UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK ETANOLIK DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav)
TERHADAP KULTUR SEL RAJI
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm)
Program Studi Ilmu Farmasi
Oleh :
Eva Dwi Kusumaningtyas
NIM : 048114147
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA 2008
i
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK ETANOLIK DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav)
TERHADAP KULTUR SEL RAJI
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm)
Program Studi Ilmu Farmasi
Oleh :
Eva Dwi Kusumaningtyas
NIM : 048114147
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA 2008
ii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PERSETUJUAN PEMBIMBING
UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK ETANOLIK DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav)
TERHADAP KULTUR SEL RAJI
Yang diajukan oleh :
Eva Dwi Kusumaningtyas
NIM : 048114147
telah disetujui oleh
iii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Pengesahan Skripsi Berjudul
UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK ETANOLIK
DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav) TERHADAP KULTUR SEL RAJI
Oleh :
Eva Dwi Kusumaningtyas
NIM : 048114147
Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma pada tanggal : 28 Juni 2008
iv
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
HALAMAN PERSEMBAHAN
Aku menanti datangnya pagi
Dan aku temui Aku menanti bergantinya hari
Dan aku temui Aku menanti musim berganti
Dan aku temui Aku mencari hati Dan aku dapati
Tiada kata yang bisa terucap selain terimakasih Dan tiada hal yang dapat kuingat selain KASIH
Skripsi Ini kupersembahkan Untuk : Papa dan Mamaku tercinta.... Kakakku terkasih.... Saudara dan teman – temanku.... Almamaterku...
v
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS
Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma :
Nama : Eva Dwi Kusumaningtyas Nomor Mahasiswa : 048114147
Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul : “Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Piper Crocatum Ruiz & Pav) terhadap Kultur Sel Raji” beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, me-ngalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di Internet atau media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis. Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya. Dibuat di Yogyakarta Pada tanggal : 18 Juli 2008 Yang menyatakan
( Eva Dwi Kusumaningtyas )
v
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yesus Kristus atas semua
rahmat dan karuniaNya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan
penulisan skripsi yang berjudul “Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih
Merah (Piper Crocatum Ruiz & Pav) terhadap Kultur Sel Raji.” Skripsi ini
disusun dalam rangka memenuhi salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Farmasi (S.Farm).
Selama penelitian dan penyusunan skripsi ini, penulis tidak terlepas dari
bantuan dan dukungan berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis mengucapkan
terimakasih kepada :
1. Rita Suhadi, M.Si., Apt selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata
Dharma.
2. Drs. A. Yuswanto S.U., Ph.D., Apt. selaku dosen pembimbing atas
kesediaannya dalam memberikan arahan, dukungan dan masukan dalam
penelitian dan penulisan skripsi ini.
3. Drs. Mulyono., Apt. selaku dosen penguji yang telah banyak memberikan
masukan kepada penulis.
4. Yohanes Dwiatmaka, M.Si. selaku dosen penguji yang telah banyak
memberikan masukan kepada penulis.
5. Ibu Tri Yuliani dan segenap karyawan LPPT Universitas Gadjah Mada yang
telah banyak membantu dalam pelaksanaan penelitian.
vi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vii
6. Ign. Y. Kristio Budiasmoro, M.Si., dan Romo Sunu yang telah membantu
penyelesaian skripsi ini.
7. Papa dan Mamaku tercinta, Kakakku Petra, Mbak Dwi, dek Pasha, Andreas
Bob Dwi Putra dan segenap keluarga besar atas semua dukungan, kasih
sayang dan semangat yang diberikan.
8. Anggota team sirih merah : Ririt, Meri, Siska dan Nur, terimakasih untuk
kerjasama dan bantuannya, serta suka dan duka dalam masa ‘penantian’.
9. Rike, Bu Novi dan temen – temen GTY, Mbak Darti sekeluarga, Bapak
Narkoyo sekeluarga yang selalu memberikan dukungan.
10. Teman - teman kosku Yanti, Dewi, Ayu, Wulan, teman – teman kelas C dan
praktikum golongan F, Vina, Syamsi, Mas Adi, Robert, Finza, Budiaji, Maria,
Siska, Evi, Dhita, Mas Ary, Yusak, Hendrat, Kornel untuk pengertian dan
dukungan yang diberikan serta persahabatan kita.
11. Semua pihak yang turut membantu dalam penyusunan skripsi ini.
Penulis menyadari masih banyak kekurangan yang terdapat dalam
penelitian dan penyusunan skripsi ini. Oleh karena itu penulis mengharapkan
kritik dan saran yang menyempurnakan. Semoga penulisan skripsi ini dapat
memberikan manfaat bagi semua pihak serta mendukung perkembangan ilmu
pengetahuan.
Yogyakarta, Mei 2008
Penulis
Eva Dwi Kusumaningtyas
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA
Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini tidak
memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam
kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah.
Yogyakarta, 10 Mei 2008 Penulis
Eva Dwi Kusumaningtyas
viii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
INTISARI
Di Indonesia, kanker merupakan salah satu penyakit yang masih berpotensi tinggi dalam menyebabkan kematian. Secara empiris, tanaman sirih merah (Piper crocatum) telah digunakan oleh masyarakat sebagai obat antikanker. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui potensi efek sitotoksik dan nilai LC50 ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel Raji.
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental murni dengan rancangan lengkap pola satu arah. Ekstrak etanolik daun sirih merah dibuat dalam delapan konsentrasi yaitu 250; 500; 750; 1000; 1250; 1500; 1750; 2000 µg/ml. Uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah dilakukan dengan metode direct counting. Perolehan hasil perhitungan merupakan persen kematian sel yang kemudian dilakukan analisis statistik menggunakan Anova satu arah dan analisis probit untuk menentukan nilai LC50.
Melalui uji sitotoksisitas yang dilakukan dapat diketahui bahwa ekstrak etanolik daun sirih merah mempunyai efek sitotoksik terhadap kultur sel Raji, dengan nilai LC50 395,5 µg/ml. Kata kunci : sitotoksisitas, ekstrak etanolik, daun sirih merah, LC50, sel Raji
ix
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ABSTRACT
In Indonesia, cancer is a kind of the disease that might cause death.
Empiricaly, Piper crocatum Ruiz & Pav has been used for cancer treatment. The objective of this research is to identify the cytotoxicity potential and the LC50 of ethanolic extract of Piper crocatum Ruiz & Pav against Raji Cell Culture.
This research was pure experimental with one way completely randomized design. Ethanolic extract of Piper crocatum Ruiz & Pav was made on eight concentration, that were 250; 500; 750; 1000; 1250; 1500; 1750 and 2000 µg/ml. The cytotoxicity test have been done with the direct counting method. Cytotoxicity of ethanolic extract of Piper crocatum Ruiz & Pav were analyzed with one way Anova and the LC50 value were analyzed with probit statistic.
The result showed that the extract of Piper crocatum Ruiz & Pav have cytotoxicity effect on Raji cell culture with LC50 value of 395.5 µg/ml.
Keyword : cytotoxicity, ethanolic extract, Piper crocatum Ruiz & Pav, LC50, Raji cell culture
x
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN SAMPUL ............................................................................................ i
HALAMAN JUDUL............................................................................................... ii
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .................................................... iii
PENGESAHAN SKRIPSI ..................................................................................... iv
HALAMAN PERSEMBAHAN................................................................... ...........v
PRAKATA............................................................................................................. vi
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .............................................................. viii
INTISARI............................................................................................................... ix
ABSTRACT ...............................................................................................................x
DAFTAR ISI.......................................................................................................... xi
DAFTAR TABEL..................................................................................................xv
DAFTAR GAMBAR ........................................................................................... xvi
DAFTAR LAMPIRAN...................................................................................... xviii
BAB I PENGANTAR..............................................................................................1
A. Latar Belakang ................................................................................................1
1. Perumusan Masalah................................................................................2
2. Keaslian karya ........................................................................................3
3. Manfaat penelitian ..................................................................................3
B. Tujuan Penelitian ............................................................................................3
1. Tujuan umum..........................................................................................3
2. Tujuan khusus.........................................................................................3
xi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xii
BAB II PENELAAHAN PUSTAKA.......................................................................4
A. Sirih Merah...................................................................... .............................. 4
1. Keterangan Botani ......................................................................................4
2. Deskripsi Tanaman .....................................................................................4
3. Kandungan Kimia.......................................................................................4
4. Khasiat dan Kegunaan ................................................................................5
B. Teknik Penyarian…………............................................................................ 5
C. Kanker .............................................................................................................7
1. Tinjauan Umum..........................................................................................7
2. Limfoma ...................................................................................................10
D. Kultur Sel ......................................................................................................10
E. Sitotoksisitas .................................................................................................11
F. Landasan Teori..............................................................................................12
G. Hipotesis........................................................................................................13
BAB III METODOLOGI PENELITIAN...............................................................14
A. Jenis dan Rancangan Penelitian ....................................................................14
B. Variabel dan Definisi Operasional ................................................................14
a. Variabel ....................................................................................................14
1. Variabel bebas......................................................................................14
2. Variabel tergantung..............................................................................14
3. Variabel pengacau terkendali...............................................................14
b. Definisi operasional .................................................................................14
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiii
C. Alat dan Bahan..............................................................................................15
1. Alat .......................................................................................................15
2. Bahan ....................................................................................................15
D. Tata Cara Penelitian ......................................................................................16
1. Determinasi tanaman ............................................................................16
2. Pengumpulan daun sirih merah ............................................................16
3. Pembuatan serbuk daun sirih merah.....................................................16
4. Sterilisasi alat........................................................................................17
5. Pembuatan ekstrak etanolik daun sirih merah ......................................17
6. Pembuatan larutan uji ...........................................................................17
7. Pembuatan medium pencuci dan medium penumbuh ..........................18
a. Pembuatan medium pencuci .............................................................18
b. Pembuatan medium penumbuh ........................................................18
8. Preparasi kultur sel Raji........................................................................18
a. Propagasi sel raji ...............................................................................18
b. Panen sel raji.....................................................................................19
9. Uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah dengan
menggunakan metode direct counting .................................................19
E. Analisis Hasil ................................................................................................20
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ...............................................................21
A. Determinasi Tanaman ...................................................................................21
B. Pengumpulan daun sirih merah.....................................................................21
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiv
C. Pembuatan serbuk daun sirih merah .............................................................22
D. Pembuatan Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah ...........................................22
E. Sterilisasi Alat ...............................................................................................24
F. Pembuatan Medium Pencuci dan Penumbuh............ ....................................24
G. Preparasi Kultur Sel Raji...............................................................................25
H. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah..................................26
BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN................................................................33
A. Kesimpulan ...................................................................................................33
B. Saran..............................................................................................................33
DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................34
LAMPIRAN...........................................................................................................37
BIOGRAFI PENULIS ...........................................................................................52
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel I. Pelarut dan tingkat kepolaran.................................................................7
Tabel II. Hasil perhitungan sel raji secara direct counting pada perlakuan
masing-masing konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah setelah
inkubasi 24 jam ....................................................................................27
Tabel III. Persentase kematian sel raji dan harga probit setelah pemberian ekstrak
etanolik daun sirih merah setelah inkubasi 24 jam ..............................29
Tabel IV. Harga probit sesuai dengan prosentasenya ..........................................42
Tabel V. Nilai koefisien korelasi pada level signifikansi 5% dan 1%................50
xv
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1. Sel Raji pada kontrol dan sel Raji dengan pemberian ekstrak etanolik
daun sirih merah 2000 µg/ml, pada bilik haemocytometer di bawah
mikroskop dengan perbesaran 100x...................................................26
Gambar 2. Sel raji yang mati seluruhnya pada pemberian ekstrak dengan
konsentrasi 2000 µg/ml; sel raji pada pemberian ekstrak dengan
konsentrasi 250 µg/ml, pada perbesaran 100x ...................................27
Gambar 3. Kontrol pada perbesaran 100x, tidak terdapat kematian sel raji ........28
Gambar 4. Grafik pengaruh konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah
terhadap persentase kematian sel Raji ..........................................28
Gambar 5. Grafik hubungan log konsentrasi ekstrak terhadap harga probit pada
penetapan I .........................................................................................30
Gambar 6. Grafik hubungan log konsentrasi ekstrak terhadap harga probit pada
penetapan II........................................................................................31
Gambar 7. Grafik hubungan log konsentrasi ekstrak terhadap harga probit pada
penetapan III ......................................................................................31
Gambar 8. Tanaman Sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.).........................38
Gambar 9. 96 well Plate dan conical steril..........................................................38
Gambar 10. Kultur sel raji dalam flask ..................................................................38
Gambar 11. Laminar air flow.................................................................................39
Gambar 12. Haemocytometer dan cell counter......................................................39
Gambar 13. Inverted microscope ...........................................................................39
xvi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xvii
Gambar 14. Sel raji dengan pemberian ekstrak 1750 µg/ml..................................40
Gambar 15. Sel raji dengan pemberian ekstrak 1500 µg/ml..................................40
Gambar 16. Sel raji dengan pemberian ekstrak 1250 µg/ml..................................40
Gambar 17. Sel raji dengan pemberian ekstrak 1000 µg/ml..................................41
Gambar 18. Sel raji dengan pemberian ekstrak 750 µg/ml....................................41
Gambar 19. Sel raji dengan pemberian ekstrak 500 µg/ml....................................41
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Hasil determinasi .................................................................................7
Lampiran 2. Peralatan dan bahan yang digunakan dalam penelitian .....................38
Lampiran 3. Sel raji dengan pemberian ekstrak setelah inkubasi 24 jam ..............40
Lampiran 4. Tabel probit........................................................................................42
Lampiran 5. Perhitungan LC50 ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur
sel raji ...............................................................................................43
Lampiran 6. Perhitungan nilai korelasi LC50 ekstrak etanolik daun sirih merah
terhadap sel Raji pada taraf kepercayaan 95%.................................50
Lampiran 7. Tes distribusi normal Kolmogorov-Smirnov.....................................51
Lampiran 8. Analisis statistik Anova satu arah......................................................51
xviii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
BAB I
PENGANTAR
A. Latar Belakang
Kanker merupakan salah satu penyakit yang berpotensi tinggi dalam
menyebabkan kematian dan bertanggung jawab atas satu dari setiap lima
kematian. Di Indonesia, kanker menempati peringkat keenam setelah penyakit
jantung dan jumlah pasien kanker mengalami peningkatan setiap tahun (Adamo,
2006). Pengobatan terhadap kanker dapat dilakukan dengan cara pembedahan,
kemoterapi dan radioterapi. Alternatif lain yang digunakan oleh sebagian
penderita kanker adalah melalui ramuan tradisional dari tanaman. Pengembangan
dan pemanfaatan bahan alam terutama tanaman telah berlangsung lama di
Indonesia yang kaya akan tumbuh – tumbuhan (Dalimartha, 2006). Masyarakat
dengan latar belakang budaya dan etniknya, lazim menggunakan obat tradisional
dengan memanfaatkan bahan alam tersebut yang disebut dengan jamu. Namun
penggunaan tanaman sebagai obat biasanya masih terbatas secara tradisional dan
turun temurun berdasarkan pengalaman.
Tanaman sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) mempunyai bentuk
yang menarik dan dapat berfungsi sebagai antikejang, antiseptik, analgetik,
antiketombe, antidiabetes, pelindung hati, antidiare, mempertahankan kekebalan
tubuh dan penghilang bengkak serta berbagai macam radang, dan yang paling
menarik adalah pemakaian empiris ekstrak yang diklaim dapat menyembuhkan
penyakit kanker payudara dan kanker rahim (Sudewo, 2005). Pemanfaatan daun
1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
2
sirih merah sebagai obat kanker telah diakui secara empiris, baik digunakan secara
tunggal maupun dikombinasikan dengan tanaman lain dalam berbagai bentuk
seperti rebusan dan kapsul. Akan tetapi, secara ilmiah belum terdapat bukti yang
mendukung mengenai kebenaran aktivitas tanaman sirih merah sebagai obat
antikanker.
Mengacu pada klaim khasiat bahwa ekstrak daun sirih merah tersebut
dapat mengobati penyakit kanker payudara dan kanker rahim, maka perlu
dilakukan penelitian mengenai potensi ekstrak daun sirih merah terhadap penyakit
kanker yang lain. Dari hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan
gambaran mengenai potensi efek sitotoksik ekstrak etanolik daun sirih merah
terhadap kultur sel kanker limfoma.
1. Perumusan Masalah
Uji sitotoksisitas dapat dilakukan secara in vitro dengan menggunakan
suatu kultur sel. Kultur sel Raji merupakan kultur sel kanker yang diturunkan dari
penyakit Limfoma Burkitt. Berdasarkan latar belakang dari penelitian maka
timbul beberapa permasalahan, yaitu :
a. Apakah ekstrak etanolik daun sirih merah memiliki efek sitotoksik terhadap
kultur sel Raji ?
b. Berapakah nilai LC50 ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel
Raji?
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
3
2. Keaslian Karya
Sejauh ini, penulis belum menemukan adanya penelitian mengenai uji
sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav)
terhadap kultur sel Raji di Universitas Sanata Dharma dan Universitas Gadjah
Mada Yogyakarta.
3. Manfaat Penelitian
a. Manfaat Teoritis
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan dan memperkaya
informasi mengenai daya sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah
terhadap kultur sel Raji.
b. Manfaat Praktis
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan suatu alternatif untuk
pengobatan kanker dengan memanfaatkan bahan alam.
B. Tujuan Penelitian
1. Tujuan Umum
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui potensi sitotoksik dari
ekstrak etanolik daun sirih merah.
2. Tujuan Khusus
a. Untuk mengetahui potensi sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah
terhadap kultur sel Raji.
b. Untuk mengetahui nilai LC50 ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur
sel Raji.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA
A. Sirih Merah
1. Keterangan Botani
Tanaman sirih merah termasuk ke dalam famili Piperaceae dan genus
Piper, memiliki nama spesies Piper crocatum Ruiz & Pav, serta sinonim dengan
Piper ornatum N.E.Br (Anonim, 2007a).
2. Deskripsi Tanaman
Tanaman sirih merah tumbuh menjalar seperti halnya sirih hijau.
Batangnya bulat berwarna hijau keunguan dan tidak berbunga. Daunnya
bertangkai membentuk jantung dengan bagian atas meruncing, bertepi rata dan
permukaannya mengkilap atau tidak berbulu. Panjang daunnya bisa mencapai 15
sampai dengan 20 cm. Warna daun bagian atas hijau bercorak warna putih keabu
– abuan. Bagian bawah daun berwarna merah hati cerah. Daunnya berlendir,
berasa sangat pahit dan beraroma wangi khas sirih. Batangnya beruas dengan
jarak buku 5 – 10 cm, di setiap buku tumbuh bakal akar (Sudewo, 2005).
3. Kandungan Kimia
Dari hasil penelitian berupa uji tabung dan uji kromatografi lapis tipis
diketahui daun sirih merah mengandung senyawa flavonoid, alkaloid, senyawa
polifenolat, tanin dan minyak atsiri (Sudewo, 2005).
4
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
5
4. Khasiat dan Kegunaan
Dalam penggunaan secara empiris ekstrak daun sirih merah pada
pemakaian tunggal atau dikombinasikan dengan tanaman obat lainnya mampu
mengobati penyakit seperti diabetes mellitus, peradangan akut pada organ tubuh
tertentu, luka yang sulit sembuh, kanker payudara dan kanker rahim, leukemia,
TBC, radang pada lever, lemah sahwat, ambeien, jantung koroner, darah tinggi
dan asam urat (Sudewo, 2005).
B. Teknik Penyarian
Ekstraksi atau penyarian adalah kegiatan penarikan kandungan kimia
yang dapat larut sehingga terpisah dari bahan yang tidak dapat larut dengan
pelarut air. Hal – hal yang perlu diperhatikan dalam pembuatan ekstrak meliputi
pembuatan serbuk simplisia dan klasifikasinya, cairan penyari, pemekatan,
pengeringan ekstrak dan rendemen (Anonim, 2000).
Ekstrak merupakan sediaan pekat yang diperoleh dengan mengekstraksi
zat aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang
sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau
serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang telah
ditetapkan (Anonim,1995). Pada ekstrak tumbuhan (umumnya konsentrasi
etanolnya berbeda – beda) jika bahan pengekstrasinya sebagian atau seluruhnya
diuapkan, maka diperoleh ekstrak, yang dikelompokkan menurut sifat – sifatnya
menjadi :
a. Ekstrak encer (extractum tenue). Merupakan ekstrak dengan konsistensi yang
dapat dituang.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
6
b. Ekstrak kental (extractum spissum). Ekstrak ini liat dalam keadaan dingin dan
tidak dapat dituang. Kandungan airnya berjumlah sampai 30%. Jika
kandungan air terlalu tinggi maka dapat menyebabkan suatu instabilitas bahan
(tumbuhnya bakteri).
c. Ekstrak kering (extractum siccum). Memiliki konsistensi kering dan mudah
digosokkan. Melalui penguapan cairan pengekstraksi dan pengeringan
terbentuk suatu produk, biasanya menunjukkan kandungan lembab tidak lebih
dari 5%.
d. Ekstrak cair (extractum fluidum). Diartikan sebagai suatu sediaan cair
simplisia yang mengandung etanol sebagai pelarut atau sebagai pengawet atau
sebagai pelarut dan pengawet (Voigt, 1994; Anonim, 1995)
Pengetahuan mengenai kandungan senyawa aktif yang terkandung dalam
simplisia akan mempermudah pemilihan cairan penyari dan cara ekstraksi yang
tepat (Anonim, 2000). Pemilihan cairan penyari harus meliputi beberapa kriteria,
antara lain adalah murah dan mudah diperoleh, stabil secara kimia fisika, selektif
yaitu hanya menarik zat berkhasiat yang dikehendaki, tidak mempengaruhi zat
berkhasiat dan diperbolehkan oleh peraturan. Cairan penyari yang digunakan
dapat berupa air, etanol, etanol – air atau pelarut lain. Oleh karena banyak bahan
tumbuhan larut air atau larut alkohol, maka air atau etanol lebih disukai
penggunaannya sebagai cairan pengekstraksi (Voigt, 1994). Bila cairan penyari
digunakan air, maka untuk mencegah timbulnya kapang ditambahkan bahan
pengawet yang diberikan pada awal penyarian (Anonim, 1986).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
7
Tabel I. Pelarut dan Tingkat Kepolaran Pelarut Tingkat
Kepolaran Air 10,2
DMSO 7,2
Etanol 4,3
Etil Asetat 4,4
Maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana. Maserasi dilakukan
dengan cara merendam serbuk simplisia ke dalam cairan penyari. Metode ini
digunakan untuk penyarian simplisia yang mengandung zat aktif yang mudah
larut dalam cairan penyari. Kerusakan senyawa yang tidak tahan panas dapat
dihindari dengan metode ini (Anonim, 1986).
C. Kanker
1. Tinjauan Umum
Proliferasi sel terjadi melalui suatu rangkaian proses. Siklus dari sel
sendiri terdiri dari fase mitosis dan interfase. Pada proses interfase tersebut sel
akan mengalami fase G-1 yang merupakan permulaan dari replikasi asam
deoksiribonukleat (DNA). Kemudian melalui fase S yaitu pembentukan DNA
baru, jumlah kromosom akan berlipat dua dan terjadi persiapan ke tahapan
selanjutnya. Fase G-2 merupakan fase pertumbuhan, kromosom yang terbentuk
dari proses ini sudah ada dalam bentuk kromatida (Mutschler, 1999).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
8
Kanker adalah suatu penyakit dimana terjadi pertumbuhan sel – sel
jaringan tubuh yang tidak normal, cepat dan tidak terkendali. Dalam keadaan
normal, sel hanya akan membelah jika tubuh membutuhkannya seperti mengganti
sel rusak dan mati. Sebaliknya, sel kanker akan terus membelah diri meskipun
tidak dibutuhkan, terlepas dari pengendalian pertumbuhan dan tidak lagi menuruti
hukum – hukum pembiakan (Dalimarta, 2006). Sifat dari sel kanker adalah
mempunyai kemampuan untuk bermigrasi dari tempatnya tumbuh ke jaringan di
dekatnya (invasif) dan membentuk massa pada daerah baru di dalam tubuh
(metastasis). Kanker terdiri dari sel ganas, menjadi lebih agresif dari waktu ke
waktu dan menjadi letal apabila jaringan atau organ yang diperlukannya untuk
bertahan hidup mengalami gangguan (Sofyan, 2000).
Penyebab dari kanker dapat berupa inveksi virus maupun faktor – faktor
yang menginduksi penyakit oleh perubahan gen –gen secara mutasi. Mutasi
merupakan perubahan yang terjadi pada gen atau pada kromosom. Beberapa buah
mutasi mungkin dibutuhkan untuk mengubah sel normal menjadi sel kanker.
Mutasi-mutasi tersebut sering diakibatkan agen kimia maupun fisik yang disebut
karsinogen. Mutasi dapat terjadi secara spontan (diperoleh) ataupun diwariskan
(mutasi germline). Bila sel kehilangan kemampuan untuk melakukan apoptosis
(misalnya karena mutasi), atau bila inisiatif untuk melakukan apoptosis dihambat
(oleh virus), sel yang rusak dapat terus membelah tanpa terbatas, yang akhirnya
menjadi kanker. Apoptosis dapat terjadi misalnya ketika sel mengalami kerusakan
yang sudah tidak dapat diperbaiki lagi. Keputusan untuk melakukan apoptosis
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
9
berasal dari sel itu sendiri, dari jaringan yang mengelilinginya, atau dari sel yang
berasal dari sistem imun (Anonim, 2007b).
Terjadinya kanker disebut pula dengan karsinogenesis. Dalam prosesnya
dibagi menjadi beberapa tahapan berupa :
a. Tahap inisiasi, sebagai tahap awal yang mengakibatkan terjadinya perubahan
genetik sehingga menyebabkan abnormalitas proliferasi sel tunggal. Pada
perubahan ini seringkali disebabkan karena mutasi atau pengaruh zat – zat
yang bersifat karsinogen.
b. Tahap promosi, sel tumbuh sangat pesat yang pada akhirnya menjadi tumor
benigna.
c. Tahap progresi, neoplasma akan berkembang menjadi bersifat ganas, biasanya
diikuti invasi sel tumor ke dalam jaringan setempat dan dapat terjadi proses
metastasis.
d. Tahap metastasis akan mengakibatkan penyebaran sel neoplastik dari tempat
tumor utama menuju tempat yang lebih jauh (Schneider, 1997).
Sel kanker dikenal oleh tubuh sebagai bahan asing, sehingga mekanisme
imunologi tubuh akan bereaksi secara humoral maupun seluler. Tubuh
mempunyai kemampuan immunosurveillance terhadap semua sel kanker maupun
sel yang bermutasi untuk mencegah perkembangan sel kanker tersebut, namun
terkadang terjadi immunological escape yaitu sel kanker luput dari pengawasan
sistem imun, sehingga terjadilah kanker. Penderita kanker sendiri juga mengalami
supresi imun, tetapi kanker juga mempengaruhi sistem imun itu sendiri (Nafrialdi,
1995).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
10
2. Limfoma
Limfoma adalah kanker yang berasal dari jaringan limfoid mencakup
sistem limfatik dan imunitas tubuh. Kelainan umum yang sering menyertai adalah
pembesaran kelenjar limfe dan terdapat kelainan sumsum tulang. Dalam praktek
yang dimaksud dengan limfoma adalah LH (Limfoma Hodgkin) dan LNH
(Limfoma Non Hodgkin). Pada LNH disebabkan oleh rangsangan imunologik
yang menimbulkan proliferasi jaringan limfoid yang tidak terkendali (Tambunan,
2003).
D. Kultur Sel
Kultur sel merupakan keadaan dimana sel prokariotik maupun eukariotik
berada dalam kondisi yang terkontrol. Sedangkan kultur primer adalah sel yang
diisolasi dari suatu jaringan maupun organ aslinya kemudian ditumbuhkan dalam
kultur media secara invitro dan dikondisikan sama seperti pada saat sel masih
berada dalam jaringan aslinya (Freshney, 2000). Pemeriksaan kultur ini dapat
dilakukan dengan pengamatan morfologi sel, warna medium dan kepadatan sel
(Wolf, 2006). Pemindahan sel ke dalam flask baru dengan medium yang baru
disebut dengan subkultur (Freshney, 2000).
Sel Raji merupakan continous cell line yang berasal dari sel β – limfoma
manusia. Dikenalkan pada tahun 1964 yang diturunkan dari penyakit Limfoma
Burkitt yang diderita oleh seorang anak laki – laki berusia 11 tahun. Penyakit ini
dihubungkan dengan infeksi oleh virus Epstein Barr yaitu virus DNA yang
menimbulkan ploriferasi pada sel – sel β normal. Protein virus ini menginaktivasi
p53 sehingga dapat meningkatkan proliferasi karena DNA yang rusak tetap
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
11
mengalami pembelahan secara berkelanjutan (King, 2000). Bentuk morfologi dari
sel Raji berupa sel tunggal berbentuk lingkaran yang terkadang dalam bentuk
berkelompok. Sifat yang dimiliki sel raji adalah tidak melekat pada dinding atau
dasar sumuran namun melayang di dalam cairan media (Anonim, 2007c).
E. Sitotoksisitas
Sitotoksisitas dapat didefinisikan sebagai sifat beracun suatu senyawa
terhadap sel hidup. Uji sitotoksisitas dapat dilakukan secara invitro menggunakan
kultur sel di dalam mengevaluasi keamanan obat, makanan, kosmetik maupun
bahan – bahan kimia yang lain (Freshney, 1986).
Penggunaan haemocytometer sangat umum dan sering dipakai dalam
penghitungan sel karena efisien dan akurat. Suatu chamber hitung yang kaku
berbentuk kotak dan memiliki kedalaman 0,1 mm digunakan sebagai media bantu
dalam penghitungan sel. Pada saat chamber telah terisi dengan suspensi sel, dapat
dilakukan pengamatan di bawah mikroskop dan sel dihitung pada sejumlah bilik
yang dipilih pada haemocytometer. Dari perhitungan yang dilakukan, dapat
ditentukan jumlah sel per ml dari suspensi sel tersebut. Untuk mengetahui sel
yang hidup maupun yang mati dapat digunakan zat penanda seperti trypan blue.
Pada metode ini perlu diperhatikan pada saat pengisian suspensi sel ke dalam
chamber pada haemocytometer agar tidak terjadi gelembung yang dapat
menyebabkan terjadinya kesalahan dalam perhitungan sel. Kondisi lain yang
menentukan keakuratan dalam perhitungan sel adalah kebersihan bilik hitung
yang digunakan dan ketepatan dalam pengisian suspensi sel ke dalam chamber
(Doyle and Griffiths, 2000).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
12
F. Landasan Teori
Efek flavonoid terhadap macam – macam organisme sangat banyak
macamnya, hal ini mengakibatkan tumbuhan yang mengandung flavonoid banyak
dipakai dalam pengobatan tradisional. Flavonoid telah menunjukkan perannya
sebagai antioksidan, antimutagenik, antineoplastik, dan aktivitas vasodilatator.
Potensi antioksidan flavonoid dapat digunakan untuk mencegah kerusakan
oksidatif pada pengendalian sejumlah penyakit (Miller, 1999). Selain itu juga
diketahui bahwa terdapat senyawa flavonoid mampu menghambat DNA
polimerase Tiga senyawa flavonoid alam telah diisolasi menggunakan etil asetat,
yang berasal dari fraksinasi S. feruginosa, yaitu kuersetin, kuersetrin, dan flavonol
glikosida 4-O-asetil kuersetrin memiliki daya sitotoksik pada kultur jaringan
kanker glioblastoma manusia (Miller, 1999).
Pada umumnya alkaloid merupakan senyawa yang tidak berwarna,
kelarutannya sangat bervariasi tergantung struktur dan bentuknya dalam
tumbuhan (Roberts, 1998). Beberapa alkaloid telah diketahui memiliki aktivitas
antikanker melalui interaksi dengan target seperti RNA polimerase dan DNA
topoisomerase (Sukardiman, 2003). Senyawa alkaloid yang terkandung di dalam
tanaman seperti senyawa vinkristin dan vinblastin dapat menghambat RNA
polimerase, vinblastin berperan dalam penghambatan pembelahan sel yaitu pada
tahap metafase. Ekstraksi dari senyawa alkaloid dalam tanaman dapat dilakukan
dengan menggunakan pelarut etanol atau etil asetat melalui metode ekstraksi yang
sesuai (Roberts, 1998).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
13
G. Hipotesis
Ekstrak etanolik daun sirih merah mempunyai efek sitotoksik terhadap
kultur sel Raji.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan penelitian
Penelitian mengenai uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah
(Piper crocatum Ruiz & Pav) terhadap kultur sel Raji ini termasuk penelitian
eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola satu arah.
B. Variabel dan Definisi Operasional
1. Variabel
a. Variabel Bebas
Konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah yaitu 250; 500; 750; 1000;
1250; 1500; 1750; 2000 µg/ml.
b. Variabel Tergantung
Persentase kematian sel Raji.
c. Variabel Pengacau Terkendali
i. Tempat tumbuh dan waktu pemanenan daun sirih merah dikendalikan
dengan memanen daun sirih merah pada tempat dan waktu yang sama.
ii. Medium tumbuh sel Raji dikendalikan dengan menggunakan medium RPMI
1640-serum.
2. Definisi Operasional
a. Sitotoksisitas ialah sifat toksik atau beracun dari ekstrak etanolik daun sirih
merah terhadap kultur sel Raji.
14
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
15
b. LC50 ialah konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah yang mampu
membunuh atau dapat menyebabkan kematian sejumlah 50% sel uji (sel Raji)
dan dinyatakan dalam µg/ml.
c. Ekstrak etanolik daun sirih merah adalah ekstrak yang diperoleh dengan cara
mengekstraksi daun sirih merah secara maserasi dengan penyari etanol 70%.
C. Alat dan Bahan
1. Alat
Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: alat - alat gelas,
timbangan analitik (Mettler Toledo), alumunium foil, tabung conical (Nunc),
autoklaf, tissue culture flask (Nunc), swing rotor centrifuge, inkubator
(inco 2 memmert), mikropipet, lemari pendingin (Sharp), cell counter
(togoshiseiki), 96-well plate (Nunc), laminar air flow (Labconco), inverted
microscope (Olympus IMT-2), mikroskop (Olympus), haemocytometer (Neubauer
Improved), tissue, glove, masker, waterbath, yellow tip, blue tip, effendorf,
blender, oven, ayakan.
2. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini ialah :
a. Daun sirih merah
b. Kultur sel Raji yang diambil dari stok Laboratorium Penelitian dan Pengujian
Terpadu (LPPT) Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
c. Etanol 70% (bahan penyari daun sirih merah)
d. Dimethyl Sulfoxide (DMSO), Sigma
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
16
e. Trypan blue
f. Aquabidest
g. Media pencuci: RPMI 1640 (Gibco), natrium bikarbonat, Hepes
h. Media penumbuh: RPMI 1640 (Gibco), FBS (Foetal Bovine Serum)
10%(Gibco), Penisilin Streptomisin 2% (Gibco), dan Fungison 0,5% (Gibco).
D. Tata Cara Penelitian
1. Determinasi Tanaman
Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun sirih
merah yang telah dideterminasi di Laboratorium Biologi Farmasi, Fakultas
Farmasi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta menggunakan acuan baku Backer
dan Brink (1965).
2. Pengumpulan Daun Sirih Merah
Daun sirih merah yang digunakan dalam penelitian diambil dari daerah
Desa Mantenan, Kecamatan Mertoyudan, Kabupaten Magelang, Propinsi Jawa
Tengah.
3. Pembuatan Serbuk Daun Sirih Merah
Daun sirih merah segar dicuci menggunakan air mengalir dan ditiriskan
sehingga sisa air menghilang. Untuk proses pengeringan digunakan oven pada
suhu 60 – 70 °C. Hasil pengeringan diserbuk menggunakan blender dan diayak
dengan pengayak 0,75 mm. Serbuk yang diperoleh disimpan dalam botol
berwarna coklat.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
17
4. Sterilisasi Alat
Alat – alat yang akan digunakan dicuci bersih menggunakan deterjen,
dibilas menggunakan air mengalir dan dikeringkan. Masing – masing dibungkus
menggunakan alumunium foil dan disterilkan dalam autoklaf selama 20 menit
pada suhu 121°C dengan tekanan 2,05 abs bar (Hagman, 2005).
5. Pembuatan Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah
Serbuk kering daun sirih merah ditimbang sebanyak 100 gram kemudian
dimaserasi menggunakan 700 ml larutan penyari etanol 70%. Kemudian ditutup
dan dibiarkan selama 24 jam terlindung dari cahaya matahari. Setelah 24 jam sari
diserkai, disaring, ampas diperas. Ampas yang diperoleh kemudian ditambah
cairan penyari secukupnya, diaduk dan diserkai sehingga diperoleh seluruh sari
sebanyak 100 bagian. Bejana ditutup, dibiarkan di tempat sejuk dan terlindung
dari cahaya, rendaman harus dikocok berulang-ulang (kira-kira 3x sehari). Setelah
2 hari maserat disaring dengan kertas saring kemudian ditampung. Maserat yang
terkumpul kemudian dipekatkan di atas waterbath dengan suhu 60-65oC dibantu
dengan kipas angin hingga diperoleh ekstrak kental.
6. Pembuatan larutan uji
Ekstrak etanolik daun sirih merah ditimbang sebanyak 0,1 g, dilarutkan
dengan DMSO dan diaduk sampai homogen untuk mendapatkan sediaan ekstrak
induk dengan konsentrasi 100 mg/ml. Dari sediaan ekstrak induk tersebut, dibuat
sediaan uji, dengan konsentrasi sebesar 250 µg/ml, 500 µg/ml, 750 µg/ml, 1000
µg/ml, 1250 µg/ml, 1500 µg/ml, 1750 µg/ml, dan 2000 µg/ml.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
18
7. Pembuatan Medium Pencuci dan Medium Penumbuh
a. Pembuatan medium pencuci
RPMI 1640 dilarutkan dalam aquabidest kurang lebih 80 ml,
ditambahkan 2,3 gram natrium bikarbonat dan 2 gram Hepes, diencerkan sampai
diperoleh volume 100 ml, pH dibuat 7,2 dan larutan disterilkan dengan
menggunakan filter berdiameter 0,22 µm. Medium disimpan dalam almari es pada
suhu 4 °C (Freshney, 1986; Jacoby and Pastan, 1979; Sambrook et al, 1989).
b. Pembuatan medium penumbuh (RPMI 1640-serum)
Dibuat suatu campuran antara 10 ml FBS (Foetal Bovine Serum), 2 ml
penisilin – streptomisin dan 0,5 ml fungison, ditambahkan RPMI 1640 sehingga
diperoleh volume 100 ml. Larutan disterilkan dengan menggunakan filter
berdiameter 0,22 µm. Medium disimpan dalam almari es pada suhu 4 °C
(Freshney, 1986; Jacoby and Pastan, 1979; Sambrook et al, 1989).
8. Preparasi Kultur Sel Raji
a. Propagasi Sel Raji
Sel diambil dari tangki nitrogen cair, kemudian segera dicairkan dalam
penangas air 37°C, kemudian ampul disemprot dengan etanol 70%. Ampul
dibuka dan sel Raji dipindahkan dalam tabung conical steril yang berisi medium
RPMI 1640. Suspensi sel disentrifugasi selama 5 menit, supernatan dibuang,
diganti dengan medium RPMI yang baru, kemudian disuspensikan perlahan.
Suspensi sel lalu disentrifugasi kembali selama 5 menit kemudian dicuci
ulang sekali lagi. Supernatan dibuang, pelet ditambahkan 1 ml medium
penumbuh yang mengandung 10% FBS. Resuspensikan secara perlahan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
19
sampai homogen, kemudian sel ditumbuhkan dalam tissue culture flask kecil dan
diinkubasikan dalam inkubator dengan suhu 37°C dengan aliran 5% CO2 dari
udara. Setelah 24 jam, medium penumbuh diganti dan sel ditumbuhkan hingga
konfluen dan jumlahnya cukup untuk penelitian.
b. Panen Sel Raji
Setelah jumlah sel cukup, media diganti dengan RPMI 1640 baru
sebanyak 5 ml kemudian sel diresuspensikan menggunakan pipet Pasteur. Sel
dipindahkan dalam tabung conical steril dan ditambahkan medium RPMI sampai
volume 10 ml dan disentrifugasi 3000 rpm selama 10 menit. Supernatan
dibuang dan pelet sel diresuspensikan perlahan dengan 1 ml medium. Sel
kemudian dihitung menggunakan haemocytometer. Suspensi sel ditambah
sejumlah medium sehingga memperoleh konsentrasi sel sebesar 3,0x104/100 µl.
9. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah dengan
Menggunakan Metode Direct Counting
Untuk uji sitotoksisitas, sebanyak 100 µl suspensi sel Raji dengan
kepadatan 3,0x104/100 µl dimasukkan dalam sumuran-sumuran 96-well
plate kemudian diberikan 100 µl ekstrak etanolik daun sirih merah dengan kadar
250; 500; 750; 1000; 1250; 1500; 1750; 2000 µg/ml pada masing – masing
sumuran. Sebagai kontrol, digunakan 200 μl suspensi sel dalam media penumbuh.
Selanjutnya 96-well plate diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37°C, dalam
inkubator dengan aliran CO2 5% dari udara. Pada akhir masa inkubasi, tiap
sumuran sel diresuspensi bersama 50 μl trypan blue, diambil sebanyak 10 μl dan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
20
dimasukkan dalam haemocytometer, diletakkan di bawah mikroskop kemudian
dihitung jumlah sel hidup dan mati menggunakan cell counter.
E. Analisis Hasil
Prosentase kematian sel hasil perlakuan dihitung menggunakan rumus
sebagai berikut : % Kematian sel = %100A
×Β−Α
Keterangan : A = Jumlah sel hidup pada sumuran kontrol media
B = Jumlah sel hidup pada sumuran yang telah diberi perlakuan
Distribusi data diuji menggunakan Kolmogorov-Smirnov. Untuk mengetahui
perbedaan antara kontrol dan perlakuan digunakan one-way Anova dengan taraf
kepercayaan 95%. Nilai LC50 dihitung dengan menggunakan analisis probit.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Determinasi Tanaman
Tujuan dari determinasi ini adalah untuk memberikan kepastian terhadap
kebenaran tanaman yang hendak diuji yaitu sirih merah, sehingga menghindari
kekeliruan penggunaan bahan dengan tanaman lain. Determinasi dilakukan di
Laboratorium Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada,
Yogyakarta menggunakan acuan baku Backer dan Brink (1965). Hasil yang
didapatkan dari determinasi menyatakan kebenaran tanaman yang digunakan
dalam penelitian ini adalah sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav).
B. Pengumpulan Daun Sirih Merah
Pada penelitian ini digunakan daun sirih merah yang diambil dari daerah
Desa Mantenan, Kecamatan Mertoyudan, Kabupaten Magelang, Propinsi Jawa
Tengah, pada bulan September 2007. Pemanenan dilakukan pada tanaman di
tempat dan waktu yang sama, hal ini dimaksudkan untuk penyeragaman
kandungan kimia atau meminimalkan variasi kandungan kimia. Daun sirih merah
dipilih pada keadaan tidak terlalu tua dan tidak terlalu muda yaitu pada tanaman
yang berumur 4 bulan dan daunnya berumur 1 bulan, dengan tujuan mendapatkan
kandungan senyawa yang optimal. Untuk menjaga kualitas daun yang dipakai
maka dipilih daun yang tebal, segar dan berwarna terang kemudian dicuci di
bawah air mengalir untuk memastikan daun sirih merah bersih dari kotoran seperti
debu dan serangga yang menempel.
21
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
22
C. Pembuatan Serbuk Daun Sirih Merah
Hasil pencucian daun sirih merah kemudian ditiriskan dan dikeringkan
menggunakan oven pada suhu 60 – 70 °C sehingga kadar air yang terkandung
dalam simplisia berkurang, dengan demikian reaksi enzimatis dan tumbuhnya
mikroorganisme dapat diminimalkan. Dipilih pengeringan menggunaan oven
karena memiliki keuntungan dibandingkan dengan pengeringan menggunakan
sinar matahari yaitu tidak tergantung cuaca serta suhu yang digunakan dapat
ditentukan selain itu waktu yang dibutuhkan relatif lebih singkat. Penyerbukan
dilakukan untuk memperkecil ukuran partikel dari daun sirih merah. Dalam
bentuk serbuk, luas permukaan partikel yang dapat kontak langsung dengan cairan
penyari menjadi lebih besar sehingga kandungan kimia yang terkandung dapat
tersari secara maksimal. Untuk memperoleh derajat halus yang optimal digunakan
ayakan 0,75 mm. Derajat halus perlu diperhatikan karena jika digunakan nomor
mesh yang terlalu besar ukuran serbuk yang dihasilkan akan semakin kecil dan
cenderung menggumpal sehingga cairan penyari akan sulit untuk masuk diantara
serbuk, sedangkan nomor mesh yang terlalu kecil akan menghasilkan ukuran
serbuk yang besar dan memperkecil luas permukaan partikel yang akan kontak
dengan cairan penyari.
D. Pembuatan Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah
Dalam pembuatan ekstrak etanolik daun sirih merah, pada penelitian ini
digunakan etanol sebagai cairan penyari. Pemilihan etanol sebagai cairan penyari
didasarkan pada kandungan senyawa di dalam daun sirih merah yaitu flavonoid,
alkaloid, polifenolat, minyak atsiri dan tanin yang dapat larut ke dalam etanol.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
23
Keuntungan lain dari penggunaan etanol adalah mikroorganisme sulit tumbuh
sehingga terjadinya kontaminasi dapat dicegah selain itu panas yang diperlukan
pada proses pemekatan ekstrak lebih sedikit.
Maserasi dipilih sebagai metode pembuatan ekstrak daun sirih merah
karena prosesnya yang sederhana sehingga mudah dilakukan dan cepat. Pada
proses ekstraksi dengan metode maserasi tidak digunakan panas, hal ini sangat
menguntungkan karena dapat menghindari penguapan minyak atsiri dan
kerusakan senyawa tidak tahan panas yang terkandung pada daun sirih merah.
Untuk menghindari penguapan baik senyawa yang mudah menguap seperti
minyak atsiri maupun cairan penyari maka digunakan bejana tertutup. Keadaan
tertutup juga dimaksudkan agar tidak terjadi kontaminasi dari luar serta
pencegahan reaksi oksidasi karena ekstrak mengalami kontak dengan oksigen
yang terkandung di udara.
Pada saat terjadi kontak antara cairan penyari dan serbuk simplisia maka
cairan penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang
mengandung zat aktif karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif
di dalam sel dan di luar sel sehingga larutan yang terpekat akan didesak keluar.
Proses maserasi dihentikan pada saat terjadi keseimbangan konsentrasi antara
larutan di luar sel dan di dalam sel. Proses pengocokan selama maserasi
dimaksudkan agar cairan penyari dapat masuk pada bagian dalam serbuk simplisia
sehingga semua bagian serbuk dapat tersari.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
24
E. Sterilisasi Alat
Proses diawali dengan pencucian menggunakan deterjen dan dibilas di
bawah air mengalir agar pengotor dan kontaminan (sebagai contoh adalah debu
dan sisa – sisa bahan kimia) yang menempel pada alat – alat yang akan digunakan
dalam penelitian dapat dihilangkan sehingga tidak mengganggu proses dan hasil
penelitian. Sterilisasi dilakukan menggunakan autoklaf dengan prinsip penetrasi
uap air panas ke dalam sel mikroorganisme. Keadaan ini mengakibatkan
terjadinya koagulasi dan denaturasi protein mikroorganisme yang pada akhirnya
mengakibatkan kematian mikroorganisme. Metode ini menguntungkan karena
proses sterilisasi yang dilakukan relatif cepat, mempunyai daya tembus dan
menghasilkan kelembapan yang tinggi.
F. Pembuatan Medium Pencuci dan Penumbuh
Medium pencuci yang digunakan dalam penelitian ini adalah RPMI 1640
yang kemudian ditambahkan bahan buffer yaitu natrium bikarbonat dan hepes.
Untuk medium penumbuh sel Raji digunakan complete medium atau disebut
dengan RPMI 1640 – serum. Komposisi dari medium ini antara lain FBS (Foetal
Bovine Serum) yang merupakan serum berisi kandungan nutrisi yang diperlukan
dalam pertumbuhan sel, penisilin – streptomisin sebagai antibiotik berfungsi
mencegah tumbuhnya bakteri dan fungison sebagai antifungi untuk mencegah
pertumbuhan jamur. Bentuk sterilisasi yang dilakukan pada pembuatan medium
pencuci dan medium penumbuh adalah filtrasi dengan menggunakan suatu
membran filter berdiameter 0,22 μm. Penggunaan diameter pori membran yang
berukuran kecil bertujuan agar dapat menyaring virus, bakteri dan fungi yang
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
25
mungkin mengkontaminasi selama proses pembuatan medium berlangsung.
Dengan suatu sistem yang terkendali maka pertumbuhan sel dapat dikontrol
sehingga permasalahan seperti kematian sel dan kontaminasi dapat dihindari.
G. Preparasi Kultur Sel Raji
Proses preparasi meliputi propagasi dan pemanenan sel Raji. Propagasi
dilakukan dengan mengambil sel Raji dari tangki nitrogen cair dalam keadaan
beku sehingga tidak merubah kondisi sel dari bentuk aslinya. Sesaat setelah
pencairan, ampul disemprot dengan etanol sehingga kontaminasi dari luar dapat
dicegah. Pencucian sel dilakukan dengan memindahkan sel Raji ke dalam medium
RPMI kemudian disentrifugasi, proses ini dilakukan berulang untuk
menyesuaikan sel Raji terhadap medium penumbuh. Sel Raji ditumbuhkan dengan
medium penumbuh dalam inkubator pada suhu 37 °C untuk mengkondisikan
seperti keadaan sel di dalam tubuh manusia.
Pemanenan sel Raji dilakukan pada saat keadaan konfluen tercapai, yaitu
kondisi dimana populasi sel menempati seluruh atau hampir seluruh permukaan
medium penumbuh. Untuk memastikan keadaan sel maka dilakukan pengamatan
di bawah mikroskop inversi terhadap sel Raji yang telah diresuspensi. Dari hasil
pengamatan sel menggunakan mikroskop inversi menunjukkan penampakan
morfologi sel Raji berupa sel berbentuk lingkaran, terdapat sel yang tunggal
maupun menggerombol, tidak melekat pada dinding flask dan melayang pada
medium penumbuh. Sel Raji kemudian ditempatkan dalam medium RPMI yang
baru dan diresuspensikan menggunakan pipet pasteur sehingga sel terlepas antara
satu dengan yang lain. Sentrifugasi sel dilakukan untuk membantu proses
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
26
pemisahan antar sel dan memperoleh pelet sel yang terpisah dari medium. Pelet
sel yang diperoleh disuspensikan kedalam medium penumbuh untuk selanjutnya
dihitung konsentrasi sel pada suspensi menggunakan haemocytometer.
H. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah
Pengujian sitotoksisitas dalam penelitian ini tidak menggunakan metode
MTT karena ekstrak etanolik daun sirih merah berwarna coklat tua yang ikut
memberikan serapan sehingga dapat mempengaruhi hasil pengukuran absorbansi
menggunakan ELISA reader. Metode uji sitotoksisitas yang dipilih adalah
menggunakan metode direct counting yaitu perhitungan sel secara langsung di
bawah mikroskop dengan menggunakan bantuan haemocytometer. Sebagai
penanda untuk membedakan sel yang hidup dan sel yang mati digunakan trypan
blue. Zat penanda ini hanya dapat menembus masuk membran sel yang mati
karena pada sel yang telah mati membran sel akan kehilangan integritasnya
sehingga dapat ditembus dan sel berwarna biru tua. Pada saat suspensi sel
diberikan trypan blue, sel yang hidup akan tetap kecil, bulat dan bersinar hal ini
dikarenakan sel yang hidup masih terdapat sitoplasma secara utuh.
i
ii
Gambar 1. Sel Raji yang hidup pada kontrol (i) dan sel Raji yang mati dengan pemberian ekstrak etanolik daun sirih merah konsentrasi 2000 µg/ml (ii) setelah pemberian trypan blue,
pada bilik haemocytometer di bawah mikroskop dengan perbesaran 100x
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
27
Dibuat berbagai konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah untuk melihat
respon yang diberikan terhadap kematian sel uji. Pada penelitian ini digunakan
delapan seri konsentrasi ekstrak yaitu 250, 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750 dan
2000 µg/ml. Metode direct counting memiliki subyektifitas tinggi oleh karenanya
perhitungan sel dilakukan dengan penetapan sebanyak tiga kali.
Tabel II. Hasil Perhitungan Sel Raji Secara Direct Counting pada perlakuan masing – masing konsentrasi ekstrak etanolik
daun sirih merah setelah inkubasi 24 jam Penetapan
I II III Konsentrasi
Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah
(µg/ml)
Sel Hidup
Sel Mati
Sel Hidup
Sel Mati
Sel Hidup
Sel Mati
250 45 15 46 15 46 15 500 34 20 36 19 36 20 750 25 25 25 25 25 25 1000 17 30 18 31 18 31 1250 9 37 10 37 11 36 1500 5 40 6 40 5 40 1750 - 43 - 43 - 43 2000 - 42 - 43 - 42
Kultur sel Raji yang hidup berbentuk hampir bulat sempurna dan
bersinar. Sedangkan pada kultur sel Raji yang mati tampak kusam.
i
ii
Gambar 2. Sel raji yang mati seluruhnya pada pemberian ekstrak dengan konsentrasi 2000 µg/ml (a) ; sel raji hidup (i) dan mati (ii) pada pemberian ekstrak
dengan konsentrasi 250 µg/ml (b), pada perbesaran 100x
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
28
Kontrol yang digunakan berupa sel Raji dalam medium penumbuh tanpa
diberikan perlakuan. Fungsi dari kontrol adalah untuk memberikan perbandingkan
antara sel yang diberikan perlakuan dengan kondisi sel tanpa adanya perlakuan.
Gambar 3. Kontrol Pada Perbesaran 100x, tidak terdapat kematian sel Raji
Hasil penelitian menunjukkan semakin besar konsentrasi ekstrak etanolik
daun sirih merah yang diberikan maka semakin besar jumlah kematian sel uji.
Konsentrasi terendah dari ekstrak telah dapat menimbulkan kematian dari sel Raji
dan pada konsentrasi tertinggi mengakibatkan kematian seluruh sel Raji.
0102030405060708090
100
0 250 500 750 1000 1250 1500 1750 2000 2250
konsentrasi kadar ekstrak etanolik daun sirih merah (µg/ml)
kem
atia
n se
l (%
)
penetapan 1penetapan 2penetapan 3
Gambar 4. Grafik pengaruh konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap persentase kematian sel Raji
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
29
Melalui jumlah sel yang diperoleh dari metode direct counting dapat
dilakukan perhitungan terhadap persentase kematian sel Raji. Berdasarkan pada
persentase kematian sel maka dapat diketahui harga probit pada masing – masing
konsentrasi ekstrak.
Tabel III. Persentase kematian sel Raji dan harga probit setelah pemberian ekstrak etanolik daun sirih merah dan inkubasi 24 jam
Penetapan I II III
Konsentrasi Ekstrak Etanolik
Daun Sirih Merah (µg/ml)
Kematian Sel (%)
Harga Probit
Kematian Sel (%)
Harga Probit
Kematian Sel (%)
Harga Probit
250 40,53 4,77 39,21 4,72 39,21 4,72 500 55,07 5,13 52,42 5,05 52,42 5,05 750 66,96 5,52 66,96 5,44 66,96 5,44 1000 77,53 5,77 76,21 5,71 76,21 5,71 1250 88,11 6,18 86,78 6,13 85,46 6,04 1500 93,39 6,48 92,07 6,41 93,39 6,48 1750 100,00 - 100,00 - 100,00 - 2000 100,00 - 100,00 - 100,00 -
Untuk mengetahui efek sitotoksisitas dari ekstrak etanolik daun sirih
merah maka dilakukan analisis statistik Anova satu arah. Analisis ini bertujuan
untuk mengetahui apakah pemberian ekstrak etanolik daun sirih merah dalam
berbagai konsentrasi pada sel raji, memiliki perbedaan bermakna terhadap kontrol.
Salah satu syarat yang harus dipenuhi dalam analisis menggunakan Anova satu
arah adalah distribusi data yang diuji adalah normal. Pengujian distribusi data
digunakan metode Kolmogorov-Smirnov. Hasil uji menunjukkan data yang
diperoleh dalam penelitian ini memiliki distribusi normal. Dari uji Anova satu
arah dengan taraf kepercayaan 95% diketahui bahwa persentase kematian sel pada
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
30
kelompok perlakuan berbeda bermakna dengan kontrol, dengan demikian ekstrak
etanolik daun sirih merah memiliki efek sitotoksik terhadap sel Raji.
Potensi sitotoksisitas dari ekstrak digambarkan melalui LC50. Harga LC50
ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap sel Raji dihitung menggunakan analisis
probit yang merupakan analisis regresi antara log konsentrasi ekstrak terhadap
harga probit dari persentase kematian sel Raji setelah perlakuan pada masing -
masing konsentrasi ekstrak.
Gambar 5. Grafik hubungan log konsentrasi ekstrak terhadap harga probit pada penetapan I
Untuk penetapan I diperoleh hubungan yang linier (r hitung > r tabel) antara
log konsentrasi ekstrak terhadap nilai probit dari persentase kematian sel Raji
setelah perlakuan dan inkubasi 24 jam. Pada perhitungan diperoleh nilai r sebesar
0,971 sedangkan nilai r pada tabel untuk taraf kepercayaan 95% adalah 0,811.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
31
Gambar 6. Grafik hubungan log konsentrasi ekstrak terhadap harga probit pada penetapan II
Pada penetapan II diperoleh hubungan yang linier (r hitung > r tabel) antara
log konsentrasi ekstrak terhadap nilai probit dari persentase kematian sel Raji.
Dari perhitungan diperoleh nilai r sebesar 0,968 sedangkan nilai r pada tabel
untuk taraf kepercayaan 95% adalah 0,811.
Gambar 7. Grafik hubungan log konsentrasi ekstrak terhadap harga probit pada penetapan III
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
32
Pada penetapan III juga diperoleh hubungan yang linier (r hitung > r tabel)
antara log konsentrasi ekstrak terhadap nilai probit dari persentase kematian sel
Raji. Untuk perhitungan diperoleh nilai r sebesar 0,962 sedangkan nilai r pada
tabel untuk taraf kepercayaan 95% adalah 0,811.
Melalui analisis probit yang dilakukan pada tiap penetapan maka
didapatkan harga LC50 ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap sel Raji sebesar
395,5 µg/ml. Menurut NCI (National Cancer Institute) suatu bahan dapat
dikatakan berpotensi sitotoksik apabila memiliki nilai LC50 < 1000 µg/ml, dengan
demikian ekstrak etanolik daun sirih merah bersifat sitotoksik terhadap sel Raji
dan berpotensi untuk dikembangkan lebih lanjut.
Ekstrak etanolik daun sirih merah juga memberikan efek sitotoksik
terhadap kultur sel kanker yang lain seperti pada sel SiHa yaitu sel kanker serviks
dengan nilai LC50 sebesar 200,6 µg/ml (Nur’aniyah, 2008), terhadap kultur sel
Mieloma yaitu sel kanker sumsum tulang dengan nilai LC50 sebesar 434,1 µg/ml
(Meri, 2008), terhadap kultur sel T47D yaitu sel kanker payudara dengan nilai
LC50 sebesar 587,7 µg/ml (Neritika, 2008) dan terhadap kultur sel Hela yaitu sel
kanker serviks dengan nilai LC50 yang dihasilkan sebesar 1143,1 µg/ml
(Atmaningsih, 2008). Perbedaan nilai LC50 pada masing – masing sel kanker
dikarenakan perbedaan karakteristik dari sel. Selain itu dimungkinkan terdapat
perbedaan reseptor pada masing – masing sel yang dapat berikatan dengan
senyawa yang bersifat sitotoksik dari ekstrak etanolik daun sirih merah.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
Kesimpulan yang dapat ditarik dari penelitian ini adalah ekstrak etanolik
daun sirih merah bersifat sitotoksik terhadap kultur sel Raji dengan harga LC50
sebesar 395,5 µg/ml.
B. Saran
Saran yang dapat dikemukakan dari penelitian ini adalah :
1. Perlu dilakukan uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap
kultur sel normal.
2. Dilakukan pengujian sitotoksisitas terhadap fraksi dari daun sirih merah.
33
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR PUSTAKA
Adamo, D., 2006, Diet Sehat Golongan Darah untuk Mencegah dan Mengobati
Kanker, 26-27, PT Bhuana Ilmu Populer Kelompok Gramedia, Jakarta Anonim, 1986, Sediaan Galenik, 17, 25-26, Direktorat POM, Jakarta Anonim, 1995, Farmakope Indonesia, edisi IV, 7, Departemen Kesehatan
Republik Indonesia, Jakarta Anonim, 2000, Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, cetakan
pertama, 1 – 38, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta Anonim, 2007a, Piper ornatum,
http://toptropicals.com/catalog/uid/Piper_ornatum.htm, diakses tanggal 10 Mei 2008
Anonim, 2007b, Kanker, http://id.wikipedia.org/wiki/Kanker diakses tanggal 7
September 2007 Anonim, 2007c, Position Statement of the ZKBS on Risk Assessment
of the Recipient Cell Lines COS, 239 and Raji, BVL, http://www.bvl.bund.de/nn_1115098/EN/06__Genetic__Engineering/ZKBS/01__Allg__Stellungnahmen/05__zellbiologischeThemen/COS-293-Raji.html diakses tanggal 10 September 2007
Atmaningsih, F. R., 2008, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah
(Piper crocatum Ruiz & Pav) terhadap Kultur Sel Hela, Skripsi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta
Backer, C. A., and Backuizen van den Brink, R. C.,1965, Flora of Java, Volume
I dan II, N. V. Noordhoff, Graningen Dalimartha, S., 2006, Ramuan Obat Tradisional untuk Pengobatan Kanker, 1, 5,
7, Penebar Swadaya, Jakarta De Muth, J.E., 1999, Basic Statistics and Pharmaceutical Statistical Applications,
585, Marcel Dekker, Inc., New York Doyle, A., and Griffiths, J.B., 2000, Cell and Tissue Culture for Medical
Research, 12 -16, 47-50, 402 – 415 John Willey and Sons Ltd, New York
Freshney, R.I., 1986, Animal Cell Culture A Practical Approach, 1st Edition, 71-
73, IRL Press, Washington DC
34
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
35
Freshney, R.I., 2000, Culture of Animal Cells, A manual of Basic Technique, 4th
Edition, 71-73, 309 – 312, 337 – 339, A John Wiley & Sons Inc, New York
Hagman, D.E., 2005, Sterilization, th, Beringer, Paul., Remington The Science and
Practice of Pharmacy, 21th edition, 776 – 781, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia.
Jacoby, W.B., and Pastan, I.H., 1979, Methods in Enzymology Cell Culture,
Volume VIII, Academia Press Inc, New York. King, R.J.B., 2000, Cancer Biology, 2nd
edition, 79 – 80, School of Biological Sciences, University of Surrey, England
Meri, 2008, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Piper
crocatum Ruiz & Pav) terhadap Kultur Sel Mieloma, Skripsi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta
Miller, R. E., Rausher, M. D., and Manos, P. S., 1999, Phylogenetic systematics
of Ipomoea (Convolvulaceae) based on ITS and waxy sequences, Syst Bot, 24:209-227
Mursyidi, A., 1985, Statistika Farmasi Dan Biologi, 157, Ghalia
Indonesia,Jakarta Mutschler, E., 1999, Dinamika Obat, Edisi 5, 701 – 702, Penerbit ITB, Bandung Nafrialdi, 1995, Antikanker dan Imunosupresan, Farmakologi dan Terapi, 687 –
689, Fakultas Kedokteran UI, Jakarta Neritika, Kartina., 2008, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah
(Piper crocatum Ruiz & Pav) terhadap Kultur Sel T47D, Skripsi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta
Nur’aniyah, 2008, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Piper
crocatum Ruiz & Pav) terhadap Kultur Sel SiHa, Skripsi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta
Roberts, F.M., and Wink, M., 1998, Alkaloid: Biochemistry, Ecology and
Medicinal Aplications, 312 – 314, Plenum Press, New York Sambrook, Fritsch, E.F., and Maniatis, T., 1989, Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, 2nd Edition, Coldspring Harbor Laboratory Press.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
36
Schneider, 1997, Cancer Genetics, Encyclopedia of Human Biology, 2nd ed., Academic Press, New York
Sofyan, R., 2000, Terapi Kanker Pada Tingkat Molekuler, Cermin Dunia Kedokteran, No. 127, 5 - 10
Sudewo, B., 2006, Basmi Penyakit Dengan Sirih Merah, 22, 35 – 36, 40 – 45, 66
– 71, Agromedia Pustaka, Yogyakarta Sukardiman., Hadi P., dan Aty W., 2003, Penapisan Antikanker dari Tanaman
Obat Indonesia dengan Molekul Target Enzim DNA Topoisomerase, Majalah Farmasi Airlangga, Vol.III, No.3, 93 – 95
Tambunan, G.W., 2003, Diagnosis dan Tatalaksana Sepuluh Jenis Kanker
Terbanyak di Indonesia, 67 – 84, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta
Voigt, Rudolf., 1994, Buku Pelajaran Teknologi Farmasi, 551, 565 – 566, Gadjah
Mada University Press, Yogyakarta. Wolf, J.B., 2007, Tissue Culture Methods,
http://www.unej.ac.id/fakultas/mipa/vol13,no2/amrun.pdf#search=%22kultur%20sel%22 diakses tanggal 11 November 2007
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Lampiran 1. Hasil Determinasi
37
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
38
Lampiran 2. Peralatan dan Bahan yang Digunakan dalam Penelitian
Gambar 8. Tanaman Sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.)
Gambar 9. 96 well Plate dan conical steril
Gambar 10. Kultur sel Raji dalam flask
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
39
Gambar 11. Laminar air flow
Gambar 12. Haemocytometer dan cell counter
Gambar 13. Inverted microscope
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
40
Lampiran 3. Sel Raji setelah pemberian ekstrak etanolik daun sirih merah pada inkubasi 24 jam dengan perbesaran 100x
Gambar 14. Sel raji yang mati dengan pemberian kadar ekstrak 1750 µg/ml
i
ii
Gambar 15. Sel raji yang hidup (i) dan mati (ii) dengan kadar ekstrak 1500 µg/ml
iii
Gambar 16. Sel raji yang hidup (i) dan mati (ii) dengan kadar ekstrak 1250 µg/ml
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
41
iii
Gambar 17. Sel raji yang hidup (i) dan mati (ii) dengan kadar ekstrak 1000 µg/ml
ii i
Gambar 18. Sel raji yang hidup (i) dan mati (ii) dengan kadar ekstrak 750 µg/ml
i
ii
Gambar 19. Sel raji yang hidup (i) dan mati (ii) dengan kadar ekstrak 500 µg/ml
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
42
Lampiran 4. Tabel Probit
Tabel IV. Harga Probit Sesuai dengan Prosentasenya Probit
Prosentase0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
0 - 2,67 2,95 3,12 3,25 3,36 3,45 3,52 3,59 3,66
10 3,72 3.77 3,82 3,87 3,92 3,96 4,01 4,05 4,08 4,12
20 4,16 4,19 4,23 4,26 4,29 4,33 4,36 4,39 4,42 4,45
30 4,48 4,50 4,53 4,56 4,59 4,61 4,64 4,67 4,39 4,72
ss40 4,75 4,77 4,80 4,82 4,85 4,87 4,90 4,92 4,95 4,97
50 5,00 5,03 5,05 5,08 5,10 5,13 5,15 5,18 5,20 5,23
60 5,25 5,28 5,31 5,33 5,36 5,39 5,41 5,44 5,47 5,50
70 5,52 5,55 5,58 5,61 5,64 5,67 5,71 5,74 5,77 5,81
80 5,34 5,88 5,92 5,95 5,99 6,04 6,08 6,13 6,18 6,23
90 6,28 6,34 6,41 6,48 6,55 6,64 6,75 6,88 7,05 7,33
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 99
7,33 7,37 7,41 7,51 7,51 7,58 7,65 7,75 7,88 8,09
(Mursyidi,1985)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
43
Lampiran 5. Perhitungan LC50 Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah terhadap Sel Raji Menggunakan Analisis Probit
Kontrol Sel Raji
Penetapan
I II III
75 76 76
Jumlah sel = 200104
××x
Keterangan: x = jumlah sel hasil perhitungan langsung pada haemocytometer
4 = jumlah bilik dalam haemocytometer
10 = jumlah volume yang masuk dalam bilik haemocytometer (µl)
200 = jumlah volume total (µl)
Penetapan I = 200104
75×× = 37.500
Penetapan II = 200104
76×× = 38.000
Penetapan III = 200104
76×× = 38.000
Rata – rata kontrol = 3
000.38000.38500.37 ++ = 37.833
Konsentrasi sel pada kontrol adalah 37.833/200 µl
PENETAPAN I
Jumlah sel Raji yang hidup/ sumuran : 200104
××x
Konsentrasi 250 µg/ml = 20010445
×× = 22.500 sel/sumuran
Konsentrasi 500 µg/ml = 200104
34×× = 17.000 sel/sumuran
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
44
Konsentrasi 750 µg/ml = 20010425
×× = 12.500 sel/sumuran
Konsentrasi 1000 µg/ml = 200104
17×× = 8.500 sel/sumuran
Konsentrasi 1250 µg/ml = 2001049
×× = 4.500 sel/sumuran
Konsentrasi 1500 µg/ml = 2001045
×× = 2.500 sel/sumuran
Konsentrasi 1750 µg/ml = 2001040
×× = 0 sel/sumuran
Konsentrasi 2000 µg/ml = 2001040
×× = 0 sel/sumuran
Persen Kematian Sel Raji = %100A
×Β−Α
Keterangan : A = jumlah sel hidup pada sumuran kontrol
B = jumlah sel hidup pada sumuran yang telah diberi perlakuan
Konsentrasi 250 µg/ml = %100833.37
500.22833.37×
− = 40,53 %
Konsentrasi 500 µg/ml = %100833.37
000.17833.37×
− = 55,07 %
Konsentrasi 750 µg/ml = %100833.37
500.12833.37×
− = 66,96 %
Konsentrasi 1000 µg/ml = %100833.37
500.8833.37×
− = 77,53 %
Konsentrasi 1250 µg/ml = %100833.37
500.4833.37×
− = 88,11 %
Konsentrasi 1500 µg/ml = %100833.37
500.2833.37×
− = 93,39 %
Konsentrasi 1750 µg/ml = %100833.37
0833.37×
− = 100,00%
Konsentrasi 2000 µg/ml = %100833.37
0833.37×
− = 100,00%
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
45
Sel No
Konsentrasi Ekstrak Etanolik
Daun Sirih Merah (µg/ml)
Hidup Mati
Kematian Sel (%) Harga Probit
1. 250 45 15 40,53 4,77
2. 500 34 20 55,07 5,13
3. 750 25 25 66,96 5,52
4. 1000 17 30 77,53 5,77
5. 1250 9 37 88,11 6,18
6. 1500 5 40 93,39 6,48
7. 1750 - 43 100,00 -
8. 2000 - 42 100,00 -
Log konsentrasi ekstrak vs harga probit
Dengan menggunakan regresi linier diperoleh nilai :
A = - 0,56218; B = 2,15849
r = 0,97118; n = 6
persamaan yang didapatkan : y = 2,15849x – 0,56218
y= nilai probit 50 5 = 2,15849x – 0,56218
X= 2,57688
PENETAPAN II
Jumlah sel Raji yang hidup/ sumuran : 200104
××x
Konsentrasi 250 µg/ml = 200104
46×× = 23.000 sel/sumuran
Konsentrasi 500 µg/ml = 200104
36×× = 18.000 sel/sumuran
Konsentrasi 750 µg/ml = 20010425
×× = 12.500 sel/sumuran
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
46
Konsentrasi 1000 µg/ml = 200104
18×× = 9.000 sel/sumuran
Konsentrasi 1250 µg/ml = 200104
10×× = 5.000 sel/sumuran
Konsentrasi 1500 µg/ml = 2001046
×× = 3.000 sel/sumuran
Konsentrasi 1750 µg/ml = 2001040
×× = 0 sel/sumuran
Konsentrasi 2000 µg/ml = 2001040
×× = 0 sel/sumuran
Persen Kematian Sel Raji = %100A
×Β−Α
Keterangan : A = jumlah sel hidup pada sumuran kontrol
B = jumlah sel hidup pada sumuran yang telah diberi perlakuan
Konsentrasi 250 µg/ml = %100833.37
000.23833.37×
− = 39,21 %
Konsentrasi 500 µg/ml = %100833.37
000.18833.37×
− = 52,42 %
Konsentrasi 750 µg/ml = %100833.37
500.12833.37×
− = 66,96%
Konsentrasi 1000 µg/ml = %100833.37
000.9833.37×
− = 76,21 %
Konsentrasi 1250 µg/ml = %100833.37
000.5833.37×
− = 86,78 %
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
47
Konsentrasi 1500 µg/ml = %100833.37
000.3833.37×
− = 92,07%
Konsentrasi 1750 µg/ml = %100833.37
0833.37×
− = 100,00%
Konsentrasi 2000 µg/ml = %100833.37
0833.37×
− = 100,0
Sel No
Konsentrasi Ekstrak Etanolik
Daun Sirih Merah (µg/ml) Hidup Mati
Kematian Sel (%) Harga Probit
1. 250 46 15 39,21 4,72
2. 500 36 19 52,42 5,05
3. 750 25 25 66,96 5,44
4. 1000 18 31 76,21 5,71
5. 1250 10 37 86,78 6,13
6. 1500 6 40 92,07 6,41
7. 1750 - 43 100,00 -
8. 2000 - 43 100,00 -
Log konsentrasi ekstrak vs harga probit
Dengan menggunakan regresi linier diperoleh nilai :
A = - 0,61283
B = 2,15349
n = 6
r = 0,96826
persamaan yang didapatkan : y = 2,15349x– 0,61283
y= nilai probit 50 5 = 2,15349x– 0,61283
X = 2,60639
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
48
PENETAPAN III
Jumlah sel Raji yang hidup/ sumuran : 200104
××x
Konsentrasi 250 µg/ml = 200104
46×× = 23.000 sel/sumuran
Konsentrasi 500 µg/ml = 200104
36×× = 18.000 sel/sumuran
Konsentrasi 750 µg/ml = 20010425
×× = 12.500 sel/sumuran
Konsentrasi 1000 µg/ml = 200104
18×× = 9.000 sel/sumuran
Konsentrasi 1250 µg/ml = 200104
11×× = 5.500 sel/sumuran
Konsentrasi 1500 µg/ml = 2001045
×× = 2.500 sel/sumuran
Konsentrasi 1750 µg/ml = 2001040
×× = 0 sel/sumuran
Konsentrasi 2000 µg/ml = 2001040
×× = 0 sel/sumuran
Persen Kematian Sel Raji = %100A
×Β−Α
Keterangan : A = jumlah sel hidup pada sumuran kontrol
B = jumlah sel hidup pada sumuran yang telah diberi perlakuan
Konsentrasi 250 µg/ml = %100833.37
000.23833.37×
− = 39,21 %
Konsentrasi 500 µg/ml = %100833.37
000.18833.37×
− = 52,42 %
Konsentrasi 750 µg/ml = %100833.37
500.12833.37×
− = 66,96%
Konsentrasi 1000 µg/ml = %100833.37
000.9833.37×
− = 76,21 %
Konsentrasi 1250 µg/ml = %100833.37
500.5833.37×
− = 85,46 %
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
49
Konsentrasi 1500 µg/ml = %100833.37
500.2833.37×
− = 93,39 %
Konsentrasi 1750 µg/ml = %100833.37
0833.37×
− = 100,00%
Konsentrasi 2000 µg/ml = %100833.37
0833.37×
− = 100,00%
Sel No
Konsentrasi Ekstrak Etanolik
Daun Sirih Merah (µg/ml) Hidup Mati
Kematian Sel (%) Harga Probit
1. 250 46 15 39,21 4,72
2. 500 36 20 52,42 5,05
3. 750 25 25 66,96 5,44
4. 1000 18 31 76,21 5,71
5. 1250 11 36 85,46 6,04
6. 1500 5 40 93,39 6,48
7. 1750 - 43 100,00 -
8. 2000 - 42 100,00 -
Log konsentrasi ekstrak vs harga probit
Dengan menggunakan regresi linier diperoleh nilai :
A = - 0,62371 n = 6
B = 2,15612 r = 0,96242
persamaan yang didapatkan : y = 2,15612x– 0,62371
y= nilai probit 50 5 = 2,15612x– 0,62371
X = 2,60825
Nilai LC50 rata – rata = antilog ( )3
2,6082560639,22,57688 ++
= 395,5 µg/ml
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
50
Lampiran 6. Perhitungan nilai korelasi LC50 ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap sel Raji pada taraf kepercayaan 95%
Tabel V. Nilai r (koefisien korelasi) pada level signifikansi 5% dan 1%
Degrees of Freedom (DF) 5% 1%
1 .997 1.000 2 .950 .990 3 .878 .959 4 .811 .917 5 .754 .874 6 .707 .831 7 .666 .798 8 .632 .765 9 .602 .735 10 .576 .708 11 .553 .684 12 .532 .661 13 .514 .641 14 .497 .623 15 .482 .606 16 .468 .590 17 .456 .575 18 .444 .561 19 433 .549 20 .423 .537 21 .413 .526 22 .404 .515 23 .396 .505
(De Muth, 1999) Korelasi pada masing – masing penetapan :
Penetapan 1 : r2 = 0,94319 r = 0,97118 [rtabel (95%, 4) = 0,811] ----- rhitung > rtabel, sehingga korelasinya linier -----
Penetapan 2 : r2 = 0,93753 r = 0,96826 [rtabel (95%, 4) = 0,811] ----- rhitung > rtabel, sehingga korelasinya linier -----
Penetapan 3 : r2 = 0,92625 r = 0,96242 [rtabel (95%, 4) = 0,811] ----- rhitung > rtabel, sehingga korelasinya linier -----
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
51
Lampiran 7. Tes Distribusi Normal dengan Menggunakan Metode Kolmogorov-Smirnov
One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test
SELHIDUP N 27
Mean 11925,9259 Normal Parameters(a,b)
Std. Deviation 12018,17830
Absolute ,161
Positive ,152
Most Extreme Differences
Negative -,161
Kolmogorov-Smirnov Z ,834
Asymp. Sig. (2-tailed) ,490 a Test distribution is Normal. b Calculated from data.
Lampiran 8. Analisis Statistik Anova Satu Arah
Oneway ANOVA SELHIDUP
Sum of Squares df Mean Square F Sig.
Between Groups 3753518518,519 8 469189814,815 4606,591 ,000
Within Groups 1833333,333 18 101851,852
Total 3755351851,852 26
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
52
BIOGRAFI PENULIS
Penulis yang bernama lengkap Eva Dwi
Kusumaningtyas lahir di Rembang pada tanggal 22
Agustus 1986. Penulis merupakan anak kedua dari
pasangan Bapak Stefanus Darjatmo dan Ibu
Purwahyuni. Tahun 1990 hingga 1992 menempuh
pendidikan taman kanak-kanak di TK Pertiwi I
Mojosongo, Boyolali. Tahun 1992 hingga 1998
menempuh pendidikan sekolah dasar di SD Kanisius
Boyolali, dilanjutkan dengan menempuh pendidikan
pada tahun 1998 hingga 2001 di SLTP Negeri I Boyolali. Tahun 2001 hingga
2004 menempuh pendidikan di SMU Negeri I Boyolali. Tahun 2004 melanjutkan
pendidikan di Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI