pseudomonas rm system

8/3/2019 Pseudomonas RM System

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P r o c .N a t LA c a d .S c i .U S A8 0 ( 1 9 8 3 ) 4 0 3

o b t a i n e d ;9 c o n t a i n e di n s e r t sf r o mp M G 7 .p PA O R M 3 . 8w a sp r e p a r e db yd i g e s t i n g2 p u go fp P A O R M 3 8 b

w i t hN r u I . T h er e s u l t i n gf r a g m e n t sw e r er e c i r c u l a r i z e dw i t hT4 l i g a s ea n d u s e dt ot r a n s f o r mM M 2 9 4 .

F u r t h e rd e l e t i o n sw e r em a d ei nt h i ss u b e l o n eb y t r e a t m e n to f t h ep l a s m i dDNA w i t hB A L - 3 1 .T e n m i c r o g r a m so fp PA O R M 3 . 8DNA( F i g .1 )w a sl i n e a r i z e dw i t he i t h e rB a m H Io rN r uI ,a n dt h eDNAw a st r e a t e dw i t h2 u n i t so fB A L - 3 1n u -c l e a s e( B e t h e s d a R e s e a r c hL a b o r a t o r i e s )u n d e rc o n d i t i o n sr e c -o m m e n d e db yt h e m a n u fa c t u r e r .A l i q u o t s( 1 0 - p l )w e r e r e -m o v e da t i n t e r v a l so f3 0s e ca n d1 , 2 ,3 , a n d5 m i n .T o e a c ha l i q u o tw a sa d d e d2 0p 1 Lo f1 0 0mMEDTAt os t o pt h er e a c t i o n ,a n dt h es a m p l e sw e r e p h e n o lt r e a t e da n dp r e c i p i t a t e d .T h ee n d so f t heB A L - 3 1 - t r e a t e dDNAf r a g m e n t s( 2 p u g )w e r e r e -p a i r e db yu s i n g1 . 4u n i t so ft h eK l e n o ws u b f r a g m e n to fDNAp o l y m e r a s eI ( N e wE n g l a n dB i o l a b s )a t1 2 ' Cf o r4 5m i n .I nt h ec a s eo fp PA O R M 3 . 8DNAo p e n e da tt h eB a m H Is i t e ,t h er e -p a i r e db l u n t - e n d e df r a g m e n t sw e r er e l i g a t e dw i t hT 4 l i g a s eb yi n c u b a t i o na t4 0 Cf o r2 4h r .W i t hp l a s m i d so p e n e da tt h eN r uI s i t e ,t h e r e p a i r e db l u n t - e n d e df r a g m e n t sw e r el i g a t e dt oS a lI l i n k e r s( C o l l a b o r a t i v eR e s e a r c h ,W a l t h a m ,M A ;r a t i oo fe n d st ol i n k e r ,1 : 2 0 )a n dc l e a v e dw i t hS a lI ,a n dt h ec o m p l e m e n t a r ye n d so ft he S a lI s i t er e j o i n e d

b yT 4 l i g a s e t o

r e c i r c u l a r i z et h ep l a s m i d .A s s a y s o fR e s t r i c t i o na n dM o d i f i c a t i o nE n z y m e s .( a )I nv i t r o

a s s a y s .E x t r a c t sw e r ep r e p a r e df r o m5 . 0m l o ft r a n s f o r m e do rc o n t r o lc e l l st od e t e c t t h ep r e s e n c eo ft h er e s t r i c t i o no rm o d i -f i c a t i o ne n z y m e s .A f t e rl o w - s p e e dc e n t r i f u g a t i o n ,c e l l sw e r er e s u s p e n d e di n 5 0 0u 1 lo f 1 0mM T r i s ,p H 7 . 6 / 1 0mMS H C H 2 C H 2 O H / 1 0mM EDTAc o n t a i n i n g0 . 5m go fl y s o z y m ea n ds u b j e c t e dt oa c y c l eo ff r e e z i n ga n dt h a w i n gf o l l o w e db y1 5s e co fs o n i c a t i o nt od i s r u p tt h ec e l lw a l l .M g C l 2wa s a d d e dt oa f i n a lc o n c e n t r a t i o no f1 0mM a n dt h ec e l ld e b r i sa n dDN Aw a sp e l l e t e db yc e n t r i f u g a t i o n .P a e R 7e n d o n u c l e a s ea c t i v i t yw a st e s t e db yd i g e s t i n g2 , u go fA d 2w i t h4 , u lo fe x t r a c ta t37C f o r1 0m i n .Th ed i g e s t i o np r o d u c t sw e r e a n a l y z e db ye l e c t r o p h o -r e s i s( 1 4 ) .P a e R 7m e t h y l a s ea c t i v i t yw a s t e s t e db yi n c u b a t i n g( 3 7 C ;3 0m i n )1 , u go fA d 2DNAw i t h1 0, u lo fc e l le x t r a c ti na 5 0 - p l Ir e a c t i o nm i x t u r ec o n t a i n i n g5 0 mM T r i s( p H7 . 5 ) ,1 0mME D TA ,1 0mM S H C H 2 C H 2 O H ,a n d0 . 1mM S - a d e n o s y l -

m e t h i o n i n e .A s a c o n t r o lt h eDNAwa st r e a t e ds i m i l a r l yb u ti nt h ea b s e n c eo fS - a d e n o s y l m e t h i o n i n e .T h eA d 2DNAw a s p u -r i f i e db yp h e n o le x t r a c t i o na n de t h a n o lp r e c i p i t a t i o n ,c h a l -l e n g e dw i t hP a e R 7o rX h oI u n d e rc o n d i t i o n sd e s c r i b e da b o v e ,a n da n a l y z e do n a 1 %a g a r o s eg e l .

( b )I nv i v oa s s a y s .T r a n s f o r m a n t sw e r es c r e e n e df o rt h ea b i l i t yt o r e s tr i c ta n dm o d i f y4 8 0p h a g ei n v iv o .T o t e s tf o rr e s t r i c t i o n ,a l i q u o t s( 0 . 1m l ) o f t r a n s f o r m a n tc u l t u r e sw e r es p o t - t e s t e dw i t ha d i l u t i o ns e r i e sf r o ma h i g h - t i t e rp h a g es t o c k ,a sd e s c r i b e db yM a n ne t a L( 1 5 ) .T o t e s tf o rp h a g em o d i f i c a t i o n ,p h a g ew e r ep i c k e df r o mp l a q u e so n t h et r a n s f o r m e dh o s ta n dr e s u s p e n d ei n 1 m l o f 1 0mM T r i s ,p H 7 . 4 / 5mM M g C l 2 / 0 . 2M N a C l /0 .1 % g e l a t i ne q u i l i b r a t e dw i t hc h l o r o f o r m ;t h ep h a g ew e r es e -r i a l l yd i l u t e da n ds p o t t e do n b o t hn o n r e s t r i c t i n g( M M 2 9 4 )a n dr e s t r i c t i n g[ M M 2 9 4( p PA O R M 3 8 b ) ]h o s tc e l l s .

N o m e n c l a t u r e .A s t a n d a r dm e t h o df o rn a m i n gp l a s m i d sc o n -t a i n i n gr e s t r i c t i o no r m o d i f i c a t i o ng e n e sh a sb e e n a d o p t e d .P l a s m i d sa r ed e s c r i b e db y :" p "f o rp l a s m i d ; t h e t h r e el e t t e ra b -b r e v i a t i o no f t h er e s t r i c t i o n / m o d i f i c a t i o ns y s t e m( PA O ) ;" R "f o rt h er e s t r i c t i o ng e n e ," M "f o rt h em e t h y l a s eg e n e ,o r" R M "f o rb o t hg e n e s ; , a n c l an u m e r a lf o rt h es i z eo ft h ei n s e r ti nk b .F o re x a m p l e ,a p l a s m i dc a r r y i n gb o t ht h er e s t r i c t i o na n dm o d i f i -

c a t i o ng e n e sf r o mP . a e r u g i n o s ao na 3 . 8 - k bi n s e r ti s n a m e d" p PA O R M 3 . 8 . "M u l t i p l e p l a s m i d sc o n t a i n i n gt h es a m ec o m -p l e m e n to fr e s t r i c t i o no r m o di f i c a t i o ng e n e so r b o t ho nt h es a m e - s i z ei n s e r tf r a g m e n ta r e f u r t he rd e n o t e d b ya l e t t e ra f t e rt h es i z ed e s i g n a t i o n( s e eb e l o w ) .

RESULTSP r o p e r t i e so fP a e R 7C l o n e s .T h ei n i t i a lt r a n s f e ro ft h eP a e R 7

r e s t r i c t i o n / m o d i f i c a t i o ns y s t e mi n t oE .c o l iw a sa c c o m p l i s h eb yl i g a t i n gB a m H If r a g m e n t so fpMG7t op B R 3 2 2( F i g .1 ) .A l lc l o n e sg e n e r a t e dw e r e t h e nt e s t e df o rr e s t r i c t i o na n d m o d i f i -c a t i o nb o t hi nv i v oa n di nv i t r o .T h r e et y p e so fp l a s m i d sw e r eo fi n t e r e s t :p PA O R M 4 2 ,c o n t a i n i n g t h ec o m p l e t ep M G 7( 4 2 - k b )i n s e r t e di n t op B R 3 2 2 ;p PA O R M 3 8 a ,c o n t a i n i n ga 3 8 - k bf r a g -m e n to f p M G 7l i g a t e dt op B R 3 2 2 ;a n dp P A O R M 3 8 b ,c o n t a i n i n gt h es a m e3 8 - k bf r a g m e n tb u tl i g a t e dt op B R 3 2 2i nt h e o p p o s i t eo r i e n t a t i o n .A l lt h r e et y p e so fc l o n e sp r o d u c e dP a e R 7e n d o -n u c l e a s ea n dm e t h y l a s ea ss h o w nb yi nv i t r oa s s a y s( F i g .2 ) .I n

X m a I /s t I - . . . . . .Bam HI -Bam HIE c o R I Hin

H i n d m I f K p nI / : : . . .

1 B a m HI - Bs t NI B s t NIR s a I R s a IRs a I R s a o IB

s a I H R sI R s o I

p M G 71 0

- H i n d f lo l

i30 ~~ ~ ~ ~~~~~~~~~-s i c I =ic RsaR s a I I I RsaI- H i n c J I I H i n c J I

E c oRI l - - ~KpnI N r u I N r u I

pPAORM3 . 8 p PA O M 2 . 7 pPAOR 1 . 9P s t I//\ ,/ ( 7 . 6 K b ) ( 5 . 3 K b ) ( 5 . 1 K b )B c 1 l \ 2 0

F I G .1 . R e s t r i c t i o ne n z y m em a p so fp M G 7a n dp B R 3 2 2c l o n e sc o n t a i n i n g t h e P a e R 7e n d o n u c l e a s eo r t h em e t h y l a s eg e n e .T h e P a e R 7r e s t r i c t i o n /m o d i f i c a t i o ns y s t e mi sw i t h i nt h e4 2 - k bp M G 7P .a e r u g i n o s ap l a s m i d .B o t ht h ee n d o n u c l e a s ea n d m e t h y l a s eg e n e sa r e p r e s e n ti np PA O R M 3 . 8 .B A L - 3 1d i g e s t i o nf r o mt h eBamHI s i t ei np PA O R M 3 . 8p r o d u c e da c l o n e( p P A O R 1 . 9 )w h i c he x p r e s s e d o n l yt h ee n d o n u c l e a s eg e n e .B A L - 3 1d i g e s t i o nf r o mt h eN r u I s i t ei n p P A O R M 3 . 8y i e l d e da c l o n e( p PA O M 2 . 7 )w h i c he x p r e s s e do n l yt h em e t h y l a s eg e n e .T h eS a lI / H i n c Hl i n k e rp r e s e n ti np PA O M 2 . 7i sr e p r e s e n t e da s a c l e a ra r e a .T h et o t a ls i z eo fe a c hp l a s m i di s l i s t e di np a r e n t h e s e sb e l ow e ac hc o n s t r u c t i o n .

B i o c h e m i s t r y :G i n g e r a sa n dB r o o k s


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4 0 4 B i o c h e m i s t r y :G i n g e r a sa n d B r o o k s

H i n d f m BamHIBam HI I / N r u I HindM B c l I B c I I H i n d = m Ba m H I

i i iI ii i Ii n v i v o i n v i t r oR M R M+ + + +

- ' p ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~

pPAORM3 8 a d o e s n o t + +p l a t ep h a g e+ + + +

p PA O R M3 . 8 + + ++ ++

_-

F I G .2 . G r a p h i csummary o ft h ep B R 3 2 2c l o n e sc o n t a i n i n gs e g m e n t so fp M G 7 .E a c hc l o n ec o n t a i n i n gan i n s e r tf r o mp M G 7was t e s t e db y i nv i t r oa n d i nv i v oa s s a y s f o rt h ep re sence o ft h eP a e R 7r e s t r i c t i o n / m o d i f i c a t i o ns y s t e m .A l t h o u g hpPAORM38aa n d pPAORM38bp l a s m i d sh a v et h esame i n s e r ti no p p o s i t eo r i e n t a t i o n s( 1 1 ) ,p P A O R M 3 8 aw i l ln o t p l a t ep h a g eb u t p P A O R M 3 8 bw i l l .+ + , i n c r e a s e dl e v e l so fm e t h y l a s ea n d r e -s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s ea c t i v i t y .

t h ei nv i v oa s s a y s , pPAORM42a n dp P A O R M 3 8 br e s t r i c t e dt h eg r o w t ha n d m o d i f i e dt h eD N Ao f 4 8 0p h a g e :u n m o d i f i e d4 8 0h a d an e f f i c i e n c yo fp l a t i n go f i 0 ' o n h o s t sc o n t a i n i n gt h e s ep l a s m i d sc o m p a r e dt o c o n t r o lM M 2 9 4 h o s tc e l l s ;m o d i f i e d

p h a g eh a dan e f f i c i e n c yo f1 . 0 .C e l l sc o n t a i n i n gt h ep P A O R M 3 8 ap l a s m i d ,h o w e v e r ,w e r e u n a b l et o p r o d u c ep l a q u e so f e i t h e r0 8 0o r A p h a g e . T h i swa s u n e x p e c t e db e c a u s ep P A O R M 3 8 aa n dp P A O R M 3 8 bc o n t a i nt h es a m e p M G 7f r a g m e n t .

S u b e l o n e sd e r i v e df r o m p P A O R M 3 8 aa n d p P A O R M 3 8 bw e r e p r e p a r e db y r e s t r i c t i o nenzyme c l e a v a g ea n d r e l i g a t i o nt o g e n e r a t e s m a l l e rp l a s m i d sc o n t a i n i n gt h er e s t r i c t i o n / m o d -i f i c a t i o ns y s t e m .T h es m a l l e s to f t h e s ec o n s t r u c t s ,p P A O R M 3 . 8 ,c o n t a i n e da 3 . 8 - k bf r a g m e n tf r o mp M G 7 .I tb o t hr e s t r i c t e da n dm o d i f i e dt h eDNAo f4 8 0p h a g ea s w e l la s p r o d u c e dl a r g equan-t i t i e so fP a e R 7e n d o n u c l e a s ea n d m e t h y l a s e( F i g .2 ) .

T o r e d u c ef u r t h e rt h es i z eo ft h ei n s e r ta n d t o d e t e r m i n et h eo r d e ro ft h er e s t r i c t i o n / m o d i f i c a t i o ng e n e sw i t h i nt h i ss e g m e n to fD N A ,t h ep P A O R M 3 . 8p l a s m i dwa s o p e n e da t e i t h e rt h eB a m H Ior N r u I s i t e ,t r e a t e dw i t hB A L - 3 1n u c l e a s e ,a n d t h e n

r e l i g a t e d .T h es m a l l e s to f t h e c l o n e sg e n e r a t e db yB A L - 3 1t r e a t -ment a t t h eN r u I s i t ec o n t a i n e da 2 . 7 - k bf r a g m e n tf r o mp M G 7( F i g .1 ) .T h i sp l a s m i d ,d e s i g n a t e dp PA O M 2 . 7 ,m a d ea c t i v em e t h y l a s ea n dm o d i f i e dt h eD NAo f4 8 0p h a g e ;h o w e v e r ,i t n ol o n g e rr e s t r i c t e di n c o m i n gp h a g e ,n o r d i di t c o n t a i ne n d o n u -c l e a s ea s j u d g e db y an i n v i t r oa s s a y ( F i g .2 ) .A more u n u s u a ls e to f c l o n e sw e r e g e n e r a t e db y B A L - 3 1t r e a t m e n to fB a m H I -c u t p PA O R M 3 . 8 .T h e s ec l o n e sm a d eP a e R 7e n d o n u c l e a s e b u tn o t m e t h y l a s e ;t h e yn e i t h e rr e s t r i c t e dn o r m o d i f i e dt h eDNAo f4 8 0p h a g e( F i g .2 ) .T h es m a l l e s t o ft h e s ec o n s t r u c t sc o n t a i n e da 1 . 9 - k bi n s e r ta n d i s d e s i g n a t e dp P A O R 1 . 9( F i g .1 ) .A c o m -p o s i t eo ft h et w o s e t so fB A L - 3 1c l o n e si n d i c a t e dt h eo r d e r( f r o mt h eB a m H Is i t et o t h eN r u I s i t e )o ft h egenes t o b e f i r s tt h em e t h y l a s ea n d t h e nt h ee n d o n u c l e a s egene .

T h ee n d o n u c l e a s e +m o d i f i c a t i o n -p P A O R l . 9c l o n ewa s c h a r -

a c t e r i z e di n s e v e r a lways. I t wa s d e t e r m i n e dw h e t h e rc h r o -m o s o m a lD NAf r o mt h ep PA O R 1 . 9 - c o n t a i n i n gc l o n ewa s p r o -t e c t e da g a i n s tc l e a v a g eb y P a e R 7( o ri t si s o s c h i z o m e r ,X h oI ) .C h r o m o s o m a lDNAi s o l a t e df r o mt h ep P A O R 1 . 9c l o n ewas s e n -s i t i v et o c l e a v a g eb y P a e R 7o r X h oI ( n o ts h o w n )as was DNAf r o m0 8 0p h a g eg r o w n i n t h e s ec e l l s( F i g .3 ) .H o w e v e r ,c h r o -m o s o m a la n dp h a g eDNAs i s o l a t e df r o mc l o n e sw i t ht h eR'M'p h e n o t y p ea l lw e r e m o d i f i e da g a i n s tP a e R 7 a ndX h oI c l e a v a g e( F i g .3 ) .

D e s p i t et h ef a c tt h a tc h r o m o s o m a lD NAf r o mt h ep P A O R 1 . 9c l o n ewa s u n m o d i f i e d ,t h ec l o n ewa s s t a b l e .T h e r e were n oo b s e r v a b l ec h a n g e si np l a s m i ds t r u c t u r e ( w i t hr e s p e c t t o i t sr e -s t r i c t i o nm a p )a f t e rt h r e er o u n d so fp l a s m i di s o l a t i o na n d r e -

t r a n s f o r m a t i o n .I n a d d i t i o n ,s e c o n d a r ya n d t e r t i a r yt r a n s f o r -m a n t ss t i l lp r o d u c e dr e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s ea t t h es a m e l e v e l .

P r o p e r t i e so f t h eP a e R 7E n d o n u c l e a s e .I t h a d p r e v i o u s l yb e e nn o t e dt h a tP a e R 7a n d X h oI h a v e a common r e c o g n i t i o nsequence , C - T- C - G - A - G( r e f .1 6 ;P . M y e r s ,p e r s o n a lcommu-n i c a t i o n ) .H o w e v e r ,t h ec l e a v a g es i t eo fP a e R 7h a d n o t b e e nd e t e r m i n e d .T h e r e f o r e ,A d 2 DNA wa s c l e a v e dw i t h e i t h e rP a e R 7or X h oI ; t h ef r a g m e n t sg e n e r a t e dw e r e l a b e l e da t t h e i r5 ' e n d sw i t h3 2 Pa n d d i g e s t e dw i t h s n a k evenom p h o s p h o d i -e s t e r a s eor e x o n u c l e a s eI , a n d t h ep r o d u c t swere r e s o l v e db ye l e c t r o p h o r e s i s .B o t he n z y m e s gave p Ta s t h ep r e d o m i n a n tt e r -m i n a lm o n o n u c l e o t i d ea n dp T p Ca s t h e t e r m i n a ld i n u c l e o t i d e .W e c o n c l u d et h a tP a e R 7c l e a v e sa t t h es a m e p o s i t i o na s X h oIw i t h i nt h es e q u e n c e 5 ' C I T- C - G - A - G3 ' .

A l t h o u g hP a e R 7a n d X h oI h a v ea common r e c o g n i t i o na n dc l e a v a g es i t e ,t h e r ear e o t h e rp r o p e r t i e st h a td i s t i n g u i s ht h et w oenzymes . P a e R 7a n dX h oI p r o d u c ed i s p a r a t ed i g e s t i o np a t t e r n so n an A d 2DNAs u b s t r a t e( F i g .4 A ) .T h i si sd u e t o t h ei n a b i l i t yo fP a e R 7t oc l e a v eo n e o ft h eX h oI s i t e so n t h eA d 2genome-

i . e . ,t h es i t el o c a t e da tn u c l e o t i d e9 , 6 8 6( 2 6 . 5 4 % )( 1 7 ) .T h i ss i t ea b c d e f

F I G .3 . A 1 . 0 %agarose g e lc o n t a i n i n g X h oI d i g e s t so f2 , u go f0 8 0D N A s .4 8 0p h a g e swere g r o w n o n : E . c o l iM M 2 9 4( l a n e sa a n d b ) ,pPAORM42 ( l a n ec ) ,pPAORM38b ( l a n ed ) ,p P A O R M 3 . 8( l a n ee ) ,p PA O M 2 . 7( l a n ef ) ,a n d p PA O R 1 . 9( l a n eg ) .D N A i n l a n ea wa s n o td i g e s t e d .

pPAORM42

pPAORM38b

pPAOR 1 . 9

pPAOM2 . 7

P r o c .N a t l .A c a d .S c i .U S A8 0 ( 1 9 8 3 )


4/5

P r o c .N a t l .A c a d .S c i .USA 8 0(1983~ 4 0 5

Aa b c d e

B

a b c d

F I G .6 . A 1 . 5 %a g a r o s e g e lc o n t a i n i n gd i -g e s t s- o fp B R 3 2 2a n d p X 2 2 8 1p l a s m i d s( h a v i n g

| 2 a Xho I linker at nucleotide 2 , 2 8 1 ) . Lanes:- a,p X 2 2 8 1DNA m o d i f i e dw i t hP a e R 7m e t h y l a s ea n d c l e a v e dw i t h T a q I ; b , u n m o d i f i e dp X 2 2 8 1DNAc l e a v e dw i t hT a q I ; c , u n m o d i f i e dp B R 3 2 2DNAl a c k i n gt h eX h oI l i n k e rc l e a v e dw i t h T a qI . F r a g m e n t1 i n p X 2 2 8 1DNA ( l a n e s a a n d c)c o n t a i n e dt h eX h oI l i n k e r .When m o d i f i e dw i t hP a e R 7m e t h y l a s e( l a n ea ) ,t h ep l a s m i dwas n o tc l e a v e d .H o w e v e r ,w h e n u n m o d i f i e d( l a n eb ) ,p X 2 2 8 1DNAwa s c l e a v e d( f r a g m e n t2 i n l a n eb ,a n d a n o t h e rs m a l lf r a g m e n t ,n o t s h o w n ,wereg e n e r a t e d ) .

F I G . 4 . S e p a r a t i o no n a 1 . 0 %aga rose g e l s .( A )D i g e s t so f2 j g o fA d 2DNAm a d ew i t h c r u d ee n z y m e e x t r a c t sa n d p u r i f i e denz ym es .L a n e s :a , X h oI ( p u r i f i e de n z y m e ) ;b ,e x t r a c to fP A 0 3 0 3( p M G 7 )c e l l s ;c , e x t r a c to fp PA O R M 3 . 8 id ,e x t r a c to fp PA O R 1 . 9 ;e , P a e R 7( p u r i f i e d ,e n z y m e ) .O n l yl a n ea s h o w st h epresence o ft h es m a l l e s tA d 2f r a g m e n t( - a )d e r i v e df r o mt h ec l e a v a g eo ft h es i t ea t2 6 . 5 % .( B )D i g e s t so f2 m go fA d 2D N A .L a n e sa , u n c u t ;b ,X h oI ;c , P a e R 7 * ;d ,P a e R 7 .

wa s r e f r a c t o r yt oP a e R 7c l e a v a g er e g a r d l e s so fw h e t h e rt h eDN Ah a db e e ni s o l a t e df r o mA d 2v i r i o n so r a s p a r to fan E .c o l ir e -c o m b i n a n tp l a s m i d ,i n d i c a t i n gt h a tb l o c k a g eo fc l e a v a g ei s n o td u e t o DNA m o d i f i c a t i o n .Tw e n t yo t h e rD N A s u b s t r a t e so fk n o w ns e q u e n c e c o n t a i n i n gX h oI s i t e sa l lp r o v e d .t o b ec l e a v -a b l eb yP a e R 7a s w e l la s X h oI .

E x p e r i m e n t swere p e r f o r m e dw i t hD N Ac o n t a i n i n gt h eA d 22 6 %s i t et o d e t e r m i n ew h a t p r o p e r t i e sw e r e r e s p o n s i b l ef o rb l o c k i n gc l e a v a g e .W h e n .l i g a t e dt o DN A f r o ma d i f f e r e n ts o u r c e , " h y b r i d "s i t e sc o n t a i n i n gs e q u e n c e s f r o mt h er i g h ts i d e( t o w a r dh i g h e rA d 2map p o s i t i o n s )o ft h e2 6 %s i t ew e r e c l e a v -a b l eb yb o t hX h oI a n dP a e R 7 .H o w e v e r ,a h y b r i ds i t ec o n t a i n -i n gs e q u e n c e s t o t h el e f t( t o w a r d .l o w e rmap p o s i t i o n s )o ft h eo r i g i n a l2 6 %s i t es t i l lwa s r e s i s t a n tt o P a e R 7( F i g .5 ) .

D u r i n ge f f o r t st oo p t i m i z ed i g e s tc o n d i t i o n sf o rP a e R 7 ,a s e c -

X h o I + p x 1 6 4

2

' AAAA C ;CCT C T CG ATT.T.T. G..G.A.GAG T

o n d e n d o n u c l e o l y t i ca c t i v i t ywa s o b s e r v e di n P a e R 7p r e p a r a -t i o n s .T h i sa c t i v i t ywa s f o u n du n d e rc o n d i t i o n so fl o ws a l t ,h i g hg l y c e r o l ,a n dh i g he n z y m e c o n c e n t r a t i o n sw i t hp r o l o n g e di n -c u b a t i o n( F i g .4 B ) .T h e s e c o n da c t i v i t ywa s i n h i b i t e db y h i g hs a l t( 1 5 0mM N a C I ) .U n d e ri d e n t i c a ld i g e s t i o nc o n d i t i o n s ,X h oI s h o w e dn o s e c o n d a r ya c t i v i t y .

S p e c i f i c i t yo f t h eP a e R 7M e t h y l a s e .W e d e t e r m i n e dw h i c hb a s ei s m e t h y l a t e dw i t h i n t h eP a e R 7r e c o g n i t i o ns i t eb y t h em e t h o dd e s c r i b e d 'b y M c C l e l l a n d( 1 8 ) .B e c a u s et h ec e n t r a lt e t -r a n u c l e o t i d eo ft h eP a e R 7r e c o g n i t i o ns i t e ,T- C - G - A ,i sa l s ot h e .T a q I r e c o g n i t i o ns i t e( 1 9 ) ,a l lP a e R 7s i t e sar e a l s oT a q I s i t e s .I th a db e e ns h o w np r e v i o u s l yt h a tT a q I c l e a v a g ei sb l o c k e db yN 6 - m e t h y l a d e n i n ew i t h i ni t sr e c o g n i t i o ns i t eb u ti s i n s e n s i t i v et o t h ep r e s e n c e o f5 - m e t h y l c y t o s i n e( 1 8 ,2 0 ) .T h e r e f o r e ,f a i l u r eo fT a qI t oc l e a v ea P a e R 7s i t ea f t e ri t h a db e e nm o d i f i e db y t h eP a e R 7m e t h y l a s ew o u l di n d i c a t et h a tt h i se n z y m e i s a DNAa d e n i n em e t h y l a s e .T a qI c o u l dn o t c l e a v ea P a e R 7s i t e( i n s e r t e da s a X h oI l i n k e ri n t op B R 3 2 2 )a f t e rh a v i n gb e e nm o d i f i e db yt h eP a e R 7m e t h y l a s e( F i g .6 ) .T h i sr e s u l ts t r o n g l ys u g g e s t st h a tt h eP a e R 7m e t h y l a s ea c t s a tt h er e c o g n i t i o ns i t et o p r o d u c e5 'C - T- C - G - m A - G3 ' .

9680 9 6 9 0 9698

...AA AACCT C T C G : A G AAAGGCGi... Ad2

. . . . T T T T G G A G A G C T l TTTCCGC... ( 2 6 . 5 % )

DNA XhoI + Ad 2 ( 2 2 6 % )DN A

GGACCGGC... TCTGGCTGCTCGAGAAAGGCG...CCTGGCCG... ...AGACCGACGAGCTC-TTTCCGC....

I + P a e R 7

3 . A : A Z A A C : G T C T C G A G G A C C G G C . . .TTTT 4 3 i t i A G G C T C C T G G C C G . . .

+ P o e R 7

... TCTGGCTGC

...AG ACCG ACGAGCTT C G AGAAAGGCG...

C T T T C C G C . . .

F I G . 5 . C o n s t r u c t i o n so fh y b r i d P a e R 7s i t e sb yu s i n g2 6 . 5 %s i t eo n t h e Ad 2 g e n o m e ( n u c l e o t i d e s9 , 6 7 9 - 9 , 6 9 8 ) .T h e2 6 . 5 %s i t ewa s l e a v e dw i t hXho I a n d the two ends ( s t i p p l e d ) were re l iga ted to otherXho I s i t e s ( p X 1 6 4 is pBR322 p l a s m i d with aXho I linker at p o s i t i o n 1 6 4 ) . After the h y b r i d

s i t e swere c o n s t r u c t e d ,t h e ywere d i g e s t e d w i t h P a e R 7 .S e q u e n c e s5' t ot h e 2 6 . 5 %s i t e( t o w a r d l o w e rn u c l e o t i d en u m b e r s ) - i nA d 2D NAa r e r e s p o n s i b lf o rt h e r e s i s t a n c eo ft h i ss i t et oc l e a v a g e . -

a b c

B i o c h e m i s t r y :G i n g e r a sa n d - B r o o k s


5/5

4 0 6 B i o c h e m i s t r y :G i n g e r a sa n dB r o o k s

Weh a v ea l s on o t e dt h a tP a e R 7m e t h y l a t i o n c a nb l o c kc l e a v -a g eo fi t sr e c o g n i t i o ns i t eb yX h oI a n dA v aI ( C - P y - C - G - P u - G ) .H o w e v e r ,t h i sd o e sn o tn e c e s s a r i l yi m p l yt h a tt h e s et w o e n -z y m e sh a v et h es a m ec o g n a t em e t h y l a t i o ns i t e( 2 1 ) .

D I S C U S S I O NE f f o r t st oc l o n e t h eg e n e sf o rv a r i o u sr e s t r i c t i o n / m o d i f i c a t i o ns y s t e m si n E . c o l ih a v em e t w i t hs u c c e s si n o n l yf o u rc a s e s :

E c o R I( 2 2 ) ,E c o R I I( 2 3 ) ,H h aI I ( 1 5 ) ,a n dP s tI ( 2 4 ) . I ti s u n -c e r t a i nw h ya t t e m p t st o c l o n e o t h e rs y s t e m sh a v en o ts u c -c e e d e d .T h e f a c tt h a tP a e R 7i sa - t y p eI I s y s t e m( 2 5 )w h i c hi sp l a s m i d - b o r n e( 5 )f a c i l i t a t e dt h ei s o l a t i o na n dt r a n s f e ro f t h eg e n e s .C l o n e sc o n t a i n i n gt h eP a e R 7s y s t e ma l s oh a v eb e e nr e -p o r t e db yT h e r i a u l ta n dR o y( 2 6 ) .

P a e R 7p o s s e s s e ss o m ei n t er e s t in g p r o p e r t i e s .T h e i n a b i l i t yo ft h i se n z y m et oc l e a v et h eA d 22 6 . 5 %s i t ei sa p h e n o m e n o nw h i c h ,t oo u rk n o w l e d g e ,i s u n i q u e( 2 7 , 2 8 ) .A l t h o u g hm a n yr e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s e sa r ek n o w nt o c l e a v ed i f f e r e n ts u b -s t r a t es i t e sa t v a r i a b l er a t e sd e p e n d e n to n t h e i rf l a n k i n gs e -q u e n c e s( 3 ,2 7 ,2 8 ) ,t h e ye v e n t u a l l yd oc l e a v ea l lc a n o n i c a ls i t e s .I nt h ec a s eo fP a e R 7 ,t h e r ec l e a r l yi sa ne f f e c ti n d u c e db yt h es e q u e n c e5 ' ( t o w a r dl o w e rn u c l e o t i d en u m b e r s )t o t h eA d 2P a e R 7s i t ew h i c hr e n d e r st h es i t ec o m p l e t e l yr e f r a c t o r y .C o m -

p u t e rs e a r c h e so ft h es e q u e n c e su p t o1 5 0n u c l e o t i d e s5 ' t ot h i sP a e R 7s i t eh a v en o ts h o w nt h ep r e s e n c eo fa n yr e g i o n st h a tc o u l df o r ms e c o n d a r ys t r u c t u r e so fs i g n i f i c a n ts t a b i l i t y .T h i s ,o fc o u r s e ,d o e sn o tp r e c l u d et h ep o s s i b i l i t yo fi n t e r a c t i o n sb e -t w e e nd i s t a lr e g i o n sl e a d i n gt o t h ef o r m a t i o no fa s t a b l es t r u c -t u r e .A l t e r a t i o n si nt h ep r i m a r yf l a n k i n gs e q u e n c e sw i l lb e r e -q u i r e dt od e t e r m i n et h ec a u s eo ft h i si n h i b i t i o n .

Th em o s tu n u s u a lf e a t u r eo ft h eP a e R 7c l o n e si s t h ef i n d i n gt h a ta f u n c t i o n i n gr e s t r i c t i o ne n z y m eg e n ec a nb e p r e s e n ti nt h ec e l lw i t h o u ta na c c o m p a n y i n g m e t h y l a s eg e n e .I no t h e rr e s t r i c -t i o n / m o d i f i c a t i o ns y s t e m s ,s u c ha st h eE c o R Ia n d H h aI I s y s -t e m s , t h ep r e s e n c eo ft h er e s t r i c t i o ne n z y m eg e n ew i t h o u ti t sc o r r e s p o n d i n gm e t h y l a s ei s l e t h a l( r e f .2 9 ;B .S c h o n e ra n d H .S m i t h ,p e r s o n a lc o m m u n i c a t i o n ) .C o n s e q u e n t l y ,o b t a i n i n gc l o n e st h a ta r ee n d o n u c l e a s e 'm e t h y l a s e -w a s u n e x p e c t e d .A l t h o u g ht h em e c h a n i s mt h a tm a k e st h eP a e R 7c l o n e sv i a b l ei sn o ty e tk n o w n ,e x p e r i m e n t si n v o l v i n gt h ep PA O R L . 9c l o n ed e m o n s t r a t et h a tt h er e s t r i c t i o ne n z y m ei nt h i sc l o n ei sn o ta c -t i v ei nv i v ob e c a u s e0 8 0p h a g ec a ng r o wu n r e s t r i c t e d .T h e r ea r ea t l e a s tt h r e ep o s s i b l ee x p l a n a t i o n so ft h i sp h e n o m e n o n .F i r s t ,i t m a yb et h a tt h er e s t r i c t i o ne n z y m ei sp h y s i c a l l ys e p -a r a t e df r o mt h ec e l l ' sD N A .P r e l i m i n a r ye x p e r i m e n t sa t t e m p t -i n gt or e l e a s ep e r i p l a s m i cp r o t e i n sb ys u b j e c t i n gt h ec e l l st oo s m o t i cs h o c kf a i l e dt o r e l e a s et h eP a e R 7e n d o n u c l e a s e ,s u g -g e s t i n gt h a tc o m p a r t m e n t a l i z a t i o nd o e sn o ti n v o l v ei t sl o c a t i o ni nt h ep e r i p l a s m i cs p a c e .

A s e c o n dp o s s i b i l i t yi s t h a tt h eP a e R 7r e s t r i c t i o ng e n eh a su n d e r g o n em u t a t i o na n dn o wc o d e sf o ra na l t e r e dp r o t e i nt h a ti sn o n f u n c t i o n a lu n d e rp h y s i o l o g i c a lc o n d i t i o n s .T h e r ei sa p r e -c e d e n tf o rt h i s - t h eo c c u r r e n c eo fs u c ha m u t a t i o ni nc l o n e sc o n t a i n i n gt h eE c o R Is y s t e m .A s p o n t a n e o u sm u t a t i o ni nt h ee n d o n u c l e a s eg e n e( 3 0 )r e s u l t e di na m u t a n tt h a tw a su n a b l et or e s t r i c ti n c o m i n gAp h a g e ;n e v e r t h e l e s s ,e x t r a c t so ft h em u t a n tc e l l sc o n t a i n e dh i g hl e v e l so fe n d o n u c l e a s ea c t i v i t y .T h em u t a n tf o r mo ft h ee n z y m ed i f f e r s - f r o mt h ew i l dt y p ei no p t i m a lr e a c t i o np a r a m e t e r s( P .G r e e n e ,p e r s o n a lc o m m u n i c a t i o n ) .T o d e t e r -m i n ew h e t h e ra s i m i l a rm u t a t i o nh a so c c u r r e di nt h eP a e R 7s y s -t e m ,i tw i l lb en e c e s s a r yt oc o m p a r et h eDNAs e q u e n c e so f t h er e s t r i c t i o ng e n ef r o mpPAORL9 ( e n d o n u c l e a s e 'm e t h y l a s e & )w i t ht h eg e n ef r o mp PA O R M S . 8( e n d o n u c l e a s e ' m e t h y l a s e ' )

d i g e s t i o np r o d u c e dc l o n e sw i t hi n s e r t so fv a r i a b l el e n g t h ,a l lo fw h i c hwere e n d o n u c l e a s e 'm e t h y l a s e - . T h e r e fo r e ,a m u t a t i o na l t e r i n gt h ei n v i v o a c t i v i t yo ft h eP a e R 7e n d o n u c l e a s eg e n ew o u l dh a v et o b e common t o a l lo f t h e s ec o n s t r u c t s .

T h et h i r dp o s s i b i l i t yi st h a ti nt h eP a e R 7s y s t e mt h ep r e s e n c eo ft h er e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s ea l o n ei sn o t s u f f i c i e n tf o ri nv i v oa c t i v i t y .A n o t h e rg e n e p r o d u c tmay b e r e q u i r e dt o e l i c i tt h ei nv i v oa c t i v i t y.T h ec o n t r o le l e m e n t ,w h a t e v e ri t sc o m p o s i t i o n ,may h a v ee v o l v e ds p e c i f i c a l l yt oa i dt h i sp l a s m i d - b o r n es y s t e md u r i n gt h et r a n s f e ro ft h ep l a s m i db e t w e e nd i f fe r e n t b a c t er i aT h ep r e s e n c e o fa t h i r df a c t o rw o u l di m p l yt h a tt y p e II r e s t r i c -t i o n / m o d i f i c a t i o ns y s t e m s are a more c o m p l e xa n dd i v e r s eg r o u p t han h a sb e e na s s u m e d .

W e t h a n kD r s .S .R .R o b e r t s ,J . S a m b r o o k ,a n dA .B u k h a r if o rt h e i rr e a d in g o ft h i sm a n u s c r i p t .W e a l s ot h a n kD . O ' L o a n ef o rh e rt e c h n i c a la s s i s t a n c ea n d N . D ' A n n a ,D . B a l k e ,a n d E . L o c k h a r tf o rt h e i rh e l pi nt h ep r e p a r a t i o no ft h i sm a n u s c r i p t .T h i sw o r kwa s s u p p o r t e db yg r a n t sf r o mN a t i o n a lI n s t i t u t e so fH e a l t h( C A 2 7 2 7 5 )a n d N a t i o n a lS c i e n c eF o u n d a t i o n( t oR .J .R o b e r t s )( P C M7 9 1 9 8 8 2 ) .

1 . A r b e r ,W. ( 1 9 7 4 )i n P r o g r e s si n N u c l e i cA c i dR e s e a r c ha n d M o -l e c u l a r B i o l o g y,e d .C o h n ,W . E . ( A c a d e m i c ,Ne w Yo r k ) ,Vo l .1 4, p p . -1 - 3 7 .

2. S m i t h ,H . 0. ( 1 9 7 9 )S c i e n c e205, 4 5 5 - 4 6 6 .3 . M o d r i c h ,P . ( 1 9 7 9 )Q . R e v .B i o p h y s .12, 3 1 5 - 3 6 9 .4 . Yu a n ,R .( 1 9 8 1 )A n n u .R e v .B i o c h e m .5 0 ,2 8 5 - 3 1 5 .5 . J a c o b y ,G .A .& S u t t o n ,L . ( 1 9 7 7 )P l a s m i d1 , 1 1 5 - 1 1 6 .6 . B a c k m a n ,K . ,P t a s h n e ,M . & G i l b e r t ,W . ( 1 9 7 6 )P r o c .N a t tA c a d .

S c i .U S A7 3 ,4 1 7 4 - 4 1 7 8 .7 . C l e w e l l ,D . B . & H e l i n s k i ,D . R . ( 1 9 7 2 )J . B a c t e r i o l1 1 ,1 1 3 5 -

1 1 4 6 .8 . B i r n b o i m ,H . C . & D o l l y ,J . ( 1 9 7 9 )N u c l e i cA c i d sR e s .7 , 1 5 1 3 -

1523.

9 . M a r m u r ,J . ( 1 9 6 1 )J .M o lB i o l3 , 2 0 8 - 2 1 8 .1 0 . P e t t e r s s o n ,U . i &S a m b r o o k ,J . ( 1 9 7 3 )J . M o l .B i o l7 3 ,1 2 5 - 1 3 0 .1 1 . C h a c o n a s ,G. & v an d e S a n d e ,J . H . ( 1 9 8 0 )M e t h o d sE n z y m o t6 5 ,

7 5 - 8 5 .1 2 . B a r r e l l ,B . G . ( 1 9 7 1 )i n P r o c e d u r e si n N u c l e i cA c i dR e s e a r c h ,

e d s .C a n t o n i ,G .L .& D a v i e s ,D . R .( H a r p e r& R o w,Ne w Yo r k ) ,Vo l .2 , p p. 7 5 1 - 7 7 9 .

' 1 3 . C o h e n ,S .N . ,C h a n g ,A .C .Y .& H s u , L .( 1 9 7 2 )P r o c .N a t iA c a d .S c i .U S A6 9 ,2 1 1 0 - 2 1 1 4 .1 4 . S h a r p ,P .A . ,S u g d e n ,B .& S a m b r o o k ,J . ( 1 9 7 3 )B i o c h e m i s t r y12,3 0 5 5 - 3 0 6 3 .

1 5 . M a n n ,M . B . ,R a o , R .N . & S m i t h ,H . 0. ( 1 9 7 8 )G e n e3 , 9 7 - 1 1 2 .1 6 . G i n g e r a s ,T . R . ,M y e r s ,P . A . ,O l s o n ,J . A . ,H a m b e r g ,F . A .&

R o b e r t s ,R .J . ( 1 9 7 7 ) J .M o l ;B io l 1 1 7 ,1 1 3 - 1 2 2 .1 7 . G i n g e r a s ,T .R . ,S c i ak y , D . ,G e l i n a s ,R .E . ,B i n g - D o n g ,J . ,Ye n ,

C .E . ,K e l l y ,M. , B u l l o c k ,P . A . ,P a r s o n s ,B .L . . ,O ' N e i l l ,K . E .& R o b e r t s ,R .J . ( 1 9 8 2 )J .B i o lC h e m .2 5 7 ,1 3 4 7 5 - 1 3 4 9 1 .

1 8 . M c C l e l l a n d ,M . ( 1 9 8 1 )N u c l e i cA c i d sR e s .9 , 6 7 9 5 - 6 8 0 4 .1 9 . S a t o ,S .& S h i n o m i y a ,T .( 1 9 7 8 ) J .B i o c h e m .8 4 ,1 3 1 9 - 1 3 2 1 .2 0 . v an d e rP l o e g ,L . H . T .& F l a v e l l ,R . A .( 1 98 0 ) C e l l19, 9 4 7 - 9 5 8 .2 1 . B r o o k s ,J . E . & R o b e r t s ,R .J . ( 1 9 8 2 )N u c l e i cA c i d sR e s .1 0 ,9 1 3 -

9 3 4 .22 . B o l i v a r ,F . , R o d r i g u e z ,R . L . , G r e e n e , P . J . , B e t l a c h ,M . C . ,

H e y n e k e r ,H . L . , B o y e r , H . W . , C r o s a ,J . H . & F a l k o w ,S .( 1 9 7 7 )G e n e2 , 9 5 - 1 1 3 .

2 3 .K o s y k h ,

V .G . ,B u r y a n o v ,Y .I . & B a y e r ,A . A .( 1 9 8 0 )M o l G e n .G e n e t .1 7 8 ,7 1 7 - 7 1 8 .

2 4 . W a l d e r ,R .Y . ,H a r t l e y ,J . L . ,D o n e l s o n ,J . E . & W a l d e r ,J . A .( 1 9 8 1 )P r o c .N a t LA c a d .S c i .U S A7 8 ,1 5 0 3 - 1 5 0 7 .

2 5 . H i n k l e ,N . & M i l l e r ,R .V .( 1 9 7 9 )P l a s m i d2 , 3 8 7 - 3 9 3 .2 6 . T h e r i a u l t ,G . & R o y ,P . ( 1 9 8 2 )G e n e ,i n p r e s s .2 7 . T h o m a s ,M . & D a v i s , R .W. ( 1 9 7 5 )J . Mo l B i o l 9 1 ,3 1 5 - 3 2 8 .28 . F o r s b l u m ,S . ,R i g l e r ,R . ,E h r e n b e r g ,M . , P e t t e r s s o n ,U . & P h i l -

i p s o n ,L . ( 1 9 7 6 )N u c l e i cA c i d sR e s .3 ,3 2 5 5 - 3 2 6 9 .2 9 . H u m p h r e y s ,G . O . ,W i l l s h a w ,G . A . ,S m i t h ,H . R .& A n d e r s o n ,

E . S .( 1 9 7 6 )M o l .G e n .G e n e t .1 4 5 ,1 0 1 - 1 0 8 .3 0 . G r e e n e ,P . J . , G u p t a , M . & B o y e r , H . W. ( 1 9 8 1 )J . B i o LC h e m .

c l o n e s .I n t h i sr e s p e c t ,i t i s i n t e r e s t i n gt o n o t et h a tB A L - 3 1

P r o c .N a t l .A c a d .S c i .U SA8 0 ( 1 9 8 3 )

0 r . C . 2 1 4 3 - 2 1 5 3 .

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