PENUNTUN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI MEDIS II

PRAKTIKUM IV

Teknik Isolasi dan Pembiakan Virus.

Virus merupakan mikroorganisme yang bersifat parasit obligat dan hanya bisa

hidup pada media yang hidup. Berkaitan dengan sifatnya tersebut, virus hanya dapat

dibiakan pada sel hidup. Untuk menumbuhkan virus dalam rangka mengisolasi suatu

virus dapat dilakukan secara :

1. in ovo yaitu metode menumbuhkan pada media telur berembrio (telur yang

sudah dibuahi)

2. in vivo adalah metode menumbuhkan pada hewan percobaan sebagai model

3. in vitro yaitu menumbuhkan virus di dalam gelas- gelas atau tabung menggunakn

media biakan jaringan (tissue culture) atau biakan sel (cell culture).

Pemilihan media yang digunakan tergantung dari jenis virusnya dan organ target dari

virus tersebut.

Pemupukan /isolasi virus pada telur berembrio

Telur berembrio telah lama dan paling sering digunakan sebagai media isolasi

dan propagasi atau pembiakan virus. Telur berembrio atau sering disebut dengan telur

embrio tertunas (TET) atau telur ayam berembrio (TAB) sangat penting dalam

perkembangan virologi karena pada telur tertunas dapat ditemukan bermacam-macam

tipe sel yang mampu ditumbuhi/menjadi media tumbuhnya berbagai jenis virus. Macam-

macam sel tersebut adalah :

1. Sel epitel khorion yang berada pada membran khorion

2. Sel epitel alantois yang merupakan sel penyusun pada membran khorioalantois.

3. Sel epitel amnion yang melapisi ruang amnion

4. sel pada kantong kuning telur ( Yolk sac) dan sel endotel pada pembuluh darah

5. Sel dari embrionya itu sendiri yang umumnya adalah sel fibroblast.

Keberhasilan isolasi dan propagasi virus pada telur dipengaruhi oleh :

Rute inokulasi

Umur embrio pada telur

Temperatur/suhu inkubasi

Lamanya waktu inkubasi setelah inokulasi

Volume dan pengenceran inokulum yang digunakan

Status kekebalan flok dari induk tempat telur berasal

Dalam membiakan virus menggunakan telur, sebaiknya digunakan telur yang berasal

dari breeding flock yang bebas patogen tertentu (spesific pathogen free). Telur yang

digunakan diinkubasikan pada suhu 37o-38 o Celcius dan kelembaban relatif 60-70%.

Sebelum diinokulasi telur diperiksa dengan teropong ( candling), pemeriksaan ini

dilakukan untuk mengetahui apakah telur dalam kondisi normal, sesuai dengan umurnya

atau ada kelainan. Kelainan yang terjadi misalnya tidak adanya kantung udara, infertile

(tidak dibuahi), embrio lemah atau mati. Telur-telur yang tidak normal tidak bisa

digunakan.

Inokulasi virus kedalam telur dapat dilakukan dibeberapa tempat tergantung jenis

virusnya, misalnya pada virus yang lebih menyukai sel epitel sebagai tempat

berkembang biaknya dapat diinokulasikan pada membran khorioalantois. Rute inokulasi

yang dapat dilakukan antara lain adalah kedalam ruang amnion ( amnionic cavity),

ruang alantois (allantoic cavity), membran khorio alantois, kantong kuning telur (yolk

sac), intravena (kepembuluh darah ) dan kedalam otak embrio. Dalam menginokulasi

virus ke telur selain rute, umur telur juga harus diperhatikan, sebab pada umur tertentu,

pada daerah tertentu kondisinya optimal. Bila akan menginokulasi kedaerah ruang

amnion , pembuluh darah ( intra vena) dan kantong kuning telur sebaiknya digunakan

telur yang berumur 5-7 hari karena pada umur tersebut embrio masih muda dan kecil

sehingga kuning telur masih cukup besar ukurannya demikian juga ruang amnionnya.

Untuk menginokulasi ke daerah ruang alantois dilakukan pada tekur yang berumur 9-11

hari karena pada saat itu luas ruang alantois yang optimal dan bila akan menginokulasi

ke membran khorio alantois sebaiknya pada telur yang berumur 12-14 hari sebab pada

umur tersebut mambran cukup kuat untuk ditarik dan dibuat kantung udara buatan.

Sebelum diinokulasi telur-telur yang akan digunakan terlebih dahulu dihapus

hamakan menggunakan alkohol 70% atau campuran alkohol 70% dengan 2% iodium

pada daerah yang hendak diinokulasi. Kemudian menggunakan bor telur dibuat lubang

sesuai dengan rute inokulasi yang diinginkan. Syringe (alat suntik) yang digunakan

sebaiknya berukuran 1 ml, dengan jarum ukuran No. 25 gauge. Umumnya dosis

inokulasi tiap telurnya 0,1-0,2 ml. Setelah inokulasi lubang tempat kita inokulasi ditutup

dengan bahan- bahan seperti paraffin, kolodion, lem plastik atau isolasi. Setelah

ditutup, telur-telur tersebut dieramkan dalam inkubator.

Prosedur inokulasi pada telur

Pada praktikum kali ini yang akan dicoba adalah membiakkan /

menumbuhkan virus pada ruang alantois menggunakan virus tetelo ( Newcastle

Disease). Virus tetelo ( Newcastle Disease) atau virus ND merupakan virus hidup yang

sel targetnya adalah sel epitel mukosa saluran pernafasan atau pencernaan sehingga

kita pilih ruang alantois sebagai tempat inokulasinya karena pada ruangan tersebut

banyak sel epitel khorion dan alantois yang bisa menjadi sel targetnya.

Gambar 1. Telur embrio tertunas dengan inokulasi ruang alantois

Bahan dan alat :

1. Telur embrio tertunas umur 9-11 hari

2. Inokulum yang berupa suspensi virus ND yang telah ditambahkan antibiotik

dengan dosis 10.000 IU penicilin dan 10.000g streptomicyn tiap mililiter

suspensi virus.

3. Alat suntik (syringe) 1 ml

4. Bor telur

5. alat candling

6. kolodion/ lem/ selotip/cat kuku

7. kapas dan alcohol 70%

Cara kerja :

1. Adakan peneropongan (candling) pada telur yang akan digunakan. Tentukan

batas kantung udara dan letak kepala embrio. Beri 2 tanda menggunakan

pensil, satu pada bagian atas kepala embrio dan sebuah diatas kantung

udara.Tuliskan nama , NIM, Sub.kelompok saudara, dan tanggal di kulit

kerabang telur menggunakan pensil.

2. Hapus hamakan daerah yang diberi tanda tersebut dengan mengoleskan alkohol

70%.

3. Buat lubang pada bagian kulit telur menggunakan bor telur tetapi jangan sampai

merusak “shell membrane” di dua tempat yng diberi tanda.

4. Inokulasikan 0,2 ml. suspensi virus (inokulum) kedalam ruang alantois,

orientasinya melewati batas kantung udara melalui lubang di atas kepala embrio.

5. Tutup kembali lubang tempat penyuntikan dengan kolodion atau bahan penutup

lainnya.

6. Eramkan dalam incubator 37o-38o celcius dan amati tiap hari (dengan dicandling)

sampai hari ke empat. Telur yang mati 24 jam setelah inokulasi disingkirkan

karena kematian biasanya bukan oleh virus tetapi adanya kontaminasi

organisme lain. Telur yang mati pada 2-4 hari setelah inokulasi disimpan dalam

refrigator (lemari pendingin), sedangkan telur yang tidak mati diamati sampai hari

keempat post inokulasikan.

7. Pada hari keempat telur yang masih hidup dimasukan kedalam refrigator selama

24 jam untuk mematikan embrionya. Telur-telur ini akan digunakan untuk

praktikum berikutnya. Dari telur ini dapat diamati dan diisolasi / dipanen

virusnya dari cairan alantois untuk dilakukan identifikasi.