TUGAS INTRUMEN DIASNOTIG KESEHATAN

ELEKTROFORESIS

DISUSUN OLEH :

KELOMPOK 2

Ferri Febrianto (111501076)

Surya Ramayani (121501005)

Nurhotimah Siregar (121501025)

Leonardo Kesuma (121501092)

Christin N purba (121501104)

Meighina Atika (121501126)

Balqis Natasya (131501005)

Elvi Syahrina (131501035)

Kartika Utami (131501038)

Siti Alita Yasmi (131501040)

Ayu Indah Lestari (131501044)

Rizka Damela (131501119)

Izmi Yolanda Rusdi (131501121)

Nabila Arlis (131501123)

Nurul Anisha Hakim (131501128)

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN

2016

ELEKTROFORESIS

Pengertian

Elektroforesis adalah teknik pemisahan suatu partikel/ spesies/ ion atau

partikel koloid berdasarkan kemampuan berpindah melalui medium konduktif,

biasanya berupa larutan bufer, sebagai respon adanya suatu medan listrik (Harvey

2000). Secara teknis, elektroforesis merupakan istilah yang diberikan untuk

migrasi partikel yang bermuatan akibat diberikan arus listrik searah atau DC

(Direct Current). Umumnya teknik dari cikal-bakal elektroforesis digunakan

untuk menentukan muatan dari suatu koloid (Patnaik 2004). Teknik elektroforesis

ditentukan oleh ciri molekular ionik dan adanya muatan sebagai sifat fisik. Arah

dan laju pergerakan tergantung pada spot dan intensitas muatan ionik (Rouessac

2007). Bufer elektroda digunakan untuk konduktor arus dengan menjadi jembatan

konduksi diantara dua elektroda sehingga memungkinkan terjadinya aliran medan

listrik (Skoog 2002).

Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan

berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik.

Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang

akan dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik

yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika

molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian

dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka

molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan

gerak molekul tersebut tergantung pada muatan terhadap massanya serta

tergantung pula pada bentuk molekulnya. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan

gaya Lorentz, yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan

kondisi elektris lingkungan,

F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E adalah

medan listrik.Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan,

mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen DNA.

Berdasarkan bentuk alat, elektroforesis dibagi menjadi 2, yaitu :

1. Elektroforesis Planar

2. Elektroforesis Kolom

Pemisahan pada elektroforesis, selain disebabkan oleh fenomena

elektrokinetik juga dapat disebabkan karena adanya filtrasi, yakni interaksi

dengan fasa diam. Pemisahan yang disebabkan karena interaksi tersebut tidak

disebut elektroforesis melainkan “elektrokromatografi”. Arus yang digunakan

pada elektroforesis adalah arus DC dengan nilai tegangan kurang dari 1000 volt.

Apabila digunakan lebih dari 1000 volt maka akan terjadi efek pemanasan pada

media gel. Efek pemanasan tersebut disebut “efek joule” yang disebabkan karena

adanya tumbukan partikel electron. Efek pemanasan dapat dihilangkan dengan

dua cara, yakni :

1. Pendinginan

2. Efek Konveksi

Efek konvensi adalah suatu cara untuk membebaskan panas dengan mengganti

bentuk planar menjadi bentuk kolom atau kapiler. Kapiler yang digunakan dibuat

dari silica yang bermuatan netral atau negative. Bagian luar kapiler dilapisi

dengan polimer agar bersifat lentur.

Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi,

dan memurnikan fragmen DNA.

Pergerakan molekul terutama tergantung di muatan yang ada pada permukaan

partikel, tanda dan besarnya muatan pembawa oleh variasi group ionogenik.

Tergantung kepada kekuatan molekul listrik dan pH dari medium dalam

mengkateristik, sehingga pemisahan molekul dapat terjadi karena efek seleksi dan

medium yang sesuai.

Prinsip

Prinsip kerja dari elektroforesis adalah adanya pergerakan komponen

bermuatan positif (+) pada kutub negatif (-) serta komponen bermuatan negatif (-)

pada kutub positif (+). Pegerakan yang terjadi disebut "elektrokinetik" . Hasil

yang didapatkan dari elektroforesis adalaha elektroforegram yang memberikan

informasi mengenai seberapa cepat perpindahan komponen (tm) atau biasa disebut

kecepatan migrasi. Besaran yang digunakan sama dengan pada proses

kromatografi.

Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang

akan dipisahkan. Teknik ini digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang

ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif.

Dari gambar diatas dapat dilihat bahwa komponen yang bermuatan positif

akan bergerak searah dengan medan listrik menuju kutub negatif. Apabila dalam

campuran terdapat dua jenis komponen, yakni (1) komponen negatif (-), dan (2)

komponen netral (N), maka komponen negatif akan bergerak menuju kutub positif

(+) sedangkan komponen netral (N) akan tetap diam. Skema alat elektroforesis

secara sederhana dapat dilihat pada gambar di bawah ini. Pada gambar tersebut

dapat dilihat komponen yang bermuatan positif akan mengalir ke arah kutub

negatif, sedangkan komponen bermuatan negatif akan mengalir ke arah kutub

positif.

Metode kerja

Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium,

kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan

muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub

positif. Laju migrasi molekul bermuatan negatif disebut elektromobilitas.

Elektromobilitas suatu molekul dipengaruhi oleh beberapa faktor, sebagaimana

yang dijabarkan oleh Switzer bahwa semakin besar muatan molekul maka

semakin besar pula elektromobilitasnya, nilai elektromobilitas berbanding terbalik

dengan besar ukuran molekul sehingga molekul dengan ukuran lebih besar

memiliki elektromobilitas yang lebih kecil bila dibandingkan dengan molekul

yang berukuran lebih kecil. Selain besar muatan dan ukuran molekul tersebut,

topologi atau bentuk molekul turut berpengaruh pula terhadap elektromolitas

suatu molekul. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz yang terkait

dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris

lingkungan.

Fe = qE

F = gaya Lorentz

q = Muatan yang dibawa oleh objek

E = Medan listrik

Kegunaan dibidang kesehatan

Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi

dan memurnikan fragmen DNA.

Elektroforesis digunakan untuk meneliti DNA dalam berbagai bidang,

misalnya dalam bidang kepolisian, teknik ini digunakan untuk pemeriksaan DNA,

setiap orang memiliki karakteristik khusus, misalnya sidik jari. Sehingga

membantu polisi dalam mengungkap sebuah kasus. Sementara itu, dalam kegiatan

biologi molekuler, elektroforesis merupakan salah satu cara untuk

memvisualisasikan keberadaan DNA, plasmid, dan produk PCR.

Keuntungan dan Kekurangan Elektroforesis

Keuntungan elektroforesis adalah merupakan teknik yang relatif murah

dan sederhana untuk menganalisa dan memurnikan macam-macambiomolekul, khususnya

protein dan asam nucleat, cepat terbentuk, dan mampu memisahkan campuran

potongan DNA sesuai dengan ukurannya secara akurat, dibanding dengan densitas

gradient sentrifugasi.

Kekurangan metode ini sulit dilakukan dengan media larutan, oleh sebab

itu digunakan gel. Media yang digunakan dapat berupa gel poliakrilamida, dapat

pula gel agarosa. Namun yang kita gunakan gelpoliakrilamida. Perbandingan gel

poliakrilamida dengan gel agarosa.

1. Gel poliakrilamida

Lebih effektif untuk pemisahan fragmen DNA antara 5-500bp

Power: ekstrim tinggi

Ukuran perbedaan DNA yang terpisah sampai 1bp

Pembuatannya lebih sulit dibanding gel agarose, karena

biasanyadigunakan poliakrilamid dengan resolusi yang tinggi.

Medan gerak secara vertikal dan listriknya konstan.

2. Gel Agarose

Power lebih rendah

Mempunyai laju pemisahan lebih cepat

Dapat memisahkan fragmen DNA antara 100bp – 50kb

tergantungdari konsentrasi gel agarose yang digunakan

Medan gerak biasanya horisontal

Contoh alat beserta gambar

a. Elektroforesis kertas

Kisah teknik pemisahan DNA/RNA ini berawal dari sekelompok ilmuwan

biokimia di awal tahun 1950-an yang sedang meneliti mekanisme molekular

DNA/RNA hidrolisis. Saat itu, tepatnya tahun 1952, Markham dan Smith

mempublikasikan bahwa hidrolisis RNA terjadi melalui mekanisme pembentukan

zat antara (intermediate) posfat siklik, yang kemudian menghasilkan nukleosida

2’-monoposfat dan 3’-monoposfat. Ternyata mereka menggunakan suatu

peralatan yang dapat memisahkan komponen campuran reaksi hidrolisis tadi,

salah satunya yaitu nukleotida ‘siklik’ yang membawa pada kesimpulan bahwa

hidrolisis RNA terjadi melalui pembentukan intermediate posfat siklik. Peralatan

itu dinamakan ‘elektroforesis’, yang dibuat dari kertas saring Whatman nomor 3,

sebuah tangki kecil dan berbagai larutan penyangga (buffer). Nukleotida yang

sudah terhidrolisis ditaruh diatas kertas saring, kemudian arus listrik dialirkan

melalui kedua ujung alat elektroforesis.

Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas

sebagai fase diam dan partikel yang terlarut sebagai fase gerak, erutama ion-ion

kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang

system pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau

valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi

elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorbsivitas zat terlarut.

Gambar Elektroforesis Kertas

Kelemahan penggunaan kertas selulosa asetat adalah: adanya gangguan

yang disebabkan oleh adanya gugus OH- yang terdapat pada selulosa yang dapat

berinteraksi dengan molekul polar sehingga daya migrasi molekul tersebut

terganggu dan menjadi lebih rendah (Harjadi 1993). Kelemahan ini dapat diatasi

dengan cara asetilasi gugus hidroksil dengan menggunakan kertas selulosa asetat

yang tidak polar. Hal ini menyebabkan migrasi molekul polar tidak terganggu,

resolusi lebih baik, dan proses pemisahan berlangsung lebih cepat.

Keuntungan penggunaan kertas selulosa asetat adalah:

proses migrasi lebih cepat

pemisahan spot menjadi lebih kecil

mudah memisahkan sampel dengan spektrofotometri

mudah dilarutkan dalam pelarut dalam jumlah sedikit.

Pada elektroforesis kertas selulosa asetat, kertas selulosa asetat harus

dibersihkan dengan cara kering dalam percobaan ini. Cara kering lebih

baik resolusinya dan spotnya lebih kecil daripada cara basah. Oleh karena

itu, percobaan ini menggunakan medium selulosa asetat.

b. Elektroforesis gel kanji

Selanjutnya teknik elektroforesis dikembangkan untuk memisahkan

biomolekul yang lebih besar. Tahun 1995 Smithies mendemonstrasikan bahwa

gel yang terbuat dari larutan kanji dapat digunakan untuk memisahkan protein-

protein serum manusia. Caranya yaitu dengan menuangkan larutan kanji panas ke

dalam cetakan plastik,setelah dibiarkan mendingin kanji tersebut akan membentuk

gel yang padat namun rapuh. Gel kanji berperan sebagai fasa diam (Stationary

phase) menggantikan kertas saring Whatman pada teknik terdahulu. Ternyata

elektroforesis gel yang diperkenalkan Smithies memicu para ilmuwan untuk

menemukan bahan kimia lain yang dapat digunakan sebagai bahan kimia lain

yang dapat digunakan sebagai bahan gel yang lebih baik, seperti agarosa dan

polimer akrilamida. Dan penemuan elektroforesis gel kanji di awal karir Smithies

membawanya menerima hadiah nobel dibidang kedokteran tahu 2007.

Gambar Elektroforesis Gel Kanji Gambar Elektroforesis Gel

Teknik elektroforesis gel makin berkembang dan disempurnakan, hingga 12

tahun kemudian ditemukan gel poliakrilamida (PAGE = Polyacrilamide Gel

Electrophoresis) yang terbentuk melalui proses polimerisasi akrilamida dan bis-

akrilamida. PAGE ini sanggup memisahkan campuran DNA/RNA atau protein

dengan ukuran lebih besar. Meskipun aplikasi elektroforesis makin berkembang

luas, namun ternyata teknik ini masih menyerah jika digunakan untuk

memisahkan DNA dengan ukuran yang super besar, misalnya DNA kromosom.

Campuran DNA kromosom tidak dapat dipisahkan meskipun ukuran mereka

berbeda-beda.

Gambar Prosedur Kerja Elektroforesis Gel

c. Pulse-Field Gel Electrophoresis (PFGE)

Pertengahan 1980-an, Schwartz dan Cantor memberitahukan ide

cerdasnya untuk memisahkan campuran DNA berukuran super besar

menggunakan teknik yang dinamakan Pulse-Field Gel Electrophoresis (PFGE),

yang menggunakan pulsa-pulsa pendek medan listrik tegak lurus yang arahnya

berganti-berganti. Teknik PFGE kini digunakan secara luas oleh para ahli biologi

dalam studi genotyping berskala masif, juga analisa epidemiologi molekular pada

patogen.

Medium pendukung

Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan medium

pendukung untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari

arus listrik yang digunakan. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan

medium pendukung yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam

nukleat. Efek penguapan juga dapat diturunkan minimal jika elektroforesis

dilakukan di medium pendukung yang dicelupkan dengan larutan buffer.

Pemisahan sempurna suatu campuran dapat terjadi efektif dalam zona

tertentu.

Meskipun medium pendukung relatif stabil (inert), komposisinya mungkin

akan menyebabkan penyerapan, migrasi elektron (elektro osmosis) atau

penyaringan berdasarkan ukuran molekulnya, yang kesemuanya

mempengaruhi kecepatan gerak senyawa.

1. Cellulose asetat

2. Larutan Buffer

Larutan buffer (penyangga) ini menstabilkan pH medium pendukung.

Buffer juga dapat mempengaruhi kecepatan gerak senyawa karena

beberapa hal, yaitu :

a. Komposisi

Buffer harus tidak mengikat senyawa yang dipisahkan karena akan

mempengaruhi kecepatan gerak. Buffer borat dipakai untuk

memisahkan karbohidrat, karena dapat membentuk gabungan yang

bermuatan listrik dengan karbohidrat.

b. Konsentrasi

Dengan naiknya kekuatan ion buffer, jumlah arus listrik yang

terbawa meningkat dan bagian aliran yang dibawa sampel

menurun, sehingga memperlambat geraknya. Kekuatan ion tinggi

dalam buffer akan meningkatkan arus keseluruhan sehingga panas

juga meningkat, biasanya dipilih 0,05 -0,10M.

c. pH

Tingkat ionisasi asam-asam organik akan bertambah apabila pH

bertambah, sebaliknya untuk basa-basa organik,oleh sebab itu

tingkat kecepatan geraknya juga terpengaruh oleh pH. Kedua

pengaruh dapat terjadi pada senyawa seperti asam aminoyang

memiliki sifat asam dan basa.

3. Medan elektrik

Apabila voltase diberikan diantara dua elektroda, arus ditentukan oleh

tahanan dalam medium.

a. Voltase

Apabila jarak antara dua elektroda adalah 1 meter dan perbedaan

potensial antara keduanya adalah V volt sehingga gradient

potensialnya adalah V/1m. Kenaikan gradient potensial akan

menyebabkan kecepatan gerak ion.

b. Aliran listrik

Arus aliran listrik dalam larutan antara dua elektroda disebabkan

umumnya oleh ion buffer dan sedikit oleh ion dalam sampel.

Kenaikan voltase akan meningkatkan jumlah muatan yang

dipindahkan setiap detik kearah elektroda. Jarak yang ditempuh ion

akan sebanding dengan waktunya.

c. Tahanan

Medium elektroforesa menimbulkan pada aliran ion sebanding

dengan jenis medium, jenis buffer dan konsentrasinya. Tahanan

akan meningkat dengan bertambahnya jarak antara elektroda,

namun berkurang dengan bertambahnya luas permukaan elektroda

dan konsentrasi ion dalam buffer.

Komponen utama alat

1. Larutan elektrolit: larutan pembawa komponen umumnya buffer

dengan pH tertentu.

2. Zat pendukung: tempat pemisahan terjadi. Biasanya berupa

kertas(selulosa asetat, selulosa nitrat), gel kanji, gel polikrilamid, busa

poliuretan, agar-agar.

3. Elektroda: dengan anoda dan katoda yang dihubungkan arus listrik.

DAFTAR PUSTAKA

Andreas Manz, et.al,. (2010). Bioanalytical Chemistry. London : Imperial College Press.

Martin, R. (1996). Gel electrophoresis nucleid acids. Oxford : Bios scientific Publisher.

Richardson. (1986). Allozyme electro-phoresis. A handbook for animal sys-tematics and population studies. San diego : Aca- demic press, inc.

Rothe, g. M. (1995). Electrophoresis of enzymes. Berlin Heidelberg : Springer - verlag.

S.M. Kopkar. (2008) . Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta : Universitas Indonesia.

Sumar Hendayana , PH.D. (2006). Kimia Pemisahan Metode kromatografi dan Elektroforesis Modern. Jakarta : PT. Remaja Rosdakarya.

Wolfe, S. L. (1995). Introduction to cell and molecular biology. Belmont : Wardworth Publishing Company.