LAPORAN PRAKTIKUM PENYAKIT INFEKSIUS

CARA ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI

Escherichia coli

NAMA : KHARISMA

NIM : O111 12 106

KELOMPOK : 1 (SATU)

PROGRAM STUDI KEDOKTERAN HEWAN

FAKULTAS KEDOKTERAN

UNIVERSITAS HASANUDDIN

MAKASSAR

2014

1

DAFTAR ISI

Halaman Judul 1

Daftar Isi 2

BAB I Pendahuluan

I.1 Latar Belakang 3

I.2 Tujuan Praktikum 4

BAB II Tinjauan Pustaka

II.1 Penyakit infeksius pada hewan yang disebabkan E.coli 5

II.2 Teknik isolasi bakteri E.coli: media (EMB Agar dan SMAC) yang

digunakan 5

II.3 Pewarnaan gram pada bakteri 7

II.4 Uji Biokimia untuk identifikasi E.coli 7

BAB III Materi dan Metode

III.1 Alat Dan Bahan 9

III.2 Prosedur Kerja 9

BAB IV Hasil dan Pembahasan

IV.1 Hasil 11

IV.2 Pembahasan 12

BAB V Penutup

V.1 Kesimpulan 13

V.2 Saran untuk praktikum selanjutnya 13

Daftar Pustaka 14

Lampiran Foto

2

BAB I

PENDAHULUAN

I.1 Latar Belakang

Bakteri(dari kata Latin bacterium; jamak: bacteria) adalah kelompok

organisme yang tidak memiliki membran inti sel.Organisme ini termasuk ke

dalam domain prokariota dan berukuran sangat kecil (mikroskopik), serta

memiliki peran besar dalam kehidupan di bumi(Sutiknowati, 2014).

Mikroorganisme yang memiliki arti penting bagi perairan budidaya laut dan

perairan budidaya air tawar. Bakteri dapat menyebabkan penyakit yang dapat

merugikan dan menjadi indikator pencemar. Parameter bakteriologis yang

digunakan sebagai indikator kualitas perairan budidaya laut dan darat (tawar)

adalah kelompok bakteri koli atau bakteri patogen (Anggraini dkk,2013).

E. coli adalah anggota flora normal usus. E. coli berperan penting dalam

sintesis vitamin K, konversi pigmen-pigmen empedu, asam-asam empedu dan

penyerapan zat-zat makanan. E. colitermasuk ke dalam bakteri heterotrof

yang memperoleh makanan berupa zat oganik dari lingkungannya karena

tidak dapat menyusun sendiri zat organik yang dibutuhkannya. Zat organik

diperoleh dari sisa organisme lain. Bakteri ini menguraikan zat organik dalam

makanan menjadi zat anorganik, yaitu CO2, H2O, energi, dan mineral. Di

dalam lingkungan, bakteri pembusuk ini berfungsi sebagai pengurai dan

penyedia nutrisi bagi tumbuhan (Maksum, 2010)

E. coli menjadi patogen jika jumlah bakteri ini dalam saluran pencernaan

meningkat atau berada di luar usus. E. colimenghasilkan enterotoksin yang

menyebabkan beberapa kasus diare. E. coli berasosiasi dengan

enteropatogenik menghasilkan enterotoksin padasel epitel (Hrenovic, J. and

T. Ivanovic. 2009).

Enterobactericeae dapat dikultur pada media diferensial mengandung

indikator dan karbohidrat, contohnya EMB, Mc Conkey atau DCA, dapat

membedakan koloni lactosefermenting (perubahan warna) dari koloni yang

3

non lactose fermenting (non pigmentasi) dan bisa digunakan untuk identifikasi

persumtif cepat (Hrenovic, J. and T. Ivanovic. 2009 ).

Di uji analisis air, E. coli yaitu mikroorganisme yang digunakan sebagai

indikator untuk menguji pencemaran air tinja hewan. Di kehidupan sehari-

hari E.coli memiliki peranan yang penting yaitu selain sebagai flora normal

tubuh (di usus besar) juga E. coli menghasilkan kolisin untuk melindungi

saluran pencernaan dari bakteri patogenik. E. coli akan menjadi patogen jika,

pindah dari habitatnya flora normal ke inangnya (Sartika,2012).

I.2 Tujuan Praktikum

Tujuan dari praktikum adalah untuk mengetahui cara isolasi dan

identifikasi bakteri Escherichia coli sebagai penyebab penyakit infeksius.

4

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

II.1 Penyakit infeksius pada hewan yang disebabkan E. coli

Escherichia coli merupakan bakteri Gram negatif berbentuk batang

pendek yang memiliki panjang sekitar 2 μm, diameter 0,7 μm, lebar 0,4-

0,7μm dan bersifat anaerob fakultatif. E.coli membentuk koloni yang bundar,

cembung, dan halus dengan tepi yang nyata (Sartika,2012).

E. coli yang menyebabkan diare banyak ditemukan di seluruh dunia. E.

colidiklasifikasikan oleh ciri khas sifat-sifat virulensinya, dan setiap

kelompok menimbulkan penyakit melalui mekanisme yang berbeda. Ada

lima kelompok galur E. coli yang patogen, yaitu : E. Coli Enteropatogenik

(EPEC), E. coli Enterotoksigenik (ETEC), E. Coli Enteroinvasif (EIEC), E.

coli Enterohemoragik (EHEK), E. coliEnteroagregatif (EAEC)

(Sartika,2012).

Uji mikrobiologis dilakukan untuk mendeteksi bakteri E. coli di

temukan di air secara konvensional, yaitu cara kultur dan uji sifat biokimia.

Namun demikian metode konvensional ini pada umumnya memerlukan

waktu 5-7 hari untuk mendapatkan hasil yang positif. Oleh karena itu,

(BSN,2011).

II.2 Teknik isolasi bakteri E. coli : media (EMB Agar dan SMAC) yang

digunakan

1. EMB (Eosin Methylene Blue) Agar

media isolasi untuk membedakan  bakteri Enterobacteriaceae. EMB

Agar adalah media yang digunakan untuk mengetahui ada atau tidaknya

bakteri coliform di dalam suatu sample. Media Eosin Methylene Blue

Agar ini mempunyai keistimewaan mengandung laktosa dan berfungsi

untuk membedakan mikroba yang memfermentasikan laktosa seperti S.

aureus, P. aerugenosa, dan Salmonella. Pembiakan dilakukan dengan cara

menuangkan 1 ml hasil tiap pengenceran ke dalam cawan Petri steril

kemudian ditambahkan kira-kira 10 ml agar EMB pada cawan Petri

5

lainnya (media masih cair, kira-kira bersuhu 50oC). Media ditunggu

sampai mengeras, lalu biakan dalam cawan Petri diinkubasi pada 37oC

selama semalam (BSN, 2011).

Mikroba yang memfermentasi laktosa menghasilkan koloni dengan inti

berwarna gelap dengan kilap logam.  Sedangkan mikroba lain yang dapat

tumbuh koloninya tidak berwarna. Fungsi dari eosin dan metilen blue

membantu mempertajam perbedaan warna. Namun demikian, jika media

ini digunakan pada tahap awal, kuman lain bisa juga tumbuh terutama P.

Aerugenosa dan Salmonella sp. Hal ini dapat menimbulkan keraguan.

Bagaiamanapun media ini sangat baik untuk mengkonfirmasi bahwa

kontaminan tersebut adalah E.coli. Media ini berbentuk padat berguna

untuk menjaga sel tidak berpindah tempat sehingga akan mudah dihitung

dan dipisahkan jenisnya ketika tumbuh menjadi koloni. Media padat juga

menampakkan difusi hasil metabolit bakteri sehingga memudahkan dalam

pengujian suatu hasil metabolit (Michael dkk, 2010).

2. SMAC (Solibitol MacConkey)

MacConkey telah digunakan untuk membedakan orang-bakteri yang

memfermentasi laktosa dari mereka yang tidak. Hal ini penting karena

bakteri usus, seperti Escherichia coli , biasanya dapat memfermentasi

laktosa, sedangkan patogen usus penting, seperti Salmonella enterica dan

sebagian shigellas tidak dapat memfermentasi laktosa. Shigella sonnei

dapat memfermentasi laktosa, tetapi hanya inkubasi setelah

berkepanjangan, sehingga disebut sebagai fermentor akhir-laktosa

(Michael dkk, 2010).

Pembiakan dilakukan dengan cara menuangkan 1 ml hasil tiap

pengenceran ke dalam cawan Petri steril kemudian ditambahkan kira-kira

10 ml agar MacConkey pada cawan Petri lainnya (media masih cair, kira-

kira bersuhu 50oC). Media ditunggu sampai mengeras, lalu biakan dalam

cawan Petri diinkubasi pada 37oC selama semalam (BSN,2011).

6

II.3 Pewarnaan Gram Bakteri

Pengecatan gram dilakukan dengan preparat olesan bakteri difiksasi pada

pembakar spirtus. Kemudian diteteskan larutan kristal violet sebanyak 2-3

tetes selama 2 menit. Dicuci dengan air mengalir, dikeringkan dengan tissu.

Lalu diteteskan larutan lugol dan dibiarkan selama 20-30 detik. Kemudian

dicuci dengan air mengalir, dikeringkan dengan tissu. Setelah itu ditetesi

dengan larutan alkohol 96% dan dibiarkan selama 30 detik. Dicuci dengan air

mengalir dan dikeringkan dengan tissu. Diteteskan dengan larutan safranin,

dibiarkan selama 2 menit lalu dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan

dengan tissu. Selanjutnya diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran

100x menggunakan minyak imersi (Sartika,2012).

II.3 Uji Biokimia untuk identifikasi E.coli

1. Uji TSI (Triple Sugar Iron)

Dengan menggunakan ose steril diambil biakan dari EMBA, lalu

ditaman pada media TSIA dengan cara ditusukkan sampai ke dasar

tabung, kemudian digores secara zig-zag pada permukaannya.

Diinkubasikan pada suhu 37oC selama 24 jam. Diamati perubahan pada

media. Bakteri yang tergolong Enterobacteriaceae dapat memfermentasi

karbohidrat (Glukosa, Laktosa, Sukrosa). Hasil : Berwarna kuning

(bersifat asam ) pada bagian tegak dan miring sehingga bakteri dapat

memfermentasi karbohidrat, berwarna hitam dapat memproduksi H2S (+),

dan terbentuk gas didasar tabung (Sartika,2012).

2. Uji SIM (Sulfid Indol Motility)

nokulasikan 1 ose dari Plate Count Agar (PCA) miring ke dalam

tryptone Broth inkubasi selama 24 jam ± 2 jam pada suhu 35oC +1oC. Uji

Indol dilakukan dengan menambahkan 0,2 ml – 0,3 ml pereaksi Kovacs.

Reaksi positif jika terbentuk cincin merah pada lapisan bagian atas media

dan negatif bila terbentuk cincin warna kuning. Mengetahui motilitas

organisme, adanya pembebasan H2S (sulfide) dan mengetahui adanya

pembentukan indol. Hasil : Adanya H3S ditunjukkan dengan perubahan

warna menjadi hitam pada bagian dasar. Motilitas diketahui dari keruhnya

7

media dan adanya penyebaran ke atas ( mirip pohon cemara terbalik ).

Adanya indol terlihat berupa cincin merah beberapa detik sampai 5 menit

setelah penambahan 1 ml chloroform dan beberapa tetes reagen Kovac

(Tirnata,2007). .

8

BAB III

MATERI DAN METODE

III. 1 Alat Dan Bahan

1. Alat

- Inkubator

- Tabung reaksi

- Gelas ukur

- Rak tabung reaksi

- Cawan petri

- Pipet pasteur

- Batang pengaduk

- Bunsen

- Ose

- Object glass

- Cover glass

2. Bahan

- Eosin Methylene Blue

(EMB) Agar

- Solibitol MacConkey

(SMAC)

- Triple Sugar Iron Agar

(TSI)

-

- Sulfid Indol Motility

(SIM)

- Metil Red-Voges

Broskauer (MR-VP)

- Media uji Citrat dan uji

Urea

- Media uji gula-gula

(glukosa, sukrosa,

laktosa)

- Media uji manitol,

sorbitol, dan laktosa

- Alkohol 96%

- NaCl fisiologis

- Crystal violet

- Fuchsin

- Lugol

- Minyak emersi

- Tissue

III. 2 Prosedur Kerja

a. EMB (Eosin Methylene Blue)

Bakteri dikultur pada media EMBA dengan cara menggoreskan

bakteri pada permukaan agar kemudian diinkubasi selama 24 jam pada

suhu 37oC.

b. SMAC (Solibitol MacConkey)

Bakteri dikultur pada media EMBA dengan cara menggoreskan

bakteri pada permukaan agar kemudian diinkubasi selama 24 jam pada

suhu 37oC.

9

c. TSI (Triple Sugar Iron Agar)

Bakteri pada media kultur bakteri diambil menggunakan ose

kemudian

d. SIM (Sulfid Indol Motility)

H2O2 3% dituangkan dalam tabung reaksi, Ose lurus difiksasi

kemudian digunakan untuk mengambil kultur bakteri dari media biakan, Ose

lurus dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi H2O2 3%, Jika hasil positif

(+) akan menghasilkan gelembung, jika hasil negatif (-) maka tidak ada

gelembung yang terbentuk

e. MR-VP (Metil Red-Voges Broskauer)

Object glass difiksasi, ose bengkok difiksasi kemudian NaCl diletakkan

pada object glass, Kultur bakteri pada media biakan diambil menggunakan

ose dan diletakkan pada object glass yang telah diberikan NaCl, Object

glass ditetesi plasma darah, jika hasil positif (+) akan terjadi penggumpalan

f. Uji Citrat dan uji Urea

Agar miring Simmon’s citrate agar disiapkan pada tabung reaksi lalu

inokulasikan biakan dan inkubasi pada suhu 37 C selama 24-48 jam. Hasil

uji positif apabila terjadi perubahan warna media dari hijau menjadi biru

yang merupakan indikator bahwa bakteri mampu menggunakan sitrat

sebagai satu-satunya sumber energi.

Urea Broth disiapkan pada tabung reaksi dan biakan di inokulasikan

lalu di inkubasi selama 24-48 jam. Uji positif ditunjukkan oleh terbentuknya

warna merah keunguan setelah inkubasi, yang merupakan indikator bahwa

bakteri mampu menggunakan urea dan mengubah pH menjadi basa

g. Uji Gula-Gula (Glukosa, Sukrosa, Laktosa)

Siapkan medium Nutrient Broth lalu tambahkan BTB (Broom Timol

Blue) sebagai indikator pada tabung reaksi lalu tambahkan gula yang akan

difermentasikan 1-2%. Tabung durham dimasukkan kedalam tabung reaksi

lalu disterilisasi. Setelah steril biakkan 1 ose bakteri pada tabung inkubasi

selama 24-48 jam pada suhu 37 C. Indikasi pembentukan asam laktat

apabila terjadi perubahan media dari hijau kebiruan menjadi kuning tanpa

pembentukan gas pada tabung durham. Uji bersifat fermentasi asam

10

campuran apabila warna medium berubah menjadi kuning dan diikuti

dengan pembentukan gas pada tabung durham. Uji bersifat fermentasi

alkohol apabila terbentuk gas pada tabung durham tanpa diikuti perubahan

warna pada medium.

h. Pewarnaan gram

Pengecatan gram dilakukan dengan preparat olesan bakteri difiksasi

pada pembakar spirtus. Kemudian diteteskan larutan kristal violet sebanyak

2-3 tetes selama 2 menit. Dicuci dengan air mengalir, dikeringkan dengan

tissu. Lalu diteteskan larutan lugol dan dibiarkan selama 20-30 detik.

Kemudian dicuci dengan air mengalir, dikeringkan dengan tissu. Setelah itu

ditetesi dengan larutan alkohol 96% dan dibiarkan selama 30 detik. Dicuci

dengan air mengalir dan dikeringkan dengan tissu. Diteteskan dengan

larutan safranin, dibiarkan selama 2 menit lalu dicuci dengan air mengalir

dan dikeringkan dengan tissu. Selanjutnya diamati di bawah mikroskop

dengan perbesaran 100x menggunakan minyak imersi (Hrenovic, J. and T.

Ivanovic. 2009 ).

11

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

IV.1 Hasil

- EMB (Eosin Methylene Blue)

Bakteri E. coli yang dikultur pada media EMB memberikan warna

koloni hijau metalik (metaliksin/mengkilat).

- SMAC (Solibitol MacConkey)

Bakteri E. coli yang dikultur pada media MacConkey memberikan

warna merah pada medium agar MacConkey.

- TSI (Triple Sugar Iron Agar)

Bakteri E. coli pada media TSI menunjukkan perubahan warna dari

yang semula berwarna merah kemudian menjadi kuning, terdapar

gelembung gas pada media, sedangkan warna hitam tidak terbentuk

pada media.

- SIM (Sulfid Indol Motility)

Bakteri E. coli pada media SIM menunjukkan perubahan warna pada

media yang semula berwarna kuning kemudian membentuk cincin

merah dan warna media menjadi keruh, sedangkan warna hitam tidak

terbentuk pada media.

- MR VP (Metil Red Voges Broskauer)

Bakteri E. coli pada media MR setelah ditambahkan metil red pada

media terjadi perubahan warna menjadi merah, sedangkan pada media

VP ditambahkan α-naftol 0,5% dan KOH 40% tidak terjadi perubahan

warna menjadi merah.

- Uji Citrat dan uji Urea

Bakteri E. coli pada media uji citrat setelah ditambahkan Brom

Thymol Blue pada media tidak terjadi perubahan warna menjadi biru

namun media menjadi berwarna hijau, sedangkan pada media uji urea

ditambahkan indikator phenol red tidak terjadi perubahan warna menjadi

merah.

- Uji Gula-Gula (Glukosa, Sukrosa, Laktosa)

12

Bakteri E. coli pada media uji laktosa, sukrosa, dan glukosa

menyebabkan perubahan warna merah pada media menjadi kuning.

Selain itu terbentuk gelembung gas pada media uji glukosa.

- Uji Manitol, Sorbitol, dan Laktosa

Bakteri E. coli pada media uji manitol, sorbitol, dan laktosa

menyebabkan perubahan warna merah pada media menjadi kuning.

Namun tidak semua E. coli dapat menyebabkan perubahan warna merah

menjadi warna kuning pada media uji sorbitol.

- Pewarnaan gram

Pada pewarnaan gram bakteri E. coli yang diamati di bawah

mikroskop dengan perbesaran 100x, terlihat koloni bakteri berwarna

merah berbentuk basil (batang).

IV.2 Pembahasan

Bakteri E Coli yang diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran

100x terlihat berwarna merah, berbentuk batang. Bakteri gram negatif

tidak memiliki lapisan peptidoglikan yang tebal dan sehingga tidak dapat

mengikat zat warna primer pada pewarnaan gram yaitu kristal violet

sehingga bakteri berwarna merah.

13

BAB V

PENUTUP

V.1 Kesimpulan

a. E. coli adalah anggota flora normal usus. E. coli berperan penting dalam

sintesis vitamin K, konversi pigmen-pigmen empedu, asam-asam empedu

dan penyerapan zat-zat makanan. E. colitermasuk ke dalam bakteri

heterotrof yang memperoleh makanan berupa zat oganik dari

lingkungannya karena tidak dapat menyusun sendiri zat organik yang

dibutuhkannya.

b. EMB (Eosin Methylene Blue) Bakteri E. coli yang dikultur pada media

EMB memberikan warna koloni hijau metalik (metaliksin/mengkilat).

c. Uji Gula-Gula (Glukosa, Sukrosa, Laktosa) Bakteri E. coli pada media uji

laktosa, sukrosa, dan glukosa menyebabkan perubahan warna merah pada

media menjadi kuning. Selain itu terbentuk gelembung gas pada media uji

glukosa.

d. Uji Manitol, Sorbitol, dan LaktosaBakteri E. coli pada media uji manitol,

sorbitol, dan laktosa menyebabkan perubahan warna merah pada media

menjadi kuning. Namun tidak semua E. coli dapat menyebabkan

perubahan warna merah menjadi warna kuning pada media uji sorbitol.

e. Pewarnaan gram Pada pewarnaan gram bakteri E. coli yang diamati di

bawah mikroskop dengan perbesaran 100x, terlihat koloni bakteri

berwarna merah berbentuk basil (batang).

V.2 Saran

Sebaiknya praktikan dapat mencoba semua percobaan yang ada.

14

DAFTAR PUSTAKA

Badan Standardisasi Nasional. 2011. Cara Uji Mikrobiologi-Bagian 9: Penentuan Staphylococcus aureus pada Produk Perikanan. Standard Nasional Indonesia.

Megasari, D. 2012. Uji Hambat Air Perak t erhadap Pertumbuhan Bakteri Straphylococcus Aureus. Skripsi Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Hasanuddin, Makassar.

Sartika, G.P. 2012. Isolasi Staphylococcus aureus dari Mukosa Hidung Perokok dan Bukan Perokok pada Buruh Makassar serta Penentuan Staphylococcus aureus Resisten Methicillin. Jurnal Penelitian Universitas Hasanuddin, Makassar.

Tirnata, L.P. 2007. Identifikasi Staphylococcus aureus Penyebab Mastitis dengan Uji Fermentasi Mannitol dan Deteksi Produksi Asetoin Pada Sapi Perah di Wilayah Kerja Koperasi Usaha Tani Ternak Suka Makmur Grati Pasuruan. Jurnal Penelitian Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga, Surabaya.

Anggraini, Rina., Marniati Salim., dan Elida Mardiah. 2013. Uji Bakteri Escherichia Coli yang Resistan Terhadap Antibiotik pada Ikan Kapas-Kapas di Sungai Batang Arau Padang. Jurnal Kimia Unand (ISSN No. 2303-3401) Vol.2, No.2. Laboratorium Biokimia Jurusan Kimia FMIPA, Universitas Andalas.

Michael., Philips Onggowidjaja., dan Djaja Rusmana. 2010. Bakteri Coliform dalam Es Batu pada Tiga Rumah Makan Ayam Goreng Siap Saji di Bandung. JKM. Vol.9 No.2:124-128

Radji, Maksum., Anglia Puspaningrum., dan Atiek Sumiati. 2010. Deteksi Cepat Bakteri Escherichia coli dalam Sampel Air dengan Metode Polymerase Chain Reaction Menggunakan Primer 16e1 Dan 16e2. MAKARA, SAINS, VOL. 14, NO. 1 : 39-43. Laboratorium Mikrobiologi dan Bioteknologi, FMIPA, Universitas Indonesia.

Hrenovic, J. and T. Ivanovic. 2009. Survival of Escherichia coli and Acinetobacter junii at various concentration of sodium chloride. Eur. Asia J. BioSci., 3:144-151.Murray, P.R., K.S. Rosenthal, and M.A. Pfaller. 2009. Medical microbiology (6th ed.). Mosby Elsevier. Philadelphia, PA. 307p.

15