Download - laporan genmol prokariot
Laporan Praktikum Genetika Molekuler
Nama : Abdullah Adzkiy Robbani Tanggal: 18 Februari 2014
NIM :34110077 Asisten:
Kel/Lab: 11/ Bio 5
IDENTIFIKASI BAKTERI SECARA MOLEKULER
Pendahuluan
Latar Belakang
Escherichia coli atau sering disebut E. coli merupakan bakteri gram negatif berbentuk
batang pendek yang memiliki panjang sekitar 2 μm, diameter 0,7 μm, lebar 0,4-0,7 μm dan
bersifat anaerob fakultatif. E. coli membentuk koloni yang bundar, cembung, dan halus
dengan tepi yang nyata (Jawetz et al. 1995). E. coli adalah anggota flora normal usus. E. coli
berperan penting dalam sintesis vitamin K, konversi pigmen-pigmen empedu, asam-asam
empedu dan penyerapan zat-zat makanan. E. coli termasuk ke dalam bakteri heterotrof yang
memperoleh makanan berupa zat oganik dari lingkungannya karena tidak dapat menyusun
sendiri zat organik yang dibutuhkannya. Zat organik diperoleh dari sisa organisme lain.
Bakteri ini menguraikan zat organik dalam makanan menjadi zat anorganik, yaitu CO2, H2O,
energi, dan mineral. Di lingkungan, bakteri pembusuk ini berfungsi sebagai pengurai dan
penyedia nutrisi bagi tumbuhan (Ganiswarna 1995).
Gen 16S-rRNA pada bakteri banyak digunakan sebagai gen target untuk menganalisis
keragaman genom. Contohnya adalah penelitian yang dilakukan Sudeesh et al. (2002) untuk
mengetahui bakteri V. parahaemolyticus dan V. alginolyticus yang diisolasi dari tambak
udang. Selain itu, Schlulze et al. (2006) juga menggunakan gen 16S-rRNA untuk identifikasi
keragaman bakteri di lingkungan hatchery. Beberapa sebab mengapa gen 16S-rRNA
digunakan untuk identifikasi bakteri yaitu : (1) bersifat universal (dapat ditemukan di semua
Liyana Salsabila G34100010
Ina Agustina G34100038
Eka Maulani G34100043
Bustomi G34100055
Dwika Armyanto G34100111
jenis bakteri), (2) sekuen basanya bersifat konservatif, (3) jumlah di dalam sel melimpah, (4)
memenuhi ukuran untuk perhitungan secara statistika (tidak terlalu panjang dan tidak terlalu
pendek), serta (5) ketersediaan informasinya lengkap, yaitu dengan cara mengakses database
di GenBank (Madigan et al. 1997). Proses amplifikasi gen 16S-rRNA dapat dilakukan
melalui teknik PCR.
Dalam kegiatan biologi molekuler, elektroforesis merupakan salah satu cara untuk
memvisualisasikan keberadaan DNA, plasmid, dan produk PCR. DNA dapat dilihat secara
langsung dan dapat ditentukan ukurannya berdasarkan migrasinya pada gel agarose maupun
gel poliakrilamid. Migrasi DNA dalam gel ini disebut elektroforesis (Lisdiyanti 1997).
Elektroforesis gel agarosa adalah teknik yang umum digunakan untuk analisis protein dan
DNA. Teknik ini merupakan teknik yang menggunakan prinsip elektroforesis zona. Prinsip
kerja elektroforesis gel dimulai saat makromolekul yang bermuatan listrik ditempatkan pada
medium berisi tenaga listrik. Molekul-molekul tersebut akan bermigrasi menuju kutub
positif atau kutub negatif berdasarkan muatan yang terkandung di dalamnya (Magdeldin
2012). Sebagai contoh molekul DNA yang bermuatan negatif dilewatkan melalui medium
gel agarose, kemudian dialiri arus listrik dari satu kutub ke kutub yang berlawanan
muatannya (positif), maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif
melalui membran matriks gel agarose tersebut (Yuwono 2005).
Tujuan
Mengetahui dan dapat mengidentifikasi bakteri menggunakan gen penyandi 16S rRNA.
Metode
Hasil
Gambar 1 Hasil elektroforesis DNA E. coli
DNA kelompok 11
Tabel 1 Nilai kemurnian DNA terhadap kontaminan
Kelompok 260 nm 280 nm Kemurnian DNA
1 0,030 0,027 1,11
2 0,686 0,614 1,11
3 0,160 0,140 1,14
4 0,066 0,053 1,24
5 0,063 0,047 1,34
6 0,061 0,046 1,32
7 0,268 0,175 1,53
8 0,039 0,033 1,18
9 0,066 0,061 1,08
10 0,040 0,035 1,14
11 0,029 0,024 1,20
Contoh perhitungan kemurnian DNA:
Kemurnian DNA kelompok 11 = OD260 = 0,029 = 1,20
OD280 0,024
Pembahasan
DNA yang diisolasi pada praktikum ini adalah DNA prokariot. DNA prokariot memiliki
struktur yang berbeda dengan struktur DNA eukariot. DNA prokariot tidak memiliki protein
histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linear dan memiliki protein
histon (Klug dan Cummings 1994). Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada 2, yaitu
sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran
berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan
berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada di bagian atas tabung. Hasil
sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian
atas dan pelet pada bagian bawah. Adapun presipitasi adalah proses pengendapan DNA dengan
suatu larutan tertentu agar utas-utas DNA tidak kembali menggulung (coiling) (Campbell 2002).
Langkah awal teknik isolasi DNA dapat dilakukan dengan cara merusak membran sel
atau membran inti sel. Pada praktikum ini, pertama-tama CTAB dan PVP ditambahkan ke dalam
bahan. Fungsi penambahan CTAB (cetyl trimethyl ammonium bromide) yaitu untuk melisiskan
membran sel, sedangkan PVP (polyvinilpirolidone) ditambahkan untuk melindungi agar DNA
tidak ikut terkena kerusakan. Kemudian, bahan disentrifugasi hingga didapatkan supernatan dan
pelet. Supernatan diambil dan dipindahkan ke dalam tabung baru, lalu
Phenol:Chloroform:Isolamyl Alcohol (PCI) ditambahkan ke dalam tabung berisi supernatan. PCI
digunakan untuk proses pemurnian larutan, yaitu proses memisahkan DNA dari kontaminan-
kontaminan yang ada. Phenol merupakan pelarut organik yang dapat melarutkan protein dan
lipid. Chloroform berfungsi untuk membersihkan protein dan polisakarida dari larutan,
sedangkan Isoamyl Alcohol berfungsi untuk memekatkan, memisahkan DNA dari larutan dan
mengendapkan DNA (Muladno 2002).
Larutan-larutan lain yang digunakan dalam praktikum ini yaitu NaOAC, ETOH, ddH2O,
RNAse dan EtBr. Penambahan NaOAC dilakukan sebagai proses pemurnian lebih lanjut dan
pembilasan, sedangkan tujuan penambahan ETOH atau etanol absolut agar terjadi pengikatan air
sehingga terjadi pengendapan DNA. Larutan ddH2O dan RNAse berfungsi menghilangkan sisa-
sisa RNA untuk memperoleh DNA yang lebih murni (Yuwono 2005). Intercalating agent
ethidium bromide (EtBr) adalah pewarna fluoresen untuk mendeteksi asam nukleat, EtBr ini
akan mengikat pada sela-sela pasangan basa DNA. EtBr berfungsi untuk membantu visualisasi
karena EtBr akan memendarkan sinar UV. Jika gel disinari dengan sinar UV dari bawah, maka
akan tampak citra berupa pita-pita DNA pada gel (Marks et al. 2000).
Gambar hasil pengamatan menunjukkan tidak ada sumur DNA yang berhasil running
DNA termasuk DNA marker. Sehingga dapat dikatakan bahwa percobaan elektroforesis dengan
DNA E. coli pada praktikum ini tidak berhasil. Diperkirakan hal ini terjadi disebabkan kesalahan
pada saat percobaan atau fungsi alat yang tidak berjalan dengan baik. Pada tabel pengamatan,
dapat dilihat bahwa pada praktikum ini juga tidak ada sumur yang mencapai nilai 1,8. Hal
tersebut menandakan bahwa DNA-DNA bakteri yang dilakukan pada praktikum ini tidak murni.
Dari semua sumur, hanya satu sumur yang paling mendekati nilai kemurnian 1,8 yaitu pada
sumur kelompok 7 dengan nilai sebesar 1,53. Sementara itu sumur kelompok sebelas tidak
berhasil, sama dengan sumur-sumur kelompok lainnya. Kemungkinan tidak berhasilnya isolasi
DNA E. coli murni pada praktikum ini diperkirakan disebabkan oleh beberapa hal. Contohnya,
pada saat proses pemipetan DNA E. coli yang terambil dari tabung sangat sedikit, pada saat
proses sebelum elektroforesis terjadi kontaminasi yang diakibatkan lingkungan yang tidak steril,
kemudian kemungkinan lain adalah karena ukuran DNA bakteri yang sangat kecil sehingga
kontaminannya yang lebih banyak daripada DNA tersebut.
Simpulan
Identifikasi DNA genom bakteri dapat dilakukan dengan cara analisis gen penyandi 16s
rRNA karena gen penyandi tersebut bersifat universal, konservatif, melimpah, ukuran
panjangnya cukup untuk diidentifikasi, serta ketersediaan informasinya lengkap di GenBank.
Hasil percobaan menunjukkan bahwa pita DNA E. coli dari semua kelompok tidak berhasil di-
running dengan elektroforesis. Selain itu DNA E. coli yang diperoleh tidak ada yang mencapai
nilai kemurnian 1,8. Hal ini diperkirakan disebabkan kesalahan dalam melakukan prosedur
percobaan atau kesalahan dalam penggunaan alat.
Daftar Pustaka
Campbell NA. 2002. Biology 5th Ed. Jakarta (ID): Erlangga.
Ganiswarna SG. 1995. Farmakologi dan Terapi Ed. 4. Jakarta (ID): Universitas Indonesia.
Jawetz E et al. 1995. Mikrobiologi Kedokteran Ed. 20. San Francisco (US): University of
California.
Klug WS, Cummings MR. 1994. Concept of Genetics 4th Ed. New Jersey (US): Prentice Hall.
Lisdiyanti. 1997. Polymerase Chain Reaction: Cara Mudah Memperbanyak DNA. Bogor (ID):
Warta Biotek.
Madigan MT et al. 1997. Biology of Microorganism 8th Ed. New Jersey (US): Prentice Hall.
Magdeldin S. 2012. Gel Electrophoresis - Principles and Basics. Rijeka (CR): InTech Publisher.
Marks DB et al. 2000. Biokimia Kedokteran Dasar: Sebuah Pendekatan Klinis. Penerjemah:
Brahm U. Terjemahan dari: Basic Medical Biochemistry: Aclinical Approach. Jakarta
(ID): EGC.
Muladno. 2002. Teknik Rekayasa Genetika. Bogor (ID): Pustaka Wirausaha Muda.
Schlulze AD et al. 2006. Bacterial diversity in a marine hatchery : balance between pathogenic
and potentially probiotic bacterial strains. Aquaculture 256: 50-73.
Sudeesh PS et al. 2002. Random amplified polymorphic DNA-PCR typing of Vibrio
parahaemolyticus and Vibrio alginolyticus isolated from cultured shrimps. Aquaculture
207:11-17.
Yuwono T. 2005. Biologi Molekuler. Jakarta (ID): Erlangga.