seminar cynthia dessy lestari...

Achmad Farajallah | Seminar Cynthia Dessy Lestari AmbarwatiCopyright Achmad Farajallah [email protected]://achamad.staff.ipb.ac.id/2011/11/23/seminar-cynthia-dessy-lestari-ambarwati/

Seminar Cynthia Dessy Lestari Ambarwati

Chyntia Dessy L.A., Dyah Perwitasari dan Achmad Farajallah. 2011. Variasi Alel Gen Agresivitas 5-HTT pada Orangutan Sumatera (Pongoabelii). Seminar disampaikan tanggal 11 Agustus 2011. DepartemenBiologi FMIPA IPB

PENDAHULUANLatar Belakang

Orangutan Sumatera (Pongo abelii) merupakan kera besar yang daerahpersebarannya hanya di Asia. Kelompok kera besar dibedakan dari kelompok keralainnya berdasarkan ciri seperti tidak berekor, tubuh dan massa otak yang lebihbesar, serta memiliki karakteristik tubuh bagian bawah yang teradaptasi untukmelakukan lokomosi secara suspensi (Dolhinow & Fuentes 1999). Orangutandikelompokkan ke dalam superfamili Hominoidea, famili Pongidae, dan genus Pongo(Dolhinow & Fuentes 1999). Brandon-Jones et al. (2004) menyatakan bahwa Pongoabelii (orangutan Sumatera) memiliki hubungan yang berbeda atau terpisah denganPongo pygmaeus (orangutan Kalimantan). Orangutan Sumatera memiliki beberapaperbedaan dengan orangutan Kalimantan. Orangutan Kalimantan dewasa memilikirambut yang cenderung berwarna coklat kemerahan sedangkan rambut orangutanSumatera biasanya berwarna lebih pucat. Rambut orangutan Sumatera biasanyalebih lembut dan lemas serta berwarna putih di sekitar wajahnya (Galdikas 1984).Orangutan hidup soliter dan lebih bersifat arboreal dibandingkan jenis kera besarlainnya (Galdikas 1984).

page 1 / 43


Orangutan memiliki seksual dimorfisme dalam ukuran tubuh sehingga jantan danbetina dapat dibedakan dengan mudah. Hewan ini bersifat frugivor atau pemakanbuah-buahan. Orangutan adalah mamalia yang arboreal dan terestrial, lokomosinyadi pohon dinamakan suspensory climbing, yaitu bergerak cepat dari pohon kepohon dengan cara berayun pada cabang-cabang pohon. Ketika bergerak di tanah,orangutan bergerak secara kuadrupedal (Fleagle 1988). Agresivitas adalah istilahumum yang dikaitkan dengan segala bentuk tingkah laku yang secara langsungmaupun tidak langsung bertujuan untuk menyakiti atau melukai makhluk hidup laindengan tujuan tertentu (Baron & Richardson 1994). Individu yang menempatihirarki tinggi biasanya lebih agresif dibanding dengan individu yang tingkatannyaberada di bawahnya (Napier & Napier 1985) dan agresivitas pada jantan lebih tinggidaripada pada betina (Smuts et al. 1987).

Gen 5-HTT (5-hydroxytitraminetransporter) merupakan penyandi transporterserotonin yang berpengaruh terhadap agresivitas (Barr et al. 2003), emosi, fungsimotorik, dan beberapa sifat kognitif pada primata dan manusia (Heils et al. 1996).Serotonin transporter adalah protein khusus untuk meregulasi fungsi serotonin diotak yang dilakukan dengan cara pengambilan kembali (reuptake) (Barr et al.2003). Daerah pengatur pada serotonin transporter (5-HTT) memiliki daerahpolimorfisme fungsional atau Variable Number Tandem Repeat (VNTR) yangmempengaruhi tingkat reuptake serotonin dan risiko pembentukan suasana hatiyang negatif pada manusia (Caspi et al. 2003; Lesch et al. 1996). VNTR padamanusia merupakan suatu daerah polimorfisme sebesar 16-17 unit terdapat padaintron 3 pada 5-HTT manusia (Inoue-Murayama et al. 2008). VNTR mempengaruhiaktivitas transkripsi gen. Struktur VNTR dapat berubah selama proses diferensiasisubspesies, oleh karena itu VNTR dapat dilihat untuk menentukan variasi antarspesies. VNTR pada daerah promotor juga mempengaruhi ekspresi 5-HTT.Kombinasi kedua daerah VNTR telah dijelaskan pada manusia (Inoue-Murayama etal. 2008). Homozigot memiliki alel yang panjang (genotip L/L) yangmengekspresikan serotonin dua kali lebih banyak daripada individu dengan alelpendek (S/S atau L/S). Alel S memiliki aktifitas transkripsi yang rendahdibandingkan alel L (Lesch et al. 1996).

Tujuan

Penelitian ini bertujuan mengidentifikasi keragaman alel gen 5-HTT serotonintransporter pada orangutan Sumatera (Pongo abelii).

Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan April 2011 sampai Juli 2011 di Laboratorium

page 2 / 43


Molekuler Bagian Sistematika dan Ekologi Hewan, Departemen Biologi, FMIPA IPB.

BAHAN DAN METODEBahan

Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah sampel DNA orangutan Sumatera(P. abelii) dalam TE (Tris-EDTA) 80% yang merupakan koleksi Pusat Studi SatwaPrimata (PSSP), LPPM IPB. Sebanyak 48 sampel yang digunakan dipilih dari satupopulasi yang terdiri dari 28 jantan dan 20 betina.

Metode

Amplifikasi Gen 5-HTT

Sampel DNA diuji kualitasnya dengan spektrofotometer GeneQuantpro (AmershamPharmacia Biotech) pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Amplifikasi gen5-HTT dilakukan secara in-vitro dengan menggunakan metode Polymerase ChainReaction (PCR). Amplifikasi menggunakan primer DPF 11 yang disusun berdasarkanfragmen DNA gen 5-HTT pada M. fascicularis (GenBank NC_000017) yaitu forward:5’-TCTGGCGCTTCCCCTACATAT-3’ dan reverse: 5’-TGTTCCTAGTCTTACGCCAGTG-3’.(Inoue-Murayama et al. 2008). Panjang DNA hasil amplifikasi yang diharapkan yaituantara 200-250 pb. Komposisi 12,5 µl reaksi PCR untuk mengamplifikasi gen 5-HTTterdiri dari 10-100 ng DNA (2 µl), masing-masing primer 25 nM (0,5 µl), sertaReadymix Kappa yang terdiri dari dNTP, Taq polymerase dan bufer. Kondisi reaksiPCR dalam mesin ESCO PCR dirancang dengan suhu pra-denaturasi 95º C selama 5menit, denaturasi 95º C selama 1 menit, penempelan primer pada suhu 58º Cselama 1 menit, pemanjangan pada suhu 72º C selama 1 menit, akhir pemanjanganpada suhu 72º C selama 4 menit dan pendinginan pada suhu 4º C. Untukperbanyakan, siklus diulang sebanyak 30 kali.

Visualisasi Produk PCR

page 3 / 43


Produk PCR dimigrasikan pada PAGE (Polyacrilamide gel electrophoresis) 6% dalambufer 1x TBE (Tris-Borat EDTA) dengan voltase 200 V selama 50 menit. Gel diwarnaidengan pewarnaan perak (Byun et al. 2009). Penanda yang digunakan adalahReady-Load 1 Kb DNA Ladder (Promega).

Sekuensing DNA dan Analisis Bioinformatika

Pengurutan DNA hasil amplifikasi dilakukan oleh perusahaan jasa sekuensing.Sekuen yang diperoleh kemudian disejajarkan dengan data pada GenBankmenggunakan program Basic Local Alignment Search Tool-Nucleotida (BLAST-N).

Analisis data

Frekuensi alel dan genotipe dihitung berdasarkan jumlah individu genotiphomozigot (L/L dan S/S) dan heterozigot (L/S) dengan menggunakan rumus sebagaiberikut:

XL = (2nLL + nLS)/2n

XLL = (nLL/N) x100%

page 4 / 43


Keterangan:

XL = frekuensi alel L XLL = frekuensi genotip LL

page 5 / 43


nLL = jumlah individu bergenotip LL nLL = jumlah individu

bergenotip LL

nLS = jumlah individu bergenotip LS N = total individu

page 6 / 43


n = jumlah total individu

(Nei 1987)

page 7 / 43


HASIL DAN PEMBAHASAN

Amplifikasi Gen 5-HTT serta Frekuensi Alel dan Frekuensi Genotip pada P.abelii

Gen 5-HTT pada P. abelii berhasil diamplifikasi dengan menggunakan teknik PCR.Primer yang digunakan untuk amplifikasi didisain berdasarkan Inoue-Murayama etal. (2008). Primer DPF 11 digunakan untuk mengamplifikasi daerah intron 3 dari genserotonin transporter 5-HTT. Sampel yang berhasil diamplifikasi yaitu sebanyak 21sampel dari 48 sampel yang tersedia. Amplikon yang terbentuk dari hasil PCRmenghasilkan dua buah pita yang berukuran 212 dan 247 pasang basa (Gambar1a). Sampel-sampel yang lain tidak berhasil diamplifikasi. Hal ini kemungkinandisebabkan oleh terdegradasinya DNA pada sampel tersebut.

page 8 / 43


Gambar 1. Hasil amplifikasi gen 5-HTT menggunakan pasangan primer DPF 11berdasarkan Inoue-Murayama et al. (2008). Keterangan gambar: M= penanda 100pb, nomor 1 dan 2= S/S, nomor 3 dan 4= L/L, nomor 5 dan 6= L/S, nomor 7-12 =amplikon dari sampel M. nemestrina.

Amplifikasi menggunakan primer DPF 11 (forward dan reverse) menghasilkan duaalel (L dan S) dan tiga macam genotip pada sampel yaitu L/L, L/S, dan S/S.Penentuan masing-masing genotip dilakukan berdasarkan banyak dan ukuran pitaDNA hasil visualisasi pada PAGE 6%. Amplikon dengan ukuran 212 pb mewakili alelS dan amplikon dengan ukuran 247 pb mewakili alel L. Sebanyak 5 sampel dari 21sampel bergenotip L/L, 10 sampel bergenotip L/S dan 6 sampel bergenotip S/S.Frekuensi untuk genotip L/L sebesar 23,81 %, L/S sebesar 47,62%, dan 28,57%untuk S/S. Frekuensi untuk alel L sebesar 47,62 % dan sebesar 52,38% untuk alel S.Berdasarkan Nei (1987), dapat disimpulkan bahwa lokus tempat gen serotonintransporter ini merupakan daerah polimorfik karena jumlah alel bersama dalampopulasi lebih dari satu dengan frekuensi alel yang paling umum kurang dari atausama dengan 0,99. Untuk membandingkan ukuran fragmen amplikon gen 5-HTTpada monyet dan kera besar, dilakukan pula amplifikasi dan visualisasi terhadapsampel Macaca nemestrina. Amplikon yang dihasilkan berukuran sebesar 230 pb(Gambar 1b).

page 9 / 43


Identifikasi Molekuler Gen 5-HTT pada P. abelii

Identifikasi molekuler dilakukan dengan menganalisis homologi hasil sekuensinggen 5-HTT pada dua sampel P. abelii dengan data di GenBank menggunakanprogram BLAST-N. Sampel nomor 127 (S/S) dan 131 (L/L) menunjukkan kemiripansebesar 98% dengan gen transporter serotonin manusia yang terletak padakromosom 17 dengan nomor aksesi NG_011747.1. Daerah VNTR yang berukuranbesar ditemukan pada manusia dan kera, kecuali orangutan. Daerah VNTR padaorangutan hanya memiliki 4 atau 6 alel berulang, dan individu yang memiliki 4 alelberulang bersifat predominan. Insersi atau delesi dapat terjadi untuk dapatmenghasilkan polimorfisme pada daerah VNTR. Alel pada orangutan tidak memilikisekuen berulang yang unik dan bervariasi seperti yang ditemukan pada manusia,simpanse, gorilla, dan gibbon. Perubahan daerah polimorfisme gen 5-HTT didugaterjadi selama proses hominisasi. Hominisasi adalah proses evolusioner menujusifat-sifat manusia yang membedakan hominid dengan primata lainnya (Malassé1993). Variasi daerah VNTR yang berukuran panjang terjadi pada manusia dan keraterkecuali orangutan (Inoue-Murayama et al. 2008).

Subspesies yang berlainan dapat saja memiliki jumlah alel berulang yang berbeda.Dua subspesies simpanse memiliki alel berulang yang spesifik dengan jumlahulangan 18 dan 19 (Pan troglodytes verus) atau 23 dan 34 (Pan troglodytesscheinfurthii), yang mengindikasikan bahwa struktur VNTR dapat berubah selamaproses diferensiasi subspesies. Gen 5-HTT bersifat unik pada manusia dan primatasimian. Sekuen progenitor 5-HTT diduga merupakan DNA virus atau element loncatyang telah terintroduksi ke dalam genom manusia dan primata pada 40 juta tahunyang lalu, sehingga sekuen 5-HTT dapat digunakan sebagai informasi untukmembandingkan hubungan kekerabatan spesies dan filogeni antara monyet, kerabesar, dan manusia (Inoue-Murayama et al. 2008).

Struktur Sosial dan Sistem Hirarki

page 10 / 43

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/226061179?report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=1&RID=3CTAX4MS012


Orangutan merupakan primata yang hidup di pepohonan dan menunjukkan struktursosial yang relatif kecil yang terdiri dari hanya satu individu atau sedikit anggotakeluarga apabila dibandingkan dengan simpanse dan gorilla. Perkembangan alelyang bervariasi dan peningkatan jumlah alel berulang yang lebih pendek selamaproses hominisasi menunjukkan perubahan pada habitat dan struktur sosial(Inoue-Murayama et al. 2008). Orangutan memiliki keunikan di antara kera besarlainnya karena hewan ini tidak memiliki unit sosial. Orangutan yang telahsepenuhnya dewasa bersifat soliter dan memiliki organisasi sosial yang disebutnoyau, dimana jantan dan betina tidak hidup bersama. Interaksi di antaraorangutan jantan dewasa biasanya bersifat agresif; ketika jantan-jantan dewasabertemu dapat mengakibatkan perkelahian tetapi lebih sering berupa salingbertukar suara (Fleagle 1988).

Hirarki sosial terbentuk akibat terdapat perbedaan kualitas individu dalamkelompok. Individu yang mempunyai kualitas tertentu dan lebih unggul daripadaindividu lain disebut dominan (Ray 1999). Dominasi ini mempunyai pengaruhterhadap tingkah laku berkompetisi, sehingga terdapat individu yang lebih dominandaripada individu lain. Perilaku sosial dipengaruhi oleh sistem hirarki. Jantan alfamenduduki hirarki tertinggi (Swindler 1998). Erniasari (2010) pada penelitiannyaterhadap gen 5-HTT pada M. nemestrina berhasil menemukan satu individubergenotipe S/S sehingga diduga kuat sebagai pejantan alfa dalam populasitersebut. Pada penelitian ini ditemukan enam individu yang bergenotip S/S daritotal populasi sebanyak 21 individu (28,57%). Individu dengan alel S memilikikemampuan yang lebih rendah dalam mentransportasikan kembali serotonin kedalam sel. Individu yang memiliki sedikitnya satu alel S cenderung memiliki tingkatkecemasan dan ketakutan yang tinggi serta menunjukkan perilaku sosial yangrendah dibandingkan dengan individu bergenotip L/L (Barr et al. 2003).

Hirarki sosial pada jantan lebih bersifat tetap. Hirarki sosial dapat berubah dalamrentang waktu yang cukup lama. Perubahan hirarki sosial yang terjadi disebabkanadanya jantan yang meninggalkan kelompok, masuknya jantan baru ke dalamkelompok, dan terjadinya perkelahian yang menimbulkan luka parah dan kematian.Hirarki sosial pada betina lebih dinamis karena dipengaruhi oleh siklus estrus dankehadiran anak (Eimerl & DeVore 1978). Struktur sosial berupa hirarki tidak selalumerupakan hasil ekspresi satu gen saja. Faktor lingkungan dan efek pleiotropi darigen-gen lain juga berpengaruh terhadap hirarki sosial dari seekor hewan(Miller-Butterworth et al. 2007).

page 11 / 43


SIMPULAN

Variasi gen 5-HTT (penyandi agresivitas) berhasil diidentifikasi pada satu kelompok P. abelii. Keragaman di daerah intron 3 gen ini diwakili oleh alel S dan alel L.Frekuensi untuk genotip L/L sebesar 23,81 %, L/S sebesar 47,62%, dan 28,57%untuk S/S. Frekuensi untuk alel L sebesar 47,62 % dan sebesar 52,38% untuk alel S.Sampel nomor 127 (S/S) dan 131 (L/L) menunjukkan homologi sebesar 98% dengangen transporter serotonin manusia yang terletak pada kromosom 17 dengan nomoraksesi NG_011747.1.

SARAN

Analisis biokimia dan perilaku dibutuhkan untuk mempelajari polimorfisme gen5-HTT secara lebih lanjut dan detail pada populasi primata. Kombinasi antar genmungkin dapat dijadikan alternatif dalam penentuan sifat agresivitas pada jenisprimata.

DAFTAR PUSTAKA

page 12 / 43



Baron RA, Richardson DR. 1994. Human Aggression. 2nd edition. New York: Plenum.

Barr CS et al. 2003. The utility of nonhuman primate model for studying gene byenvirontment interactions in behavioral research. Genes Brain Behav 2: 336-340.

Brandon-Jones D et al. 2004. Asian primate classification. Am. J. Primatology 25:97-164.

Byun SO, Fang Q, ZhouH, Hickford JGH. 2009. An effective method for silver-stainingDNA in large numbers of polyacrylamide gels. Anal Biochem 385: 174-175.

Caspi A et al. 2003. Influence of life stress on depression: moderation by apolymorphism in the 5-HTT gene. Science 301: 386-389.

Dolhinow P, Fuentes A. 1999. The Non Human Primates. California: MayfieldPublishing.

Eimerl S, deVore I. 1978. Primata. Timan Th S, penerjemah. Jakarta: Tira Pustaka.Terjemahan dari: The Primates.

Erniasari I. 2010. Variasi Alel Gen 5-HTT Penyandi Agresivitas pada Beruk (Macacanemestrina) [skripsi]. Institut Pertanian Bogor.

Fleagle JG. 1999. Primate Adaptation and Evolution. San Diego: Academic Press.

page 13 / 43

https://springerlink3.metapress.com/content/0164-0291/



Galdikas BMF. 1984. Adaptasi Orangutan di Suaka Tanjung Puting, KalimantanTengah. Jakarta: Universitas Indonesia Press.

Heils A et al. 1996. Allelic variation of human serotonin transporter gene expression.J Neurochem 6: 2621-2624.

Inoue-Murayama et al. 2008. Interspecies and intraspecies variations in theserotonin transporter gene intron 3 VNTR in nonhuman primates. Primates 49:139-142.

Lesch et al. 1996. Association of anxiety-related traits with a polymorphism in theserotonin transporter gene regulatory region. Science 274:1527-1531.

Malassé Anne D. 1993. Continuity and discontinuity during hominization. Quaternary International 19: 85-100.

Miller-Butterworth CM et al. 2007. The serotonin transporter: sequence variation in Macaca fascicularis and its relationship to dominance. Behav Genet 37: 678-696.

Napier JR, Napier PH. 1985. The Natural History of Primates. Massachussets: TheMIT Press.

Nei M. 1987. Molecular Evolutionary Genetics. New York: Columbia University.

Ray E. 1999. The Macaques. In: Dolhinow P, Fuentes A, editor. The Non HumanPrimates. California: Mayfield Publishing.

Smuts BB et al. 1987. Primate Societies. Chicago: The University of Chicago.

page 14 / 43


Swindler DR. 1998. Introduction to The Primate. Seatle: University of WashingtonPress.




page 15 / 43




Tujuan




page 16 / 43





Metode




page 17 / 43





Analisis data



XLL = (nLL/N) x100%

page 18 / 43


Keterangan:


page 19 / 43



bergenotip LL


page 20 / 43



(Nei 1987)

page 21 / 43





page 22 / 43




page 23 / 43






page 24 / 43






page 25 / 43


SIMPULAN


SARAN


DAFTAR PUSTAKA

page 26 / 43












page 27 / 43














page 28 / 43






page 29 / 43




Tujuan




page 30 / 43





Metode




page 31 / 43





Analisis data



XLL = (nLL/N) x100%

page 32 / 43


Keterangan:


page 33 / 43



bergenotip LL


page 34 / 43



(Nei 1987)

page 35 / 43





page 36 / 43




page 37 / 43






page 38 / 43






page 39 / 43


SIMPULAN


SARAN


DAFTAR PUSTAKA

page 40 / 43












page 41 / 43














page 42 / 43



page 43 / 43

seminar cynthia dessy lestari...

Documents