolasi enzim

langsung dari organisme yang hidup dalam keadaan ekstrim (Weagen, 1984) atau

dengan teknik imobilisasi, modifikasi kimia, rekayasa molekuler dan penambahan

zat aditif. Penggunaan zat aditif lebih banyak digunakan karena relatif lebih

mudah dan biayanya relatif lebih murah (Suhartono, 1993)

Pada penelitian ini, dilakukan penambahan zat aditif yakni sorbitol untuk menguji

stabilitas enzim selulase. Pada dasarnya enzim merupakan senyawa yang tidak

stabil sehingga dilakukan penambahan sorbitol yang merupakan zat aditif dan

memiliki kemampuan untuk meningkatkan stabilitas enzim selulase dari bakteri

Bacillus Subtillis ITBCCB148 sebesar 39% dibandingkan tanpa penambahan

sorbitol (Riawati, 2012). Sorbitol mampu mempertahankan hidrasi air dan

menjaga konformasi protein agar tidak terbuka, sehingga aktivitas enzim dapat

lebih stabil pada kondisi ekstrim (Suhartono, 1989).

Oleh karena itu, pada penelitian ini dipelajari pengaruh penambahan sorbitol

terhadap stabilitas enzim selulase dari Rhizopus oryzae.

3

B. Tujuan Penelitian

Tujuan dari penelitian ini adalah:

1. Memperoleh enzim selulase dari jamur Rhizopus Oryzae dengan aktivitas

dan tingkat kemurnian yang tinggi.

2. Mempelajari pengaruh penambahan sorbitol terhadap stabilitas enzim

selulase dari Rhizopus oryzae.

C. Manfaat Penelitian

Manfaat yang dapat diperoleh melalui penelitian ini adalah:

1. Enzim selulase yang mempunyai kemurnian dan aktivitas yang tinggi,

dapat digunakan untuk konversi enzimatis selulosa menjadi glukosa secara

optimal.

2. Memberikan informasi mengenai pengaruh penambahan sorbitol terhadap

stabilitas enzim selulase dari Rhizopus oryzae..

II. TINJAUAN PUSTAKA

A. Enzim

Definisi enzim adalah protein yang menurunkan energi aktivasi (EA) suatu reaksi

kimia. Enzim mengurangi energi aktivasi melalui berbagai mekanisme. Enzim

dapat juga bertindak sebagai katalis biologis (enzim tersebut mempercepat reaksi

tanpa turut mengalami perubahan). Dengan tidak adanya enzim dalam suatu reaksi

kimia, suatu energi aktivasi tidak dapat diatasi pada suhu sel yang normal. Hal ini

akan menyebabkan reaksi kimia berjalan sangat lambat sehingga sel dapat mati

sebelum reaksi kimia menghasilkan energi dan molekul yang dibutuhkan. Setiap

sel membuat dan menghasilkan banyak jenis enzim yang masing masing

mengatalisasi reaksi yang berlainan dan sangat spesifik. Oleh karena itu, enzim

memiliki bentuk yang spesifik yang secara khusus mengikat satu set molekul

tertentu. Dalam mempelajari tentang enzim, kita perlu mengetahui tentang

substrat. Substrat adalah reaktan yang diolah pada reaksi yang dikatalisasi oleh

enzim (Ahern and Klibanov, 1987).

5

1. Struktur Enzim

Struktur enzim memiliki kesamaan dengan struktur protein. Namun, enzim

memiliki kelebihan yakni mampu menurunkan energi aktivasi sehingga dapat

mempercepat jalannya reaksi. Enzim mampu mempercepat reaksi karena

dapat menurunkan energi pengaktifan, yang penggambarannya dapat dilihat

pada Gambar 1.

Gambar 1. Grafik hubungan antara laju reaksi dan energi bebas (Deutscher, 1990)

Terdapat 4 macam struktur enzim yaitu struktur primer, sekunder, tersier dan

struktur kuartener (Montgomery, 1993) yaitu:

a. Struktur primer adalah rangkaian asam amino pada rantai

polipeptida yang menyusun enzim.

b. Struktur sekunder terbentuk dari ikatan kimia yang lemah seperti

pada ikatan hidrogen yang terbentuk di antara atom-atom di

sepanjang tulang punggung (backbone) rantai polipeptida. Struktur

sekunder enzim merupakan interaksi lokal yang menghasilkan pola

6

tiga dimensi berulang. Contoh struktur enzim sekunder adalah alfa

heliks dan lembaran berlipat-beta.

c. Struktur tersier melibatkan interaksi jarak jauh di antara rantai sisi

asam amino. Struktur enzim tersier membentuk globular protein

yang sangat akurat.

d. Struktur kuartener enzim berhubungan dengan interaksi antara dua

atau lebih subunit polipeptida yang berbeda atau sama pada sebuah

protein fungsional.

Dalam mempelajari struktur enzim, dikenal adanya situs aktif (active site).

Pengertian situs aktif adalah daerah terbatas dalam enzim yang merupakan

tempat satu atau banyak substrat berikatan dan tempat reaksi enzimatik

berlangsung. Suatu situs aktif enzim dapat berupa suatu kantung di dalam

molekul enzim yang penggambarannya dapat dilihat pada Gambar 2.

Gambar 2. Situs aktif enzim (Montgomerry, 1993)

Substrat adalah molekul organik yang berada dalam kondisi siap/segera

bereaksi, karena telah mengandung promotor. Keberadaan katalis akan

mempercepat reaksi substrat menuju molekul produk, melalui reaksi kimiawi

dengan energi aktivasi rendah yang membentuk senyawa intermediet.

Walaupun demikian, tanpa katalis, sebuah substrat akan bereaksi menuju

7

sebuah produk, segera setelah energi aktivasi reaksi kimia yang diarahkan

oleh suatu promotor tercapai (Montgomerry, 1993).

2. Fungsi Enzim

Enzim memiliki fungsi dasar yaitu menurunkan energi aktivasi sehingga

reaksi dapat berlangsung dalam suhu atau kondisi normal. Dengan kata lain

enzim berfungsi sebagai unsur katalitik atau sebagai katalisator dalam suatu

reaksi. Dalam pengikatan substrat oleh enzim dalam melakukan katalisis

sebuah reaksi dapat dilihat tahapannya pada Gambar 3.

Gambar 3. Enzim mengikat substrat sebagai katalis (Healy, 1999)

a. Substrat berikatan dengan enzim. Substrat atau banyak substrat berikatan

pada situs aktif (active site) untuk membentuk kompleks substrat-enzim.

b. Terinduksi hingga pas (induced fit). Enzim yang berikatan dengan substrat

menginduksi (mengikuti perubahan bentuk enzim) sehingga substrat lebih

pas pada tempat yang lebih sempit di bagian situs aktif (induced fit).

Induced fit dapat didefinisikan sebagai perubahan enzim yang reversibel.

c. Katalisis. Saat terjadinya katalisis dalam reaksi, substrat atau banyak

substrat berubah dengan cara yang spesifik, contoh dengan modifikasi

kimiawi, pembelahan (cleavage) atau penggabungan substrat yang berlipat

8

ganda. Pada langkah katalisis ini, terdapat dua macam jenis yaitu turnover

number (pergantian jumlah) dan bidirectional (dua arah). Pergantian jumlah

yaitu katalisis terjadi sangat cepat sehingga satu molekul enzim dapat

mengubah lebih dari 1000 molekul substrat per detik. Sedangkan dua arah

yaitu enzim yang sama mengkatalisis reaksi tertentu dalam dua arah ke

depan atau sebaliknya.

d. Langkah terakhirnya adalah produk dilepaskan. Terjadinya pelepasan

produk reaksi dari situs aktif, dan enzim tetap dalam bentuk aslinya. Enzim

selanjutnya dapat meninggalkan situs aktif dan digunakan kembali dengan

substrat yang baru (Healy, 1999).

3. Faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim

Dalam melakukan aktivitas dan fungsi enzim, terdapat beberapa faktor yang

mempengaruhinya. Secara garis besar terdapat 3 faktor utama yang

mempengaruhi aktivitas enzim yaitu substansi nonprotein, kondisi lingkungan

optimal dan inhibitor. Beberapa faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim

(Kuchel and Gregory, 2002) :

a. Substansi protein dalam enzim

Dalam banyak reaksi yang menggunakan enzim, diperlukan adanya

substansi nonprotein untuk melakukan aktivitas enzim yang seharusnya.

Substansi nonprotein ini memulai reaksi melalui ikatan molekul enzim

dengan cara yang spesifik. Secara khusus terdapat 5 bagian enzim, yaitu :

1. Koenzim yang merupakan substansi organik seperti vitamin,

koenzim A, heme, dan biotin.

9

2. Kofaktor yaitu substansi anorganik seperti atom logam seng,

besi, tembaga.

3. Kelompok prostetik yaitu tempat kofaktor enzim dapat berikatan

dengan efektif yang merupakan bagian protein enzim.

4. Holoenzim adalah bagian protein dan nonprotein enzim yang ada

bersamaan.

5. Apoenzim merupakan bagian protein enzim.

Penggambaran struktur nonprotein enzim dapat dilihat melalui Gambar 4.

Gambar 4. Struktur nonprotein enzim (Goddette et al., 1993)

b. Kondisi Lingkungan Optimal

Setiap enzim memiliki kondisi lingkungan yang optimal yang akan

mengoptimalkan konformasi enzim yang aktif. Hingga saat ini diketahui

dua poin yang dibutuhkan dalam kondisi lingkungan optimal yaitu

pengaturan suhu dan pengaturan pH.

Suhu memiliki dua pengaruh utama yaitu pengaruh terhadap reaksi serta

terjadinya denaturasi. Pengaruh terhadap reaksi yaitu untuk enzim pada

umumnya semakin adanya peningkatan pada suhu maka akan terjadi

peningkatan kecepatan reaksi, molekul bergerak lebih cepat dikarenakan

kenaikan suhu sehingga akan banyak berinteraksi. Penurunan suhu

10

tentunya akan berakibat sebaliknya. Ketika suhu mencapai serta

melampaui batas tertentu, maka akan terjadi denaturasi. Definisi

denaturasi adalah perubahan permanen yang menginaktivasi enzim. Saat

terjadi denaturasi, ikatan kimia terputus dan enzim kehilangan bentuk

spesifiknya (Dryer, 1993).

Hubungan salah satu faktor lingkungan yang mempengaruhi kerja enzim dengan

suhu dapat dilihat pada Gambar 5.

Gambar 5. Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim (Zaldivar et al., 2001)

pH adalah ukuran kadar ion H atau OH pada lingkungan. Apabila pH lingkungan

terlalu asam atau basa dapat menyebabkan denaturasi enzim. Umumnya, pH

optimum enzim adalah dalam pH netral (pH 7).

Gambar 6. Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim (Armstrong, 1983)

11

c. Inhibitor

Pengertian inhibitor adalah molekul yang berikatan secara selektif pada enzim

dan menghambat aktivitas enzim. Enzim dapat berikatan dengan inhibitor

secara reversibel ataupun ireversibel. Ada dua macam inhibitor yaitu inhibitor

kompetitif dan inhibitor nonkompetitif. Inhibitor kompetitif memiliki bentuk

seperti substrat normal dan bersaing dengan substrat normal tersebut untuk

berikatan dengan situs aktif enzim. Oleh karena itu, pengikatan inhibitor

memblokade situs aktif terhadap substrat. Apabila inhibitor bersifat reversibel

dapat diatasi dengan menambahkan konsentrasi substrat.

Inhibitor kompetitif mengikat bagian enzim yang lain selain situs aktif.

Pengikatan inhibitor ini dapat mengubah bentuk situs aktif enzim sehingga

tidak dapat mengikat substrat, yang tahapan sederhananya dapat dilihat pada

Gambar 7.

Gambar 7. Penghambatan enzim oleh inhibitor (Deustcer, 1990)

12

B. Enzim Selulase

Selulase adalah enzim terinduksi yang disintesis oleh mikroorganisme selama

ditumbuhkan dalam medium selulosa. Selulase termasuk sistem multienzim yang

terdiri dari tiga komponen. Untuk menghidrolisis selulosa yang tidak larut atau

selulosa kristal diperlukan kerja sinergis dari ketiga komponen enzim tersebut.

Adapun ketiga komponen enzim tersebut yaitu:

1) Ekso-β-(1,4)-glukanase dikenal sebagai faktor C1.

Faktor ini diperlukan untuk menghidrolisis selulosa dalam bentuk kristal

2) Endo-β-(1,4)-glukanase dikenal sebagai faktor Cx.

Faktor ini diperlukan untuk menghidrolisis ikatan β-(1,4)-glukosida

(selulosa amorf).

3) β-(1,4)-glukosidase menghidrolisis selobiosa menjadi glukosa.

(Muchtadi et al, 1992).

Kerja enzim selulase dihambat dengan adanya glukanolakton dan logam-logam

berat seperti tembaga dan merkuri, tetapi penghambatan dengan logam berat ini

dapat dinetralisir dengan penambahan sistein, sehingga aktivitas enzim akan

kembali normal. Penghambatan oleh glukanolakton lebih banyak terjadi pada

substrat selobiosa dan oligosakarida lain yang lebih sederhana, dan lebih kecil

pengaruhnya pada substrat selulosa (Smith, 1989).

Sintesa enzim selulase dihambat dengan adanya glukosa dan gula-gula lain yang

mudah dimetabolisme dalam media pertumbuhan dan hal ini dikenal sebagai

13

represi katabolit. Mekanisme sintesis yang dilakukan oleh enzim selulase yang

diatur oleh induksi dan represi katabolit, sebagai berikut (Page, 1989):

1) Selobiosa dan glukosa merupakan hasil hidrolisa selulosa yang

dilakukan oleh enzim selulase yang jumlahnya sangat sedikit. Selobiosa

kemudian berperan sebagai sumber karbon dan juga sebagai induser.

2) Dengan sistem transpor aktif selobiosa masuk ke dalam sel melalui

membran sel. Enzim glukosidase yang terikat pada membran sel kemudian

menghidrolisa selobiosa menjadi glukosa. Enzim glukosidase ini juga

dibentuk sebagai respon adanya laktosa, soforosa atau induser lain di

dalam media pertumbuhan.

3) Setelah selobiosa masuk ke dalam sel, selobiosa ini menjadi induser

yang aktif dan bereaksi dengan protein represor membuat represor inaktif

menjadi induksi. Kemungkinan lain, induser yang potensial itu dapat

dihidrolisa oleh enzim glukosidase intraseluler yang menyebabkan

akumulasi glukosa sehingga merepresi sintesa enzim selulase.

4) Induksi pada sintesa selulase terjadi bila represor telah diinaktifkan oleh

induser aktif dan kemudian diteruskan dengan proses transkripsi dan

translasi.

5) Selulase yang baru saja disintesa sebagai respon dari adanya induser,

untuk sementara masih terikat pada membran sel. Pelepasan selulase

melewati membran sel diatur oleh suatu mekanisme pelepasan yang

spesifik, mungkin oleh enzim protease asam bersifat intraseluler. Kondisi

14

pH rendah mempermudah pelepasan enzim selulase, sedangkan pada pH

tinggi pelepasan enzim selulase keluar sel akan terhambat.

6) Enzim selulase yang baru saja dilepaskan keluar sel akan menghidrolisa

selulosa menjadi glukosa atau selobiosa. Jumlah enzim selulase yang

dikeluarkan mempengaruhi jumlah glukosa dan selobiosa kemudian

menyokong pertumbuhan sel dan juga berperan dalam mekanisme induksi-

represi.

7) Glukosidase intraseluler menghidrolisis sebagian dari selobiosa

intraseluler menjadi glukosa.

8) Kadar glukosa intraseluler yang tinggi akan menghambat aktivitas

enzim glukosidase intraseluler.

9) Pada mikroorganisme yang mampu memproduksi enzim selulase

intraseluler sebagai respon pada terjadinya akumulasi glukosa intraselular,

akan terjadi proses oksidasi glukosa oleh glukooksidase menghasilkan

produk berupa glukanolakton dan asam glukonat.

10) Glukonolakton akan menghambat kerja enzim glukooksidase sehingga

aktifitasnya akan menurun dan akibatnya respon terhadap sintesa juga

akan berkurang.

11) Konsentrasi glukosa intraseluler mempengaruhi sintesa enzim selulase

dengan mekanisme represi.

Induser terhadap sintesa enzim selulase pada mikroorganisme yaitu selulosa,

selobiosa, dan laktosa, semuanya dapat digunakan sebagai sumber karbon oleh

15

mikroorganisme itu sendiri. Pembentukan selulase secara berkelanjutan

dipengaruhi oleh penyediaan induser aktif secara berkelanjutan pula sehingga

untuk menjadi produsen selulase yang berkelanjutan perlu digunakan induser yang

tidak dapat digunakan sebagai sumber karbon dan juga mempunyai afinitas yang

tinggi terhadap protein repressor (Stahl, 1999).

Enzim selulase memiliki aplikasi yang luas dan potensial dalam bidang makanan,

pakan ternak, tekstil, bahan bakar, industri kimia, industri pulp dan kertas,

pengolahan limbah, industri farmasi, produksi protoplas, dan teknik genetik

(Illanes, 1999).

C. Rhizopus oryzae

Morfologi dan klasifikasi Rhizopus oryzae adalah:

Kingdom : Fungi

Divisio : Zygomycota

Class : Zygomycetes

Ordo : Mucorales

Familia : Mucoraceae

Genus : Rhizopus

Species : Rhizopus oryzae

Sifat-sifat jamur Rhizopus oryzae yaitu:

● Koloni berwarna putih berangsur-angsur menjadi abu-abu;

● Stolon halus atau sedikit kasar dan tidak berwarna hingga kuning kecoklatan;

16

● Sporangiofora tumbuh dari stolon dan mengarah ke udara, baik tunggal atau

dalam kelompok (hingga 5 sporangiofora);

● Rhizoid tumbuh berlawanan dan terletak pada posisi yang sama dengan

sporangiofora;

● Sporangia globus atau sub globus dengan dinding berspinulosa (duri-duri

pendek), yang berwarna coklat gelap sampai hitam bila telah masak;

● Kolumela oval hingga bulat, dengan dinding halus atau sedikit kasar;

● Spora bulat, oval atau berbentuk elips atau silinder;

● Suhu optimal untuk pertumbuhan 350C, minimal 5-70C dan maksimal 440C

Penggambaran Rhizopus oryzae dapat dilihat pada Gambar 8.

Gambar 8. Sporangium Rhizopus oryzae (Lemos et al., 2000)

17

Rhizopus oryzae memiliki beberapa kegunaan dalam kehidupan sehari-hari,

diantaranya adalah:

1. Rhizopus oryzae sebagai bahan pangan dan penghasil enzim

Jamur Rhizopus oryzae merupakan jamur yang sering digunakan dalam

pembuatan tempe. Jamur Rhizopus oryzae aman dikonsumsi karena tidak

menghasilkan toksin dan mampu menghasilkan asam laktat. Jamur Rhizopus

oryzae mempunyai kemampuan mengurai lemak kompleks menjadi

trigliserida dan asam amino. Selain selulase, jamur Rhizopus oryzae mampu

menghasilkan protease (Margiono, 1992).

2. Rhizopus oryzae sebagai starter

Jamur sering digunakan sebagai starter dalam pembuatan berbagai jenis

keju. Agar tumbuh pada susu, kultur starter harus mampu untuk

memfermentasikan laktosa, menghasilkan asam amino dari proses

proteolisis (Vielle and Zeikus, 1996).

Peran utama jamur dalam pembuatan keju adalah mempertajam cita rasa dan

aroma, serta sedikit memodifikasi penampakan tekstur tahu keju

(Suhartono, 1989). Adapun tempat hidup Rhizopus oryzae adalah di darat, di

tanah yang lembab atau sisa organisme mati. Rhizopus oryzae tumbuh baik

pada kisaran pH 3,4-6. Pada penelitian yang telah dilakukan sebelumnya,

semakin lama waktu fermentasi, pH tempe semakin meningkat sampai pH

8,4 sehingga jamur semakin menurun karena pH tinggi kurang sesuai untuk

pertumbuhan jamur. Secara umum jamur juga membutuhkan air untuk

pertumbuhannya, tetapi kebutuhan air untuk jamur lebih sedikit

18

dibandingkan dengan bakteri. Selain pH dan kadar air, jumlah nutrien dalam

bahan juga dibutuhkan oleh jamur.

Ciri-ciri R. oryzae secara umum, antara lain adalah:

1. Hifa tidak bersekat (senositik)

2. Hidup sebagai saprotrof, yaitu dengan menguraikan senyawa

organik.

D. Inokulasi

Penanaman bakteri atau biasa disebut juga inokulasi adalah pekerjaan

memindahkan bakteri dari medium yang lama ke medium yang baru dengan

tingkat ketelitian yang sangat tinggi. Untuk melakukan penanaman bakteri

(inokulasi) terlebih dahulu diusakan agar semua alat yang ada dalam hubungannya

dengan medium agar tetap steril, hal ini agar menghindari terjadinya kontaminasi.

Ada beberapa tahap yang harus dilakukan (Judoamidjojo, 1989) sebelum

melakukan teknik penanaman bakteri (inokulasi) yaitu :

1. Menyiapkan ruangan

Ruang tempat penanaman bakteri harus bersih dan keadannya harus steril

agar tidak terjadi kesalahan dalam pengamatan atau percobaaan dalam

labotarium pembuataan serum vaksin dan sebagainya. Inokulasi dapat

dilakukan dalam sebuah kotak kaca udara yang dalam kotak tersebut

dilewatkan saringan melalui suatu jalan agar terkena sinar ultraviolet

(Laminar Air Flow).

19

2. Pemindahan dengan jarum ose

Ujung kawat inokulasi sebaiknya dari platina atau nikel yang ujungnya

boleh lurus juga boleh berupa bolongan yang diameternya 1-3mm. Dalam

melakukuan penanaman mikroorganisme kawat ini terlebih dahulu

dipijarkan sedangkan sisanya tungkai cukup dilewatkan nyala api saja

setelah dingin kembali kawat itu disentuhkan lagi dalam nyala api.

Adapun metode yang digunakan untuk mengisolasi biakan murni :

a. Metode gores

Teknik ini lebih menguntungkan jika ditinjau dari sudut ekonomi dan

waktu, tetapi memerlukan keterampilan-keterampilan yang diperoleh

dengan latihan. Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni

yang terpisah. Inokulum digoreskan di permukaan media agar nutrien

dalam cawan petri dengan jarum pindah (lup inokulasi). Di antara garis-

garis goresan akan terdapat sel-sel yang cukup terpisah sehingga dapat

tumbuh menjadi koloni.

Cara penggoresan dilakukan pada medium pembiakan padat bentuk

lempeng. Bila dilakukan dengan baik teknik inilah yang paling praktis.

Dalam pengerjaannya terkadang berbeda pada masing-masing

laboratorium tapi tujuannya sama yaitu untuk membuat goresan

sebanyak mungkin pada lempeng medium pembiakan.

20

b. Metode tebar

Setetes inokolum diletakkan dalam sebuah medium agar nutrien dalam

cawan petri dengan menggunakan batang kaca yang bengkok dan

steril. Inokulasi itu disebarkan dalam medium batang yang sama agar

dapat digunakan untuk menginokulasikan pinggan kedua agar dapat

menjamin penyebaran bakteri yang merata dengan baik. Pada

beberapa pinggan akan muncul koloni koloni yang terpisah-pisah.

c. Metode tuang

Inokulasi menggunakan media cair dengan cara pengenceran. Dasar

melakukan pengenceran adalah penurunan jumlah mikroorganisme

sehingga pada suatu saat hanya ditemukan satu sel di dalam tabung

(Boyer, 1993).

d. Metode tusuk

Metode tusuk yaitu dengan dengan cara meneteskan atau menusukan

ujung jarum ose yang di dalamnya terdapat inokolum, kemudian

dimasukkan ke dalam media (Boyer, 1993).

Perbedaan Inokulasi Jamur dan Bakteri adalah :

1. Inokulasi jamur menggunakan jarum ose bentuk batang. Hifa yang

berbentuk seperti benang mudah diambil dengan jarum ose batang dan

mudah sekali tumbuh di dalam suatu media.

21

2. Inokulasi bakteri menggunakan jarum ose bentuk bulat. Pada ujung jarum

ose yang berbentuk bulat, bakteri akan dapat terambil dalam jumlah yang

relatif banyak (Chaplin and Bucke, 1990).

E. Isolasi

Isolasi adalah suatu usaha atau cara memisahkan senyawa yang bercampur

sehingga kita dapat menghasilkan senyawa tunggal yang murni. Tumbuhan

mengandung ribuan senyawa sebagai metabolit primer dan metabolit sekunder.

Biasanya proses isolasi senyawa dari bahan alami dapat mengisolasi senyawa

metabolit sekunder, karena dapat memberikan manfaat bagi kehidupan manusia.

Kandungan senyawa dari tumbuhan untuk isolasi dapat diarahkan pada suatu

senyawa yang lebih dominan dari salah satu usaha isolasi senyawa tertentu maka

dapat dimanfaatkan pemilihan pelarut organik yang akan digunakan pada isolasi

tersebut, selanjutnya pelarut polar akan lebih mudah melarutkan senyawa polar

dan sebaliknya senyawa non polar lebih mudah larut dalam pelarut non polar

(Pelczar dan Chan, 2007).

F. Sorbitol

Nama “sorbitol” berasal dari Sorbus, nama ilmiah untuk sejenis genus dari

tumbuh-tumbuhan. Tumbuhan-tumbuhan bergenus sorbus inilah yang

menghasilkan sorbitol. Tumbuhan lain yang juga menghasilkan sorbitol adalah

rumput laut dan buah-buahan seperti plum. Selain dari bahan alam, sorbitol juga

bisa dibuat secara sintetis. Sorbitol masuk dalam kelas senyawa yang disebut

poliol. Poliol adalah alkohol yang memiliki beberapa ikatan hidroksil (-OH)

dalam strukturnya. Molekul sorbitol terdiri dari enam rantai atom karbon dengan

22

satu hidroksil melekat pada setiap atom karbon. Sorbitol bisa larut dalam air.

Larutan sorbitol memiliki rasa manis dan tekstur mirip sirup. Tingkat rasa manis

sorbitol kira-kira setengah dari manis gula tebu (Poedjiadi, 1994). Sorbitol sebagai

zat aditif dalam penelitian ini dapat dilihat struktur Fischernya pada Gambar 9.

Gambar 9. Struktur Sorbitol (Hart et al., 2003)

Nama IUPAC Sorbitol ialah (2S,3R,4R,5R)-Heksana 1,2,3,4,5,6-heksol. Nama

lainnya adalah: D-Sorbitol dan D-Glusitol.

Sobitol memiliki sifat fisika dan kimia sebagai berikut:

Rumus molekul: C6H14O6

Berat molekul: 182,17 gr/mol

Densitas: 1,489 gr/cm3

Titik leleh: 95 °C

Titik didih: 296 °C

23

G. Uji Aktivitas

1. Metode Mandels

Pengujian aktivitas selulase dilakukan dengan metode Mandels (Mandels et al.,

1976), yaitu berdasarkan pembentukan produk glukosa serta CMC (Carboxy

Methyl Selulase) sebagai substratnya. Semakin tinggi absorbansi sampelnya

semakin baik aktivitasnya.

2. Metode Lowry

Metode Lowry merupakan pengembangan dari metode Biuret. Dalam metode ini

terlibat 2 reaksi. Awalnya, kompleks Cu(II)-protein akan terbentuk sebagaimana

metode biuret, yang dalam suasana alkalis Cu(II) akan tereduksi menjadi Cu(I).

Ion Cu+ kemudian akan mereduksi reagen Folin-Cioceltau, kompleks

fosfomolibdat-fosfotungstat, menghasilkan heteropolimolibdenum biru akibat

reaksi oksidasi gugus aromatik (rantai samping asam amino) terkatalis Cu, yang

memberikan warna biru intensif yang dapat dideteksi secara kolorimetri.

Kekuatan warna biru terutama bergantung pada kandungan residu triptofan dan

tirosin-nya. Keuntungan metode Lowry adalah lebih sensitif (100 kali) daripada

metode Biuret sehingga memerlukan sampel protein yang lebih sedikit. Batas

deteksinya berkisar pada konsentrasi 0,01 mg/mL. Namun metode Lowry lebih

banyak interferensinya akibat kesensitifannya (Lowry et al., 1951).

Beberapa zat yang bisa mengganggu penetapan kadar protein dengan metode

Lowry ini diantaranya adalah: buffer, asam nuklet, dan gula/karbohidrat, deterjen,

gliserol, Tricine, EDTA, Tris, senyawa-senyawa kalium, sulfhidril, disulfida,

24

fenolat, asam urat, guanin, xanthine, magnesium dan kalsium. Interferensi agen-

agen ini dapat diminimalkan dengan menghilangkan interferens tersebut. Sangat

dianjurkan untuk menggunakan blanko untuk mengkoreksi absorbansi.

Interferensi yang disebabkan oleh deterjen, sukrosa dan EDTA dapat dieliminasi

dengan penambahan SDS atau melakukan preparasi sampel dengan pengendapan

protein.

III. METODE PENELITIAN

A. Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilakukan pada bulan Agustus 2016 - Januari 2017 bertempat di

Laboratorium Biokimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Universitas Lampung.

B. Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas, jarum ose,

autoclave model S-90 SN, Laminar Air Flow CURMA model 9005-FL, Neraca

Analitik Airsworth AA-160, Incubator Precisterm JP Selecta, Shaker Incubator

Environ Shaker Lab-Line, Sentrifuga model 225 Fischer Scientific dan model

Labor 50-WIFUG-Lab, Lemari Pendingin, mikropipet Effendorf, Penangas

Precisterm JP Selecta, Magnetic Stirrer STUART, termometer, batang pengaduk,

spatula, dan Spektrofotometer UV-Vis Carry-100 Agilent Technologies serta

bahan-bahan yang digunakan antara lain MgSO4.7H2O, CaCl2.5H2O, Urea,

Akuades, Alkohol, DNS (Dinitrosalisilic Acid), NaOH, Fenol, Na2SO3, Na(K)

Tartarat, Na2CO3, reagen follin

26

ciaocelteau, Na2HPO4, NaH2PO4, serta biakan jamur Rhizopus oryzae yang

diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi dan Teknik Kimia, Teknologi

Bioproses Institut Teknologi Bandung.

C. Prosedur penelitian

1. Penentuan kondisi optimum Rhizopus oryzae untuk memproduksi enzimselulase

a. Pembuatan media inokulum dan fermentasi

Media inokulum dan fermentasi yang digunakan terdiri dari (NH4)2SO4 0,14 %;

KH2PO4 0,2 %; MgSO4 0,02 %; CaCl2..5H2O 0,03 %; Urea 0,03 %; Pepton 0,2 %;

Yeast 0,2 %; KCl 0,03 %; CMC 0,1 % yang dilarutkan dengan 100 mL buffer

fosfat pH 5; 6; dan 7 ke dalam labu Erlenmeyer, kemudian disterilkan pada suhu

121oC, tekanan 1 atm, selama ±15 menit dalam autoklaf.

b. Inokulasi Rhizopus oryzae

Sebanyak 3 ose Rhizopus oryzae dari media agar miring dipindahkan ke dalam

100 mL media inokulum secara aseptis lalu dikocok dalam shaker incubator

dengan kecepatan 150 rpm pada suhu 35oC selama 24 jam.

c. Penentuan pH optimum media fermentasi

Penentuan pH optimum media fermentasi ditentukan dengan cara mengatur pH

awal media fermentasi dengan variasi 5; 6; dan 7 menggunakan buffer fosfat 0,1

M. Selanjutnya dipindahkan 2 % media inokulum dari jumlah media fermentasi

sebanyak 400 mL, media fermentasi secara aseptis dan dikocok dalam shaker

incubator dengan kecepatan 150 rpm pada suhu 35oC. Lalu diuji aktivitas enzim

selulase dengan metode Mandels pada interval waktu tertentu

27

2. Produksi dan isolasi enzim selulase

a. Produksi enzim selulase

Produksi enzim selulase dilakukan pada kondisi optimum yang diperoleh

pada kerja praktik yang telah dilakukan yaitu pada pH 6 dan waktu

fermentasi selama 72 jam.

b. Isolasi Enzim Selulase

Setelah media fermentasi yang berisi Rhizopus oryzae dikocok

menggunakan shaker incubator pada suhu 35oC. Selanjutnya dipisahkan

enzim selulase dari komponen sel lainnya menggunakan sentrifuga dengan

kecepatan putaran 5000 rpm, pada suhu 4oC selama 20 menit. Filtrat yang

diperoleh merupakan ekstrak kasar enzim selulase yang selanjutnya diuji

aktivitasnya dengan metode Mandels dan kadar proteinnya menggunakan

metode Lowry.

3. Pemurnian enzim selulase

Sebelum dipekatkan, ekstrak kasar enzim selulase hasil isolasi ditempatkan dalam

gelas kimia dan ditutup dengan kain kasa, kemudian dibekukan di dalam lemari

pendingin. Ekstrak kasar enzim selulase yang telah beku selanjutnya diendapkan

dengan menggunakan ammonium sulfat dan dilanjutkan dengan tahap dialisis

sehingga enzim semakin bertambah volumenya hingga mencapai kurang lebih dua

kali lipat volume sebelumnya.

28

4. Uji aktivitas enzim selulase

a. Pembuatan pereaksi untuk pengujian aktivitas enzim selulase metodeMandels

Ke dalam labu ukur 100 mL, dimasukkan 1% DNS (dinitrosalisilic acid),

1 % NaOH, 0,2 % fenol, 0,05 % Na2SO3 dan 1 mL Na(K)- tartarat 40 %.

Kemudian dilarutkan dalam 100 mL akuades hingga tanda batas.

b. Pengujian aktivitas enzim selulase metode Mandels

Metode ini berdasarkan glukosa yang terbentuk (Mandels et al.,1976). Se-

banyak 0,25 mL enzim dan 0,25 mL larutan CMC 1 % (dalam bufer fosfat

pH 5) dicampur lalu diinkubasi selama 60 menit pada suhu 50oC.

Kemudian ditambahkan 1 mL pereaksi DNS (dinitrosalisilic acid)

dididihkan selama 10 menit pada suhu 100oC dan didinginkan. Setelah

dingin, campuran ditambahkan 1,5 mL akuades dan diukur absorbansinya

menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 510 nm.

Kadar glukosa yang terbentuk ditentukan dengan menggunakan kurva

standar glukosa.

5. Penentuan kadar protein enzim selulase

a. Pembuatan pereaksi untuk penentuan kadar protein enzim selulasemetode Lowry

Pereaksi A : 2 gram Na2CO3 dilarutkan dalam 100 mL NaOH 0,1 N.

Pereaksi B : 5 mL larutan CuSO4.5H2O 1% ditambahkan ke dalam 5 mL

larutan Na(K)-tartarat 1 %.

Pereaksi C : 2 mL pereaksi B ditambah 100 mL pereaksi A.

Pereaksi D : reagen follin ciocelteau diencerkan dengan akuades 1:1.

29

Larutan standar : larutan BSA (Bovine Serum Albumin) dengan kadar 0; 20;

40; 60; 80; 100; 120; dan 140 ppm.

b. Penentuan kadar protein enzim selulase melalui metode Lowry

Kadar protein enzim ditentukan dengan metode Lowry (Lowry et al.,

1951). Penentuan kadar protein ini bertujuan untuk mengatur aktivitas

spesifik dari protein enzim selulase. Sebanyak 0,1 mL enzim selulase

ditambah dengan 0,9 mL akuades. Lalu direaksikan dengan 5 mL pereaksi

C, diaduk rata dan dibiarkan selama 10 menit pada suhu ruang. Setelah itu,

ditambahkan dengan cepat 0,5 mL pereaksi D dan diaduk dengan

sempurna, didiamkan selama 30 menit pada suhu ruang. Untuk kontrol, 0,1

mL enzim diganti dengan 0,1 mL akuades. Selanjutnya perlakuannya sama

seperti sampel. Serapannya diukur menggunakan spektrofotometer UV-Vis

pada λ 750 nm. Untuk menentukan kadar protein enzim digunakan kurva

standar BSA (Bovine Serum Albumin).

6. Penambahan sorbitol

Larutan sorbitol dengan variasi konsentrasi 0,5 M;1,0 M; dan 1,5 M masing-

masing ditambahkan ke dalam enzim hasil pemurnian dengan perbandingan 1:1.

7. Karakterisasi enzim (sebelum dan setelah penambahan sorbitol)

Karakterisasi sebelum dan setelah penambahan sorbitol meliputi: penentuan pH

dan suhu optimum, penentuan data kinetika (KM dan Vmaks), serta penentuan

kestabilan terhadap suhu dan pH.

30

a. Penentuan pH dan suhu optimum

1. Penentuan pH optimum

Untuk mengetahui pH optimum enzim sebelum dan sesudah

penambahan sorbitol digunakan buffer fosfat 0,1 M dengan variasi pH

sebagai berikut: 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; dan 8. Suhunya tetap dijaga pada

50oC, kemudian dilanjutkan dengan pengujian aktivitas enzim dengan

metode Mandels.

2. Penentuan suhu optimum

Untuk mengetahui suhu optimum kerja enzim dilakukan dengan variasi

suhu yaitu 45; 50; 55; 60; 65; 70; 75 dan 80. pH tetap dijaga pada pH

optimum. Selanjutnya diuji aktivitas menggunakan metode Mandels.

b. Penentuan data kinetika enzim

Konstanta Michaelis-Menten (KM) dan laju reaksi maksimum (VMAKS) enzim

sebelum dan setelah penambahan sorbitol ditentukan dari kurva Lineweaver-

Bark. Kurva ini dibuat dengan menguji aktivitas enzim selulase dengan variasi

konsentrasi substrat 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,25% dalam buffer fosfat pada pH

6 dan suhu 50oC selama 60 menit. Selanjutnya diuji aktivitas dengan metode

Mandels.

c. Uji stabilitas termal

Pengukuran stabilitas termal enzim dilakukan dengan mengukur aktivitas sisa

enzim sesudah diinkubasi selama periode waktu 100 menit pada pH 6. Caranya

adalah dengan mengukur aktivitas enzim setelah proses pemanasan setiap

interval waktu 10 menit. Aktivitas awal enzim (tanpa pemanasan) diberi nilai

100%.

31

Aktivitas Sisa = 100 %d. Penentuan waktu paruh (t1/2), konstanta laju inaktivasi (ki) dan

perubahan energi akibat denaturasi (ΔGi)

Penentuan nilai ki (konstanta laju inaktivasi termal) enzim selulase sebelum dan

setelah penambahan sorbitol dilakukan dengan persamaan kinetika inaktivasi

orde 1 (Kazan et al., 1997):, dengan persamaan:

Ln (Ei/Eo)= -ki t

Sedangkan untuk perubahan energi akibat denaturasi (ΔGi) enzim sebelum dan

setelah penambahan sorbitol dilakukan menggunakan persamaan (Kazen et al.,

1997):

ΔGi = - R T ln (ki h/kB T)

Keterangan:

R = Konstanta gas (8,315 J K-1 mol-1)

T = Suhu absolut (K)

ki = konstanta laju inaktivasi termal

h = konstanta Planck (6,63 x 10-34 J det)

kB = konstanta Boltzmann (1,381x10-23 J K-1)

Secara keseluruhan, penelitian ini terangkum dalam diagram alir penelitian yang

ditunjukkan oleh Gambar 10.

32

78

Gambar 10. Diagram alir Penelitian

Pemurnian enzim:1. Pengendapan dengan ammonium sulfat2. Dialisis

Uji aktivitas enzimselulase

Enzim hasil pemurnian

Pengujianstabilitas termal

Penambahan sorbitol

Enzim setelah penambahan sorbitol

Penentuan pH dansuhu optimum

Penentuan Km dan Vmaks

PRODUKSI ENZIM

EKSTRAK KASAR ENZIM

Uji Aktivitas Enzim selulase

V. SIMPULAN DAN SARAN

A. Simpulan

Dari pembahasan hasil penelitian yang telah dilakukan didapatkan

kesimpulan sebagai berikut:

1. Waktu dan pH optimum produksi enzim selulase dari Rhizopus oryzae

adalah pada waktu 72 jam dan pada pH 6.

2. Enzim hasil pemurnian memiliki aktivitas spesifik sebesar 9,18 U/mg,

meningkat 4,03 kali dibandingkan ekstrak kasar enzim.

3. Enzim hsil pemurnian dan setelah penambahan sorbitol 0,5; 1,0; dan

1,5 M memiliki pH optimum 7 dan suhu optimum 60o C.

4. Uji stabilitas termal enzim hasil pemurnian memiliki masing-masing

berturut-turut ki = 1,5227 menit-1; t1/2 = 32,77 menit; dan ∆Gi = 89,03

kJmol-1.

5. Uji stabilitas enzim setelah penambahan sorbitol 0,5 M; 1,0 M; dan 1,5

M pada pH dan suhu optimum selama 60 menit memiliki berturut-turut

t1/2 = 49,96 menit, ki = 1,50 menit-1, dan ∆Gi = 89,25 kJmol-1; t1/2 =

71,8 menit, ki = 1,44 menit-1 dan ∆Gi = 89,36 kJmol-1; t1/2 = 58,2 menit,

ki = 1,38 menit-1 dan ∆G i = 89,47 kJmol-1 yang menunjukkan bahwa

50

waktu paruh enzim setelah penambahan sorbitol meningkat 1,17 –

1,4 kali dari enzim selulase sebelum penambahan sorbitol.

6. Hasil karakterisasi Km, dan Vmaks enzim selulase menunjukkan

sebelum dan setelah penambahan sorbitol pada pH dan suhu

optimum adalah nilai Km dan Vmaks tanpa sorbitol sebesar 74,017

mg/mL substrat dan 6,5665 µmol/mL.menit, sedangkan nilai Km

dan Vmaks setelah penambahan sorbitol sebagai berikut: sorbitol 0,5

M Km = 24,89 mg/mL, Vmaks = 0,9176 µmol/mL.menit; sorbitol 1,0

M Km= 18,387 mg/mL substrat, Vmaks= 0,8169 µmol/mL.menit;

dan sorbitol 1,5 M Km= 14,83 mg/mL substrat, Vmaks= 0,4195

µmol/mL.menit yang menunjukkan bahwa harga Km dan Vmaks

untuk enzim setelah penambahan sorbitol mengalami penurunan.

7. Enzim selulase yang didapatkan dari jamur Rhizopus oryzae

memiliki aktivitas yang lebih rendah daripada yang didapatkan

bakteri Bacillus Subtilis ITBCCB148 dengan perbandingan

aktivitas 6:17.

B. Saran

Berdasarkan hasil penelitian yang didapatkan, disarankan untuk metode

penelitian selanjutnya agar mencari metode pemurnian enzim yang lain

sehingga diperoleh kemurnian enzim yang lebih tinggi, dan agar

digunakan pula metode pengujian enzim yang lain agar hasil yang

didapatkan lebih variatif.

DAFTAR PUSTAKA

Ahern, T.J. and A.M Klibanov. 1987. Why Do Enzyme Irreversibly Inactive AtHigh Temperature. Biotec. I. Microbial Genetic Engineering and EnzymeTechnology. Gustav Fischer. Stuttgart. New York. P. 131-136.

Armstrong, F. B. 1983. Biochemistry Second Edition, Oxford University Press.135-139, 142-143.

Beguin, P. and J. P. Aubert. 1994. The biological degradation of cellulose. FEMSMicrobiology Reviews. 13: 25-58.

Boyer, R. F. 1993. Modern Experimental Biochemistry. Benjamin CummingPublishing Company. Redwood City, California. 41-43, 48-49.

Chaplin, M. F. and C. Bucke. 1990. Enzym Technology, Cambridge UniversityPress. Cambridge, Great Britain. 264.

Coughlan, M. 1983. Cellulase: Production Properties and Application.Biochem. Soc. Trans. 15. 405-406.

Deutscher, M. P. 1990. Methods in Enzymology : Guide to Protein Purification.Acamic Press, inc. California.

Dryer, R. L. 1993. Biokimia Jilid 1. UGM Press. Yogyakarta. 180-181.

Goddette, D. W., T. Christianson, B. F. Laddin, M. Lau, J. R. Mielendz, C. Paech,R. B. Reynolds, S. S. Yang, and C. R Wilson. 1993. Strategy andImplementation of a System of Protein Engineering. J. Biotechol. 28: 41-54.

52

Harbone, 1987. Metode Fitokimia. ITB Press. Bandung. 27-29.

Hart, H., E. Lessie, dan J. David. 2003. Kimia Organik. Erlangga. Jakarta. 53-56.

Healy, M. G., R. O Bustos, and C. R. Romo. 1999. Stabilization of Trypsin-LikeEnzymes from Antarctic Krill: Effect of Polyols, Polysaccharida andProteins. J. Chem. Technol. Biotechnol., 65: 200.

Illanes, A. 1999. Stability of Biocatalysts. Review Article. EJB Electronic Journalof Biotechnology. Universitas Catolica de Valparaiso. Chile. 2(1).

Judoamidjojo, M. 1989. Teknologi Fermentasi. Rajawali Press. Jakarta. 128-132.

Kazan, D., H. Ertan and A. Erarslan. 1997. Stabilization of Escherichia colipenicillin G acylase agains thermal inactivation by cross linking withdextran dialdehyde polymers. Applied. Microbial Biotechnol. 48. 191-197.

Kuchel, P. W. dan B. R. Gregory. 2002. Biokimia. Erlangga. Jakarta. 55-56.

Lowry, O. H., N. J. Rosebrough, A. L. Farr, and R. J. Randall. 1951. ProteinMeasurement With The Folin Phenol reagent. J. Biol. Chem. 193 : 265-267.

Lemos, S. L. J., E. P. S. Bon, M. D. F. E. Santana, and N. P. Junior. 2000.Thermal stability of xylanase produced by Aspergillus awamori. BrazilianJournal of Microbiology. 31. 206-211.

Madigan, M. 2005. Brock Biology of Microorganism. Pretince Hall.

Mandels, M., A. Raymond, and R. Charles. 1976. Measurement of saccharifyingcellulose. Biotech. & Bioeng. Symp. 6. John Wiley & Sons Inc.

Margiono. 1992. Molekuler Genetika Mikroba. UGM Press. Yogyakarta. 213-311.

Montgomery, R. 1993. Biokimia Berorientasi Kasus. UGM Press. Yogyakarta.181-182.

53

Muchtadi D., N. S. Palupi, dan M. Astawan. 1992. Enzim dan Industri Pangan .PAU. IPB. Bogor.

Murashima, K., T. Nishimura, Y. Nakamura, J. Koga, T. Moriya, N. Sumida, T.Yaguci and T. Kono. 2002. Purification and characterization fromRhizopus oryzae. Enzim Microb. Technol. 30: 318-326.

Noriko, M. K., K. Miok, and K. Tada. 1999. Stabilization of L. Ascorbic acidsuperoxide dismutase and catalase. Bios. Biotehnol. Biochem. 63, 54-57.

Page, D. S. 1989. Prinsip-prinsip Biokimia. Erlangga. Jakarta. 111-115.

Palczar, M. J. and E. C. S. Chan, 2007. Dasar-dasar Mikrobiologi. UI Press.Jakarta. 180, 318, 330-331.

Poedjiadi, A. 1994. Dasar-dasar Biokimia. UI. Jakarta. 155, 158-160.

Scopes, R. K. 1982. Protein Purification. Springer Verlag. New York. 33-35.

Riawati, S. 2012. Studi Pengaruh Penambahan Gliserol dan Sorbitol TerhadapStabilitas Enzim Selulase dari Bacillus subtillis ITBCCB148. (Skripsi).Universitas Lampung. Bandar Lampung.

Smith, J. E. 1989. Prinsip Bioteknologi. Diterjemahkan oleh Sumo, U.F.,Sumantri, B. dan Subono.PT. Gramedia. Jakarta. 31-44.

Soemitro, S. 2005. Pengaruh modifikasi kimia selektif terhadap kestabilanamylase dari Saccaromycopsis fibuligera. 3: 259-273.

Stahl, S. (1999), Thermophilic Microorganisms: The Biological Background forThermophily and Thermoresistance of Enzymes in Thermostability ofEnzymes (Gupta, M.N. editor), Springer Verlag.

Suhartono, M. T. 1989. Enzim dan Bioteknologi. Departemen Pendidikan danKebudayaan Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi Antar UniversitasBioteknologi, Institut Pertanian Bogor. Bogor.

54

Suhartono, M. T. 1993. Telaah Formulasi Aditif dalam Peningkatan Sumber DayaSimpan Protease Bacillus sp. Laporan Penelitian IPB. Bogor,

Vielle, C. and J. G. Zeikus. 1996. Thermozymes : Identifying MolecularDeterminant of Protein Structural and Fuctional Stability. Tibtech., 14(6):183-189.

Weagen E. S. 1984. Strategies for increasing the stability of enzymes, in enzymeengineering. The New York Academy of Science, New York. 7:1-19.

Winarni, 1997. Teknik Fermentasi. ITS Press. Surabaya. 13-23.

Zaldivar, J., J. Nielsen, and L. Olsson, 2001. Fuel ethanol production fromlignuccelulose; a challenge for methabolic engineering and processintegration. Applied Microbiology and Biotechnology. 56: 17-34.