Uji Aktivitas Antibakteri Pada Minyak Atsiri Costus speciosus, Crytocarya massoia, Hedycium coronarium, Nicolaia speciosa, seledri Terhadap Bakteri Escherichia coli dan Staphylococcus aureus.Waktu dan Tempat Pelaksanaan : Sabtu 09 November 2013 pukul 09.00-14.00 WIB dan Minggu 10 November 2013 pukul 13.00- 16.00 WIB di Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga.AlatdanBahan :Alat :1. Cawan petri 2. Tabungreaksi3. Pinset4. KawatOse5. Spektrofotometer6. Waterbath7. Raktabungreaksi8. Mikropipet9. Spirtus10. KertasCakram Antibiotic Tetrasiklin 30g/disc

Bahan :1. MinyakatsiriCostusspeciosus2. MinyakatsiriHedyciumcoroarium3. MinyakatsiriCryptocaryaMassoia4. MinyakatsiriNicolaiaspeciosa5. Minyakatsiriseledri6. MHA7. MSA (media bakteri Staphylococcus aureus)8. EMB (media bakteri Eubacteria coli)9. Biakan bakteri Escherichia coli10. Biakan bakteri Staphylococcus aureus11. Akuades 12. Larutan fisiologis NaCl13. Kapas14. Aluminium foil15. Pelarut n-heksana pro-analis

Prosedur Kerja :A. Pembuatan Media dan Sterilisasi1. Menimbang MHA 7,6 gram2. Memanaskan akuades 200 ml hingga mendidih sebentar kemudian melarutkan MHA ke dalam larutan akuades tersebut sambil diaduk hingga homogen3. Menuangkan larutan tersebut ke dalam botol bening kemudian ditutup dengan aluminium foil lalu mendiamkannya selama 1 jam dan proses ini merupakan sterilisasi4. Menimbang MSA 5,5797 gram5. Memanaskan akuades 50 ml hingga mendidih sebentar kemudian melarutkan MSA ke dalam larutan akuades tersebut sambil diaduk hingga homogen 6. Menuangkan larutan tersebut ke dalam 10 tabung reaksi dengan volume yang sama kemudian masing-masing tabung ditutup dengan aluminium foil lalu mendiamkannya selama 1 jam proses ini disebut sterilisasi.7. Menimbang EMBseberat 1,0973 gram 8. Memanasakanakuades 20 ml hinggamendidihsebentarkemudianmelarutkan EMB kedalamlarutanakuadestersebutsambildiadukhinggahomogen9. Menuangkanlarutantersebutkedalam 10 tabungreaksidengan volume yang samakemudianmenutupnyadenganaluminium foillalumendiamkannyaselama 1 jamdan proses inidinamakansterilisasi.

B. Proses Peremajaan1. Memindahkan bakteri dari biakan ke media masing masing. 2. Langkahnya kawat ose dipanaskan kemudian didinginkan sebentar lalu mulut tabung yang berisi media MSA dipanaskan pada nyala api.3.Lalu kawat ose dimasukkan ke tabung reaksi tersebut untuk mengambil bakteri Staphylococcus aureus dengan cara menggoreskan kawat ose tersebut ke bakteri 4.Lalu Memanaskan mulut tabung berisi media MSA diatas nyala api kemudian memasukkan kawat ose yang terdapat bakteri Staphylococcus aureus dengan menggoreskan bakteri tersebut kedalam 4 media MSA lalu membiarkannya dalam keadaan miring 5.Kemudiandiletakkanselama 24 jam diruanginkubator6.Mengulangi prosedur 2-5 pada Escherichia coli dengan media MSA diganti EMB

C. Proses PemindahanSuspensiBiakankedalamLarutanFisiologis1.Memindahkanbakteri yang telahberada di media kedalambotoltabung yang berisilarutanfisiologisNaCl2.Langkahnyakawatosedipanaskankemudiandidinginkansebentarlalumuluttabung yang berisibakteri Staphylococcus aureusdan media MSAdipanaskanpadanyalaapi.3.Lalukawatosedimasukkanketabungreaksitersebutuntukmengambilbakteri Staphylococcus aureusdengancaramenggoreskankawatosetersebutkebakteriStaphylococcus aureus.4.Lalumulutbotol yang berisilarutanfisiologisdipanaskan, kemudiankawatose yang telahberisibakteri Staphylococcus aureusdicelupkankedalamlarutanfisiologishinggabakteriberpindahsemuakedalamlarutanfisiologistersebut5.Kemudianbotolbeningtersebutdivortexhinggahomogen6.Mengulangi prosedur 1-5 pada bakteri Escherichia coli

D. PengukuranNilai OD (Optical Density)

1.Mengambil 10 ml dengan pipet volumkedalamtabungreaksiuntukmengukur OD (Optical Density) 2.Menyiapkanlarutanblanko yang berisilarutanfisiologisNaCl3.Mengukurnilai OD padalarutanblankountukmengenolkan4.Mengukur nilai OD pada larutan berisi bakteri dengan 450 nm. Berdasarkan literatur dianjurkan nilai OD pada bakteri 0,1. Bila nilai OD > 0,1 maka suspense harus di encerkan dengan akuades dengan rumus V1.N1 = V2.N2 dengan V1= volume suspense perlakuan N1=Nilai OD suspense perlakuan V2=volume suspense yang dicari N2- Nilai OD=0,1 dan jika OD < 0,1, maka suspense harus mengulangi prosedur 12-16 hingga menunjukkan nilai OD = 0,1.5. Mengulangi prosedur 1-4 untuk bakteri Escherichia coli.E. Proses Pour PlateE.1. Pada Media Perlakuan1.Menyiapkan media ujidayahambatbakteri. Dimulaidenganmemasukkanbotollarutan MHA dalam water bath dengansuhu 50C.2.Setelah kira kira 15 menit, MHA dibiarkan pada suhu kamar selama 15 menit. Kemudianmenuangkanmasing masing 1 ml MHA keenamcawan petri denganmemanaskanmulutbotolbeningdiatasnyalaapi agar terhindarpatogen.3.Kemudianmemipet 5 ml suspensibiakanbakteri Staphylococcus aureusdalamlarutanfisiologisdengan OD = 0,1 padake lima cawan petri yang telahberisi 1 ml MHA, dan 1 cawan petri tidakdiberibakterinamunhanya MHA sajasebagai control. Laludigoyang-goyangkanhinggahomogen.Lalumembiarkannyaagakmemadat.4.Memberi label padakelimacawan petri tersebutberdasarkannamasampelminyakatsiriCostusspeciosus, Hedyciumcoronarium, Massoia, Nicolaiaspeciosa5.Menyiapkan disc untukujidayahambatbakteripadasampelminyakatsiridenganmenggunakanpinsetdanberadadidekatnyalaapikemudiandiletakkanpadacawan petri kosongdanditutup6.Meneteskan 25 L sampelminyakatsiriCostusspeciosuspada 1 disc lalumeletakkandenganhati-hatidanberadadidekatnyalaapi, kedalam media MHA sehingga 3 disc dalam 1 cawan petri.7. Menutup cawan petri dan meletakkan pada suhu kamar selama 24 jam lalu mengamati hasil.8.Mengulangi prosedur 1-7 untuk sampel minyak atsiri Hedycium coronarium, Massoia, dan Nicolaia speciosa9.Mengulangi prosedur 1-11 pada bakteri Escherichia coli.E.2 Proses Pour Plate Pada Media Kontrol 1.Menyiapkan media uji daya hambat bakteri. Dimulai dengan memasukkan botol larutan MHA dalam water bath dengan suhu 50C. 2.Setelah kira kira 15 menit, MHA dibiarkan pada suhu kamar selama 15 menit. Kemudian menuangkan 1 ml MHA ke dua cawan petri dengan memanaskan mulut botol bening diatas nyala api agar terhindar patogen.3.Laludigoyang-goyangkanhinggahomogen. Lalu membiarkannya agak memadat.4.Memberi label pada dua cawan petri tersebut sebagai media kontrol.5.Menyiapkan disc untuk uji daya hambat bakteri dengan menggunakan pinset dan berada didekat nyala api kemudian diletakkan pada cawan petri kosong dan ditutup6.Meneteskan 25 L pelarut n-heksan pro-analis pada 1 disc lalu meletakkan dengan hati-hati dan berada didekat nyala api, kedalam media MHA sehingga 3 disc dalam 1 cawan petri.7. Menutup cawan petri dan meletakkan pada suhu kamar selama 24 jam lalu mengamati hasil.

Hasil PengamatanA. Pembuatan Media dan Sterilisasi

Penimbangan MHA Melarutkan MHA dalam 200ml Larutan MHAakuades

Penempatan media MHAtunggu 1 jamLarutan MSA dalamakuadesmeletakkan MSA pada 10 tabungMenutupdengankapastunggu 1 jam

Melarutkan EMB dalam 1, ml Menuangkan EMB padaMenutupdengankapasAkuades6 tabungreaksitunggu 1 jam

Peletakkan tabung media sebelum peremajaanPenempatan media selama proses sterilisasi

B.Proses Peremajaan

Penyediaan biakan bakteri S.aureus E.coli

Pemindahan bakteri dari biakan menuju mediaC.Proses Pemindahan Suspensi Biakan ke dalam Larutan Fisiologis

Mengambil S.aureus dengan ose yang Meletakkan S.aureus pada larutan fisiologis NaClSebelumnya telah dipanaskan yang sebelumnya mulut botol telah dipanaskandiatas nyala api diatas nyala api

PengukuranNilai OD (Optical Density) Menghomogenkan S.aureus dengan larutanMenghasilkan nilai 0,1pada 450 nm Fisiologis NaCl dengan vortex sejenak.

Mengambil E.coli dengan ose yang sebelumnya Meletakkan E.coli pada larutan fisiologis NaClTelah dipanaskan diatas nyala api yang sebelumnya mulut botol telah dipanaskandiatas nyala api

PengukuranNilai OD (Optical Density) MenghomogenkanE.colidenganlarutanMenghasilkannilai 0,1pada 450 nm FisiologisNaCldengan vortex sejenak.

E.Proses Pour PlateE.1. Proses Pour Plate pada Media Perlakuan

Menguapkanpelarut n-heksanpadaminyakatsiriMinyakatsirisetelahdiuapkanselama 1 Costusspeciosus, Cryptocarya massoia, Hedycium malamcoronarium, Nicolaia speciosa, dan seledri selama 1 malam.

Penyiapan KertasCakram Antibiotic Tetrasiklin 30g/disc Mengambil satu persatu disc

Meletakkan disc yang telah diambil pada Memanaskan pinset sebelum mengambil disccawan petri dan ditutup

Menyiapkan cawan petri Memanaskan MHA pada Waterbath 50C

Menuangkan 15 ml MHA pada 12 cawan petri Meletakkan MHA padasuhukamarsetelahdariwaterbath agar suhutidakterlalukritissaatdimasukkankecawan petri

Staphylococcus aureus dan media MSA Escherichia coli dan media EMB

Memutar-putar cawan petri agar tercampur Menuangkan 1 ml suspensi bakteri MHA dan bakteri

Memutar-putar hingga ke 12 cawan petri Mengambil disc satu persatu

Menuangkan 25L sampel yaitu munyak atsiri Meletakkan disc berisi sampel pada cawan diatas permukaan disc dengan pipetmikro petri yang telah berisi MHA dan Bakteri dekatdekat nyala api nyala api

Disc yang telah terletak didalam cawan petri hendaknya melabeli sesuai nama sampel dan ditutup dan diantara penutup dengan cawan petri dengan plastic warp. Meletakkan pada suhu kamar selama 3 menit kemudiandiletakkan dalam inkubator 24 jam dengan suhu 37 C

E.2. Proses Pour Plate pada Media Kontrol

Mengambil disc satu persatu Menuangkan 25 L pelarut n-heksan diatas permukaan disc

Meletakkan disc berisi n-heksanke dalam cawan petri Disc yang telah diletakkan dalam cawan Yang telah berisi MHA dan Bakteri E.coli dan S.aureuspetri daiatas disc

Pada Hari Selasa, 12 November 2013 pukul 13.00 WIBPengukuran Daya Hambat (Halo) Bakteri Escherichia coliNoNama BakteriDisc IDisc IIDisc III

1Costus speciosus

2Cryptocarya massoia1,6 cm1,5 cm1,1 cm

1,5 cm1,4 cm1,1 cm

1,6 cm1,5 cm1,1 cm

1,57 cm1,47 cm1,1 cm

3Hedychium coronarium

4Nicolaia speciosa (B.l.) Horan0,6 cm0,7 cm0,7 cm

0,7 cm0,7 cm0,7 cm

0,7 cm0,7 cm0,8 cm

0,67 cm0,7 cm0,73 cm

5Seledri0,9 cm 0,9 cm0,9 cm

0,9 cm0,9 cm0,9 cm

1,0 cm0,9 cm0,9 cm

0,93 cm0,9 cm0,9 cm

6.Kontrol

PengukuranDayaHambat (Halo) BakteriStaphylococcusaureusNoNama BakteriDisc IDisc IIDisc III

1Costus speciosus1,2 cm1,0 cm0,8 cm

1,4 cm0,9 cm0,8 cm

1,2 cm1,0 cm0,8 cm

1,27 cm0,97 cm0,8 cm

2Cryptocarya massoia1,5 cm1,4 cm1,5 cm

1,4 cm1,5 cm1,4 cm

1,4 cm1,5 cm1,5 cm

1,43 cm1,47 cm1,47 cm

3Hedychium coronarium1,4 cm1,5 cm1,0 cm

1,3 cm1,5 cm1,0 cm

1,3 cm1,5 cm1,0 cm

1,33 cm1,5 cm1,0 cm

4Nicolaia speciosa (B.l.) Horan1,3 cm1,1 cm0,8 cm

1,2 cm1,1 cm0,8 cm

1,2 cm1,1 cm0,8 cm

1,23 cm1,1 cm0,8 cm

5Seledri1,1 cm1,0 cm1,0 cm

0,9 cm1,0 cm1,0 cm

0,9 cm1,0 cm1,0 cm

0,97 cm1,0 cm1,0 cm

6.Kontrol0,8 cm0,9 cm0,7 cm

0,9 cm0,9 cm 0,7 cm

0,8 cm0,9 cm0,7 cm

0,83 cm0,9 cm0,7 cm