Laporan Praktikum Genetika Molekuler

Nama : Abdullah Adzkiy Robbani Tanggal: 18 Februari 2014

NIM :34110077 Asisten:

Kel/Lab: 11/ Bio 5

IDENTIFIKASI BAKTERI SECARA MOLEKULER

Pendahuluan

Latar Belakang

Escherichia coli atau sering disebut E. coli merupakan bakteri gram negatif berbentuk

batang pendek yang memiliki panjang sekitar 2 μm, diameter 0,7 μm, lebar 0,4-0,7 μm dan

bersifat anaerob fakultatif. E. coli membentuk koloni yang bundar, cembung, dan halus

dengan tepi yang nyata (Jawetz et al. 1995). E. coli adalah anggota flora normal usus. E. coli

berperan penting dalam sintesis vitamin K, konversi pigmen-pigmen empedu, asam-asam

empedu dan penyerapan zat-zat makanan. E. coli termasuk ke dalam bakteri heterotrof yang

memperoleh makanan berupa zat oganik dari lingkungannya karena tidak dapat menyusun

sendiri zat organik yang dibutuhkannya. Zat organik diperoleh dari sisa organisme lain.

Bakteri ini menguraikan zat organik dalam makanan menjadi zat anorganik, yaitu CO2, H2O,

energi, dan mineral. Di lingkungan, bakteri pembusuk ini berfungsi sebagai pengurai dan

penyedia nutrisi bagi tumbuhan (Ganiswarna 1995).

Gen 16S-rRNA pada bakteri banyak digunakan sebagai gen target untuk menganalisis

keragaman genom. Contohnya adalah penelitian yang dilakukan Sudeesh et al. (2002) untuk

mengetahui bakteri V. parahaemolyticus dan V. alginolyticus yang diisolasi dari tambak

udang. Selain itu, Schlulze et al. (2006) juga menggunakan gen 16S-rRNA untuk identifikasi

keragaman bakteri di lingkungan hatchery. Beberapa sebab mengapa gen 16S-rRNA

digunakan untuk identifikasi bakteri yaitu : (1) bersifat universal (dapat ditemukan di semua

Liyana Salsabila G34100010

Ina Agustina G34100038

Eka Maulani G34100043

Bustomi G34100055

Dwika Armyanto G34100111

jenis bakteri), (2) sekuen basanya bersifat konservatif, (3) jumlah di dalam sel melimpah, (4)

memenuhi ukuran untuk perhitungan secara statistika (tidak terlalu panjang dan tidak terlalu

pendek), serta (5) ketersediaan informasinya lengkap, yaitu dengan cara mengakses database

di GenBank (Madigan et al. 1997). Proses amplifikasi gen 16S-rRNA dapat dilakukan

melalui teknik PCR.

Dalam kegiatan biologi molekuler, elektroforesis merupakan salah satu cara untuk

memvisualisasikan keberadaan DNA, plasmid, dan produk PCR. DNA dapat dilihat secara

langsung dan dapat ditentukan ukurannya berdasarkan migrasinya pada gel agarose maupun

gel poliakrilamid. Migrasi DNA dalam gel ini disebut elektroforesis (Lisdiyanti 1997).

Elektroforesis gel agarosa adalah teknik yang umum digunakan untuk analisis protein dan

DNA. Teknik ini merupakan teknik yang menggunakan prinsip elektroforesis zona. Prinsip

kerja elektroforesis gel dimulai saat makromolekul yang bermuatan listrik ditempatkan pada

medium berisi tenaga listrik.  Molekul-molekul tersebut akan bermigrasi menuju kutub

positif atau kutub negatif berdasarkan muatan yang terkandung di dalamnya (Magdeldin

2012).  Sebagai contoh molekul DNA yang bermuatan negatif dilewatkan melalui medium

gel agarose, kemudian dialiri arus listrik dari satu kutub ke kutub yang berlawanan

muatannya (positif), maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif

melalui membran matriks gel agarose tersebut (Yuwono 2005).

Tujuan

Mengetahui dan dapat mengidentifikasi bakteri menggunakan gen penyandi 16S rRNA.

Metode

Hasil

Gambar 1 Hasil elektroforesis DNA E. coli

DNA kelompok 11

Tabel 1 Nilai kemurnian DNA terhadap kontaminan

Kelompok 260 nm 280 nm Kemurnian DNA

1 0,030 0,027 1,11

2 0,686 0,614 1,11

3 0,160 0,140 1,14

4 0,066 0,053 1,24

5 0,063 0,047 1,34

6 0,061 0,046 1,32

7 0,268 0,175 1,53

8 0,039 0,033 1,18

9 0,066 0,061 1,08

10 0,040 0,035 1,14

11 0,029 0,024 1,20

Contoh perhitungan kemurnian DNA:

Kemurnian DNA kelompok 11 = OD260 = 0,029 = 1,20

OD280 0,024

Pembahasan

DNA yang diisolasi pada praktikum ini adalah DNA prokariot. DNA prokariot memiliki

struktur yang berbeda dengan struktur DNA eukariot. DNA prokariot tidak memiliki protein

histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linear dan memiliki protein

histon (Klug dan Cummings 1994). Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada 2, yaitu

sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran

berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan

berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada di bagian atas tabung. Hasil

sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian

atas dan pelet pada bagian bawah. Adapun presipitasi adalah proses pengendapan DNA dengan

suatu larutan tertentu agar utas-utas DNA tidak kembali menggulung (coiling) (Campbell 2002).

Langkah awal teknik isolasi DNA dapat dilakukan dengan cara merusak membran sel

atau membran inti sel. Pada praktikum ini, pertama-tama CTAB dan PVP ditambahkan ke dalam

bahan. Fungsi penambahan CTAB (cetyl trimethyl ammonium bromide) yaitu untuk melisiskan

membran sel, sedangkan PVP (polyvinilpirolidone) ditambahkan untuk melindungi agar DNA

tidak ikut terkena kerusakan. Kemudian, bahan disentrifugasi hingga didapatkan supernatan dan

pelet. Supernatan diambil dan dipindahkan ke dalam tabung baru, lalu

Phenol:Chloroform:Isolamyl Alcohol (PCI) ditambahkan ke dalam tabung berisi supernatan. PCI

digunakan untuk proses pemurnian larutan, yaitu proses memisahkan DNA dari kontaminan-

kontaminan yang ada. Phenol merupakan pelarut organik yang dapat melarutkan protein dan

lipid. Chloroform berfungsi untuk membersihkan protein dan polisakarida dari larutan,

sedangkan Isoamyl Alcohol berfungsi untuk memekatkan, memisahkan DNA dari larutan dan

mengendapkan DNA (Muladno 2002).

Larutan-larutan lain yang digunakan dalam praktikum ini yaitu NaOAC, ETOH, ddH2O,

RNAse dan EtBr. Penambahan NaOAC dilakukan sebagai proses pemurnian lebih lanjut dan

pembilasan, sedangkan tujuan penambahan ETOH atau etanol absolut agar terjadi pengikatan air

sehingga terjadi pengendapan DNA. Larutan ddH2O dan RNAse berfungsi menghilangkan sisa-

sisa RNA untuk memperoleh DNA yang lebih murni (Yuwono 2005). Intercalating agent

ethidium bromide (EtBr) adalah pewarna fluoresen untuk mendeteksi asam nukleat, EtBr ini

akan mengikat pada sela-sela pasangan basa DNA. EtBr berfungsi untuk membantu visualisasi

karena EtBr akan memendarkan sinar UV. Jika gel disinari dengan sinar UV dari bawah, maka

akan tampak citra berupa pita-pita DNA pada gel (Marks et al. 2000).

Gambar hasil pengamatan menunjukkan tidak ada sumur DNA yang berhasil running

DNA termasuk DNA marker. Sehingga dapat dikatakan bahwa percobaan elektroforesis dengan

DNA E. coli pada praktikum ini tidak berhasil. Diperkirakan hal ini terjadi disebabkan kesalahan

pada saat percobaan atau fungsi alat yang tidak berjalan dengan baik. Pada tabel pengamatan,

dapat dilihat bahwa pada praktikum ini juga tidak ada sumur yang mencapai nilai 1,8. Hal

tersebut menandakan bahwa DNA-DNA bakteri yang dilakukan pada praktikum ini tidak murni.

Dari semua sumur, hanya satu sumur yang paling mendekati nilai kemurnian 1,8 yaitu pada

sumur kelompok 7 dengan nilai sebesar 1,53. Sementara itu sumur kelompok sebelas tidak

berhasil, sama dengan sumur-sumur kelompok lainnya. Kemungkinan tidak berhasilnya isolasi

DNA E. coli murni pada praktikum ini diperkirakan disebabkan oleh beberapa hal. Contohnya,

pada saat proses pemipetan DNA E. coli yang terambil dari tabung sangat sedikit, pada saat

proses sebelum elektroforesis terjadi kontaminasi yang diakibatkan lingkungan yang tidak steril,

kemudian kemungkinan lain adalah karena ukuran DNA bakteri yang sangat kecil sehingga

kontaminannya yang lebih banyak daripada DNA tersebut.

Simpulan

Identifikasi DNA genom bakteri dapat dilakukan dengan cara analisis gen penyandi 16s

rRNA karena gen penyandi tersebut bersifat universal, konservatif, melimpah, ukuran

panjangnya cukup untuk diidentifikasi, serta ketersediaan informasinya lengkap di GenBank.

Hasil percobaan menunjukkan bahwa pita DNA E. coli dari semua kelompok tidak berhasil di-

running dengan elektroforesis. Selain itu DNA E. coli yang diperoleh tidak ada yang mencapai

nilai kemurnian 1,8. Hal ini diperkirakan disebabkan kesalahan dalam melakukan prosedur

percobaan atau kesalahan dalam penggunaan alat.

Daftar Pustaka

Campbell NA. 2002. Biology 5th Ed. Jakarta (ID): Erlangga.

Ganiswarna SG. 1995. Farmakologi dan Terapi Ed. 4. Jakarta (ID): Universitas Indonesia.

Jawetz E et al. 1995. Mikrobiologi Kedokteran Ed. 20. San Francisco (US): University of

California.

Klug WS, Cummings MR. 1994. Concept of Genetics 4th Ed. New Jersey (US): Prentice Hall.

Lisdiyanti. 1997. Polymerase Chain Reaction: Cara Mudah Memperbanyak DNA. Bogor (ID):

Warta Biotek.

Madigan MT et al. 1997. Biology of Microorganism 8th Ed. New Jersey (US): Prentice Hall.

Magdeldin S. 2012. Gel Electrophoresis - Principles and Basics. Rijeka (CR): InTech Publisher.

Marks DB et al. 2000. Biokimia Kedokteran Dasar: Sebuah Pendekatan Klinis. Penerjemah:

Brahm U. Terjemahan dari: Basic Medical Biochemistry: Aclinical Approach. Jakarta

(ID): EGC.

Muladno. 2002. Teknik Rekayasa Genetika. Bogor (ID): Pustaka Wirausaha Muda.

Schlulze AD et al. 2006. Bacterial diversity in a marine hatchery : balance between pathogenic

and potentially probiotic bacterial strains. Aquaculture 256: 50-73.

Sudeesh PS et al. 2002. Random amplified polymorphic DNA-PCR typing of Vibrio

parahaemolyticus and Vibrio alginolyticus isolated from cultured shrimps. Aquaculture

207:11-17.

Yuwono T. 2005. Biologi Molekuler. Jakarta (ID): Erlangga.