8

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Hati

Hati yang juga dikenal dengan liver atau hepar merupakan kelenjar tubuh

dengan berat sekitar 1/36 berat badan orang dewasa, yaitu berkisar 1.200-1.600

gram. Posisi organ hati sebagian besar terletak di perut bagian kanan atas, yakni

dibelakang iga. Ukuran hati normal adalah selebar telapak tangan orang itu sendiri

atau kira-kira diameternya 7-10 cm (Tavill, 2012; Karim, 2013).

2.1.1 Struktur Hati

a. Stroma.

Hati dibungkus oleh simpai tipis jaringan ikat yang menebal di hilum,

tempat vena porta dan arteri hepatika memasuki hati dan duktus hepatikus kiri dan

kanan serta tempat keluarnya pembuluh limfe. Pembuluh-pembuluh dan duktus

ini dikelilingi oleh jaringan ikat sepanjang jalannya di daerah portal diantara

lobulus hati klasik. Area ini tersusun oleh jaringan serta komponen retikuler halus

yang menunjang hepatosit dan sel endotel sinusoid dari lobulus hati.

b. Lobulus hati

Komponen struktural utama dari hati adalah sel hati atau hepatosit. Sel

epitelial ini berkelompok membentuk lempeng-lempeng yang saling berhubungan.

Lobulus hati dibentuk oleh massa jaringan berbentuk poligonal berukuran 0,7 x 2

mm, lobulus ini dipisahkan oleh selapis jaringan ikat sehingga sulit ditetapkan

batas-batas antar lobuli. Hepatosit berderet secara radier dalam lobulus hati

9

membentuk lapisan setebal 1 atau 2 sel. Darah mengalir dari tepian ke pusat

lobulus klasik di dalam parenkim hati. Oksigen dan metabolit serta semua

substansi toksik atau non-toksik lain yang diserap dalam usus pertama akan tiba di

sel perifer dan kemudian baru ke sel lobulus.

c. Hepatosit (sel hati)

Sel hati berbentuk polihedral dengan 6 atau lebih permukaan. Hepatosit

memiliki banyak retikulum endoplasma kasar dan halus. Retikulum endoplasma

kasar membentuk kelompok tersebar dalam sitoplasma disebut badan basofik

dalam hepatosit. Beberapa protein disintesis pada polisum dalam struktur ini.

Berbagai proses penting terjadi dalam retikulum endoplasma halus yang tersebar

secara difus di dalam sitoplasma. Organel ini berfungsi untuk proses konjugasi

dan detoksifikasi sebelum dikeluarkan dari tubuh. Retikulum endoplasma halus

pada hepatosit merupakan sistem labil yang segera bereaksi terhadap perubahan

dalam lingkungan (Ramadori et al., 2008; Karim, 2013)

Gambar 2.1Struktur Histologi Hati Normal, A. Skematis dan B. Pulasan Hematoksilin-Eosin

(Dhillon, 2012)

10

2.1.2 Peranan Hati Dalam Metabolisme Tubuh

Hati merupakan organ kedua terbesar dalam sistem tubuh. Ukuran hati kira-

kira empat kali lebih besar daripada jantung, dengan berat sekitar 1500 gram pada

laki-laki dewasa. Hati merupakan satu organ unik yang berupaya menghasilkan

sel baru untuk menggantikan sel yang rusak. Kerusakan hati berulang dalam

jangka waktu yang panjang misalnya akibat mengkonsumsi alkohol dan merokok

secara terus menerus akan menyebabkan hati mengalami kerusakan yang tidak

bisa diperbaiki. Guyton dan Hall (2011) menjelaskan bahwa hati memiliki

peranan dalam metabolisme yang cukup besar baik dalam metabolisme

karbohidrat, lemak dan protein.

Hati memiliki fungsi dalam metabolisme karbohidarat sebagai berikut:

menyimpan glukosa, mengubah galaktosa dan fruktosa menjadi glukosa,

glukoneogenesis dan membentuk banyak senyawa kimia penting dari hasil

perantara metabolisme karbohidarat. Sebagian metabolisme lemak dapat terjadi di

semua sel tubuh, namun aspek metabolisme lemak tertentu terutama terjadi di

hati. Beberapa fungsi spesifik hati dalam metabolisme lemak adalah: kecepatan

oksidasi beta asam lemak yang sangat cepat untuk mensuplai energi bagi fungsi

tubuh yang lain, pembentukkan sebagian besar lipoprotein dan pembentukkan

sejumlah besar kolesterol dan fospolipid. Fungsi hati lain yang cukup penting

dalam metabolisme protein yaitu: deaminasi asam amino, pembentukan amoniak

dari cairan tubuh, pembentukan protein plasma dan introkonvensi diantara asam

amino yang berbeda demikian juga dengan ikatan penting lainnya untuk proses

metabolisme tubuh. Hati juga merupakan tempat terjadi proses-proses penting

11

bagi kehidupan kita, yaitu proses penyimpanan energi, pembentukan protein dan

asam empedu, pengaturan metabolisme kolesterol, dan penetralan racun/obat yang

masuk dalam tubuh kita. Gangguan metabolisme yang fatal akan timbul apabila

terjadi kerusakan pada hati.

Beberapa penyakit hati antara lain :

1. Penyakit hati karena infeksi misalnya hepatitis virus.

2. Penyakit hati karena racun misalnya karena alkohol atau obat tertentu seperti

parasetamol.

3. Genetik atau keturunan misalnya hemochromatosis.

4. Gangguan imunitas misalnya hepatitis autoimun.

5. Kanker misalnya karsinoma hepatoseluler. Kanker hati dapat disebabkan

oleh senyawa karsinogenik diantaranya aflatoxin, polyvinyl chloride, virus

Hepatitis B dan C, sirosis hati, dan lain-lain (Karim, 2013).

2.1.3 Pertahanan Hati terhadap Radikal Bebas

Pertahanan utama hati terhadap radikal bebas menggunakan jalur glutation.

Jalur glutation merupakan pertahanan utama hepatosit dari pengaruh oksidan

(misalnya radikal oksigen). Glutation yang tereduksi dapat membebaskan

hepatosit dari peroksida (H2O2) dengan suatu reaksi yang dikatalisis oleh glutation

peroksidase, reaksi ini sangat penting karena penumpukan H2O2 intrasel akan

memperpendek umur hepatosit (Lushchak, 2012; Murray et al., 2012). Keadaan

defisiensi glukosa 6-fosfat dehidrogenase (G6PD) menyebabkan hepatosit dan

eritrosit tidak mampu menyediakan nicotinamide adenine dinucleotide phosphate

(NADPH) yang cukup untuk mereduksi glutathione teroksidasi (GSSG) menjadi

12

glutathione tereduksi (GSH) yang mengakibatkan terganggunya proses penetralan

hidrogen peroksida (H2O2) dan radikal oksigen lain (Murray, 2012). Radikal

oksigen dapat menyebabkan oksidasi gugus –SH kritis dari protein dan

peroksidasi lipid bilayer membran semua sel termasuk hepatosit sehingga

memudahkan terjadinya lisis. Oksidasi gugus –SH hemoglobin disertai presipitasi

protein eritrosit membentuk Heinz bodies yang merupakan parameter kondisi

akibat stress oksidatif (Sugawara et al., 2013).

H2O2 H2O

Glutation Peroksidase Oksidan lain (O2* / OH*)

GSH G S S G GSH

Glutation Reduktase (Glutation Transferase)

NADP NADPH HMP Shunt(hexose monophosphate shunt)

Glukosa 6 Fosfat Dehidrogenase (G6PD)

Glukosa Glukosa 6-P 6-Fosfoglukonat

Gambar 2.2Jalur Glutation dalam Hati (Murray et al., 2012)

2.1.4 Pengobatan Penyakit pada Hati

Pengobatan penyakit hati kronik dengan metode pengobatan modern masih

belum memuaskan, angka kekambuhan yang cukup tinggi, efek samping yang

13

berat, dan harga obat yang sangat mahal sehingga tidak terjangkau oleh sebagian

penderita, menyebabkan penderita berpaling ke metode pengobatan lain sebagai

pelengkap ataupun alternatif obat modern. Metode pengobatan ini sering

dinamakan complementary and alternative medicine (CAM). Metode CAM

jenisnya bermacam-macam, satu diantaranya memanfaatkan zat aktif dari

tumbuh-tumbuhan yang disebut pengobatan herbal. Pengobatan herbal mulai

dilirik kembali oleh pasien, dokter, maupun industri obat pada saat ini.

Pengetahuan para dokter tentang manfaat, efek samping, dan risiko obat herbal

masih sangat terbatas karena sedikitnya data klinis yang bisa diakses, terutama

untuk memenuhi standar berdasarkan fakta tentang efikasi, efektivitas dan

keamanan obat herbal (Daulay, 2011).

Obat-obatan yang selama ini diberikan untuk pengobatan kelainan hati

umumnya hanya sebagai obat simptomatik, disamping sebagai pengobatan

suportif atau promotif yang berguna untuk membantu kelangsungan fungi hati.

Hasil penelitian-penelitian terbaru membuktikan adanya tumbuhan obat yang

berkhasiat sebagai hepatoprotektor, antiviral, antiflamasi, antifibrosis, regenerasi

sel hati dan meningkatkan sistem imun (imunostimulator). Hepatoprotektor

merupakan senyawa atau zat berkhasiat yang dapat melindungi sel-sel hati

terhadap pengaruh zat toksik yang dapat merusak sel hati. Senyawa tersebut

bahkan dapat memperbaiki jaringan hati yang fungsinya sedang terganggu

(Kumar, 2012). Beberapa jenis tanaman yang telah digunakan sebagai bahan

pengobatan penyakit hati yaitu rimpang temulawak, herba meniran, daun mimba,

herba daun sendok, herba sambiloto, herba pegagan, buah tomat, rambut jagung,

14

akar langalang, umbi wortel dan masih banyak herba yang lainnya. Tanaman-

tanaman tersebut, termasuk juga mimba mengandung flavonoid, beta karoten, dan

senyawa lain yang memiliki potensi antioksidan (Setiawan, 2006; Kumar, 2012).

2.2 Siklus Sel dan Regulasi Replikasi Sel

Proliferasi sel merupakan suatu proses yang sangat teratur melibatkan

sejumlah besar molekul dan jalur-jalur yang saling terkait. Untuk memahami

bagaimana sel berproliferasi selama regenerasi dan pemulihan, sangat penting

merangkum gambaran-gambaran kunci dari siklus sel normal dan regulasinya.

Paparan berikut adalah ringkasan gambaran utama dari proses proliferasi sel.

Replikasi sel distimulasi oleh faktor pertumbuhan atau sinyal dari

komponen matriks ekstraseluler melalui integrin. Suatu sel untuk mencapai

replikasi dan pembelahan sel harus melalui urutan proses yang terkontrol sangat

ketat yang disebut sebagai siklus sel. Siklus sel terdiri dari fase G1 (presintesis),

fase S (sintesis DNA), fase G2 (premitosis), dan fase M (mitosis). Sel stabil

(quiescent cells) yang tidak masuk siklus sel berada pada fase istirahat atau G0

(Gambar 2.3). Tiap fase siklus sel tergantung pada aktivasi yang memadai dan

kelengkapan proses sebelumnya dan siklus akan terhenti pada fase tertentu saat

ekspresi gen penting yang mengaturnya kurang mencukupi. Siklus sel memiliki

banyak pengaturan dan pengulangan, terutama selama transisi antara fase G1 dan

S karena peran sentralnya mempertahankan homeostasis jaringan dan mengatur

proses fisiologis pertumbuhan seperti regenerasi serta pemulihan. Pengaturan

15

tersebut termasuk aktivator dan inhibitor, termasuk sensor yang bertanggung

jawab terhadap checkpoints, dijelaskan pada gambar dibawah ini (Gambar 2.3).

Gambar 2.3Siklus Sel (Kumar et al., 2010)

Gambar memperlihatkan siklus sel (G0, G1, G2, S, dan M), lokasi dari titikrestriksi G1 serta checkpoint siklus sel G1/S dan G2/M. Sel dari jaringan labilseperti epidermis dan saluran cerna dapat masuk siklus secara kontinu. Sel-selstabil seperti hepatosit relatif diam (quiescent) tetapi dapat masuk siklus sel. Sel-sel permanen seperti saraf dan miosit jantung kehilangan kemampuan untukproliferasi.

Sel dapat masuk fase G1 setelah G0 (sel-sel quiescent) atau setelah lengkap

melalui mitosis (pada sel-sel yang kontinu membelah). Sel-sel quiescent pertama

harus melalui transisi dari G0 ke G1, tahap penentu awal yang berfungsi sebagai

gerbang siklus sel. Transisi ini melibatkan aktivasi transkripsional dari sejumlah

besar gen, termasuk berbagai proto-onkogen dan gen yang diperlukan untuk

sintesis ribosom serta translasi protein. Sel-sel pada tahap G1 melalui siklus dan

mencapai keadaan kritis pada transisi G1/S, dikenal sebagai titik restriksi

16

(restriction point), sebuah tahap replikasi yang terbatas kecepatannya (Gambar

2.3). Selama menjalani fase restriksi, sel-sel normal menjadi irreversibel untuk

melanjutkan replikasi deoxyribonucleic acid (DNA). Perkembangan melalui

siklus sel terutama pada transisi G1/S diatur sangat ketat oleh suatu protein yang

disebut cyclin dan enzim-enzim terkait yang disebut cyclin-dependent kinases

(CDKs). Cyclin-dependent kinases memerlukan aktivitas katalitik dengan terikat

dan membentuk suatu kompleks dengan cyclin. Aktivasi CDKs dalam kompleks

ini mengarahkan terjadinya siklus sel dengan fosforilasi protein yang penting

dalam transisi siklus sel. Satu protein tersebut adalah protein rentan

retinoblastoma (RB), yang secara normal mencegah sel-sel bereplikasi dengan

membentuk suatu kompleks erat inaktif dengan faktor transkripsi eukaryotes 2F

(E2F). Fosforilasi RB menimbulkan protein ini terlepas, yang mengaktifkan E2F d

an mengarahkan untuk menstimulasi transkripsi gen yang produknya mengatur sel

saat siklus berjalan.

Aktivitas kompleks cyclin-CDK diatur secara ketat oleh CDK inhibitors,

beberapa jenis faktor pertumbuhan (growth factors) dapat menghentikan produksi

inhibitor tersebut. Mekanisme pertahanan hidup utama yang tertanam di dalam sel

yang menggerakan siklus sel adalah pengenalan adanya kerusakan DNA dan

kromosom. Pemeriksaan ulang yang mengontrol kualitas tersebut disebut

checkpoints, proses ini menjamin sel dengan kerusakan DNA atau kromosom

tidak menjalani replikasi lengkap. Checkpoint G1/S menilai integritas dari DNA

sebelum replikasi, sedangkan checkpoint G2/M menilai DNA setelah replikasi dan

mengawasi apakah sel dapat masuk ke fase mitosis secara aman. Saat sel

17

mengenali kerusakan DNA, aktivasi checkpoint menghambat siklus sel dan

memicu mekanisme perbaikan DNA. Bila kerusakan DNA terlalu berat untuk

diperbaiki, sel akan dihilangkan melalui apoptosis atau masuk jalur nonreplikatif

disebut senescence, proses ini terutama melalui mekanisme p53-dependent. Defek

checkpoint yang meloloskan DNA dengan rantai rusak dan kromosom dengan

kelainan untuk membelah menghasilkan mutasi pada sel anak, yang dapat

mengarah pada perkembangan neoplasia.

2.2.1 Faktor Pertumbuhan (Growth Factor)

Proliferasi hampir semua jenis sel dipicu oleh suatu polipeptida dikenal

sebagai faktor pertumbuhan (growht factor). Faktor pertumbuhan tersebut dapat

hanya memiliki target satu jenis sel atau banyak jenis sel, juga memicu sel

bertahan hidup, gerak, kontraktilitas, diferensiasi, dan angiogenesis yang

merupakan aktivitas yang sama pentingnya dengan efek memicu pertumbuhan.

Gambar 2.4Tabel Faktor Pertumbuhan dan Sitokin yang Terlibat dalam Regenerasi dan

Proses Penyembuhan Luka (Kumar et al., 2010)

18

Semua faktor pertumbuhan berfungsi sebagai ligan yang terikat pada

reseptor spesifik, yang menghantarkan sinyal ke sel target. Sinyal ini

menstimulasi transkripsi dari gen-gen yang tidak aktif saat sel fase istirahat,

termasuk gen-gen yang mengkontrol awal dan progresi siklus sel. Sebagian daftar

faktor-faktor pertumbuhan penting yang terlibat dalam proses perbaikan dan

regenerasi jaringan disajikan pada Gambar 2.4.

2.2.2 Faktor Pertumbuhan Hepatosit (Hepatocyte Growth Factor)

Hepatocyte growth factor (HGF) atau scatter factor (SF) diproduksi oleh

sel-sel mesenkim. Faktor pertumbuhan ini berfungsi memicu proliferasi hepatosit,

sel-sel epitelial, dan sel endotel. Hepatocyte growth factor juga berfungsi

meningkatkan motilitas sel dan replikasi keratinosit.

Hepatocyte growth factor pertama kali diisolasi dari trombosit dan serum.

Penelitian selanjutnya memperlihatkan bahwa hepatocyte growth factor identik

dengan faktor pertumbuhan yang telah lebih dulu diisolasi dari fibroblas yang

dikenal sebagai scatter factor. Faktor pertumbuhan ini dalam literatur sering

disingkat HGF/SF.

Hepatocyte growth factor memiliki efek mitogenik pada hepatosit dan

hampir seluruh jenis sel epitel, termasuk sel epitel kandung empedu, epitel paru,

ginjal, kelenjar payudara, dan kulit. Hepatocyte growth factor berperan sebagai

suatu morfogen dalam perkembangan embrionik, memicu penyebaran dan migrasi

sel serta meningkatkan kemampuan hepatosit untuk bertahan hidup. Faktor

pertumbuhan ini diproduksi oleh fibroblas dan hampir seluruh jenis sel mesenkim,

sel endotel, dan sel-sel nonparenkimal hati. Hepatocyte growth factor diproduksi

19

sebagai bentuk rantai tunggal inaktif (pro-HGF) yang diaktivasi oleh protease

serin yang dilepaskan oleh jaringan rusak. Reseptor HGF, yaitu proto-onkogen c-

MET sering tinggi ekspresinya atau mengalami mutasi pada tumor, terutama pada

karsinoma papiler tiroid dan ginjal. Penyampaian sinyal hepatocyte growth factor

dibutuhkan dalam bertahan hidup selama perkembangan embrionik, seperti yang

terlihat pada defek perkembangan otot, ginjal, hati, dan otak. Penelitian pada tikus

knockout terbukti bersifat letal bila kekurangan c-met. Beberapa inhibitor HGF

dan c-MET sedang dalam tahap penelitian uji coba untuk terapi kanker.

2.2.3 Mekanisme Regenerasi Jaringan dan Organ

Beberapa jenis kadal dan amfibi dapat meregenerasi ekor, kaki, lensa,

retina, rahang serta sebagian besar sel jantungnya, tetapi kemampuan regenerasi

dari seluruh organ dan jaringan tersebut hilang pada mamalia. Kecenderungan

tidak mampunya regenerasi sejati pada mamalia disebabkan hilangnya

pembentukan blastema (sumber sel untuk regenerasi) dan respon fibroproliferatif

yang cepat terjadi setelah cedera. Jalur Wnt/β-catenin merupakan jalur utama yang

berperan dalam regenerasi cacing pipih planaria, regenerasi sirip dan jantung ikan

zebra, dan pembentukan pola regenerasi kaki dan blastema pada kadal. Jalur

Wnt/β-catenin memodulasi fungsi sel punca epitel usus, sumsum tulang, otot,

berperan dalam regenerasi hati setelah hepatektomi parsial, dan proliferasi sel

oval setelah proses cedera pada mamalia (Kumar et al., 2010).

Regenerasi hati telah diteliti secara detail aspek biologis dan klinisnya,

walaupun proses tersebut bukan sebuah proses regenerasi sejati karena reseksi

jaringan tidak menimbulkan pertumbuhan baru hati, tetapi memicu hiperplasia

20

kompensasi sisa organ. Organ lain seperti ginjal, pankreas, kelenjar adrenal,

tiroid, dan paru hewan yang masih sangat muda juga dapat mengalami

pertumbuhan kompensasi, walaupun organ-organ tersebut memperlihatkan proses

yang kurang dramatis dibandingkan pada hati. Pertumbuhan ginjal kontralateral

setelah nefrektomi unilateral melibatkan hipertrofi nefron dan replikasi sebagian

sel tubulus proksimal, karena nefron yang baru terbentuk tidak dapat regenerasi

pada ginjal dewasa. Pankreas memiliki kemampuan terbatas untuk regenerasi

komponen eksokrin dan pulau-pulau sel beta. Regenerasi sel-sel beta pankreas

melibatkan replikasi sel beta, transdediferensiasi sel-sel duktal atau diferensiasi

dari sel-sel punca yang diduga mengekspresi faktor transkripsi Oct4 dan Sox2.

Baru-baru ini telah dapat dilakukan program ulang sel-sel eksokrin pankreas

menjadi sel-sel beta penghasil insulin (Kumar et al., 2010).

2.2.4 Regenerasi Sel Hati

Hati manusia memiliki kemampuan regenerasi yang mengagumkan, seperti

yang diperlihatkan pada pertumbuhan setelah hepatektomi parsial yang dilakukan

setelah reseksi tumor atau setelah transplantasi hati donor hidup (Gambar 2.5).

Pada manusia, reseksi sekitar 60% hati pada pendonor hidup menghasilkan

penggandaan sisa hati yang ada setelah sekitar satu bulan. Bagian hati yang tersisa

setelah hepatektomi parsial berperan sebagai “mini-liver” intak yang membesar

cepat dan mencapai ukuran semula (Gambar 2.5). Perbaikan massa hati tercapai

tanpa pertumbuhan kembali dari lobus yang direseksi saat operasi. Pertumbuhan

terjadi melalui membesarnya lobus yang tersisa setelah operasi, sebuah proses

dikenal sebagai pertumbuhan kompesasi atau hiperplasia kompensasi. Pada

21

manusia maupun hewan pengerat, titik akhir dari regenerasi hati setelah

hepatektomi parsial adalah pemulihan dari massa fungsional daripada penyusunan

kembali dari bentuk asal.

Sel punca pada hati dapat ditemukkan di perbatasan sistem porta dan sel-sel

hepatosit. Sel-sel punca tersebut dapat berdiferensiasi menjadi sel-sel duktus

empedu dan hepatosit (Pedersen, 2011).

Gambar 2.5Regenerasi Sel-Sel Hati setelah Hepatektomi Parsial (Kumar et al., 2010)

A. Lobus hati tikus (M: medial; right lobe (RL) dan left lobe (LL): lobus kanandan kiri; C: lobus kaudatus). Hepatektomi parsial mengangkat dua pertiga darihati (lobus medial dan lateral kiri). Setelah 3 minggu lobus lateral kanan dankaudatus tumbuh mencapai ukuran setara dengan ukuran asal sebelumhepatektomi tanpa pertumbuhan lobus medial dan lateral kiri.

B. Awal dan perkembangan hepatosit dalam siklus sel.C. Regenerasi hati manusia pada transplantasi donor hidup. Computed

tomography scans (CT scan) dari penerima donor hati dengan transplantasidonor hidup. Gambar atas adalah CT scan dari donor hati sebelumtransplantasi. Lobus kanan, yang dipakai untuk donor diberi batas garis.Gambar bawah adalah CT scan hati 1 minggu setelah hepatektomi parsial.

22

Catatan: pertumbuhan lobus kiri (diberi garis batas) tanpa pertumbuhan lagilobus kanan.

Sebagian besar hepatosit replikasi selama regenerasi hati setelah hepatektomi

parsial. Karena hepatosit adalah sel quiescent, perlu beberapa jam sel-sel hati

untuk dapat masuk siklus sel, berkembang melalui fase G1, dan mencapai fase S

dari replikasi DNA. Gelombang replikasi hepatosit disinkronisasi dan diikuti

replikasi sinkronus dari sel-sel nonparenkim (sel-sel Kupffer, sel-sel endotel, dan

sel-sel stellate).

Bukti kuat dari hasil penelitian baru bahwa proliferasi hepatosit dalam proses

regenerasi hati dipicu oleh gabungan kerja dari banyak sitokin dan polipeptida

faktor pertumbuhan. Replikasi hepatosit bergantung sangat ketat pada efek

parakrin faktor pertumbuhan dan sitokin seperti HGF dan interleukin 6 (IL-6)

yang diproduksi sel-sel nonparenkimal hati, dengan mengesampingkan aktivitas

autokrin dari transforming growth factor alpha (TGF-α). Terdapat dua titik

restriksi utama dalam replikasi yaitu: transisi G0/G1 yang mengarahkan hepatosit

quiescent masuk siklus sel dan transisi G1/S yang diperlukan melewati akhir titik

restriksi G1. Ekspresi gen dalam proses regenerasi hati terjadi dalam beberapa

tahap, diawali dengan respon gen awal segera, yang merupakan respon sementara

yang bertanggung jawab terhadap transisi G0/G1. Lebih dari 70 gen diaktifkan

selama respon ini, termasuk proto-onkogen c-FOS dan c-JUN dimana produknya

digabung untuk membentuk faktor transkripsi AP-1 yaitu c-MYC yang mengkode

faktor transkripsi yang mengaktivasi banyak gen berbeda dan faktor transkripsi

lain seperti nuclear factor κ-binding (NF-κB), STAT-3, dan C/EBP. Respon gen

awal segera mengatur tahapan aktivasi berurutan dari banyak gen, seperti pada

23

hepatosit saat masuk fase G1. Transisi G1 ke S terjadi seperti pada gambar

(Gambar 2.3).

Hepatosit yang quiescent menjadi kompeten untuk masuk siklus sel melalui

sebuah fase awal yang terutama dimediasi oleh sitokin tumor necrosis factor

(TNF) dan IL-6 serta komponen sistem komplemen. Sinyal awal mengaktivasi

beberapa jalur sinyal transduksi sebagai pendahulu penting untuk proliferasi sel.

Akibat stimulasi dari HGF, TGFα, dan heparin binding epidermal growth factor

(HB-EGF) hepatosit masuk siklus sel serta mengalami replikasi DNA (Gambar

2.5). Norepinefrine, serotonin, insulin, tiroid, dan hormon pertumbuhan berfungsi

sebagai pelengkap untuk regenerasi hati, memfasilitasi masuknya hepatosit

kedalam siklus sel.

Hepatosit masing-masing replikasi sekali atau dua kali selama regenerasi dan

kemudian kembali ke keadaan quiescence melalui sebuah urutan proses yang

diatur sangat ketat, tetapi mekanisme penghentian pertumbuhan belum jelas.

Inhibitor pertumbuhan seperti TGF-β dan activin mungkin terlibat dalam

mengakhiri replikasi hepatosit, namun masih belum dipahami cara kerjanya. Sel

punca intrahepatik atau sel progenitor tidak berperan dalam pertumbuhan

kompensasi yang terjadi setelah hepatektomi parsial dan tidak terdapat bukti

adanya hepatosit yang diturunkan dari sel turunan sumsum tulang selama proses

ini. Walaupun sel-sel endotel dan sel-sel nonparenkimal lain dapat merupakan

turunan dari sel prekursor dari sumsum tulang (Kumar et al., 2010).

2.2.5 Cyclin D1 dan Peranannya dalam Siklus Sel

24

Perkembangan melalui siklus sel membutuhkan ekspresi urutan gen dari

kelompok protein yang disebut cyclin (siklin). Siklin adalah semua kelompok

protein aktif yang mengatur siklus sel dan memulai sintesis DNA. Jenis siklin

yang telah teridentifikasi hingga saat ini berjumlah 15, secara garis besar dibagi

menjadi siklin A, B, C, D, E, F, G, H, I, K, dan T (Kumar, 2010). Siklus sel

membutuhkan kerja gabungan dari beberapa jenis siklin yang saling overlapping

dan berurutan. Siklin D mengawali masuk siklus sel dari fase G1 ke fase S,

dilanjutkan oleh siklin A dari fase S masuk G2, kemudian dilanjutkan siklin B

dari fase G2 masuk fase mitosis (M). Perubahan menjadi keganasan sering

melibatkan mutasi pada siklin D atau CDK4, namun jarang melibatkan mutasi

siklin B dan E.

Siklin membentuk kompleks dengan specific cyclin-dependent kinases

(CDKs) spesifik, saat terinduksi membentuk holoenzim yang memfosforilasi

protein target yang dibutuhkan pada progresi siklus sel. Induksi proto-onkogen

siklin D1, dan terikatnya pada CDK4 atau CDK6 adalah terbatas kecepatannya

selama progresi siklus sel fase G1. Beberapa penelitian mengusulkan bahwa siklin

D1 memiliki fungsi CDK-independent. Gen siklin D1 merasakan mitogenik

potensial dari lingkungan mikro selama masuk siklus sel dari posisi diam karena

induksinya membutuhkan koordinat sinyal yang berasal dari matriks ekstraseluler

dan faktor-faktor pertumbuhan terlarut, pada sel-sel yang tidak bertransformasi.

Kontrol ini dapat hilang saat transformasi seluler, dan siklin D1 berbanding lurus

overekspresinya pada beberapa jenis kanker, termasuk kanker payudara, hati, dan

otak. Represi ekspresi gen siklin D1 sebaliknya merupakan tanda khas diferensiasi

25

sel. Sejumlah besar faktor transkripsi telah teridentifikasi yang secara langsung

terikat atau sebaliknya mengatur promoter siklin D1, sejak deskripsi pertama

promoter siklin D1 muncul 15 tahun yang lalu. Kadar siklin D1 dapat diatur

secara transkripsional dan pos-transkripsional, dan pada penelitian beberapa ahli

(Klein, 2008) dibahas pemeriksaan kontrol transkripsional gen siklin. Peneliti-

peneliti mempelajari pengetahuan sel ini secara komprehensif faktor-faktor

transkripsi dan tempat terikatnya yang fungsional pada sel utuh memakai

pemeriksaan luciferasereporter, chromatin immuno-precipitation (ChIP), dan

penelitian invitro menggunakan electrophoretic mobility shift assays (EMSAs),

namun tempat terikatnya secara pasti masih belum teridentifikasi (Klein and

Richard, 2008).

Keputusan apakah sel melanjutkan progresi terletak pada fase G2, saat gen

rat sarcoma (RAS) seluler menginduksi peningkatan kadar cyclin D1. Kadar

cyclin D1 tersebut perlu dipertahankan selama fase G1 untuk inisiasi fase S,

dimana saat tersebut kadar cyclin D1 secara otomatis dikurangi hingga berkadar

rendah. Penurunan kadar cyclin D1 selama fase S diperlukan untuk sintesis DNA,

dan memaksa sel untuk menginduksi peningkatan kadar cyclin D1 sekali lagi saat

memasuki fase G2. Cyclin D1 diusulkan sebagai tombol aktif dalam pengaturan

progresi siklus sel berkelanjutan (Bienvenu et al., 2010).

Cyclin/Cdks adalah regulator kunci selama progresi siklus sel melalui

fosforilasi substrat. Masing-masing cyclin/Cdks memiliki fungsi berbeda pada tiap

fase siklus sel yang berbeda. Kompleks cyclin D1/Cdk4 memegang sebuah

peranan penting dalam fase G1. Kompleks ini dapat memfosforilasi kelompok

26

protein Rb untuk menonaktifkan fungsinya sebagai supresor transkripsi dan

diikuti aktivasi faktor transkripsi E2F-dependent untuk promosi masuk fase S dan

inisiasi sintesis DNA. Cyclin D1/Cdk4 juga memfosforilasi Smad3 untuk

mengambat aktivitas transkripsinya dan fungsi antiproliferatif. Cyclin D1/Cdk4

beriteraksi dengan NDR1/2, pada jalur ini. Hal terpenting pada penelitian tersebut

menemukan bahwa cyclin D1 memperkuat aktivitas NDR1/2 untuk promosi

transisi independen G1/S dari Cdk4. Temuan penelitian tersebut menunjukkan

fungsi penting cyclin D1 melalui pengaturan aktivitas NDR kinase selama

progresi siklus sel. Cyclin D1/Cdk4 dapat bersilang dengan jalur NDR kinase.

Penelitian tersebut menemukan bahwa cyclin D1 merupakan regulator positif dari

NDR kinase dan promosi progresi siklus sel pada satu jalur independen Cdk4.

Penemuan ini memperluas peran cyclin D1 sebagai regulator kunci dalam regulasi

siklus sel dan dapat menyediakan peluang baru terapi kanker terkait cyclin D1 (Du

et al., 2013).

Gambar 2.6Skema Peran Siklin D1 dan Ras dalam Siklus Sel (Stacey, 2003)

2.2.6 Kelebihan Siklin D1 dibandingkan Protein Petanda Proliferasi yang Lain

(Ki67)

27

Siklin dan cyclin dependent kinases (CDKs) adalah dua kelompok protein

yang bertanggung jawab terhadap siklus sel melalui pengaturan pada beberapa

checkpoint. Kadar empat jenis protein siklin berfluktuasi selama siklus sel

(Minikel, 2013), ditampilkan pada Gambar 2.7.

Gambar 2.7 Konsentrasi Berbagai Jenis Siklin dalam Siklus Sel (Minikel, 2013)

Kombinasi dari siklin dan berbagai CDKs yang aktif pada tiap fase tertentu,

menentukan bebagai aktivitas siklus sel, diperlihatkan pada Tabel 2.1.

Tabel 2.1Peran Siklin dan Berbagai CDKs pada Tiap Fase Siklus Sel (Minikel, 2013)

Fase SiklusSel

Siklin CDKs Keterangan

G1 Siklin D

CDK4, CDK6

Dapat bereaksi terhadap sinyal dari luar seperti faktor pertumbuhan atau mitogen.

G1/S SiklinE, A

CDK2 Meregulasi duplikasi sentrosom, penting untuk mencapai kondisi start.

S SiklinE, A

CDK2 Targetnya adalah helikase dan polimerase

M Siklin CDK1 Meregulasi checkpoint G2/M. Siklin

28

A, B disintesis selama S, tetapi tidak aktif sampaisintesis lengkap. Memfosforilasi banyak target jalur dibawahnya.

Sel-sel quiescent (stabil) seperti hepatosit yang diam pada fase G0 setelah

distimulasi sinyal mitogenik, terjadi aktivasi CDK4 dan CDK6 yang bekerja

bersama siklin D (terutama siklin D1) yang kemudian dapat masuk fase G1 dan

memulai siklus sel (Carrassa, 2013). Ki67 merupakan salah satu protein petanda

proliferasi yang juga dapat dipakai untuk mengetahui suatu jaringan tinggi

pembelahan selnya (banyak sel masuk siklus sel). Ekspresi ki67 dalam siklus sel

bervariasi. Ki67 tidak terekspresi pada fase G0. Ekspresi ki67 rendah pada fase

G1 dan S. Ekspresi tertinggi ki67 pada fase G2 dan M. Kadar ki67 akan menurun

tajam pada anafase dan telofase. Pulasan imunohistokimia maupun pengukuran

protein ki67 pada jaringan yang telah difiksasi memiliki kelemahan tidak dapat

membedakan apakah suatu sel quiescent (seperti hepatosit dan saraf) berada pada

fase G0 atau telah masuk fase G1, sebaliknya siklin D1 merupakan pemicu

masuknya sel quiescent dari fase G0 masuk G1 dan melanjutkan fase siklus sel

selanjutnya. Pemeriksaan probing imunositokimia proximal promoter gen ki67

(Ki67p) yang dapat dipakai sebagai penanda sel mengalami transisi G0-G1 dan

masuk siklus sel (Carrassa, 2013; Zambon, 2011). Siklin D terekspresi dengan

kadar yang bervariasi pada seluruh siklus sel seperti terlihat pada Gambar 2.7.

Ki67 terekspresi pada hampir seluruh fase siklus sel, kecuali pada fase G0 seperti

terlihat pada Gambar 2.8.

29

Gambar 2.8Ekpresi Protein Ki67 pada Seluruh Siklus Sel.

Semakin cerah warna merah, semakin rendah ekspresi Ki67.Ki67 tidak terekspresi pada fase G0 (Yuan et al., 2015)

Gambar 2.9Ekspresi Siklin D1 dan Ki67 dalam Siklus Sel (Iwakura et al., 2016)

2.2.7 Faktor-Faktor yang Meningkatkan dan Menurunkan Aktivitas Siklus Sel

dan Siklin

Banyak faktor yang mempengaruhi aktivitas regenerasi sel melalui siklus

sel. Faktor yang menginduksi peningkatan siklus sel antara lain: tumor necrozing

factor alpha (TNF-α), interleukin 6 (IL6), HGF, telomerase, P44/P42, RAS, dan

30

gen Rb. Faktor yang menginhibisi siklus sel antara lain p27, p53, dan anti-RAS

(Kumar, 2010).

Gambar 2. 10Skema Ilustrasi Peranan Siklin, CDK, dan Inhibitor CDK (CDKIs) dalam

Mengatur Siklus Sel (Kumar et al., 2010)Panah warna biru memperlihatkan fase siklus sel dimana kompleks siklin-CDKspesifik aktif. Sebagai ilustrasi, siklin D-CDK4, siklin D-CDK6, dan siklin E-CDK2 mengatur transisi G1 ke S melalui fosforilasi protein RB (pRB). Siklin A-CDK2 dan siklin A-CDK1 aktif pada fase S. siklin B-CDK1 penting pada transisifase G2 ke M. dua kelompok CDKIs dapat memblokir aktivitas CDK dan progresimelalui siklus sel. Inhibitor yang disebut INK4, terdiri dari p16, p15, p18, danp19, bekerja pada silin D–CDK4 dan siklin D–CDK6. Tiga kelompok inhibitorlain p21, p27, dan p57, dapat menghambat semua CDK.

31

Cyclin dependent kinase 4 (CDK4) membentuk kompleks dengan siklin D

memfosforilasi protein RB, memfasilitasi perkembangan siklus sel melalui titik

restriksi G1. Cyclin dependent kinase 2 (CDK2) membentuk kompleks dengan

siklin E pada fase lanjut G1, yang terlibat dalam transisi G1/S. Cyclin dependent

kinase 2 (CDK2) juga membentuk kompleks dengan siklin A pada fase S yang

memfasilitasi transisi G2/M. Cyclin dependent kinase 1 (CDK1) membentuk

kompleks dengan siklin B yang memfasilitasi transisi G2/M (Kumar et al., 2010).

2.2.8 Penilaian Hasil Pulasan Imunohistokimia Cyclin D1 pada Regenerasi Hati

Penilaian ekspresi cyclin D1 pada regenerasi hati dilakukan pada daerah

zona 3 dan 2 disekitar fokus-fokus nekrosis, umumnya hepatosit yang regenerasi

tampak dengan gambaran lebih hidrofik dibandingkan sel-sel hati disekitarnya

yang berukuran lebih kecil disertai peningkatan aktivitas mitosis. Perbesaran kuat

memperlihatkan hepatosit jinak yang regeneratif umumnya membentuk pita-pita

dengan ketebalan tidak lebih dari 2 lapis sel (Kleiner and Ferrel, 2016).

Ekspresi Cyclin D1 pada pulasan imunohistokimia (IHK) dinilai secara

visual menggunakan mikroskop cahaya binokuler dan dibuat skor kuantitatif

dengan menghitung jumlah inti sel hepatosit yang terpulas berintensitas sedang

sampai kuat dalam 100 sel memakai perbesaran kuat 400 kali (lapangan pandang

besar) pada area hot spot, bila memungkinkan menggunakan grid (mikrometer).

Skor pulasan Skor tersebut dinyatakan dalam prosentase 0-100% (Batinac et al.,

2004; Ramirez et al., 2005; Dornales et al., 2009; Swati et al., 2012; Nurliani and

Sandika, 2015).

32

Area hot spot terletak pada daerah zona 3 dan 2 disekitar fokus-fokus

nekrosis, hepatosit yang regenerasi tampak dengan gambaran lebih besar

dibandingkan sel-sel hati disekitarnya yang normal disertai peningkatan aktivitas

mitosis. Perbesaran kuat memperlihatkan hepatosit jinak yang regeneratif

umumnya membentuk pita-pita dengan ketebalan tidak lebih dari 2 lapis sel.

Gambar 2.11Imunohistokimia Cyclin D1 tidak Terpulas pada Sediaan (Das et al., 2011)

Gambar 2.12Imunohistokimia Cyclin D1 Terpulas pada 65% Sel, dengan Intensitas Kuat

(Termo Fisher, 2016)

33

2.3 Parasetamol

Parasetamol merupakan salah satu obat yang pemakaiannya sangat luas di

dunia, sebagai ilustrasi di Amerika terdapat lebih dari 600 merk dagang obat yang

mengandung parasetamol. Pemakaian parasetamol sangat sering, di Amerika

sebagai contohnya diperkirakan lebih dari 200 juta penduduk memakai obat ini

per tahun. Parasetamol sangat sering pemakaiannya di dunia kedokteran karena

merupakan salah satu analgesik-antipiretik yang efektif. Obat ini di Amerika

banyak dikombinasikan dengan analgesik golongan opioid, sehingga

penyalahgunaannya berkontribusi pula meningkatkan kejadian gagal hati akut.

Obat ini di Indonesia dalam bentuk murni termasuk obat bebas (berlabel hijau)

dan termasuk obat bebas terbatas bila dalam kombinasi sebagai obat flu, sehingga

mudah didapat dimana-mana baik preparat murni parasetamol maupun terkandung

dalam obat flu. Pemakaian parasetamol oleh masyarakat sering tanpa pengawasan

tenaga medis dan pemakaian parasetamol yang melebihi dosis terapi dalam jangka

waktu lama atau dengan dosis yang tidak tepat mampu menimbulkan kerusakan

hati (efek hepatotoksik). Sebagian masyarakat kurang tahu akan efek hepatotoksik

parasetamol ini (Franciscus, 2014).

2.3.1 Metabolisme Parasetamol dalam Hati

Pemberian parasetamol dosis toksik menghasilkan metabolit reaktif yang

dipercaya sebagai senyawa pemicu kerusakan pada hati. Sebagian besar

parasetamol (± 80%) di dalam hati terkonjugasi dengan asam glukuronat dan

sulfat dan sebagian kecil (9%-20%) dioksidasi oleh sistem sitokrom P-450 MFO

hati menjadi metabolit rektif N-asetil-p benzokuinonimina (NAPBKI). Campuran

34

ini sangat beracun, akan tetapi di dalam hati akan diikat oleh enzim antioksidan

berupa glutation, jika jumlahnya tidak mencukupi maka kuinon yang bersifat

beracun ini tidak akan dihapuskan dan mulai untuk bereaksi dengan

makromolekul protein-protein selular dan asam nukleat di dalam hati, pada

akhirnya menyebabkan kerusakan hati (Johnson et al., 2014; Lee, 2007).

Gambar 2.13Kadar Metabolit Acetaminophen-Cystein (Acetaminophen-CYS) dalam Serum

pada Beberapa Kelompok Pasien (Pauls and Senior, 2013)

A. Pasien acute liver failure (ALF) sekunder akibat overdosis acetaminophen.B. Pasien dengan ALF karena obat nonacetaminophen.C. Pasien dengan overdosis acetaminophen tetapi tanpa ALF.D. Pasien dengan ALF karena sebab yang tidak diketahui etiologinya dan tidak

terdeteksi obat dalam serumnya.E. Pasien dengan ALF tidak diketahui penyebabnya dan tidak diperiksa

serumnya.

2.3.2 Efek Hepatotoksik Parasetamol

Obat yang menyebabkan hepatotoksisitas dapat memiliki perangai

berhubungan dengan dosis (dose-dependent) atau tidak bergantung dosis (dose-

independent atau idiosyncratic). Kedua tipe cedera hati terinduksi obat yang

35

paling sering menimbulkan kegagalan hati akut disertai ensefalopati hepatik dan

koagulopati, meskipun proporsi kasus gagal hati akut disebabkan obat sangat

bervariasi di dunia (Gambar 2.17). Reaksi obat idiosinkratik jarang terjadi (terjadi

pada 1:10.000 sampai 1:100.000 penduduk yang memakai obat tertentu), dan

polimorfisme enzim pada satu sitokrom P450 (CYP) atau gen lain berperan

penting pada banyak pasien yang rentan, walaupun peran klinis dan nilai

farmakogenetik baru saja muncul. Acetaminophen (paracetamol) mungkin contoh

terbaik obat yang bersifat tergantung dosis dalam menimbulkan hepatotoksisitas.

Acetaminophen sangat aman saat dipakai pada dosis maksimal yang dianjurkan (4

gram/hari), tetapi dosis 8–10 gram/hari dapat menimbulkan nekrosis hati berat.

Gambar 2.15 menjelaskan secara skematik jalur metabolisme parasetamol

(acetaminophen) menghasilkan metabolit toksik. Telah diterima secara luas

bahwa toksisitas dianggap berasal dari metabolitnya yang sangat reaktif N-acetyl-

p-benzoquinone imine (NAPQI). N-acetyl-p-benzoquinone imine dapat terikat

secara kovalen pada protein seluler dan menyebabkan pembengkakan dan

kemudian lisis hepatosit. Gagal hati terinduksi parasetamol merupakan kelainan

hiperakut dimana gagal hati dapat berkembang hanya dalam waktu satu hari

setelah menelan parasetamol overdosis. Karakteristik biokimiawi termasuk

peningkatan enzim aminotransferase yang sangat tinggi (5.000–25.000 IU/L) dan

sering disertai peningkatan kadar kreatinin karena efek nefrotoksik langsung dari

parasetamol. Transplantasi hati tidak sering dilakukan pada pasien gagal hati

terinduksi parasetamol karena penyakit berkembang sangat cepat atau terdapat

kontraindikasi transplantasi secara medis atau sosial. Sebagai tambahan, rerata

36

bertahan hidup spontan (bebas transplantasi) adalah lebih baik (sekitar 70%)

dibanding penyebab lain dari gagal hati akut dan sebagian besar pasien tidak

memerlukan transplantasi hati. Kasus toksisitas parasetamol dapat salah

diinterpretasi apabila pasien datang dengan ensefalopati atau tidak mengaku

memakai parasetamol. Untuk mengatasi hal tersebut, telah dikembangkan

pemeriksaan baru yang dapat mengukur parasetamol terikat protein, yang sangat

efektif dalam mengidentifikasi kasus terselubung “smoking gun” (Franciscus,

2014).

Parasetamol juga merupakan salah satu contoh hepatotoksin unpredictable

yang merusak hati secara tidak langsung. Kerusakan hati yang timbul disini bukan

disebabkan karena toksisitas intrinsik dari obat, tetapi karena adanya reaksi

idiosinkrasi yang hanya terjadi pada orang-orang tertentu. Ciri dari kelainan yang

bersifat idiosinkrasi ini ialah timbulnya tidak dapat diramalkan dan biasanya

hanya terjadi pada sejumlah kecil orang yang rentan. Reaksi yang berdasarkan

idiosinkrasi menurut penyebab terjadinya dapat dibedakan dalam dua golongan

yaitu karena reaksi hipersensitivitas dan karena kelainan metabolisme. Kelainan

yang timbul karena hipersensitivitas biasanya terjadi setelah satu sampai lima

minggu dimana terjadi proses sensitisasi. Tanda-tanda sistemik dapat muncul

berupa demam, ruam kulit, eosinofilia dan kelainan histologik berupa peradangan

granulomatosa atau eosinofilik pada hati (Borges et al., 2010). Brunton et al.

(2011) mengemukakan teori parasetamol dimetabolisme terutama oleh enzim

mikrosomal hati.

37

Gambar 2.14Seluruh Jalur Metabolisme Parasetamol dalam Hati (Brunton et al., 2011)

Parasetamol mengalami biotranformasi di hati dan sebagian besar

dieksekresikan setelah berkonjugasi dengan glukoronat (60%), asam sulfat (20%)

dan sistein (3%). Konsumsi parasetamol dalam dosis yang tinggi, maka

parasetamol ikut mengalami N-hidroksilasi yang secara spontan mengalami

dehidritasi membentuk metabolit N-asetil-p-benzoquinone yang bersifat

hepatotoksik. Brunton et al. (2011) juga berpendapat hepatotoksis dapat terjadi

setelah mengkonsumsi dosis tunggal 10-15 g (200-250 mg/kg) parasetamol. Dosis

diatas 250 mg/kg secara potensial sangat fatal. Indikasi klinik terhadap

manifestasi kerusakan hati terjadi 2-6 hari setelah mengkonsumi parasetamol

dosis toksik.

38

Gambar 2.15Metabolisme Parasetamol Menghasilkan Metabolit Toksik NAPQI

(Borges et al., 2010)

Jalur utama metabolisme parasetamol termasuk glukoronidasi dan sulfatasi

(kiri) menghasilkan konjugat nontoksik larut air yang diekskresi lewat ginjal

(kanan atas). Jalur kedua melibatkan sistem sitokrom P450 (CYP), terutama

CYP2E1, dimana parasetamol dimetabolisme menjadi metabolit yang sangat

reaktif N-acetyl-p-benzoquinone imine (NAPQI). Metabolit ini dapat terikat

secara kovalen dengan protein hati dan menimbulkan nekrosis seluler. Efek toksik

dari NAPQI dihilangkan dengan pengikatan pada antidot alami glutation (GSH),

menghasilkan asam merkapturat suatu metabolit nontoksik larut air yang dapat

diekskresi. N-acetylcysteine berfungsi sebagai antidot dengan cara memperbaharui

glutation. Alkohol dapat meningkatkan toksisitas dengan induksi dari CYP2E1

atau menyebabkan deplesi simpanan glutation hati (Gambar 2.15).

39

Gambar 2.16Mekanisme Kerusakan Hati Dipicu Obat (Clinicalgate, 2015)

a. Gangguan filamen sitoskeletal memicu pembentukan gelembung dan nekrosissel.

b. Gangguan mekanisme transport kanalikuler empedu menyebabkan kolestasis.c. Zat antara yang sangat reaktif yang terikat ke protein sel mengarahkan

pembentukan hapten.d. Neoantigen dapat ditranport ke permukaan sel dan membangkitkan suatu

respon imun sitotoksik atau pembentukan autoantibodi.e. Mekanisme apoptosis dapat juga berperan.f. Gangguan mitokondria mengarahkan akumulasi lemak mikrovesikuler dalam

hepatosit juga pembentukan asam laktat akibat metabolisme anaerob.

40

Gambar 2.17Mekanisme Antioksidan Herbal Menurunkan Toksisitas Seluler

Akibat Radikal Bebas (Singh et al., 2016)

Keterangan: = menghambat

2.3.3 Insiden Hepatotoksik

Toksisitas parasetamol adalah penyebab utama gagal hati akut di negara-

negara maju seperti Eropa dan Amerika Serikat. Parasetamol merupakan agen

penyebab yang memberikan kontribusi sekitar 46% dari seluruh gagal hati akut di

Amerika Serikat. Nekrosis masif hepatosit adalah gambaran predominan cedera

hati akut terinduksi parasetamol (Yamada et al., 2009; Sirisha et al., 2013).

Gagal hati akut terinduksi obat lain dan parasetamol predominan bertambah

pada negara-negara maju yang sering diakibatkan karena pemakaian obat

kombinasi narkotik-parasetamol, sedangkan hepatitis virus banyak di Asia dan

negara-negara berkembang (Bernal and Wendon, 2013).

41

Gambar 2.18Etiologi Gagal Hati Akut di Amerika (Pauls and Senior, 2013)

Keterangan:Jumlah pasien keseluruhan 2000.APAP: acetaminophen = parasetamol.Hep B: virus hepatitis BHep A: virus hepatitis A

Indeter: tidak dapat diketahui etiologinya dengan pasti

Insiden gagal hati akut akibat pemakaian parasetamol di Amerika pada

januari tahun 2013 sebanyak 916 kasus dari keseluruhan 2000 pasien gagal hati

akut yang tercatat dalam register pasien nasional. Parasetamol menduduki

peringkat pertama sebagai penyebab gagal hati akut, memberikan kontribusi

sekitar 46% dari seluruh kasus gagal hati akut. Seluruh penelitian di seluruh

negara tersebut (Gambar 2.19) terdapat kasus hepatitis A dan hepatitis B,

sedangkan gagal hati akut terinduksi parasetamol adalah tinggi berdasarkan hasil

penelitian di negara barat. Reaksi obat idiosinkratik terutama memberi kontribusi

12%–17% kasus, dengan jumlah kasus yang lebih rendah di India, Jepang, dan

Inggris Raya. (Pauls and Senior, 2013).

42

Gambar 2.19Perkiraan Etiologi Gagal Hati Akut di Berbagai Belahan Dunia

(Pauls and Senior, 2013)ACM: acetaminophen; drug: idiosyncratic drug reactions; HAV: hepatitis Avirus; HBV: hepatitis B virus; shock: ischemic hepatitis.

Data jumlah pasien gagal hati akut dan etiologinya di Indonesia belum

tercatat dengan baik, namun dari sebuah kepustakaan angka kejadian kasus

hepatotoksik akibat obat di rumah sakit umum pusat dokter Sardjito Yogyakarta

sekitar 3,4% dari seluruh pasien yang berobat. Obat penyebab hepatotoksik yang

terbanyak adalah isoniazid, diikuti oleh parasetamol. Kasus hepatotoksik akibat

isoniasid yang tinggi tersebut dikarenakan kejadian tuberkulosis yang tinggi di

Indonesia, namun parasetamol sebagai agen penyebab hepatotoksik perlu

diperhitungkan karena menduduki urutan kedua (Febrinasari, 2010).

2.3.4 Gambaran Histopatologi Hati pada Toksisitas Akut Parasetamol

Makroskopis hati yang rusak akibat parasetamol dosis toksik tampak

dengan bercak-bercak, area nekrosis tampak sebagai bintik-bintik merah gelap

hemoragik yang umumnya tersebar dengan latar belakang kekuningan (Cavar et

al., 2010). Toksisitas akut parasetamol terutama memberikan gambaran histologi

berupa adanya nekrosis koagulatif pada zona 3 dengan sebukan ringan radang

limfoplasmasitik, terdapat sedikit atau tidak ada sama sekali fibrosis, dapat ada

43

kolestasis, dan tidak ada gambaran kelaianan oklusi vena sentral. Hepatosit

disekitar sistem porta masih viabel. Gambaran histologi nekrosis zona 3 (nekrosis

zonal) yang ditemukkan pada toksisitas akut parasetamol terlihat sebagai area

berwarna merah muda pekat, disekitarnya hepatosit yang viabel berwarna pucat

karena mengalami steatosis dan cedera bengkak (balloning injury) (Kleiner and

Ferrel, 2016).

2.3.5 Gambaran Histologi Regenerasi Hati

Regenerasi dapat bersifat difus, fokal, dan kadang dapat membentuk nodul.

Hepatosit yang regenerasi umumnya belum disertai sirosis. Hepatosit yang

regenerasi terlihat lebih hidrofik dibandingkan sel-sel hati disekitarnya yang

berukuran lebih kecil. Perbesaran kuat memperlihatkan hepatosit jinak secara

sitologis membentuk pita-pita dengan ketebalan tidak lebih dari 2 lapis sel.

Gambaran pada perbesaran kuat dapat memperlihatkan sel-sel hati dengan

sitoplasma luas dan inti membesar, sebagian dengan anak inti prominen. Sebagian

sel mengandung badan Mallory (displasia sel besar), masih membentuk pita

dengan ketebalan tidak lebih dari 2 lapis sel. Aktivitas mitosis meningkat pada

area yang regenerasi. Pulasan H-E lebih sulit untuk mengevaluasi sediaan,

gambaran histologi lebih jelas dengan pulasan retikulin.

2.3.6 Parameter Klinis dan Laboratoris Hepatotoksisitas atau Nekrosis Hati Akut

Nekrosis hati akut menurut jurnal terbaru, didefinisikan sebagai nekrosis

akut hati akibat cedera toksik, onsetnya mendadak, bertambah berat, ditandai

peningkatan kadar aminotransferase, muncul tanda awal kegagalan atau disfungsi

hati atau organ lain, dan disertai atau tidak disertai ikterus. Gejala nekrosis hati

44

akut muncul dalam periode singkat 1 sampai 14 hari. Obat-obat yang sering

menimbulkan nekrosis hati akut antara lain: parasetamol (acetaminophen), asam

asetilsalisilat, kokain, niasin, amiodaron dosis tinggi, metotreksat, terbutalin,

bahan toksik seperti fosfor atau minyak penny royal. Hepatotoksik dapat terjadi

juga setelah anestesi umum atau propofol.

Parameter laboratoris berupa peningkatan ALT (SGPT) secara cepat >800

IU/L atau meningkat >20 kali nilai awal, alkalin fosfatase naik < 2 kali nilai awal

atau < 230 U/L. Rasio ALT/ALP meningkat sangat tinggi (lebih dari 10).

Parameter lain yang juga meningkat LDH, kreatinin, BUN, INR, dan amonia.

Hiperbilirubinemia terjadi lebih lambat. Kadar parameter-parameter dalam darah

tersebut akan menurun drastis setelah paparan dengan bahan toksik pemicu

dihentikan, akan menurun nilainya 50% dalam 8 hari.

Kriteria nekrosis hati akut yaitu:

1. Muncul mendadak, kurang dari 14 hari

2. Onset dan gejala bertambah berat

3. Alanine aminotransferase (ALT)/SGPT meningkat >800 IU/L atau

meningkat >20 kali nilai awal

4. Alkalin fosfatase (ALP) normal atau meningkat ringan-sedang (<2 kali

nilai awal)

5. Kadar bilirubin < 10 mg/dL saat diagnosis

6. Cedera akut dan disfungsi sistem organ lain (paru, ginjal, sumsum tulang)

7. Histopatologi (bila dilakukan biopsi): terjadi nekrosis koagulatif zona 3

dengan infiltrat ringan limfositik, sedikit atau tanpa fibrosis, tidak ada

45

kolestasis atau kolestasis ringan, dan tidak ada gambaran oklusi vena

sentral (Kleiner and Ferrel, 2016).

Beberapa kepustakaan menyebutkan kadar ALT dan AST meningkat

setelah paparan obat hepatotoksik (termasuk parasetamol), dengan puncak setelah

24 jam hingga 48 jam. Beberapa kepustakaan lain menyebutkan puncaknya pada

24 jam hingga 96 jam setelah paparan parasetamol dosis toksik (Kleiner and

Ferrel, 2016).

2.3.7 Pemakaian N-Acetylcystein (NAC) Sebagai Antidot Efek Hepatotoksik

Parasetamol

Regenerasi hati merupakan proses vital dalam survival setelah paparan

bahan toksik, proses ini terjadi relatif terlambat setelah fase cedera. N-

acetylcystein yang merupakan prekursor glutation hingga saat ini dipakai sebagai

antidot overdosis parasetamol. Beberapa literatur memaparkan bahwa pemakaian

N-acetylcystein yang terlambat lebih dari 8 jam setelah paparan parasetol dosis

toksik, menurunkan efektivitasnya dan efek hepatoprotektifnya semakin menurun

setelah paparan parasetamol lebih dari 24 jam (Waring, 2012; Quai and

Shepherd, 2010; Yang et al., 2009).

Dosis NAC yang lazim digunakan adalah dosis awal 150 mg/kg BB

intravena atau 140 mg/kg BB peroral, dilanjutkan 70 mg/kg BB tiap 4 jam atau

420 mg/kg BB/hari minimal diberikan selama tiga hari (Varney, 2012; Algren,

2008). Tikus putih dengan berat badan rerata 200 gram memerlukan dosis awal 28

mg, dilanjutkan 84 mg/hari. Obat herbal terstandar yang sering diberikan oleh

klinisi penyakit selain obat standar NAC dalam untuk mengobati gangguan fungsi

46

hati akibat intoksikasi obat ialah silimarin (dengan berbagai merk dagangnya)

yang merupakan ekstrak dari tanaman milk thistle. Silimarin telah teruji klinis

sebagai hepatoprotektor (MIMS, 2017).

2.3.8 Kegagalan Pemakaian N-Asetilsistein (NAC) Jangka Panjang Sebagai

Antidot Efek Hepatotoksik Parasetamol

Regenerasi hati merupakan proses vital dalam survival setelah paparan

bahan toksik, proses ini terjadi relatif terlambat setelah fase cedera. N-

acetylcystein yang merupakan prekursor glutation hingga saat ini dipakai sebagai

antidot overdosis parasetamol. Beberapa literatur memaparkan bahwa pemakaian

N-acetylcystein lebih dari 8 jam setelah paparan parasetol dosis toksik,

menurunkan efektivitasnya dan efek hepatoprotektifnya semakin menurun setelah

paparan parasetamol lebih dari 24 jam (Waring, 2012; Quai and Shepherd, 2010).

Beberapa penelitian menunjukkan NAC hanya efektif untuk pasien dengan

overdosis akut yang baru terjadi beberapa jam dan kurang efektif pada pasien

yang terpapar parasetamol dengan jangka waktu yang lebih lama. Hasil penelitian

tersebut, 72 jam setelah paparan parasetamol, dibandingkan dengan kontrol yang

diberikan larutan garam fisiologis, perlakuan dengan NAC secara signifikan

meningkatkan serum transaminase (alanin transaminase/aspartat

aminotransferase), menginduksi terjadinya vakuolisasi hepatosit pada daerah

periportal dan pada pemeriksaan histopatologi tampak memperlambat regenerasi

sel hati. Efek merugikan ini dikaitkan dengan berkurangnya faktor inti hati terikat

DNA (hepatic nuclear factor (NF)-κB DNA binding) dan berkurangnya ekspresi

protein siklus sel cyclin D1, keduanya merupakan faktor penting dalam regenerasi

47

hati. Disimpulkan pengobatan jangka panjang NAC menghambat regenerasi pada

cedera hati akut diinduksi parasetamol (Yang et al., 2009).

Penelitian tersebut mendapatkan hasil pengobatan jangka panjang NAC

meningkatkan kadar ALT dan AST 72 jam setelah paparan parasetamol. Dua pulu

empat jam setelah penyuntikan parasetamol, dibandingkan dengan perlakuan

memakai larutan garam fisiologis, pengobatan NAC secara signifikan

menurunkan kadar ALT / AST. Cedera hati akut pada 6 ekor tikus jantan dengan

parasetamol dosis tunggal (350 mg/kgBB) melaui injeksi intraperitoneal. 2 jam

setelah injeksi parasetamol, hewan coba diberikan NAC 100 mg/kgBB dilarutkan

dalam 0,6 mL saline dan kontrol dengan 0,6 mL saline saja tiap 12 jam. Alanine

Aminotransferase (ALT) dan Aspartate Aminotransferase (AST) diukur 24 jam

setelah injeksi parasetamol (n=6 tikus yang bertahan hidup pada masing-masing

kelompok). Hasil adalah rata-rata + standard error of the mean (SEM). *p < 0,05

dibanding kontrol; † p < 0,05 dibanding kelompok NAC. Tiga kelompok tikus

terpisah, 72 jam setelah paparan parasetamol dibandingkan dengan perlakuan

memakai larutan garam fisiologis, pemakaian NAC secara signifikan

meningkatkan kadar ALT / AST dengAN nilai p < 0,05. Cedera akut hati

diinduksi seperti cara tersebut diatas. 2 jam setelah paparan parasetamol, hewan

coba diberikan perlakuan yang sama tiap 12 jam, selama periode total 72 jam.

ALT dan AST diukur 72 jam setelah injeksi parasetamol (n = 6 sampai 7 tikus

yang bertahan tiap kelompok). Hasil adalah rata-rata + standard error of the mean

(SEM). *p < 0,05 dibanding kontrol; † p < 0,05 dibanding kelompok NAC (Yang

et al., 2009).

48

Pengobatan jangka panjang menggunakan NAC menghambat regenerasi

hati pada pemeriksaan histopatologi. Hasil penilaian histologi 72 jam setelah

induksi cedera hati akut, dibandingkan dengan hewan coba kontrol, tikus dengan

perlakuan larutan saline memperlihatkan sejumlah kecil sebaran hepatosit

nekrosis, bukti adanya regenerasi dan infiltrasi luas sel-sel radang (240 + 40 per

lapang pandang besar, n = 6) pada daerah sentrilobuler. Sebaliknya, tikus dengan

perlakuan NAC memperlihatkan 10% nekrosis hepatosit dan infiltrasi luas sel-sel

radang (250 + 35 per lapang pandang besar, n = 6) pada daerah sentrilobuler,

namun tidak ada tanda regenerasi yang terlihat (Gambar 2.20; tanda panah

memperlihatkan daerah periportal yang ditunjukkan pada gambar 2.21). Sebagai

tambahan, bertambah lamanya pengobatan memakai NAC juga menginduksi

terjadinya vakuolisasi pada daerah periportal (Gambar 2.21).

Gambar 2.20Efek Pengobatan dengan NAC atau Larutan Garam Fisiologis terhadap Patologi Cedera Akut Hati Diinduksi Parasetamol dengan Pulasan HE. A. Kontrol (200x); B. Saline (200x); C. NAC (200x). Tanda panah menunjukkan daerah periportal

pada gambar 2.25. NAC = N-acetyl-cystein (Yang et al., 2009)

A B C

49

Gambar 2.21Pemakaian NAC Jangka Panjang Menginduksi Vakuolisasi Daerah Periportal

pada Tikus yang Diinduksi Cedera Hati Akut dengan Parasetamol, Pulasan HE. A.Kontrol (200x); B. Saline (200x); C. NAC (200x)

NAC = N-acetyl-cystein (Yang et al., 2009)

Pengobatan jangka panjang menggunakan NAC meningkatkan kadar

mieloperoksidase (MPO) jaringan hati. Aktivitas MPO jaringan didefinikan

sebagai suatu indeks infiltrasi netrofil pada hati setelah injeksi parasetamol. Nilai

aktivitas MPO hati kelompok control adalah 4,2 + 0,29 U/g. Tujuh puluh dua jam

setelah induksi cedera hati akut, nilai tersebut meningkat menjadi 5,88 + 1,19 U/g

pada kelompok dengan larutan saline. Aktivitas MPO hati meningkat secara

signifikan pada kelompok perlakuan NAC, menjadi 9,5 + 0,70 U/g (p < 0,05), bila

dibandingkan dengan kelompok saline (n = 6 tiap kelompok, data diperlihatkan

sebagai rata-rata + SEM) (Gambar 2.22).

A B C

50

Gambar 2.22Efek Perlakuan dengan NAC atau Salin terhadap Aktivitas MPO Hati Tikus yang

Diinduksi Cedera Hati AkutNAC = N-acetylcystein (Yang et al., 2009)

Pengobatan jangka panjang NAC menurunkan hepatic NF-κB DNA

binding. NF-κB adalah suatu factor transkripsi pleiotropik yang aktivasinya

dihubungkan dengan inflamasi dan proses destruksi, dan juga sebagai inisiasi dari

program regenerasi hati yang cedera. Blockade dari HMGB1 melindungi dari

cedera akibat iskemia-reperfusi (I/R-induced liver injury); perlindungan ini

dihubungkan dengan peningkatan aktivitas pengikatan NF-κB DNA. Pacuan

aktivitas NF-κB DNA terlihat pada tikus yang terlindungi dari cedera hati

iskemia-reperfusi diikuti blockade dari reseptor HMGB1 terhadap hasil akhir

proses glikasi (advanced glycation end products). Oleh karena itu, peneliti

memeriksa pengaruh parasetamol terhadap aktivasi NF-κB 72 jam setelah injeksi

parasetamol dan menguji efek pengobatan NAC. Terdapat kadar basal NF-κB

DNA binding yang rendah pada jaringan hati sampel kelompok kontrol.

Kelompok yang mendapat larutan garam fisiologis (saline), memiliki peningkatan

51

nyata NF-κB DNA binding. Pengobatan jangka panjang menggunakan NAC pada

tikus yang dipapar parasetamol secara jelas menurunkan NF-κB DNA binding

secara relative dibanding kadar yang teramati pada tikus yang diperlakukan

dengan saline. Nuclear Factor (NF)-κB DNA binding diukur 72 jam setelah

induksi cedera hati akut atau prosedur Sham. Gambar diambil untuk

memperlihatkan hasil dari 5 pemeriksaan yang representatif (Gambar 2.23).

Gambar 2.23Efek Perlakuan dengan NAC atau Salin terhadap NF-κB DNA-binding dalam

Ekstrak Inti yang Dibuat dari Sampel Jaringan Hati Tikus yang Diinduksi Cedera Hati Akut. Diperlihatkan jel yang khas. NAC = N-acetyl-cystein

(Yang et al., 2009)

Pengobatan jangka panjang NAC menurunkan ekspresi cyclin D1 hati.

Onset yang tepat proses perbaikan dapat membatasi cedera hati dan memicu

regenerasi kehilangan massa jaringan. Induksi cyclin D1 adalah petanda yang

paling dapat dipercaya untuk menilai tahapan perkembangan siklus sel (fase G1)

pada hepatosit. Pemeriksaan Western blot dilakukan menggunakan ekstrak

seluruh sel yang dibuat dari jaringan hati untuk menilai ekspresi cyclin D1 pada

tikus hewan coba yang diinduksi cedera hati akut atau kelompok prosedur kontrol.

Ekspresi cyclin D1 pada kelompok kontrol dan kelompok NAC terlihat minimal

(Gambar 2.24). Sebaliknya, secara kontras, ekspresi cyclin D1 secara jelas dapat

52

teramati pada kelompok hewan coba dengan perlakuan larutan saline pada 72 jam

setelah pemberian parasetamol, yang mengindikasikan bahwa pengobatan jangka

panjang menggunakan NAC menghambat ekspresi cyclin D1 hati. Pemeriksaan

Western blot dilakukan memakai ekstrak hati yang dibuat dari jaringan yang

diambil 72 jam setelah injeksi parasetamol. Gambar diambil untuk

memperlihatkan hasil dari 5 pemeriksaan yang representatif (Yang et al., 2009).

Gambar 2.24 Efek Perlakuan dengan NAC atau Salin terhadap Ekspresi Cyclin D1 Jaringan

Hati. Diperlihatkan jel yang khasNAC = N-acetyl-cystein (Yang et al., 2009)

2.3.9 Dosis Parasetamol untuk Hewan Coba

Dosis terapi parasetamol oral untuk manusia dewasa (70 kg) rata–rata 1500

mg per hari. Dosis toksik parasetamol sering terjadi pada pemakaian dengan dosis

lebih dari 200 mg/kgBB/hari. Sedangkan dosis parasetamol yang menimbulkan

cedera berat sel hati atau nekrosis hati yang fatal adalah 3-4 g/kgBB/hari atau

dosis tunggal 3-4 gram pada kasus percobaan bunuh diri atau kasus tidak sengaja

tertelan pada anak-anak (Bancha, 2007). Dosis toksik untuk tikus yang memiliki

berat badan 200 gram bila dihitung dari dosis untuk manusia dewasa 70 kilogram

sebesar 250 mg/kg BB/hari berdasarkan penelitian oleh Bancha dengan faktor

53

konversi manusia–tikus 0,018 maka dosis toksik parasetamol adalah 315 mg/hari

(Johnson et al., 2014; Lee, 2007).

Sebuah penelitian yang menguji efektifitas N-acetylcystein jangka panjang

sebagai antidot parasetamol, dipakai dosis toksik parasetamol 350 mg/kgBB/

dosis tunggal melalui injeksi intraperitoneal (Yang et al., 2009). Sebuah laporan

kasus seorang wanita 33 tahun dirawat di rumah sakit, pemakaian parasetamol

dosis terapi 3 kali sehari 500 mg selama 3 hari dengan dosis total 4 gram

menimbulkan nekrosis hati yang fatal dan gagal ginjal akut atau nekrosis tubuler

akut (Bancha et al., 2007).

2.3.10 Sediaan Parasetamol yang Digunakan untuk Hewan Coba

Parasetamol yang dipakai dalam bentuk obat tetes untuk bayi yang

mengandung parasetamol 100 mg/ mL, maka volume yang diberikan pada hewan

coba 3,15 mL, setara dengan 315 mg parasetamol. Dosis pemberian 3,15 mL

sesuai acuan volume maksimum pemberian obat menurut Donatus dan Nurlaila

masih di bawah volume maksimum untuk tikus 200 g yaitu 10 mL obat peroral

seperti tertera pada Lampiran 2 (BPOM RI, 2014; Soekanto, 2002). Parasetamol

tersebut diberikan melalui sonde lambung.

2.4 Etika Penelitian Menggunakan Hewan Coba

2.4.1 Pemanfaatan dan Penggunaan Hewan Coba

Pemanfaatan hewan coba di bidang kesehatan antara lain untuk penelitian

pengembangan obat dan vaksin; uji coba keamanan, potensi, khasiat dari obat dan

bahan makanan; pengembangan diagnostik baru; penyedia produk biologis; serta

54

bahan pendidikan (biologi dan kedokteran). Penggunaan hewan coba antara lain

untuk penelitian (bidang fisiologi, farmakologi, biokimia, patologi, komporatif

zoologi, dan ekologi); diagnostik; pengamatan tingkah laku hewan; serta pada

balita untuk menguji tingkat kecerdasan anak (Ardhana and Rita, 2015).

2.4.2 Latar Belakang Etika Penelitian Hewan Coba

Hal-hal yang melatarbelakangi etika penelitian hewan coba ialah:

1. Penggunaan hewan coba untuk meramalkan efek yang mungkin timbul

dalam percobaan pada manusia, untuk penelitian fisologik, patologik,

toksikologik, pencegahan, diagnostik, terapeutik atau untuk menguji

sekumpulan preparat biologik yang tidak dapat diperiksa kadarnya

dengan metode kimia fisik, sehingga memerlukan pertimbangan etik

2. Adanya perbedaan dalam sistim hukum dan latar belakang kebudayaan

maka terdapat perbedaan pendekatan dalam implikasi etis dalam

penelitian pada hewan coba di berbagai negara

3. Hewan coba sebagai sistim biologik utuh masih belum dapat tergantikan

Penggunaan hewan coba hanya diizinkan bila diperlukan, dan hanya

dengan perlakuan yang layak, sehingga memerlukan pertimbangan etik dan

kualitas hasil penelitian (Darwin, 2016).

2.4.3 Pentingnya Etika dalam Penelitian Hewan Coba

Hewan coba yang dipakai dalam penelitian akan mengalami penderitaan,

berupa ketidaknyamanan, ketidaksenangan, kesusahan, rasa nyeri, dan terkadang

berakhir dengan kematian. Berdasarkan hal tersebut, hewan coba yang

dikobankan pada penelitian yang hasilnya dapat dimanfaatkan manusia patut

55

dihormati, mendapat perlakuan manusiawi, dipelihara secara baik, dan diusahakan

agar dapat disesuaikan pola kehidupannya seperti di alamnya. Peneliti yang akan

memakai hewan coba dalam penelitian kesehatan harus menilai dengan seksama

kelayakan dan alasan pemanfaatan hewan coba dengan mempertimbangkan

penderitaan yang akan dialami hewan coba dan seberapa besar manfaat yang akan

diperoleh untuk kepentingan umat manusia (Prastowo, 2016).

Bahan uji (obat) yang ditujukan untuk digunakkan pada manusia, perlu

diteliti dengan menyertakan subjek manusia sebagai final test tube. Relawan

manusia secara etis boleh diikutsertakan bila bahan yang akan diuji telah lolos uji

di laboratorium secara menyeluruh, dilanjutkan dengan menggunakan hewan coba

untuk menguji kelayakan dan keamanannya. Hewan coba dibutuhkan untuk

mengamati dan mengkaji semua reaksi dan interaksi bahan uji yang diberikan,

serta dampak yang muncul secara utuh dan mendalam. Kelayakan penggunaan

hewan coba dalam penelitian harus dikaji secara mendalam dengan

membandingkan risiko yang akan dialami hewan coba dengan manfaat yang akan

diperoleh untuk umat manusia. Setiap penelitian yang memanfaatkan hewan coba

secara etis harus mengaplikasikan prinsip umum etika penelitian kesehatan dan

prinsip 3R yaitu: replacement, reduction, dan refinement. Perlakuan terhadap

hewan coba perlu dijabarkan secara rinci di dalam protokol penelitian sebagai

pengganti informed consent pada subjek manusia (Ridwan, 2013).

Penggunaan hewan coba dibutuhkan untuk mengungkap proses-proses

yang terjadi di dalam tubuh (in vivo) dalam suatu bentuk penelitian dan hewan

coba yang dipakai pada proses pendidikan menjadi hal yang sangat perlu

56

diperhatikan. Komisi Bioetika Nasional maupun Komisi Nasional Etik Penelitan

Kesehatan dibentuk untuk mengemban tugas khusus dengan memperhatikan dan

mempertimbangkan sudut pandang multidisiplin dalam spektrum ilmu-ilmu dasar

dan ilmu-ilmu terapan yang mengacu pada bidang kesehatan dan kedokteran serta

ilmu pengetahuan dan teknologi di bidang pertanian dalam arti luas (Prastowo,

2016; Ridwan, 2013).

Penelitian-penelitian di bidang ilmu dasar, biologi, dan biomedis dalam

pelaksanaannya sering menimbulkan munculnya masalah etika. Penggunaan

hewan coba dalam proses pendidikan atau pengajaran seperti praktikum dan

demonstrasi dalam ilmu dasar, pertanian, perikanan, peternakan, dan biomedik,

harus memenuhi kaidah kesejahteraan hewan. Suatu penelitian yang dilakukan

pada objek hewan coba yang telah dirancang dengan cermat dan teliti pun tetap

memiliki risiko merugikan hewan coba yang dipakai sebagai objek penelitian.

Risiko yang muncul dalam penelitian harus tetap selalu diperhitungkan, bukan

saja didasari kepentingan penggunaan hewan coba atau institusi pengguna hewan

coba semata, tetapi berdasarkan didapatkannya manfaat sebesar-besarnya bagi

hewan coba yang diteliti dan sumbangsihnya terhadap ilmu pengetahuan

(Prastowo, 2016).

Semua perlakuan terhadap hewan coba dijelaskan secara rinci di dalam

protokol penelitian yang dianggap sama seperti informed consent pada penelitian

yang memanfaatkan relawan manusia. Uraian perlakuan terhadap hewan coba

dapat dianggap sama seperti informed consent bagi hewan coba dan menjadi salah

57

satu penilaian dalam etika penelitian yang memanfaatkan hewan coba (Ridwan,

2013).

2.4.4 Syarat Etis Penggunaan Hewan Coba pada Penelitian Biomedik

Syarat Etis hewan coba dapat dipakai dalam penelitian biomedik antara

lain:

1. Tujuan penelitian cukup memiliki nilai manfaat

2. Desain penelitian disusun sedemikian rupa sehingga kemungkinan besar

penelitian tersebut mencapai tujuan

3. Tujuan penelitian tidak mungkin akan tercapai bila hewan coba diganti

dengan subjek atau prosedur alternatif

4. Manfaat yang akan diperoleh jauh lebih berarti dibandingkan dengan

penderitaan yang akan dialami hewan coba (Darwin, 2016).

2.4.5 Landasan Etika Penelitian Hewan Coba

Kebijakan yang mendasari etika penelitian hewan coba yaitu peraturan

perundang-undangan nasional dan internasional, komisi etik penelitian kesehatan

(KEPK) dan komisi pemanfaatan dan pemeliharaan hewan (KPPH), serta prinsip

dasar etik pelaksanaan penelitian kesehatan yang memanfaatkan hewan coba.

Peraturan menteri kesehatan republik indonesia nomor 7 tahun 2016 tentang

komisi etik penelitian dan pengembangan kesehatan nasional. Salah satu fungsi

komisi etik penelitian dan pengembangan kesehatan nasional adalah memberikan

masukan dalam menyusun pedoman nasional di bidang etik penelitian dan

pengembangan kesehatan yang mengikutsertakan manusia sebagai subyek

penelitian dan memanfaatkan hewan coba, untuk ditetapkan menjadi peraturan

58

atau kebijakan. Dasar etika penelitian hewan coba yang lain adalah pedoman

nasional etik penelitian kesehatan suplemen II tahun 2006 yang membahas etik

penggunaan hewan coba pada riset biomedik (Darwin, 2016; Kementerian

Kesehatan, 2016).

Dasar pengembagan etika penelitian yang melibatkan hewan coba adalah

deklarasi Helsinki yang diperbaharui di Tokyo tahun 2004, “Ethical principles for

medical research involving human subjects” butir 11 dan 12 (World Medical

Association). Butir 11 menyatakan “Penelitian kesehatan yang mengikutsertakan

manusia sebagai subyek penelitian harus memenuhi prinsip ilmiah (scientifically

sound), berdasarkan kepustakaan ilmiah, percobaan di laboratorium; dan

dilakukan percobaan pada hewan (bila diperlukan)”. Butir 12 menyatakan

“Keberhati-hatian (caution) yang wajar harus diterapkan pada penelitian yang

dapat mempengaruhi lingkungan maupun kesejahteraan hewan yang digunakan

dalam penelitian, dan harus dihormati (respect). Pedoman lain yang perlu diingat

adalah hewan bukan manusia (animals are not human) dan tidak memanusiakan

hewan (do not humanize animals, instead treat animals humanely) (Ardhana and

Rita, 2015).

2.4.6 Tiga Prinsip Dasar Etik Pelaksanaan Penelitian Menggunakan Hewan Coba

Tiga prinsip dasar etik pelaksaan penelitian menggunakan hewan coba

ialah:

1. Tiga pilar prinsip etik penelitian

2. Prinsip etik penggunaan hewan Coba 3R

59

3. Prinsip etik pemeliharaan atau perlakuan terhadap hewan coba: 5F (Five

freedom) (Ardhana and Rita, 2015)

2.4.6.1 Tiga Pilar Prinsip Etik Penelitian Hewan Coba

Tiga pilar prinsip Etik Penelitian Hewan Coba:

1. Respect for animals: setiap peneliti yang menggunakan hewan coba

harus menghormati hewan coba tersebut

2. Beneficence: bermanfaat bagi manusia dan mahluk lain

3. Justice: bersikap adil dalam memanfaatkan hewan coba. Contoh sikap

adil: hewan tidak dibedah berulang kali untuk menghemat jumlah

hewan coba dan memakai euthanasia yang tidak menimbulkan rasa

nyeri (Ardhana and Rita, 2015).

2.4.6.2 Prinsip Etik Penggunaan Hewan Coba (3R)

Prinsip etik penggunaan hewan coba (3R) meliputi:

1. Reduction: penggunaan hewan dalam jumlah sekecil mungkin tetapi

memberikan hasil penelitian yang sahih. Jumlah minimum biasa

dihitung menggunakan rumus Federer yaitu (n-1) (t-1) >15, dengan n

adalah jumlah hewan yang diperlukan dan t adalah jumlah kelompok

perlakuan. Kelemahan dari rumus itu adalah semakin sedikit kelompok

penelitian, semakin banyak jumlah hewan yang diperlukan, serta

sebaliknya. Untuk mengatasinya, diperlukan penggunaan desain

statistik yang tepat agar didapatkan hasil penelitian yang sahih.

2. Replacement: dapat bersifat relatif berupa penggantian hewan coba

dengan memakai organ, jaringan hewan dari rumah potong, atau dari

60

orde yang lebih rendah; dapat bersifat absolut: mengganti hewan coba

dengan memakai kultur sel jaringan atau tissue culture, maupun

program komputer.

3. Refinement: memperlakukan hewan percobaan secara manusiawi

(humane), memelihara hewan dengan baik, tidak menyakiti hewan,

mengurangi rasa distress dengan memakai obat analgetik, sedativa,

anastesi, atau dengan melakukan prosedur secara benar oleh tenaga ahli

teknisi yang terlatih, sehingga menjamin kesejahteraan hewan coba

sampai akhir penelitian. Pada dasarnya prinsip refinement berarti

membebaskan hewan coba dari beberapa kondisi yang terjabarkan

dalam prinsip “five freedom” (Ardhana and Rita, 2015; Ridwan, 2013).

2.4.6.3 Prinsip Etik Pemeliharaan dan Perlakuan Hewan Coba (5F atau Five

freedom)

Five freedom mencakup:

1. Freedom from hunger and thirst (bebas dari kelaparan dan haus)

Tikus: pakan mengandung nutrisi protein 20–25%, lemak 5%, pati

45-50%, serat kasar 5 %, abu 4-5%, vitamin (A 4.000 IU/kg, D 1.000

IU/kg, E 30 mg/kg, kalsium pantotenat 8 mg/kg, B1 4 mg/kg, B6 3

mg/kg, B12 50 mg/kg, biotin 10 µg/kg, piridoksin 40-300 µg/kg, kolin

1.000 mg/kg, dan asam linoleat 3 g/kg). Jenis pakan untuk tikus: pakan

ayam petelur, pakan tikus, dll. Jumlah makan 12 gram- 20 gram/hari.

Minum add libitum.

61

Mencit: Pakan mengandung nutrisi protein 20-25 %, lemak 10-12%,

pati 45-55 %, serat kasar Maksimal 4%, abu 5-6%. Tambahan vitamin

A15.000-20.000 IU/kg, vitamin D 5.000 IU/kg,vitamin E 50 mg/kg,

asam linoleat 5-10 g/kg, B1 15-20 mg/kg, vitamin B12 30 ug/kg, dll.

Jumlah pakan 3 g- 5 gram per hari.

Marmut: pakan berupa sayuran ditambah vitamin C tinggi dan vitamin

lainnya, serat kasar 10 kali lipat dari makanan hewan lain, asam amino

arginin, sistin, dan metionin. Komposisi: protein 17-20%, lemak 3-4%,

pati 35-40%, serat kasar 30-35% dan abu : 4-5%. Jumlah pakan 20

g–35 g per hari.

2. Freedom from pain, injury and diseases (bebas dari rasa nyeri,

trauma, dan penyakit)

Melalui langkah-langkah berikut:

a. Program promotif

b. Pencegahan penyakit: bioskuriti, vaksinasi, dan medikasi (obat

cacing, antibiotik, dll.)

c. Pengobatan: sesuai penyakitnya

d. Meminimalkan rasa nyeri menggunakan analgesia, anestesi,

dan eutanasia (Ardhana and Rita, 2015)

Analgesia dan Anestesi yang umum dipakai:

Analgesia yang sering dipakai adalah xylazine, untuk hewan coba:

1. Mencit dan tikus: 4-8 mg/kg BB injeksi i.m. atau 10 mg/kg BB injeksi

i.p.

62

2. Kelinci: 1-5 mg/kg BB injeksi i.m. atau sc.

3. Hewan primata: 1-2 mg/kg BB injeksi i.m.

4. Marmut: 3-5 mg/kg BB injeksi i.m. atau 5 mg/kg BB injeksi i.p.

Anestesi yang umum dipakai:

1. Ketamin

Mencit dosis 100 –200 mg/kg BB injeksi i.p., 200 mg/kg BB injeksi

i.m. Tikus dosis 44 –100 mg/kg BB injeksi i.m., 75 mg/kb BB injeksi

i.p. Marmut dosis 100-200 mg/kg BB injeksi i.m. Kelinci dosis 44-50

mg/kg BB injeksi i.m. Hewan primata dosis 20-25 mg/kg BB injeksi

i.m.

2. Kombinasi Ketamine (K)–xylazine (X)

Mencit dosis 90-120 mg (K)/kgBB dan 10 mg (X)/kgBB injeksi i.m.

Tikus 40-80 mg (K)/kgBB dan 5-10 mg (X)/kgBB injeksi i.p. Marmut :

40 mg (K)/kg BB dan 5 mg (X)/kg BB injeksi s.c. Kelinci : 35 mg

(K)/kg BB dan 5 mg (X)/kg BB injeksi i.m. Primata : 10 mg (K)/kg BB

dan 0,5 mg (X)/kg BB injeksi i.m.

Eutanasi Hewan Percobaan

Ada 3 cara eutanasi yg dianjurkan:

1. Metode fisik

Metode fisik dilakukan terhadap hewan kecil, cara yang dianjurkan:

a. Dislokasi leher

63

b. Disuntik dengan udara ke dalam pembuluh darah, dosis pada

kelinci 5- 10 ml/kg BB

c. Elektrokusi untuk hewan besar

2. Metode inhalasi obat bius

3. Metode Suntikan obat bius. Prinsip menggukanan anasthesia dg dosis

3 kali lipat.

Eutanasi untuk hewan rodensia: barbiturat (diterima), eter (diterima dengan

syarat), dan anestesi per inhalasi (diterima). Eutanasi untuk hewan primata:

barbiturat (diterima) dan anestesi per inhalasi (diterima dengan syarat).

Eutanasi untuk hewan babi: barbiturat (diterima) dan anestesi per inhalasi

(diterima dengan syarat) (Ardhana and Rita, 2015).

3. Freedom from discomfort (bebas dari ketidaksenangan atau

ketidaknyamanan)

Tabel 2.2Suhu Ruangan yang Dianjurkan pada Pemeliharaan Hewan Coba (Ardhana and

Rita, 2015)

Hewan Suhu ruang

oC oF

Tikus, mencit, hamster, gerbil, marmut 20-26 68-79

Kelinci 16-22 61-72

Kucing, anjing, hewan primata 18-29 64-84

Hewan ternak, unggas 16-27 61-81

Persyaratan ruangan yang digunakan untuk memelihara hewan coba

hendaknya memenuhi persyaratan suhu, kelembaban, cahaya dan kebisingan yang

sesuai dengan kebutuhan hidup hewan coba, yaitu secara umum untuk hewan

64

rodensia suhu ruangan diatur menjadi 22° ± 3° C, dengan kelembaban relatif

30–70%, dan penerangan 12 jam terang 12 jam gelap. Ruangan harus selalu dijaga

kebersihannya. Hewan diberi pakan yang sesuai standar laboratorium dan

diberikan minum air tanpa batas (ad libitum). Hewan dipelihara dalam kandang

yang terbuat dari material yang kedap air, kuat dan mudah dibersihkan, ruang

pemeliharaan bebas dari kebisingan.

Luas area kandang per ekor hewan menurut Cage Space Guidelines For

Animals Used In Biomedical Research (2008) sebagai berikut:

a) Mencit (berat 15 – 25 g) : luas alas kandang 77,4 cm2, tinggi 12,7 cm

b) Tikus (berat 100 – 200 g) : luas alas kandang 148,4 cm2 , tinggi 17,8 cm .

c) Kelinci (berat 2 – 4 kg) : luas alas kandang 270 cm2 , tinggi 40,64 cm .

d) Marmut (berat 300 – 350 g) : luas alas kandang 387 cm2, tinggi 17,18 cm

(BPOM, 2014).

4. Freedom from fear and distress (bebas dari ketakutan dan kesusahan).

Caranya dengan memberi kondisi (lingkungan, perlakuan) kandang yg

nyaman, memberikan masa adaptasi dan latihan sebelum diberi perlakuan,

dan personil yang menangani hewan coba adalah tenaga profesional.

5. Freedom to express natural behavior (bebas mengekspresikan tingkah laku

alami). Memberikan ruang dan fasilitas yang sesuai (pengayaan lingkungan

yang sesuai dengan biologi dan tingkah laku spesies), mencari makan, dll.

Memberikan sarana untuk kontak sosial (bagi spesies yang bersifat sosial),

pengandangan berpasangan atau berkelompok. Memberikan kesempatan

65

untuk prooming, mating, bermain, dll. Program pengayaan lingkungan

(environmental enrichment) (Ardhana and Rita, 2015).

Pedoman-pedoman umum yang lahir dari prinsip-prinsip dasar etik

pelaksanaan penelitian menggunakan hewan coba antara lain:

1. Untuk kemajuan pengetahuan biologik dan pengembangan cara-cara yang

lebih baik dalam usaha melindungi kesehatan dan kesejahteraan manusia dan

memerlukan percobaan pada spesies hewan utuh.

2. Bila layak, gunakan metode simulasi komputer, matematik dan invitro untuk

mengurangi jumlah hewan coba.

3. Percobaan hewan hanya dapat dilakukan dengan pertimbangan seksama, ada

relevansi kuat terhadap kesehatan manusia dan kemajuan pengetahuan

biologik.

4. Spesies hewan coba harus tepat dan dari fologeni serendah mungkin.

5. Peneliti atau pelaksana penelitian harus melakukan hewan sebagai makhluk

perasa (sentient).

6. Peneliti harus beranggapan bahwa prosedur yang menimbulkan rasa nyeri

pada manusia juga menimbulkan nyeri pada hewan coba.

7. Prosedur yang menimbulkan nyeri harus dengan pembiusan yang memadai.

8. Pada akhir penelitian hewan yang menderita nyeri hebat atau kecacatan harus

dimatikan tanpa rasa nyeri.

9. Hewan yang dimanfaatkan untuk penelitian biomedik harus dijamin dalam

kondisi hidup yang paling baik berdasarkan animal laboratory science

(Darwin, 2016).

66

2.5 Pemilihan Hewan Coba

Tikus adalah hewan coba yang paling sering dipakai sebagai pada

penelitian laboratoris bidang biomedis. Tikus merupakan hewan coba yang ideal

untuk penelitian eksperimental karena beberapa alasan. Alasan pertama ialah

tersedianya banyak literatur yang telah diterbitkan membahas hewan coba ini.

Alasan lainnya ialah karena hewan coba tikus mudah dipindahkan, tidak

memakan ruang pemeliharaan yang luas, memiliki fertilitas tinggi, masa

kehamilan pendek, mudah dalam perawatannya, dan dapat menjadi model

berbagai kelainan serta penyakit pada manusia (McGill, 2009).

Fisiologi dan metabolisme tikus memiliki banyak kemiripan dengan

manusia, dengan sedikit perbedaan sifat biologis dan perilaku. Tikus memiliki

sifat biologis lebih aktif pada malam hari (hewan nokturnal) dan sangat ingin tahu

lingkungan sekitarnya. Salah satu galur tikus yang paling sering dipakai sebagai

knock-out rats pada penelitian eksperimental adalah tikus putih strain Wistar yang

memiliki nama Latin Rattus norvegicus. Tikus galur ini memiliki ciri khas kepala

lebar, telingga panjang, dan panjang ekor tidak melebihi panjang badan. Nama

Wistar diambil dari nama institut Wistar yang pertama kali membiakkan tikus

putih strain ini untuk hewan coba pada tahun 1906. Jenis tikus ini sekarang

banyak dikembangbiakkan di banyak negara (Alexandru, 2011; Hubrecht and

Kirwood, 2010). Nilai normal parameter biologis dasar tikus putih Wistar

disajikan pada Tabel 2.3.

Tabel 2.3

67

Data Biologis Dasar Tikus Wistar (Alexandru, 2011; Hubrecht and Kirwood, 2010)

Parameter Nilai NormalJumlah kromosomUmur maksimal (tahun)Berat badan jantan dewasa (g)Berat badan jantan dewasa (g)Berat badan lahir (g)Kebutuhan makanan per hari (g/100g BB) Kebutuhanair per hari (mL/100g BB) Defekasi (g/24 jam)Produksi kencing (mL/24 jam)

422 – 4

450 – 520250 – 300

4,5 – 610

10 – 159 – 1310 – 15

Tabel 2. 4Berat Organ Tikus Putih (Alexandru, 2011; Hubrecht and Kirwood, 2010)

Organ Prosentase dari berat badan (%)Kelenjar anak ginjal (masing-masing)DarahOtakJantungGinjal (masing-masing)HatiParuOvarium (masing-masing)SpleenTestis (masing-masing)TimusTiroid

0,025 – 7

10,50,531

0,050,20,5

0,070,005

Tabel 2.5Konversi Umur Tikus Terhadap Manusia (Andreollo et al., 2012)

Umur Tikus (dalam bulan) Umur Manusia (dalam tahun)6 bulan

12 bulan18 bulan24 bulan30 bulan36 bulan42 bulan45 bulan48 bulan

18 tahun30 tahun45 tahun60 tahun75 tahun90 tahun

105 tahun113 tahun120 tahun

Nilai normal fungsi hati tikus, dalam hal ini alanine aminotransferase

(ALT) atau disebut juga serum glutamic pyruvic transaminase (SGPT) memiliki

rentang antara 44,45 – 75 U/L dan aspartate aminotransferase (AST) atau disebut

68

juga serum glutamic oxaloacetic transaminase (SGOT) memiliki rentang antara

54,54 – 120 U/L (Dwarkinath, 2014). Parameter fungsi hati yang meningkat

secara signifikan pada cedera akut akibat toksisitas parasetamol adalah SGPT.

2.5.1 Ciri Umum Hewan Coba Tikus Putih yang Sehat

Ciri umum yang dapat dinilai dari luar sebagai dasar menyatakan seekor

tikus hewan coba sehat antara lain tidak tampak kelainan anatomis secara

makroskopis, gerakan aktif, mata bersinar, mau makan dengan lahap, bulu tidak

berdiri, bulu bersih (tidak kusam atau rontok), dan feses padat (Mahanani, 2013).

Hewan coba memperlihatkan ciri-ciri umum tersebut diatas dianggap memiliki

fungsi hati yang normal, karena kelainan hati bawaan jarang terjadi.

2.6 Peroksidasi Lipid

Peroksidasi lipid merupakan suatu reaksi yang dipicu oleh adanya radikal

bebas. Peroksidasi lipid terjadi akibat ketidakseimbangan radikal bebas (oksidan)

dengan antioksidan seluler atau dengan kata lain jumlah radikal melebihi

kemampuan tubuh untuk menetralisirnya. Peroksidasi lipid yang terjadi

menimbulkan kerusakan membran. Kerusakan membran diawali dengan

perusakan protein dan oksidasi rantai samping asam lemak tak jenuh ganda (poly

unsaturated fatty acid / PUFA) yang merupakan penyusun utama membran sel

(Murray et al., 2012; Lane, 2011).

69

Senyawa pemicu inisiasi peroksidasi lipid dapat berupa radikal alkil (R*)

atau radikal hidroksil (OH*). Tahapan reaksi peroksidasi lipid dapat digambarkan

secara skematis sebagai berikut (Lane, 2011):

Inisiasi : Lipid + R* / OH* à Lipid*

Propagasi : Lipid* + O2 à Lipid-OO*

Lipid-OO* + Lipid à Lipid-OOH + Lipid*

Terminasi : Lipid* + Lipid* à Lipid-Lipid

Lipid-OO* + Lipid* à Lipid-OO-Lipid

(Scavenging / : Lipid* + Vit E (atau antioksidan lain) à Lipid + Vit E*

Penyelamatan) / Antioksidan*

2.7 Radikal Bebas

Radikal bebas didefinisikan sebagai atom yang memiliki satu atau lebih

orbital yang diisi elektron tak berpasangan (unpaired electron). Setiap molekul

dapat menjadi radikal asalkan memiliki elektron tak berpasangan. Radikal bebas

bersifat merusak karena sangat reaktif, untuk menstabilkan ikatan kimia akibat

adanya elektron tak berpasangan tersebut atom atau molekul ini mudah bereaksi

dengan molekul donor yang akan menyumbangkan elektron untuknya. Radikal

bebas juga memiliki kemampuan mengubah senyawa lain termasuk komponen

tubuh baik komponen stuktural (lipid, karbohidrat dan protein penyusun

membran) maupun komponen fungsional (enzim dan asam nukleat) menjadi

radikal (Murray et al., 2012; Lane, 2011). Pengertian oksidan dan radikal bebas

sering dibaurkan di dalam kepustakaan kedokteran. Radikal bebas merupakan

70

oksidan, tetapi tidak semua oksidan termasuk radikal bebas (misalnya ion Fe3+

merupakan oksidan namun bukan radikal bebas). Oksidan, dalam pengertian ilmu

kimia adalah senyawa penerima elektron (electron acceptor), yaitu senyawa yang

dapat menarik elektron. Radikal bebas memiliki persamaan dengan oksidan dalam

hal kemampuannya menerima elektron (Murray et al., 2012).

Ditinjau dari struktur kimianya radikal bebas dapat dibedakan menjadi

beberapa tipe, yaitu:

a. Radikal bebas dengan atom pusat hidrogen, misalnya atom H dengan

satu proton dan satu elektron.

b. Radikal bebas dengan atom pusat karbon, misalnya radikal triklorometil

dan karbon triklorida.

c. Radikal bebas dengan atom pusat sulfur, misalnya radikal thiyl.

d. Radikal bebas dengan atom pusat nitrogen, misalnya radikal fenildiazin

dan nitrit oksida.

e. Radikal bebas dengan atom pusat oksigen, terdiri dari 2 macam, yaitu:

1. Anorganik, misalnya radikal superoksida dan radikal hidroksil.

2. Organik, misalnya radikal alkoksil dan peroksil.

2.7.1 Radikal Oksigen

Oksigen merupakan unsur terbanyak di bumi. Unsur oksigen (lambang

kimia O) merupakan komponen terbanyak di udara atau atmosfer yaitu berkisar

21%. Oksigen di udara terdapat sebagai molekul ganda (diatomik), yaitu dua atom

yang bergabung menjadi molekul O2 (dioksigen).

71

Oksigen diatomik (O2) dapat dikategorikan sebagai radikal bebas karena

memiliki dua elektron yang tidak berpasangan, tetapi oksigen dalam bentuk ini

mempunyai kemampuan mengatur susunan elektronnya (dua orbital elektron yang

berperan dalam reaksi oksidasi memiliki spin yang sama) sehingga tidak sereaktif

radikal oksigen lain (Lane, 2011). Reduksi oksigen akan menghasilkan radikal

kuat yaitu radikal superoksida dan melalui reaksi bertahap dapat terbentuk radikal

hidroksil (Murray et al., 2012; Lane, 2011).

1. O2 + e- à O2* (radikal superoksida)

2. O2* + 2 H+ + e- à H2O2 (hidrogen peroksida)

3. H2O2 + e- à OH* (radikal hidroksil)

Radikal superoksida terbentuk melalui penambahan satu elektron pada

oksigen sehingga hanya terdapat satu elektron oksigen yang tidak berpasangan,

dilambangkan dengan O2*. Sifat kimia radikal ini sangat bergantung pada tempat

dimana dia berada. Radikal ini tidak begitu reaktif di dalam air, tetapi di dalam

pelarut organik radikal ini menjadi lebih reaktif. Radikal superoksida dapat

terbentuk pada proses auto-oksidasi hemoglobin menjadi methemoglobin di dalam

eritrosit. Radikal superoksida di jaringan lain dapat terbentuk melalui kerja enzim

seperti sitokrom P450 reduktase dan xantin oksidase. Radikal superoksida lebih

lanjut dapat bereaksi dengan hidrogen (H+) dan penambahan elektron membentuk

hidrogen peroksida.

Reaksi pembentukan H2O2 dari radikal superoksida masih dapat berlanjut

bila terdapat donor elektron. Hidrogen peroksida yang memperoleh donor elektron

akan membentuk radikal hidroksil, radikal ini lebih reaktif dibanding radikal

72

superoksida maupun hidrogen peroksida. Jumlah radikal superoksida dan

hidroksil yang melampaui kemampuan antioksidan seluler (NADPH, vitamin E

dan GSH) untuk menetralisirnya akan menyebabkan cedera membran sel (Murray

et al., 2012).

Radikal superoksida secara langsung dapat bereaksi dengan hidrogen

peroksida membentuk radikal hidroksil melalui suatu reaksi yang dikatalisis oleh

besi, reaksi ini disebut reaksi Haber-Weiss (Murray et al., 2012; Lane, 2011):

O2* + H2O2 à O2 + OH- + OH* (radikal hidroksil)

Radikal hidroksil yang sangat reaktif tersebut juga dapat terbentuk dari

hidrogen peroksida melalui suatu reaksi nonenzimatik yang dikatalisis oleh ion

besi (Fe2+), reaksi ini disebut reaksi Fenton (Murray et al., 2012):

Fe2+ + H2O2 à Fe3+ + OH- + OH* (radikal hidroksil)

2.7.2 Efek Radikal Bebas dalam Tubuh

Radikal bebas dalam tubuh dapat menimbulkan kerusakan lipid,

karbohidrat, protein dan asam nukleat. Radikal bebas juga mampu mengubah

senyawa lain termasuk komponen tubuh menjadi radikal (Lane, 2011) Radikal

bebas dapat menimbulkan kerusakan sel dan mendasari berbagai macam keadaan

patologis terutama penyakit degeneratif, seperti penyakit kardiovaskuler, penyakit

respiratorik, artritis, katarak, penyakit hati, diabetes melitus, sindroma penurunan

imunitas dan bahkan ikut berperan dalam proses penuaan. Hampir 90% penyakit

degeneratif didasari ketidakseimbangan oksidan-antioksidan dalam tubuh.

Walaupun sebagian besar mekanisme kerusakan tersebut masih belum jelas

sepenuhnya akibat rumitnya proses–proses yang terkait (Sharma, 2014).

73

2.8 Antioksidan

Radikal bebas mudah bereaksi dengan molekul donor yang akan

menyumbangkan elektron untuknya. Molekul donor dapat berupa protein, lipid,

karbohidrat dan asam nukleat, akibatnya terjadi kerusakan sel tubuh. Paparan

tubuh oleh radikal bebas merupakan suatu proses melibatkan reaksi oksidasi,

reaksi inilah yang dapat menimbulkan perubahan atau kerusakan sel. Paparan

dengan radikal bebas disebut juga stress oksidatif (Lane, 2011).

Antioksidan diperlukan untuk mencegah kerusakan tubuh karena adanya

radikal bebas. Antioksidan dapat didefinisikan sebagai suatu substansi yang

menghambat atau mencegah kerusakan akibat reaksi oksidasi pada molekul target

baik berupa lipid, protein, karbohidrat maupun asam nukleat tubuh (Lane, 2011).

Antioksidan dikelompokkan menjadi 3 bagian besar berdasarkan fungsinya

yaitu kelompok pemutus rangkaian atau golongan antioksidan primer, kelompok

antioksidan sinergis dan kelompok antioksidan sekunder (Hamid et al., 2010;

Caballero, 2006).

1. Kelompok antioksidan primer / chain–breaking–antioxidant

Antioksidan primer bekerja sebagai pemutus rangkaian reaksi yang

dipicu radikal bebas dengan cara mendonorkan hidrogen atau elektron

pada molekul radikal bebas sehingga tidak mempunyai lagi elektron

tunggal yang tak berpasangan, radikal yang sudah mendapat donor

elektron bersifat lebih stabil. Pada peroksidasi lipid kelompok

74

antioksidan ini akan bereaksi dengan radikal peroksil membentuk

komplek lipid-antioksidan.

Kelompok antioksidan primer terdiri atas golongan hindered

phenolic seperti butil hidroksi-toluen (BHT), butil hidroksi-anisol

(BHA), tokoferol, golongan polyhydroxyphenolic dan golongan derivat

fenolik natural seperti flavonoid, eugenol, vanilin. Kelompok

antioksidan primer bekerja efektif pada konsentrasi rendah dan

kelompok ini memiliki efek antioksidan paling kuat.

2. Kelompok antioksidan sinergis

Antioksidan sinergis ialah antioksidan yang bila bekerja sendirian

efeknya terbatas, sehingga memerlukan kerjasama (sinergi) dengan

antioksidan primer agar efek antioksidannya optimal. Antioksidan

sinergis juga dapat membantu menyediakan suasana asam yang

meningkatkan stabilitas dari antioksidan primer.

Kelompok ini dibagi menjadi dua, pertama golongan yang bereaksi

dengan radikal oksigen (oxygen scavenger) dan golongan chelator.

Golongan oxygen scavenger dapat bereaksi dengan radikal oksigen

karena mampu menangkap elektron radikal oksigen dan mengubahnya

menjadi sistem tertutup. Contoh golongan oxygen scavenger antara lain

asam askorbat (vitamin C), β-karoten, askorbil palmitat dan sulfit.

Golongan chelator sebenarnya bukanlah antioksidan, tetapi

keberadaannya dapat memperbesar efek positif antioksidan primer.

Golongan chelator terdiri atas EDTA, asam sitrat, dan asam fosfat.

75

3. Kelompok antioksidan sekunder

Kelompok ini berperan sebagai antioksidan lapis kedua setelah

antioksidan primer bekerja. Pada peroksidasi lipid kelompok ini

mengubah hasil akhir peroksidasi menjadi bentuk yang lebih stabil.

Contoh antioksidan sekunder ialah asam thiodriponit dan asam diauril

thiodipropionat (Valko, 2006).

Masalah lain yang timbul dalam pemakaian antioksidan dari luar ialah

penerimaan sel terhadap antioksidan sintetik rendah. Antioksidan sintetik (berat

molekul rendah) juga mudah membentuk ikatan yang sangat kuat sehingga sulit

lepas, padahal antioksidan dalam bentuk tak terikat yang mampu memberikan

efek. Hal ini yang mendasari pentingnya tambahan pasokan antioksidan alamiah

dalam diet kita sehari–hari. Pasokan antioksidan dalam diet dapat kita peroleh dari

makanan misalnya sayur dan buah atau suplemen.

2.9 Flavonoid

Tanaman kaya akan antioksidan karena hal ini merupakan kompensasi

terhadap banyaknya radikal bebas yang terbentuk akibat paparan sinar ultra violet

(sinar matahari). Jenis antioksidan berat molekul rendah berasal dari tanaman

yang telah terbukti efeknya melalui penelitian ialah vitamin C, vitamin E

(tokoferol), vitamin B2, karoten, catechin dan senyawa flavonoid lain (Sharma,

2014).

Flavonoid merupakan salah satu metabolit sekunder terbanyak pada

tumbuhan, zat ini terutama berfungsi sebagai pigmen. Flavonoid memiliki

76

aktivitas sebagai antioksidan, berdasarkan cara kerjanya kelompok senyawa ini

termasuk antioksidan primer (Valko, 2006). Tanaman kaya akan antioksidan

karena hal ini merupakan kompensasi terhadap banyaknya radikal bebas yang

terbentuk akibat paparan sinar ultra violet yang merupakan salah satu komponen

sinar matahari. Kelompok senyawa ini digolongkan sebagai polyphenol natural.

Golongan favonoid dapat digambarkan sebagai deretan senyawa C6-C3-C6.

Artinya kerangka karbonnya terdiri atas dua gugus C6 (cincin benzena

tersubstitusi) disambungkan oleh rantai alifatik tiga-karbon (Valko, 2006).

Flavonoid dikelompokkan menjadi lima subgrub utama yaitu kelompok

flavonol, flavon, isoflavon, flavan (catechin dan antosianin) dan proantosianin

(condensed tannin). Flavonoiod memiliki kesamaan dengan tokoferol (vitamin E)

yakni mempunyai struktur chromane (senyawa piron yang terdiri dari 3 cincin)

dan efek flavonoid sebagai antioksidan memiliki sinergisme dengan tokoferol

(Hamid et al., 2010).

2.10 Mimba dan Aktivitas Hepatoprotektor

Tanaman obat yang sangat potensial sebagai antioksidan salah satunya

ialah mimba.

2.10.1 Karakteristik Tanaman Mimba

Tanaman mimba secara taksonomi diklasifikasikan sebagai berikut:

Divisi : Spermatophyta

Anak Divisi : Angiospermae

Kelas : Dicotyledoneae

77

Anak Kelas : Dialypetalae

Bangsa : Rutales

Famili : Meliaceae

Genus : Azadirachta

Spesies : Azadirachta indica A. Juss

Morfologi daun mimba merupakan daun majemuk yang tersusun saling

berhadapan di petiol atau tangkai daun, bentuknya lonjong dengan tepi bergerigi,

ujung lancip, pangkal daun meruncing. Susunan tulang daun menyirip, lebar daun

sekitar 2 cm dan panjang 5 cm (Sherley, 2008).

Gambar 2.25Daun Mimba (Noverianto, 2013)

Tanaman mimba di Indonesia memiliki nama daerah mimba atau imba

(Jawa), nimba (Sunda), membha atau mempheuh (Madura), dan intaran (Bali dan

Nusa Tenggara). Mimba diperkirakan berasal dari Assam (India) dan Myanmar.

Mimba mungkin dapat dianggap sebagai tanaman obat yang paling

bermanfaat di India. Hampir setiap bagian tanaman ini dapat dipakai dalam

78

pengobatan tradisional untuk mengobati bermacam–macam penyakit. Pemakaian

mimba dalam pengobatan tradisional mulai dikenal di India dan negara–negara

sekitarnya sejak 2000 tahun yang lalu. Penggunaan mimba sangat erat kaitannya

dengan kultur masyarakat India hingga sekarang. Mimba telah dipakai dalam

Ayurveda, pengobatan Yunani dan pengobatan homeopatik Cina kuno. Tanaman

obat ini mendapat julukan Arishtha (Sansekerta) yang berarti tanaman pereda

segala penyakit atau di Eropa tanaman ini mendapat julukan The Wonderful Tree

(Sukrasno, 2003), hingga sekarang tanaman ini telah mendasari penemuan banyak

obat modern dan tetap menarik perhatian para peneliti. Tanaman ini mulai

dikenal dunia internasional sejak diterbitkannya buku berjudul “Neem–Tree for

Solving Global Problems” (Mimba–Tumbuhan untuk Mengatasi Permasalahan

Kesehatan Global) oleh US National Academy of Sciences (Akademi Ilmu

Pengetahuan Nasional Amerika Serikat) pada tahun 1992 (Biswas et al., 2002).

Sebagian masyarakat Indonesia di pulau Bali dan Lombok telah lama

menggunakan daun maupun kulit batang mimba dalam pengobatan, sekarang

pemakaiannya sebagai obat tradisional juga sudah mulai meluas di Jawa Barat

(Bandung, Tasikmalaya dan Ciamis) dan Jawa Tengah (Klaten dan Yogyakarta).

Namun secara umum pemanfaatan mimba belum begitu luas di Indonesia karena

masih banyak yang belum mengetahui sosok dan kegunaan tanaman ini dengan

baik (Kardinan, 2003).

Pemakaian mimba di luar negeri terutama di negeri asalnya India sudah

sangat luas dan telah banyak diteliti bahkan terdapat produk jadi dari mimba yang

sudah dipatenkan. Produk tersebut antara lain ekstrak dalam kapsul, hasil

79

pengolahan minyak mimba (sabun, lotion perawatan kulit, sabun cuci, sampo) dan

bahkan pasta gigi. Berdasar hasil penelitian mimba memiliki efek farmakologi

sebagai antiseptik, fungisida, antivirus, antiinflamasi, antirematik, antipiretik,

hipoglikemik, antitukak lambung, hepatoprotektor, imunostimulan, antioksidan,

antifertilitas dan antikanker (Kardinan, 2003; Sukrasno, 2003).

2.10.2 Simplisia Daun Mimba

Simplisia adalah bahan alamiah yang dipergunakan sebagai obat yang

belum mengalami pengolahan apapun juga dan kecuali dinyatakan lain, berupa

bahan yang telah dikeringkan. Simplisia daun mimba dibuat dari daun mimba

segar yang dipetik, dipisahkan dari tangkai daunnya, kemudian dikeringkan

dengan cara dijemur terlindung dari sinar matahari langsung. Daun yang telah

kering atau simplisia tersebut kemudian digiling dengan pemecah biji kopi,

kemudian diayak dengan pengayak nomor 100 hingga seluruh serbuknya lolos

(Kementerian Kesehatan, 2014; Prastowo, 2013).

2.10.3 Kandungan Aktif Daun Mimba

Senyawa utama yang terkandung dalam mimba ialah kuersetin, β-sitosteral

dan margosin. Siddiqui berhasil mengisolasi pertama kalinya kandungan mimba

pada tahun 1942, senyawa tersebut adalah nimbin yang merupakan kandungan

terpahit dari komponen minyak mimba. Daun dan kulit batang mimba

mengandung senyawa utama kuersetin yang merupakan flavonoid, telah lama

diketahui bahwa senyawa flavonoid memiliki efek antioksidan. Kuersetin

memiliki aktivitas antioksidan cukup kuat (Kumar, 2012).

80

Tanaman mimba mengandung sekitar 135 macam senyawa kimia.

Kandungan mimba dibagi menjadi dua kelas utama yaitu kelompok isoprenoid

dan kelompok nonisoprenoid. Isoprenoid meliputi diterpenoid dan triterpenoid

yang terdiri atas golongan protomeliacin, limonoid, azadirone dan derivatnya,

gedunin dan derivatnya, beberapa tipe vilasinin dan Csecomeliacin seperti nimbin,

salanin dan azadirachtin. Nonisoprenoid meliputi protein dan polisakarida,

persenyawaan sulfur, flavonoid dan glikosidanya, dihydrochalcone, kumarin dan

tanin, senyawa alifatik, dan senyawa lain (Biswas et al., 2002).

Gambar 2.26Rumus Bangun Kuersetin (Grotewold, 2006)

Mimba selain mengandung kuersetin, juga mengandung flavonoid lain

yaitu asam galat, (+)gallocatechin, (-)epicatechin, (+)catechin, dan

epigallocatechin (Biswas et al., 2002). Dibanding flavonoid lain epigallocatechin

memiliki aktivitas sebagai antioksidan terkuat (Kumar, 2012). Karena kandungan

flavonoidnya tersebut mimba sangat berpotensi digunakan sebagai antioksidan

dalam bentuk suplemen maupun dikonsumsi langsung daunnya (Sukrasno, 2003;

Biswas et al., 2002). Flavonoid memiliki kesamaan dengan tokoferol (vitamin E)

yakni mempunyai cincin chromane dan efek antioksidannya memiliki sinergisme

81

dengan tokoferol. Tanin atau zat penyamak yang terkandung dalam daun mimba

juga memiliki aktivitas antioksidan.

Hasil penelitian golongan katekin memiliki efek antioksidan lebih kuat

daripada butil hidroksi-anisol (BHA) dan α-tokoferol. Bahkan efek antioksidan

golongan katekin setara dengan efek antioksidan butil hidroksi-toluen (BHT) yang

merupakan salah satu antioksidan sintetik untuk senyawa lipid yang terkuat.

Katekin memiliki tiga aktivitas utama yang mendasar sebagai antioksidan.

Pertama katekin mempunyai aktivitas penyelamatan sel (scavenger) dari H2O2

dan O2* yang terbentuk dari sistem xantine oksidase, aktivitas kedua katekin yaitu

mencegah peroksidasi lipid bilayer membran sel. Aktivitas ketiga katekin sebagai

antioksidan ialah meningkatkan aktivitas enzim glutation-S transferase (glutation

reduktase) yang merupakan salah satu enzim terpenting untuk menjaga keutuhan

membran sel mamalia, terutama membran sel hati dan eritrosit. Penelitian lain

menyebutkan bahwa katekin (10 mikrogram/mL) memiliki efek protektif terhadap

membran eritrosit normal dan membran eritrosit penderita talasemia dari stres

oksidatif in vitro (Biswas et al., 2002).

82

Gambar 2.27Rumus Bangun Kandungan Mimba Selain Senyawa Utama Kuersetin

(Biswas et al., 2002)

2.10.4 Efek Sinergis Flavonoid dalam Ekstrak Mimba dengan Glutation

Hasil penelitian beberapa jenis flavonoid didapatkan hasil flavonoid yang

memiliki gugus catechol pada cincin B, termasuk kuersetin, fisetin, luteolin,

luteolin-7-O-glucoside, taxifolin, dan (+)-catechin, memperlihatkan efek sinergis

dengan glutation. Sebuah perkecualian adalah quercetagetin yang memiliki

tambahan satu gugus hidroksil pada karbon C6 rantai A dibandingkan dengan

kuersetin. Gugus hidroksil ini tampaknya sangat penting sebagai penentu

perangainya saat bekerja bersama GSH, karena insersi gugus ini pada kuersetin

membentuk quercetagetin, akan meningkatkan kadar quercetagetin yang

meningkatkan aktivitas bahan isolat ini (dengan p < 0.05), namun membuat

campuran ini menjadi suatu bahan antagonis dari GSH (Pereira et al., 2013).

Hasil yang didapat dari penelitian baru tersebut menunjukkan bahwa

pemakaian suplementasi flavonoid dan atau lewat diet tidak selalu bagus karena

interaksinya berbeda dengan antioksidan endogen utama dalam tubuh (GSH).

Semua antioksidan yang diuji memiliki aktivitas antioksidan saat diisolasi,

83

walaupun demikian galangin dan ishoramnetin memiliki efek antagonis terhadap

GSH, menurunkan kapasitas antioksidan endogen. Adanya gugus catechol pada

cincin B terbukti memiliki sinergi esensial dengan GSH, kecuali saat sebuah

gugus hidroksil (-OH) pada C6 juga ada (seperti pada quercetagetin).

Penambahan GSH pada flavonoid dengan gugus cathecol cincin B lebih aktif

daripada di cincin A. Proses-proses oksidatif banyak terlibat pada banyak

penyakit, sehingga interaksi yang teramati tersebut juga sangat penting dalam

meningkatkan kesehatan manusia. Kapasitas antioksidan beberapa flavonoid

tersebut telah terbukti secara in vitro sinergis dengan antioksidan endogen

terpenting dalam tubuh (GSH), namun potensi bahaya dan manfaat sebenarnya

pada penelitian in vivo akan bergantung pada proses bioavailabilitas dan

biotransformasi flavonoid-flavonoid tersebut (Pereira et al., 2013).

2.10.5 Ekstrak Daun Mimba

Ekstrak adalah sediaan kering, kental atau cair dibuat dengan menyari

simplisia nabati atau hewani menurut cara yang cocok, di luar pengaruh cahaya

matahari langsung. Cairan penyari dapat dipakai air, eter, atau campuran etanol

dan air (Kementerian Kesehatan, 2014). Simplisia adalah bahan alam yang

digunakan sebagai obat yang belum mengalami pengolahan apapun juga, kecuali

dinyatakan lain, berupa bahan yang telah dikeringkan. Ekstrak daun mimba dibuat

menggunakan larutan penyari etanol 96% karena kelarutan flavonoid yang

terkandung dalam serbuk mimba lebih tinggi dalam alkohol (sering dipakai etanol

96% atau metanol 80%) dibanding dalam air.

84

Pembuatan ekstrak daun mimba dilakukan dengan cara maserasi serbuk

daun mimba. Daun mimba dicuci kemudian dikeringkan di bawah sinar matahari,

dilanjutkan dengan penyerbukan menggunakan pemecah biji dan diayak dengan

pengayak nomor 100 (setiap 2,54 cm pengayak terdapat 100 lubang dihitung

searah dengan panjang kawat pengayak) hingga semua bagian lolos terayak lalu

serbuk dimaserasi. Maserasi ialah penyarian dengan cara merendam simplisia

dalam larutan penyari pada suhu 15o-25o C (Anief, 2015).

Ekstraksi dengan cara maserasi secara umum dilakukan sebagai berikut: 10

bagian simplisia atau campuran simplisia dengan derajat halus yang cocok (untuk

daun mimba derajat halusnya 100) dimasukkan dalam bejana, lalu dituangi 75

bagian cairan penyari etanol 96%, ditutup dan dibiarkan selama 7 hari terlindung

dari cahaya langsung sambil sering diaduk. Campuran tersebut setelah dibiarkan 7

hari diserkai, diperas dan dicuci ampasnya dengan cairan penyari secukupnya

hingga diperoleh 100 bagian. Ekstrak cair yang diperoleh kemudian diuapkan

cairan penyarinya pada tekanan rendah dan suhu tidak lebih dari 50oC dalam

cawan penguap di atas penangas air atau rotary evaporator hingga diperoleh

ekstrak dengan konsistensi kental, penguapan cairan penyari etanol tersebut

dilakukan di lemari asam (Anief, 2015; Kementerian Kesehatan, 2014). Ekstrak

kental yang diperoleh ditimbang untuk menghitung konversinya dengan berat

serbuk daun mimba yang dipakai.

Dosis lethal (LD50) ekstrak mimba dengan penyari metanol 13g/kg berat

badan tikus. Dosis 2g/kg BB tikus tidak menimbulkan kematian, perubahan berat

organ-organ tubuh, komposisi darah, kadar enzim dan histopatologi organ hewan

85

coba, sehingga dosis ini dapat dianggap sebagai dosis maksimal untuk hewan

coba. Dosis untuk tikus putih dengan berat badan 200 gram adalah 400 mg/hari

atau 200 mg 2 kali sehari (Biswas et al., 2002).

Penelitian Kiranmai et al. (2011) yang mengekstraksi kulit akar mimba

dengan metode maserasi didapatkan hasil jumlah bahan yang terlarut dalam etanol

80% 1,66% m/m dengan kandungan total flavonoid 0,512% (512 mg/100 gram

serbuk kulit akar mimba), total flavonoid dihitung sebagai ekuivalen terhadap

asam galat.

Penelitian El-Sayed et al. pada tahun 2009 yang meneliti ekstraksi daun

mimba menggunakan berbagai macam bahan pelarut, didapatkan kandungan zat

berkhasiat dihitung sebagai ekuivalen terhadap asam galat (Tabel 2.6).

Tabel 2.6 Kandungan Flavonoid Total Ekstrak Daun Mimba dengan Berbagai Macam Pelarut, dihitung sebagai GAE: gallic acid equivalent (El-Sayed et al., 2009)

Pelarut Ekstrak Kandungan Flavonoid Total(mg GAE/g ekstrak)

MetanolMethanol 90%Metanol 85%Methanol 70%Methanol 50%AirMetanol (defatted)KloroformAsetonn-Butanol

92.10 ± 3.76

112.78 ± 3.76

130.94 ± 2.87

152.87 ± 7.59

57.64 ± 2.87

9.39 ± 1.88

254.37 ± 1.08

180.79 ± 1.88

280.19 ± 3.76

520.00 ± 2.87

Sebuah penelitian oleh Sirisha et al. tahun 2013 yang menguji efek

hepatoprotektor campuran 5 ekstrak etanol tanaman obat yang salah satunya

ekstrak daun mimba 2g/100 mL dan 3g/100 mL ekstrak dipakai pelarut etanol

80%.

86

Sebuah penelitian lain oleh Kawakami et al. tahun 2012 yang menguji cara

ekstraksi turbo extraction dan shake extraction menggunakan 3 macam pelarut,

didapatkan hasil yang tertera pada tabel 2.7 di dawah ini.

Tabel 2.7Kandungan Flavonoid dan Polifenol Ekstrak Daun Mimba

(Kawakami et al., 2012)

Cara Ekstraksi dan Pelarut Flavonoid(mg/g ekstrak) + SD

Polifenol(mg/g ekstrak) + SD

TE TM TA SE SM SA

135.36/0.1140.14/0.26140.48/0.24189.73/0.22225.40/0.28119.62/0.1

37.12/0.0531.95/0.0423.78/0.1944.46/0.0546.98/0.2728.86/0.14

Keterangan: TE: Turbo extraction dengan pelarut etanol absolut.TM:Turbo extraction dengan pelarut metanol absolut.TA: Turbo extraction dengan pelarut air.SE: Shake extraction dengan pelarut etanol absolut.SM: Shake extraction dengan pelarut metanol absolut.SA: Shake extraction dengan pelarut air.

2.10.6 Toksisitas dan Dosis Toksik Ekstrak Mimba

Efek toksik pada hewan coba akibat pemberian bahan–bahan racun atau

obat–obatan (pada dosis toksik) peroral biasanya muncul setelah beberapa menit

sampai beberapa jam sesudah pemberian, dapat berupa tanda–tanda pada bibir dan

selaput lendir mulut berwarna keputih–putihan.

Pemberian ekstrak biji mimba peroral dapat menghambat spermatogenesis

pada tikus. Toksisitas sub-akut pada tikus putih yang diberi minyak mimba 30%

dengan dosis harian 200mg/kg BB, 400mg/kg BB, dan 600mg/kg BB

menunjukkan adanya peningkatan konsumsi pakan yang berlebih dan

penambahan berat badan. Ekstrak daun mimba dapat merangsang sistem saraf

pusat untuk mensekresikan serotonin. Serotonin tersebut akan menghambat

87

respon kontraksi yang ditimbulkan oleh stimulasi saraf adrenergik pada pembuluh

darah dan organ (Hidayah, 2003).

Penyuntikan ekstrak daun mimba dapat menurunkan tekanan darah karena

secara tidak langsung dapat mempengaruhi kekuatan kontraksi jantung dan

diameter pembuluh darah (Hidayah, 2003). Tikus jantan maupun betina yang

disuntik intramuskuler ekstrak daun mimba dengan dosis 1,3 mg/10g BB dapat

mengalami kejang, hal ini terjadi karena adanya rangsangan terhadap sistem saraf

pusat.

Pemberian ekstrak mimba (daun dengan cairan penyari metanol) dengan

dosis 2g/kg BB atau 2mg/g BB pada tikus belum menimbulkan kematian,

perubahan berat organ–organ tubuh, komposisi darah, kadar enzim dan perubahan

histopatologi organ hewan coba (Biswas et al., 2002).

2.10.7 Hasil Penelitian Aktivitas Hepatoprotektor Ekstrak Daun Mimba Melawan

Efek Hepatotoksik Parasetamol

Penelitian Sirisha tahun 2013 yang menguji efek hepatoprotektor campuran

lima ekstrak etanol tanaman obat yang salah satunya mimba (2 g/100 mL formula

dan 3 g/100 mL formula) melawan efek hepatotoksik parasetamol dengan dosis

2000 mg/kgBB sebagai dosis tunggal.

Tabel 2.8Komposisi Formula F1 dan F2 (Sirisha et al., 2013)

Nama Tanaman Obat Bagian Tanaman yang Dipakai

F1(g/100 mL)

F2(g/100 mL)

Aloe barbadensisAzadirachta indicaCinnamomum zeylanicumCurcuma longaEmblica officinalis

DaunDaunDaunUmbi AkarBuah

23322

32233

88

Parasetamol dosis 2000 mg/kgBB dosis tunggal peroral memperlihatkan

efek hepatotoksik setelah 48 jam, dengan bukti adanya perubahan parameter

biokimiawi dan histopatologi. Terdapat peningkatan signifikan kadar SGOT,

SGPT, SALP, bilirubin serum dan secara signifikan menurunkan kadar total

protein. Formula F1 (mengandung 3 g ekstrak daun mimba/100 g formula) dan F2

(mengandung 2 g/100 g formula) diberikan dengan dosis 500 mg/kg BB/hari.

Dosis tersebut setara dengan dosis serbuk daun mimba kering 2 mg/200 g BB

tikus/hari dan 3 mg/200 g BB tikus/hari. Dosis tersebut secara signifikan

menurunkan kadar SGOT, SGPT, SALP, bilirubin serum dan secara signifikan

meningkatkan kadar total protein yang diinduksi parasetamol. Kadar bilirubin

(total dan direct) menurun secara bermakna dengan pemakaian formula F2 dan

standar, tetapi penurunan tersebut ditemukan lebih sedikit secara bermakna

dengan formula F1. Hasil pemeriksaan histopatologi memberikan bukti yang

mendukung analisis biokimia. Histologi dari irisan hati dari kelompok perlakuan

memperlihatkan aktivitas hepatoprotektif formula standar Liv52, F1 dan F2 bila

dibandingkan kelompok normal dan kontrol toksik (Gambar 2.28).

89

Gambar 2.28Gambaran Histopatologi Hati Kelompok Kontrol dan Perlakuan dengan Pulasan

HE (Sirisha et al., 2013); A: Kontrol Normal; B: Kontrol ToksikC: Standar; D: Formula 1; E: Formula 2

Penelitian Devmurari dan Jivani tahun 2010 yang menguji efek

hepatoprotektif ekstrak daun mimba dengan pelarut metanol dan air pada tikus

putih strain wistar yang dipapar karbon tetra klorida (CCl4). Ekstrak daun mimba

diberikan dalam 3 dosis berbeda untuk masing-masing pelarut (metanol dan air),

yaitu dengan konsentrasi 10 mikrogram/mL, 50 mikrogram/mL, dan 100

mikrogram/mL. Hasil analisis one way ANOVA dan difference means dianalisis

menggunakan Dunnet’s ‘t’ test menunjukkan hasil perbedaan bermakna antara

kelompok kontrol toksik dengan kelompok yang memperoleh ekstrak daun mimba

dengan p<0,001.