IMMUNOHEMATOLOGI

dr. Suryanto, SpPK

2

IMUNOHEMATOLOGI

Cabang Ilmu Patologi Klinik yg mempelajari penggunaan teknik imunologik untuk mendeteksi kelainan-kelainan hematologik, al:

1. Reaksi transfusi hemolitik 2. Reaksi hemolitik pd bayi yang baru lahir (HDN=Hemolytic Disease of the Newborn) 3. Reaksi hemolitik pd AIHA (Auto Immuno Hemolytic Anemia)

Pemeriksaan laboratorium yg sering

dilakukan untuk kepentingan klinis adalah :

1. Deteksi Antigen (Ag) gol darah

ABO & Rhesus (Rh)

2. Tes pretransfusi : Cross matching test

reaksi silang Mayor & Minor

3. Deteksi antibodi (Ab) Coomb’s test

(Test Anti Globulin)

Reaksi transfusi hemolitik

HDN AIHA

Gol drh ABO

Gol drh Rh Reaksi silang

Coomb’s test

Pendahuluan

Normal:

Abnormal: hemolisis

mengalami hemolisis

• Jutaan eritrosit diproduksi tiap menit, umur 120 hari• Eritrosit tua, ‘mati’: dibersihkan dan dihancurkan oleh SRE (limpa)

• Penyebab hemolisis: sebagian besar krn adanya antibodi• Tipe hemolisis : destruksi/kerusakan imun• Tjd pd reaksi transfusi, hemolytic disease of the newborn (HDN), autoimmune hemolytic disease (AIHA)

Pendahuluan

>> reaksi transfusi hemolitik disebabkan krn kerja antibodi (dlm serum pasien) spesifik berinteraksi dg antigen donor

Dasar-dasar imunologi

Dasar imunologi

Eritrosit mengekspresikan antigen (Ag) (glikoprotein) di permukaan sel eritrosit, Ag tsb disebut Aglutinogen

Aglutinogen bersifat imunogenik Antigen A : golongan darah A Antigen B : golongan darah B Tidak mengekspresikan Ag A & B : gol O

Normal seseorang membentuk aglutinin thd Antigen yg “ tidak dimiliki “ oleh eritrosit didlm tubuhnya sendiri

Antibodi (Ab) dlm serum (Aglutinin): anti A, Anti B

Pendahuluan

1. Ab natural dan Ab imun

Ab natural : merupakan IgM, timbul sbg akibat rangsangan bahan alami yg

menyerupai Ag A/B (berasal dr bakteri/makanan atau produk bakteri) yg masuk tubuh, terbentuk ssdh umur 6 bln.

Ab imun (Allo Ab) :

merupakan IgG thd Ag pada individu dgn genetik berbeda ttp spesies sama, o.k masuknya Ag A dan/atau B kedlm tubuh melalui sirkulasi darah (transfusi, placenta) atau pemaparan thd produk darah

Macam-macam antibodi (Ab)

2. Complete Ab dan incomplete Ab

Complete Antibody (Ab sempurna):

Antibodi yg mampu menyebabkan aglutinasi langsung ( direk ) eritrosit-eritrosit yg tersuspensi di dalam salin (Ig M)

Incomplete Antibody (Ab tak sempurna) :

Antibodi yg tidak mempunyai kemampuan untuk menyebabkan aglutinasi secara langsung dari eritrosit-eritrosit tsb tanpa penambahan fase antiglobulin (Ig G)

3. Ab tipe hangat ( Warm ) & Ab tipe dingin ( Cold )

Ab tipe warm : bereaksi lebih cepat pd 370 C

(IgG)

Ab tipe cold : bereaksi lebih cepat pd 200C

(IgM)

Alur uji laboratorium pre-transfusi

b. Eritrosit

Buat suspensi eritosit1. 5% dlm salin2. 10% dlm salin3. 40% dlm salin a/ serum

Pasien

Donor

a. Serum

Reaksi silangABORh

a. Serum

Buat suspensi eritosit1. 5% dlm salin2. 10% dlm salin3. 40% dlm salin a/ serum

c. Pem gol ABO, Rh – metode slide, jika hasil OK:

d. Reaksi silang

b. Eritrosit

MAYORFase IFase IIFase III

MINORFase IFase IIFase III

e. CCC

Minor + : sebab?- Ab donor ?- Ab melapisi eritr pasien ?

Cek dg tes Coombs Direk

Merup tes Coombs indirek

Golongan darah

Tipe gol drh ditentukan oleh ekspresi antigen di permukaan eritrosit (Antigen A, B, H)

Ditemukan I x oleh Landsteiner th 1900

(Golongan A, B, O) Golongan AB ditemukan oleh

Von Decastello & Sturli (1902) Identifikasi gol drh ditentukan dg melihat reaksi

aglutinasi antara Ag & Ab

A

A

Anti B

B

Anti A

BH

H

Y

Y

Y

Y

Y

YAntigen/aglutinogen A

Antigen/aglutinogen B

Anti/aglutinin A

Anti/aglutinin B

Y

Golongan A Golongan B

Anti B

YAntigen/aglutinogen A

Antigen/aglutinogen B

Anti/aglutinin A

Anti/aglutinin B

Golongan AB Golongan O

ABB H

A

-

-

O --

-

H

Anti A

Y

Y

Y

Y

Golongan darah

Genotipe Gen Imunologi

A AA

atau

AO

Homozygot

Heterozygot

Memp Ag A & H

Memp Anti B

B BB

Atau

BO

Homozygot

Heterozygot

Memp Ag B & H

Memp Anti A

AB AB Heterozygot Memp Ag A, Ag B, Ag H

Tidak punya anti

O OO Homozygot Memp Ag H

Tdk punya Ag A & B

Memp Anti A

Memp Anti B

Bombay hh Homozygot Tdk memp Ag H, A & B

Memp anti A, anti B, & anti H

Phenotype A dpt dibagi menjadi sub group :

Sub grup dlm sistem ABO : A1 & A2

± 80 % group A : ph A1

± 20 % group A : ph A2

A2 : bereaksi lemah, kdg2 terdeteksi sbg Gol O

A2B : bereaksi lemah, kdg2 terdeteksi sbg Gol B

Antigen (Ag) yg termasuk sistem gol AB terdapat dlm :

- eritrosit, endotel & epitel

- cairan tubuh (mis : saliva) : glikoprotein

Kualitatif dan

Kuantitatif berbeda

A A Anak

B AB AB Semua

Gol AB

100%B AB AB

Istri

Suami

Suami istri homozygot

OOAOO

Bisa A, B, O, AB

Prob ms

25%

BOABB

AnakOA

Istri

Suami

Suami istri heterozygot

BOABB

Bisa B a/ AB

Prob.

50:50

BOABB

AnakOA

Istri

Suami

Suami heterozygot AIstri homozygot B

AOAOO

Bisa A a/ AB

Prob.

50:50

ABABB

AnakAA

Istri

Suami

Suami homozygot AIstri heterozygot B

OOOOO

100%

O

OOOOO

AnakOO

Istri

Suami

Suami homozygot OIstri homozygot O

BOAOO

50% A

50% B

BOAOO

AnakBA

Istri

Suami

Suami heterozygot ABIstri homozygot O

OOAOO

A 75%

O 25%

AOAAA

AnakOA

Istri

Suami

Suami heterozygot AIstri heterozygot A

BOBOO

100%

B

BOBOO

AnakBB

Istri

Suami

Suami homozygot BIstri homozygot O

Golongan darah Bombay

Darah Bombay adalah homozygot hh Jarang >> 99,9% individu : HH atau Hh Pertama kali ditemukan oleh Bhende di Bombay

(1952) Dicurigai adanya darah yg tidak diaglutinasi oleh

anti-A, anti-B, anti-AB dan anti-H Dituliskan sebagai golongan darah Oh untuk

menunjukkan tidak adanya substansi H Gen h tidak memproduksi L-fucocyltransferase Memp Anti-A, anti-B, & anti-H

Seorang yang tidak mengekspresikan gen H

(disbt juga genotype-nya hh)

memp phenotype

Bombay (Oh)

tidak memproduksi substrat H

gen A & B juga tdk bisa diekspresikan shg juga tidak mampu memproduksi Ag A dan Ag B

Perbedaan gol drh Oh dan O biasa

Gol Anti A

Anti B

Anti AB

Anti H Sel A1

Sel A2

Sel B Sel O

Oh/

Bombay - - - - + + + +

O - - - + + + + -

Golongan BOMBAY

BOMBAY

h

Anti/aglutinin H

Y

Y

Anti B

Anti A

Y

Y

Aglutinasi eritrosit oleh adanya reaksi

antigen-antibodi ada 2 tahap :

1. Tahap Sensitisasi

2. Tahap Hemaglutinasi

Lisis eritrosit terjadi bila seluruh rangkaian sistem komplemen teraktifkan menyertai interaksi Ag-Ab

Aglutinasi terjadi bila Ab yg terikat menghubungkan eritrosit-eritrosit yg berdekatan membentuk gumpalan

Reaksi aglutinasi

B

B

BB

Anti A

B

Hemaglutinasi= reaksi positif

B

B

Anti-B

+

Anti-B

Anti-B

Anti-B

B

B

Golongan B

Y

Y

Y

Y

Reaksi aglutinasi

O

Tdk tjd hemaglutinasi= reaksi negatif

O

O

Anti-A

+

Anti-B

Golongan O

O -

Anti AAnti A

Anti A

-

-

Anti B Anti B

Anti BH

Anti-B Anti-AB

Anti-A Y Y

Y

Reaksi penggolongan darah

Eritrosit

pasien

Reaksi dg anti-A

Reaksi dg anti-B

Reaksi dg

anti-AB

Interpretasi

1 Negatif Negatif Negatif O

2 + Negatif + A

3 Negatif + + B

4 + + + AB

ANTIGLOBULIN TEST ( COOMBS TEST )

Definisi :

Tes utk mendeteksi adanya antibodi tidak sempurna

(incomplete antibody) yang diabsorpsi oleh eritrosit dengan jalan mereaksikan anti Ig G dan anti komplemen dengan eritrosit yg sudah tersensitisasi terjadi hemaglutinasi

Serum Coombs :

Serum kelinci yg telah diimunisasi dg fraksi globulin/Ig G manusia, sehingga disebut juga Serum Anti Globulin

Pembuatan serum Coombs:• Serum manusia disuntikkan ke kelinci• Kelinci membuat Ab thd serum mns yg disuntikkan, disebut Rabbit Antihuman globulin = serum Coombs

Digunakan dlm Tes Coombs / Uji Antiglobulin

Direct Coomb’s TestIndikasi : untuk diagnosis HDN ( Hemolytic Disease of the Newborn ) AIHA ( Autoimmune Hemolytic Anemia ) Reaksi transfusi hemolitik Drug Induced Hemolytic Anemia

Indirect Coomb’s TestIndikasi : Skrining Antibodi

Deteksi Ab IgG; IgG anti Rh (D), lain2 Ig G Deteksi thd variant Rh yg bereaksi lemah, Ag Kell & Duffy Pada keadaan hipo/a- gamaglobuliemia/a-

gamaglobulinemia Pada cross matching (reaksi silang)

Direct Antiglobulin Test ( Direct Coombs Test )

Untuk mendeteksi incomplete antibody yg melapisi eritrosit penderita in vivo

Cara : Eritrosit penderita dicuci dengan salin untuk

menghilangkan globulin plasma yang tidak bersifat

antibodi spesifik Campur dengan serum Coombs tambahkan pada

antibodi spesifik “incomplete“ yg diabsorbsi

/melapisi eritrosit in vivo

DIRECT ANTIGLOBULIN TEST(DAT)/Direct Coombs Test

Untuk mendeteksi incomplete antibody ygmelapisi eritrosit penderita in vivo

+

Serum Coombs

E

Ag Incompl Ab

hemaglutinasi

Indirek Antiglobulin Test / IAT ( Indirect Coombs Test )

Untuk mendeteksi incomplete antibody Ig G incomplete yang terdapat didalam serum penderita :Cara : Eritrosit normal dari golongan darah yg sama atau gol darah O disuspensikan ke dalam serum penderita dan diinkubasikan pada 370 C Sesudah dicuci dengan salin, tambahkan serum Coombs, disentrifus 1 menit pada 1000 rpm agglutinasi serum penderita mengandung antibodi tsb positif

E

Serum Coombs

IATAb dlm serum

Inkubasi 37° C

Cuci dg salin

+

Sentrifus 1000 rpm (1 menit)

hemaglutinasi

Ag

E

1 2

3 4

Kd tes Coombs menghasilkan hasil NEGATIF PALSU, sebab:

1. Pencucian eritrosit seblm pe + an serum Coombs kurang sempurna, msh tdp sisa globulin yg menetralkan serum Coombs2. Salin terkontaminasi oleh protein/globulin3. Lupa menambahkan serum Coombs

Diperlukan Coombs Control Cells (CCC)

Sistim Rhesus

Sampai saat ini dikenal 6 Ag: C & c, D & d, E & e Kombinasi: CDe, cDE, cDe, CDE, cdE, CdE, cde,

Cde (terbanyak CDE, cDE, cde) Hasil: Rhesus + & Rhesus – Yang menentukan + a/ - adalah: ada tidaknya

antigen D Berguna dalam klinik Rhesus - : >> orang kulit putih Indonesia: <<

Golongan Darah Rhesus ( Rh )

D + : gol darah Rh +, mempunyai Ag D D - : gol darah Rh - , genotipe cde/cde, tdk mempunyai

Ag D, mampu membentuk Anti D bila terjadi

pemaparan dg eritrosit Rh + Du : Rh + lemah, bereaksi lambat, sering keliru

dengan D-

Reaksi silang (Crossmatch)

Merupakan bagian dari tes kompatibilitas Tes kompatibilitas mengandung:

1. Review riwayat blood bank pasien & catatan pasien sebelumnya (transfusi, kehamilan) 2. Penggolongan drh ABO & Rh 3. Skrining antibodi 4. Reaksi silang

Kegunaan reaksi silang

Cek final kompatibilitas ABO antar donor & pasien

Mendeteksi antibodi dlm serum penderita yg akan bereaksi dg Ag donor, yg tak terdeteksi dg tes skrining Ab

Reaksi Mayor : reaksi antara eritrosit donor dengan serum resipien

Reaksi Minor : reaksi antara eritrosit resipien

dengan serum donor

Reaksi silang terdiri atas 2 macam :

Eritrosit Serum

Eritrosit MINOR

Serum MAYOR

DonorResipien

-

-

3 fase reaksi silang

Fase I : Fase suhu kamar dalam medium salin

serum + suspensi sel dlm salin Suhu kamar 250 C Tahap penggolongan darah & deteksi complete Ab adanya cold autoagglutinin/auto-Ab tipe dingin adanya cold alloagglutinin/allo-Ab tipe dingin

(anti A1, anti M, anti P1, anti Lewis dll)

Fase II : Fase inkubasi 37°C• Tahap Rh grouping

• Incomplete Ab akan tersensitisasi

• Keseimbangan ikatan Ag-Ab berlangsung beb saat (15-60 memit)

• Inkubasi terlalu lama : sensitisasi melemah

• Inkubasi dlm Bovine Albumin 22% hanya 15 menit

• Kd incomplete Ab sistim Rh dpt terdeteksi (anti-D, anti-C, anti-E), tampak reaksi aglutinasi

• incomplete Ab lain spt K, k, Fya, Fyb, Jka, Jkb hanya tersensitisasi saja, tampak aglutinasi jika di + reagen Antiglobulin

Fase III : Fase Antiglobulin• Mendeteksi incomplete Ab

• Sel pd fase II dicuci, kmd di + serum Coombs

• = Tes Coombs/Antiglobulin Indirek

REAKSI TRANSFUSI

Reaksi transfusi hemolitik Akut/segera Lambat

Reaksi transfusi nonhemolitik Akut/segera Lambat

RT HEMOLITIK AKUT

• Eritrosit ditransfusikan, antibodi (IgM) mengenali

eritrosit ikatan Ag-Ab hemolisis sel donor

• Terjadi segera (1-2 jam) ses transfusi

• Pernah dilaporkan tjd dlm beb menit

• Transfusi ABO inkompatibel : mengancam kehidupan,

mengakibatkan:

• shock

• gagal ginjal akut

• DIC

Tanda & gejala klinik reaksi transfusi hemolitik akut

Demam Kedinginan Facial flushing Sakit dada Sakit punggung & panggul Hipotensi Sakit perut Nausea Sesak napas Muntah

Hemoglobinemia Hemoglobinuria Shock Anemia Oliguri a/ anuria (gagal

ginjal) Sakit pd area transfusi Perdarahan menyeluruh Urticaria Diare DIC

RT HEMOLITIK LAMBAT

• Terjadi 3-14 hari sesudah transfusi

• Terjadi karena sebelumnya pernah mengalami hal-hal

berikut (anamnesis):

• transfusi

• kehamilan

• transplantasi

• antibodi tak terdeteksi dgn metode pretransfusi

standard/rutin

• Tanda & gejala klinik lebih ringan: demam, anemia &

ikterik ringan, jarang tjd oliguria & DIC

• Penurunan hb a/ hematokrit ses transfusi dicurigai tjd

RT hemolitik lambat

INKOMPATIBILITAS ABO

HEMOLYTIC DISEASES OF NEWBORN / HDN

Rusaknya eritrosit janin dan neonatus oleh antibodi IgG yang diproduksi oleh ibu Hanya antibodi IgG yg ditransfer aktif melalui plasenta

INKOMPATIBILITAS Rh

INKOMPATIBILITAS ABO

HEMOLYTIC DISEASES OF NEWBORN / HDN

• Terjadi pada ibu gol O dan janin gol A/B• Antibodi ibu (IgG) dpt menembus plasenta dan masuk ke sirkulasi fetal, menempel di eritrosit janin• Terjadi formasi kompleks Ag-Ab destruksi eritrosit (hemolisis)

Y

Ag-Ab

Ibu gol O

Y

YY

YY

Y

Y

lisis

sirkulasi fetal

B

Anti B

Anti A

Kasus berat jarang tjd, lebih ringan dp HDN inkomp. Rh

Terjadi pada setiap kehamilan (resiko mendptkan HDN pd kehamilan I & sesudahnya sama)

Hiperbilirubinemia dlm 12-48 jam (tx dg fototerapi), bisa sp 1-13 hari

Pemeriksaan laboratorium: Karakteristik: - mikrosferositosis, - peningkatan fragilitas eritrositAnemia lebih ringan dp HDN inkompatibilitas RhTes Coombs direk +Bilirubin indirek meningkat ringan

Anti-Kell : >> menyebabkan HDN

HDN inkomp. ABO

INKOMPATIBILITAS Rh

HEMOLYTIC DISEASES OF NEWBORN / HDN

• Terjadi pada ibu gol Rh - dan janin gol Rh +• Antigen Rh (Ag D) : paling antigenik• Subklas IgG1 & IgG3 lebih efisien melisiskan eritrosit dp IgG2

dan IgG4

• Selama kehamilan, & tu saat partus ketika plasenta lepas dr uterus, eritrosit fetus masuk ke sirkulasi ibu• Sel fetus membawa antigen Rh (Rh +) yg diturunkan dr ayahnya• Ibu dgn D – (Rh -), terpapar oleh Rh + , terinduksi membentuk anti-D (ibu tersensitisasi/terimunisasi) • Paparan Rh + juga bisa disebabkan krn transfusi sebelumnya• Anti-D ibu dibawa selama hidup• Sekali ibu terimunisasi oleh antigen Rh maka semua keturunan setelah kehamilan I akan mengalami HDN• Pada kehamilan I, HDN tdk tjd krn ibu belum memp anti D

Hemolytic Disease ofNewborn (HDN)

Ibu Rh -Bayi Rh +

Eritrosit janin masuk ke sirkulasi ibu pada saat kelahiran

Eritrosit janin dikenali olehsistim imun ibu

Ibu tersensitisasi & memproduksiantibodi thd eritrosit janin

Antibodi melewati plasenta masuk dlm sirkulasi janin

Antibodi ibu berikatan dg eritrosit janin

Hemolisis ekstravaskuler : HDN

1

2

3

4

Pemeriksaan Laboratorium

Darah rutin : Anemia ringan – sedang - berat Jumlah lekosit tidak khas (10rb-20rb/mmk)

Retikulosit : meningkat > 10%

Pem darah tepi : - Eritr berinti ++ (>10/100 lekosit) - eritroblastosis,

polikromasi, lekositosis, tombositopenia

Pem kimia drh : Bilirubin indirek meningkat (hemolisis ++)

Pem imunologi : Tes Coombs direk ++

AUTOIMMUNE HEMOLYTIC ANEMIA ( AIHA )

AIHA disebabkan rusaknya eritrosit krn antibodi, yg diproduksi o/ pasien thd antigen yg ada a/ melekat di eritrosit tubuh sendiri

Autoimmune Hemolytic Anemia (AIHA) tipe dingin & hangat

16% kasus Antibodi aktif pd suhu

dingin < 20°C Ig M Penyebab: >> infeksi

MYCOPLASMA PNEUMONIAE

MONONUKLEOSIS INFEKSIOSA (EBV)

CYTOMEGALOVIRUS HIV dll

Hemolisis intravaskuler (sel lisis)

70-75% kasus Antibodi aktif pd suhu hangat 37°C Ig G Penyebab: >> peny autoimun

PENY LIMFOPROLIFERATIF SYSTEMIC LUPUS

ERYTHEMATOSUS (SLE) INFEKSI TERTENTU NEOPLASMA NONLIMFOID ULCERATIVE COLITIS BEB OBAT

Hemolisis ekstravaskuler

(sel tidak lisis)

DINGINHANGAT

AIHA karena infeksi virus

Normal

AIHA tipe dingin

E

Antibodi dibentuk karena induksi antigen di permukaan eritrosit pasien sendiri

Infeksi virus

Aglutinasi(clumping)

YYY

Y

YYY Y

YYY Y

YYY Y

YY YY

YYY Y

Infeksi virus

AIHA tipe dingin

clumping

Aglutinasi(clumping)

YYY

YYYY Y

YYY Y

YYY Y

YY YY

YYY Y

Pemeriksaan laboratoriumDarah rutin

Anemia: sedang sp berat (Hb < 3 g/dl) Granulositosis, pergeseran ke kiri Jumlah lekosit bisa sp > 50 rb/mmk (akut) Jumlah trombosit bisa meningkat

Morfologi darah tepi Eritrosit berinti, polikromasi nyata, anisositosis Eritrofagositosis oleh monosit (hemolisis berat) AIHA tipe hangat: mikrosferosit + (disebabkan krn

ingesti parsial kompleks Ag-Ab oleh makrofag) AIHA tipe dingin:

Akut post infeksi : gb. an mirip AIHA tipe hangat Kronik : aglutinasi eritrosit (clumping)