Bahagian Penyelidikan (Research)

Saintis Penyelidikan (Research Scientist)Seorang Saintis Penyelidikan menjalankan   kerja   kerja sains berasaskanprojek, terutamanya dalam menghasilkan   penemuan-penemuan   baru   dalam   penyelidikan, atau membangunkan teknik   saintifik yang lebih   baik.   Tugasnya termasuk menganalisa data, menginterpretasi hasil,menjalankan eksperimen saintifik, dan merekodkan hasil eksperimen.Selain itu,   seorang   Saintis   Penyelidikan   juga boleh memainkan   peranan   dalam   menguruskan peralatan makmal dan perolehan bahan, sertabekerjasama   dengan rakan   sepasukan untuk   membincangkan strategipenyelidikan. Beliau akan mengemukakan   laporan mengenai   penemuan   penyelidikan, membuat ringkasan, menyemak   semula protokol ujikaji sertamenguruskan   kerja-kerja penerbitan. Saintis   Penyelidikan memerlukansekurang-kurangnya ijazah asas   (BSc) dan pengalaman bekerja dalammakmal

MethodsDalam  menjalankan   eksperimen-eksperimen  bioteknologi,   terdapat   pelbagai   teknik   yang   dijalankan bersesuaian dengan tujuan eksperimen. Teknik-teknik tersebut bukan hanya diguna di Malaysia, malah turut   diguna   di   seluruh   makmal   yang   menjalankan   eksperimen   bioteknologi.   Antaranya   ialah pemprofilan DNA (DNA Profiling),  electroporasi  gel   (Gel  Electroporation), Polymerase Chain Reaction (PCR),   DNA   recombinant   dan   sebagainya.   Penerangan   lanjut   adalah   seperti   di   bawah.

Teknik 1: DNA Profiling/DNA Fingerprinting (Pemprofilan DNA)

'DNA Profiling'  adalah teknik yang digunakan oleh ahli sains forensik untuk membantu sama ada dalam penyiasatan,  atau pun dalam kerja  mengenalpasti  individu-individu  tertentu  berdasarkan  profil  DNA tertentu. Teknik ini juga biasanya dikenali sebagai 'DNA Fingerprinting', atau 'DNA Testing', atau 'DNA Typing',  atau  'genetic fingerprinting'.  Sepertimana yang kita sedia maklum, setiap orang mempunyai profil DNA yang unik, dan teknik pemprofilan DNA ini akan digunakan untuk menentukan bahawa set DNA yang mahu dikenal pasti tersebut dimiliki oleh individu tertentu. Kebiasaannya, teknik ini digunakan untuk memastikan hubungan anak dan ibubapa (parental testing), ataupun dalam penyiasatan jenayah.

Teknik   ini   telah  ditemui   oleh   Sir  Alec   Jeffreys   pada   tahun   1985.  Dalam  dunia   forensik,   teknik   ini merupakan satu teknik yang sangat menarik kerana ianya tidak memerlukan cap jari milik seseorang individu itu, kerana ianya (merujuk DNA) boleh di dapati di mana-mana bahagian sel yang lain,  dan setiap individu mempunya set DNA yang unik, termasuklah di mana-mana bahagian sel, dari rambut hinggalah ke kaki. Contoh yang biasa digunakan ialah analisis DNA di sel rambut, ataupun titisan darah di tempat kejadian.  Sesungguhnya teknik   ini  adalah  sangat   luar  biasa kerana sangat  membantu dalam 

pencegahan  jenayah,  kerana penjenayah sangat  sukar untuk tidak meninggalkan kesan 100% dalam tindakan jenayahnya. 

Walaubagaimanapun,   teknik   ini   masih   mempunyai   kelemahan,   dimana   setiap   sel   yang   dijumpai, walaupun  ianya unik,  namun masih tidak ada 100% kepastian tentang pemilik  sel   itu yang sebenar. Namun, setidak-tidaknya, teknik ini memberikan kemungkinan tentang pemilik sel itu. Selain itu, teknik ini   juga masih mendapat tentangan daripada beberapa pihak,   iaitu  isu yang berkaitan pengumpulan bank DNA, yang berkemungkinan tidak sah disisi undang-undang negara. Namun setakat ini, kelebihan teknik ini masih lagi mengatasi kekurangannya, dan oleh sebab itu ianya masih logik untuk diaplikasikan.

Sebagai contoh dalam bidang bioteknologi, teknik ini digunakan untuk mengelakkan pembiak-bakaan (inbreeding). Dalam teknik ini, saintis akan memastikan proses mengawan berlaku antara individu yang tidak   berkaitan   secara   genetik   (melalui   peningkatan   dalam   'gene   pool',  mengurangkan   perubahan ekspresi  gen perosak atau yang membawa maut,  'deleterious/lethal  genes').  Dengan mengenal pasti profil DNA, haiwan ternakan dewasa yang paling berjaya boleh dikenal pasti, dimana keturunan mereka akan   mempunyai   petanda   DNA   tersebut.   Jadi,   ahli   saintis   akan   mengutamakan   burung   ini   untuk membiakkan lagi spesis dalam jumlah yang besar.

Teknik 2: Elektroporasi Gel (Gel Electrophoresis)  Pada awal pengenalan teknik memanipulasi DNA, keratan/potongan DNA dipisahkan di makmal oleh graviti. Pada tahun 1970-an, alat yang berkuasa elektroforesis gel DNA telah dibangunkan. Proses ini menggunakan elektrik untuk menghasilkan keratan/potongan DNA yang berasingan mengikut saiz dan cas seperti yang dihasilkan melalui gel matriks (agar) dan dibezakan mengikut jarak keratan/potongan DNA, iaitu merupakan satu teknik yang dipanggil 'gel elektroforesis'.

Gel diletakkan di dalam bekas elektroforesis, yang kemudiannya disambungkan ke punca kuasa. Apabila arus elektrik digunakan, molekul yang lebih besar bergerak dengan lebih perlahan-lahan melalui gel manakala molekul yang lebih kecil bergerak lebih pantas. Molekul mempunyai saiz yang berbeza, seterusnya membentuk kumpulan-kumpulan yang berbeza gel.

Istilah "gel" dalam contoh ini merujuk kepada matriks digunakan untuk mengandungi, kemudian memisahkan molekul sasaran. Dalam kebanyakan kes, gel polimer crosslinked yang komposisi dan keliangan dipilih berdasarkan berat tertentu dan komposisi sasaran untuk dianalisis. Apabila memisahkan kecil protein atau asid nukleik (DNA, RNA, atau oligonucleotides) gel biasanya terdiri daripada kepekatan yang berbeza acrylamide dan rentas pemaut, menghasilkan rangkaian jejaring yang berbeza bersaiz polyacrylamide.

"Elektroforesis" merujuk kepada daya elektromotif (EMF) yang digunakan untuk menggerakkan molekul melalui matriks gel. Dengan meletakkan molekul di telaga dalam gel dan menggunakan medan elektrik, molekul akan bergerak melalui matriks pada kadar yang berbeza, yang ditentukan sebahagian besarnya oleh massa mereka apabila caj kepada nisbah jisim (Z) spesis semua seragam, ke arah anod jika bercas negatif atau ke arah katod jika bercas positif.

Picture: Gel electrophoresis: 6 "DNA-tracks". In the first row (left), DNA with known fragment sizes was used as a reference. Different bands indicate different fragment sizes.

Teknik 3: Polymerase Chain Reaction (PCR)

Tindak balas polymerase berangkai (PCR) merupakan satu teknik saintifik dalam biologi molekul untuk menambah bilangan satu  atau beberapa salinan DNA mengikut  beberapa magnitud  tertentu,  untuk menjana   beribu-ribu   kepada   berjuta-juta   salinan   daripada   urutan   DNA   tertentu.

Teknik ini telah dibangunkan pada tahun 1983 oleh Kary Mullis, dan kini, PCR telah menjadi satu teknik yang  biasa  dan   akan  digunakan  dalam makmal  penyelidikan  perubatan  dan  biologi   untuk  pelbagai aplikasi. Ini termasuk pengklonan DNA (DNA cloning), phylogeny berasaskan DNA, atau analisis fungsi gen; diagnosis penyakit keturunan; mengenal pasti cap jari genetik (digunakan dalam sains forensik dan ujian paterniti); dan pengesanan dan diagnosis penyakit berjangkit. 

Kaedah   ini   bergantung   kepada   kitaran   thermal   (thermal   cycling),   yang   terdiri   daripada   kitaran pemanasan berulang-ulang, dan penyejukan tindak balas untuk meleburkan DNA dan replikasi enzim DNA. Primers (serpihan DNA pendek) yang mengandungi  urutan pelengkap kepada kawasan sasaran bersama-sama  dengan  enzim  polimerase  DNA  adalah  komponen  utama  bagi  membolehkan  proses pemilihan, dan ianya berlaku secara berulang-ulang. Ketika PCR sedang berlaku, DNA yang dihasilkan sendiri akan digunakan sebagai template untuk replikasi, dalam proses tindak balas berangkai, di mana template   DNA   eksponen   dikuatkan.   Teknik   PCR   boleh   diubahsuai   untuk   melaksanakan   pelbagai manipulasi   genetic.

Hampir semua aplikasi PCR menggunakan enzim DNA polimerase yang mempunyai haba stabil, seperti polimerase   Taq   (Taq   polymerase),   enzim   yang   pada   berasal   daripada   bakteria   aquaticus   Thermus. Polimerase DNA mengumpulkan DNA yang baru daripada blok DNA yang asal, nukleotida (nucleotide), dengan   menggunakan   DNA   yang   hanya   mempunyai   satu   lembar   (strand)   sebagai   template oligonucleotide   (juga   dipanggil   primers  DNA),   yang   diperlukan   untuk  permulaan   penghasilan  DNA. Majoriti   kaedah   PCR   menggunakan   teknik   kitaran   haba   (thermal   cycling),   iaitu,   sebagai   gantian pemanasan dan penyejukan sampel PCR kepada suhu-suhu tertentu secara bersiri. 

Ternyata   hal   ini   gak   lepas   dari   yang   namanya   PCR   alias   Polymerase   Chain   Reaction.   Proses   yang berlangsung   secara   in   vitro   dalam   tabung   reaksi   sebesar   200   µl   ini   mampu  menggandakan   atau mengkopi   DNA   hingga  miliaran   kali   jumlah   semula.  Maka   pantes   aja   dengan   berbekal   DNA   yang terkandung dalam sampel yang cuma secuil itu bisa diperoleh banyak sekali informasi sesuai kebutuhan kita.

Reaksi PCR meniru reaksi penggandaan atau replikasi  DNA yang terjadi dalam makhluk hidup. Secara sederhana PCR merupakan reaksi penggandaan daerah tertentu dari DNA cetakan (template) dengan batuan enzim DNA polymerase.

PCR   terdiri   atas  beberapa   siklus  yang  berulang-ulang,  biasanya  20   sampai  40   siklus.  Nah,   sekarang bayangkan bahwa pada setiap siklus DNA polymerase akan menggandakan DNA sebanyak 2 kali, dan coba hitung berapa salinan utas ganda DNA yang akan dihasilkan setelah 30 siklus? Yup, 2 pangkat 30 

alias 1.073.741.824 kali! Tentu saja nilainya tidak tepat seperti itu, kita masih harus memperhitungkan efisiensi reaksi, tapi tetap saja hasilnya akan sangat banyak.

Komponen PCRSelain   DNA   template   yang   akan   digandakan   dan   enzim   DNA   polymerase,   komponen   lain   yang dibutuhkan adalah:

PrimerPrimer  adalah   sepasang  DNA utas   tunggal  atau  oligonukleotida  pendek  yang  menginisiasi   sekaligus membatasi  reaksi  pemanjangan rantai atau polimerisasi  DNA. Jadi   jangan membayangkan kalau PCR mampu menggandakan seluruh DNA bakteri E. coli yang panjangnya kira-kira 3 juta bp itu. PCR hanya mampu menggandakan DNA pada daerah tertentu sepanjang maksimum 10000 bp saja, dan dengan teknik tertentu bisa sampai 40000 bp. Primer dirancang untuk memiliki sekuen yang komplemen dengan DNA template, jadi dirancang agar menempel mengapit daerah tertentu yang kita inginkan.

dNTP (deoxynucleoside triphosphate)dNTP alias building blocks sebagai  ‘batu bata’ penyusun DNA yang baru. dNTP terdiri  atas 4 macam sesuai dengan basa penyusun DNA, yaitu dATP, dCTP, dGTP dan dTTP.

BufferBuffer   yang   biasanya   terdiri   atas   bahan-bahan   kimia   untuk   mengkondisikan   reaksi   agar   berjalan optimum dan menstabilkan enzim DNA polymerase.

Ion Logam Ion logam bivalen, umumnya Mg++, fungsinya sebagai kofaktor bagi enzim DNA polymerase. Tanpa ion 

ini enzim DNA polymerase tidak dapat bekerja. Ion logam monovalen, kalsium (K+).

Tahapan ReaksiSetiap siklus reaksi PCR terdiri atas tiga tahap, yaitu:

1-DenaturasiDenaturasi dilakukan dengan pemanasan hingga 96oC selama 30-60 detik. Pada suhu ini DNA utas ganda akan memisah menjadi utas tunggal.

2-AnnealingSetelah   DNA  menjadi   utas   tunggal,   suhu   diturukan   ke   kisaran   40-60oC   selama   20-40   detik   untuk memberikan kesempatan bagi primer untuk menempel pada DNA template di tempat yang komplemen dengan sekuen primer.

3-Ekstensi/elongasiDilakukan dengan menaikkan suhu ke kisaran suhu kerja optimum enzim DNA polymerase, biasanya 70-72oC. Pada tahap ini DNA polymerase akan memasangkan dNTP yang sesuai pada pasangannya, jika basa pada template adalah A, maka akan dipasang dNTP, begitu seterusnya (ingat pasangan A adalah T, dan C dengan G, begitu pula sebaliknya). Enzim akan memperpanjang rantai baru ini hingga ke ujung. Lamanya waktu  ekstensi  bergantung  pada panjang  daerah  yang akan  diamplifikasi,   secara  kasarnya adalah 1 menit untuk setiap 1000 bp.

Selain ketiga proses tersebut biasanya PCR didahului dan diakhiri oleh tahapan berikut:

4-Pra-denaturasiDilakukan   selama   1-9   menit   di   awal   reaksi   untuk   memastikan   kesempurnaan   denaturasi   dan mengaktifasi DNA Polymerase (jenis hot-start alias baru aktif kalau dipanaskan terlebih dahulu).

5-Final ElongasiBiasanya dilakukan pada suhu optimum enzim (70-72oC) selama 5-15 menit untuk memastikan bahwa setiap utas tunggal yang tersisa sudah diperpanjang secara sempurna. Proses ini dilakukan setelah siklus PCR terakhir

PCR dilakukan dengan menggunakan mesin Thermal  Cycler  yang dapat menaikkan dan menurunkan suhu dalam waktu cepat sesuai kebutuhan siklus PCR. Pada awalnya orang menggunakan tiga penangas air (water bath) untuk melakukan denaturasi, annealing dan ekstensi secara manual, berpindah dari satu suhu   ke   suhu   lainnya  menggunakan   tangan.   Tapi   syukurlah   sekarang  mesin   Thermal   Cycler   sudah terotomatisasi dan dapat diprogram sesuai kebutuhan.

Aplikasi teknik PCRKita harus berterima kasih kepada Kary B Mullis yang telah menemukan dan mengaplikasikan PCR pada tahun 1984. Saat ini PCR sudah digunakan secara luas untuk berbagai macam kebutuhan, diantaranya:

Isolasi GenKita tahu bahwa DNA makhluk hidup memiliki ukuran yang sangat besar, DNA manusia saja panjangnya sekitar 3 miliar basa, dan di dalamnya mengandung ribuan gen. Oh ya, gen itu apaan ya?

Sebagaimana kita tahu bahwa fungsi utama DNA adalah sebagai sandi genetik, yaitu sebagai panduan sel  dalam memproduksi  protein,  DNA ditranskrip  menghasilkan  RNA,  RNA kemudian  diterjemahkan untuk menghasilkan rantai asam amino alias protein. Dari sekian panjang DNA genome, bagian yang menyandikan protein  inilah yang disebut gen,  sisanya tidak menyandikan protein atau disebut  ‘junk DNA’, DNA ‘sampah’ yang fungsinya belum diketahui dengan baik.

Kembali  ke pembahasan  isolasi  gen,  para ahli  seringkali  membutuhkan gen tertentu untuk diisolasi. Sebagai contoh, dulu kita harus mengekstrak insulin langsung dari pancreas sapi atau babi, kemudian 

menjadikannya obat diabetes,  proses yang rumit  dan tentu saja mahal  serta memiliki  efek samping karena insulin dari sapi atau babi tidak benar-benar sama dengan insulin manusia.

Berkat   teknologi   rekayasa   genetik,   kini  mereka   dapat  mengisolasi   gen   penghasil   insulin   dari   DNA genome   manusia,   lalu   menyisipkannya   ke   sel   bakteri   (dalam   hal   ini   E.   coli)   agar   bakteri   dapat memproduksi   insulin   juga   [http://www.littletree.com.au/dna.htm].   Dan   ajaib!  Hasilnya   insulin   yang sama persis dengan yang dihasilkan dalam tubuh manusia, dan sekarang insulin tinggal diekstrak dari bakteri,   lebih   cepat,  mudah,   dan   tentunya   lebih   murah   ketimbang   cara   konvensional   yang   harus ‘mengorbankan’ sapi atau babi.

Nah, untuk mengisolasi gen, diperlukan DNA pencari atau dikenal dengan nama ‘probe’ yang memiliki urutan basa nukleotida sama dengan gen yang kita inginkan. Probe ini bisa dibuat dengan teknik PCR menggunakan primer yang sesuai dengan gen tersebut.

DNA SequencingUrutan   basa   suatu   DNA   dapat   ditentukan   dengan   teknik   DNA   Sequencing,   metode   yang   umum digunakan   saat   ini   adalah   metode   Sanger   (chain   termination   method)   yang   sudah   dimodifikasi menggunakan dye-dideoxy terminator, dimana proses awalnya adalah reaksi PCR dengan pereaksi yang agak berbeda, yaitu hanya menggunakan satu primer (PCR biasa menggunakan 2 primer) dan adanya tambahan  dideoxynucleotide   yang  dilabel  fluorescent.  Karena  warna  fluorescent  untuk   setiap  basa berbeda, maka urutan basa suatu DNA yang tidak diketahui bisa ditentukan.

ForensikIdentifikasi   seseorang   yang   terlibat   kejahatan   (baik   pelaku   maupun   korban),   atau   korban kecelakaan/bencana kadang sulit  dilakukan.  Jika  identifikasi  secara fisik sulit  atau tidak mungkin lagi dilakukan,  maka   pengujian   DNA   adalah   pilihan   yang   tepat.   DNA  dapat   diambil   dari   bagian   tubuh manapun,  kemudian dilakukan analisa  PCR untuk  mengamplifikasi  bagian-bagian tertentu DNA yang disebut fingerprints alias DNA sidik jari, yaitu bagian yang unik bagi setiap orang. Hasilnya dibandingkan dengan DNA sidik jari keluarganya yang memiliki pertalian darah, misalnya ibu atau bapak kandung. Jika memiliki kecocokan yang sangat tinggi maka bisa dipastikan identitas orang yang dimaksud.

Konon   banyak   kalangan   tertentu   yang   memanfaatkan   pengujian   ini   untuk   menelusuri   orang   tua ‘sesungguhnya’ dari seorang anak jika sang orang tua merasa ragu.

Diagnosa PenyakitPenyakit Influenza A (H1N1) yang sebelumnya disebut flu babi sedang mewabah saat ini, bahkan satu fase lagi dari fase pandemi. Penyakit berbahaya seperti ini memerlukan diagnosa yang cepat dan akurat.

PCR   merupakan   teknik   yang   sering   digunakan.   Teknologi   saat   ini   memungkinkan   diagnosa   dalam hitungan jam dengan hasil  akurat.  Disebut akurat karena PCR mengamplifikasi  daerah tertentu DNA yang merupakan ciri khas virus Influenza A (H1N1) yang tidak dimiliki oleh virus atau makhluk lainnya.

Masih   banyak   aplikasi   PCR   lainnya   yang   sangat   bermanfaat.   Maka   tak   salah   panitia   Nobel menganugrahkan hadiah Nobel bidang kimia yang bergengsi  ini kepada Kary B Mullis hanya 9 tahun setelah penemuannya (1993).

Jenis2 PCR

Reaksi   berantai   polimerase   atau   lebih   umum   dikenal   sebagai   PCR   (Polymerase   Chain Reaction)merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme. Dengan teknik ini, DNA dapat dihasilkan dalam jumlah besar dengan waktu relatif singkat sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA. Teknik ini dirintis oleh Kary Mullis pada tahun 1983. Penerapan PCR banyak dilakukan di bidang biokimia dan biologi molekuler karena relatif   mudah   dan   hanya   memerlukan   jumlah   sampel   yang   kecil.PCR adalah suatu teknik yang melibatkan beberapa tahap yang berulang (siklus) dan pada setiap siklus terjadi   duplikasi   jumlah   target   DNA   untai   ganda.   Untai   ganda   DNA   template   (unamplified   DNA) dipisahkan dengan denaturasi termal dan kemudian didinginkan hingga mencapai suatu suhu tertentu untuk memberi waktu pada primer menempel (anneal primers) pada daerah tertentu dari target DNA. Polimerase   DNA  digunakan   untuk  memperpanjang   primer   (extend   primers)   dengan   adanya   dNTPs (dATP, dCTP, dGTP dan dTTP) dan buffer yang sesuai. Umumnya keadaan ini dilakukan antara 20 – 40 siklus. Target DNA yang diinginkan (short ”target” product) akan meningkat secara eksponensial setelah siklus keempat dan DNA non-target (long product) akan meningkat secara linier seperti tampak pada bagan di atas.

Real-Time PCR

Real-Time PCR merupakan suatu perangkat platform instrumentasi, yang terdiri atas satu buah thermal cycler, satu buah komputer, lensa untuk eksitasi fluoresen dan pengumpul emisi, serta perangkat lunak untuk akuisisi  dan analisis  data.  Prinsip kerja Real-Time PCR adalah mendeteksi  dan menguantifikasi reporter fluoresen. Sinyal fluoresen akan meningkat seiring dengan bertambahnya produk PCR dalam reaksi.  Dengan mencatat   jumlah emisi  fluoresen pada setiap siklus,   reaksi  selama fase eksponensial dapat dipantau. Peningkatan produk PCR yang signifikan pada fase eksponensial berhubungan dengan jumlah   inisiasi   gen   target.Berbeda dengan PCR konvensioal,  pada real-time PCR tahap deteksi  dan tahap penggandaan materi genetik dilakukan secara bersamaan (simultan), deteksi produk PCR dilakukan pada fase eksponensial sehingga hasil yang diperoleh berada pada rentang daerah dengan presisi hasil tinggi. Selain itu, deteksi dilakukan   menggunakan   pelacak   bertanda   fluoresense.   Pelacak   adalah   reagen   yang   menentukan kespesifikan hasil.  Penggunaan fluoresense dalam tahap deteksi  menawarkan sensitivitas yang tinggi. Dengan demikian, real time PCR menawarkan sensitivitas yang tinggi dan rentang linearitas yang cukup luas sehingga hasil  penentuan kandungan DNA atau RNA di dalam spesimen menjadi sangat akurat. Contoh produk komersial yang menggunakan real time PCR yaitu Cobas Taqman.

Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (Rt-Pcr)

RT-PCR  merupakan   singkatan   Reverse   Transcription   Polymerase   Chain   Reaction.   Seperti   namanya, proses RT-PCR merupakan bagian dari  proses PCR biasa. Perbedaanya dengan PCR yang biasa,  pada proses   ini   berlangsung   satu   siklus   tambahan   yaitu   adanya   perubahan   RNA   menjadi   cDNA (complementary DNA) dengan menggunakan enzim Reverse Transkriptase. Reverse Transcriptase adalah suatu   enzim   yang   dapat   mensintesa   molekul   DNA   secara   in   vitro   menggunakan   template   RNA.Seperti halnya PCR biasa, pada pengerjaan RT-PCR ini juga diperlukan DNA Polimerase, primer, buffer, dan dNTP. Namun berbeda dengan PCR, template yang digunakan pada RT-PCR adalah RNA murni. Oleh karena primer juga dapat menempel pada DNA selain pada RNA, maka DNA yang mengkontaminasi proses ini harus dibuang. Untuk proses amplifikasi mRNA yang mempunyai poly(A) tail pada ujung 3′, maka oligo  dT,   random heksamer,  maupun primer   spesifik  untuk  gen  tertentu  dapat  dimanfaatkan untuk   memulai   sintesa   cDNA.Reverse transcriptase biasanya digunakan untuk mensintesis rantai pertama cDNA dari  RNA. Reverse transkriptase dapat dipurifikasi  dari  beberapa sumber, seperti: avian myeloblastosis virus (AMV) dan Molones   murine   leucemia   virus   (MMLV).   AMV   reverse   transkriptase   adalah   RNA-dependent   DNA plimerase yang menggunakan RNA rantai tunggal sebagai template dan dapat mensintesis cDNA dengan arah 5’→3’ jika terdapat primer. Sama seperti aktivitas DNA polimerase.

Nested PCR

Nested PCR adalah suatu teknik perbanyakan replikasi sampel DNA menggunakan bantuan enzim DNA polymerase yang menggunakan dua pasang primer untuk mengamplifikasi fragmen. Pasangan primer yang pertama akan mengamplifikasi  fragmen yang cara kerjanya mirip dengan PCR pada umumnya. Pasangan primer yang kedua biasanya disebut nested primers ( sepasang primer tersebut terletak di dalam   fragmen   pertama)   yang   berikatan   di   dalam   fragmen   produk   PCR   yang   pertama   untuk memungkinkan terjadinya amplifikasi produk PCR yang kedua dimana hasilnya lebih pendek dari yang pertama.Nested  PCR  adalah  PCR  yang  sangat   spesifik  dalam melakukan  amplifikasi   karena   jika  ada fragmen yang salah diamplifikasi maka kemungkinan bagian tersebut diamplifikasi untuk kedua kalinya oleh   primer   yang   kedua   sangat   rendah.Nested PCR merupakan variasi dari reaksi polymerase chain reaction (PCR) biasa. Nested PCR dan PCR biasa sama-sama berguna untuk  mempernanyak  fragmen DNA tertentu dalam jumlah banyak.  Pada nested PCR digunakan 2 pasang primer sedangkan pada PCR biasa hanya menggunakan 1 pasang primer. Oleh karena itu, hasil fragmen DNA dari nested PCR lebih spesifik (lebih pendek) dibandingkan dengan PCR biasa. Waktu yang diperlukan dalam reaksi nested PCR lebih lama daripada PCR biasa karena pada nested PCR pada nested PCR dilakukan 2 kali reaksi PCR sedangkan pada PCR biasa hanya 1 kali reaksi PCR.   Selain   itu   ,   keuntungan   nested   PCR   adalah  meminimalkan   kesalahan   amplifikasi   gen   dengan menggunakan   2   pasang   primer.Prinsip   kerja   nested   PCR   tidak   jauh   berbeda   dengan   PCR   biasa,   namun   nested   PCR   akan   bekerja menggunakan 2 pasang primer untuk mengamplifikasi fragmen DNA spesifik melalui 2 proses PCR secara terpisah.Pertama-tama DNA mengalami denaturasi lalu memasuki fase penempelan, diaman sepasang primer pertama melekat di kedua utas tunggal DNA dan mengamplifikasi DNA diantara kedua primer tersebut dan terbentuklah produk PCR pertama. Kemudian produk PCR pertama tersebut dijalankan pada proses PCR kedua dimana pasangan primer kedua (nested primer)akan mengenali  sekuen DNA 

spesifik yang berada di dalam fragmen produk PCR pertama dan memulai amplifikasi bagian diantara kedua primer tersebut. Hasilnya adalah sekuens DNA yang lebih pendek daripada sekuens DNA hasil PCR pertama.

Multiplex PCR

Multiplex PCR digunakan untuk mendeteksi beberapa target DNA sekaligus. Multiplex PCR merupakan beberapa set primer dalam campuran PCR tunggal untuk menghasilkan amplikon dari berbagai ukuran yang spesifik untuk sekuens DNA yang berbeda. Dengan penargetan gen sekaligus, informasi tambahan dapat  diperoleh dari   lari-tes   tunggal  yang tidak akan membutuhkan beberapa kali   reagen dan  lebih banyak   waktu   untuk   melakukan.   Temperatur   Annealing   untuk   masing-masing   set   primer   harus dioptimalkan   untuk   bekerja   dengan   benar   dalam   reaksi   tunggal,   dan   ukuran   amplikon.   Artinya, panjangnya   pasangan   basa   harus   berbeda   cukup   untuk   membentuk   band   yang   berbeda   ketika divisualisasikan dengan elektroforesis gel .

ELISA PCR

Teknik PCR-ELOSA adalah suatu metode untuk mendeteksi suatu segmen nukleotida menggunakan PCR dan   ELISA.   Amplikon  PCR  didenaturasi,   diimobilisasi   pada  microwell   plate   lalu   diidentifikasi   secara hibridisasi   DNA   dan   imunologis   (ELISA).   Sejumlah   istilah   telah   digunakan   untuk   teknik   tersebut diantaranya   PCR   and   DIG-ELISA   detection,   ELISA-based   oligonucleotide   ligation   assay, PCRoligonucleotide ligation assay, DIAPOPS (Detection of immobilised amplified products in one phase system).PCR-ELISA merupakan metode yang digunakan untuk menangkap asam nukleat yang meniru prinsip dari enzim linked immunosorbant yang terkait. Dimana dalam sebuah pengujian hibridisasi hasil produk dari PCR akan terdeteksi dengan metode ini. Dengan metode inilah dapat dilakukan pengukuran sequen internal pada produk PCR. Metode ini lebih dipilih karena lebih murah dibandingkan metode Real Time PCR. PCR-ELISA telah digunakan sejak akhir 1980-an dan telah berkembang untuk mendeteksi sequen tertentu dalam produk PCR. Meskipun banyak metode yang tersedia untuk mendeteksi sequen tersebut, ELISA PCR berguna untuk mendeteksi dan membedakan antara beberapa sasaran dari sequen yang diinginkan. ELISA PCR ini juga berguna untuk screening beberapa sampel, terutama bila jumlah sampel tidak menjamin. Salah satu aspek yang paling berguna dari PCR-ELISA adalah kemampuannya dalam  membedakan   antara   produk   reaksi   perubahan  polimerase   yang   dihasilkan   dari   seperangkat primer yang mengandung variasi sequen, yaitu sequen yang bervariasi antar primer.

Random amplified polymorphic DNA (RAPD)

RAPD adalah teknik molekuler untuk mendeteksi keragaman DNA didasarkan pada penggandaan DNA (Griffiths   et   al.1999).   RAPD   juga   merupakan   penanda   DNA   yang   memanfaatkan   primer   acak oligonukleotida   pendek   (dekamer)   untuk   mengamplifikasi   DNA   genom   organisme.

Prinsip teknik RAPD didasarkan pada kemampuan primer menempel pada cetakan DNA. Primer yang didesain berupa primer tunggal pendek agar dapat menempel secara acak pada DNA genom organisme. Dengan demikian akan terdapat banyak pola fragmen DNA. Perbedaan ini dapat dilihat dengan adanya pola   pita   pada   gel   agarosa   setelah   diwarnai   dengan   pewarnaan   DNA   seperti   etidium   bromide.Disamping ditentukan oleh ada tidaknya situs penempelan primer, keberhasilan teknik ini ditentukan juga oleh kemurnian dan keutuhan DNA cetakan.  DNA cetakan yang tidak murni  akan mengganggu penempelan primer pada situsnya dan akan menghambat aktifitas enzim polymerase DNA. Enzim ini berfungsi   untuk   melakukan   polimerisasi   DNA.   Sedangkan   DNA   cetakan   yang   banyak   mengalami fragmentasi   dapat   menghilangkan   situs   penempelan   primer.Data  pita  DNA hasil  RAPD umumnya dianalisis  dengan  mengubah menjadi  data  biner   satu  dan nol berdasarkan ada atau tidak adanya pita. Primer acak yang digunakan jumlahnya dapat banyak dan tidak terbatas sehingga data biner yang terbentuk berupa matriks biner peubah ganda (Roslim et al.2002).

Keunggulan teknik RAPD terletak pada beberapa kemudahan sebagai berikut:1. Pengetahuan latar belakang genom organisme tidak diperlukan2. Hasil RAPD dapat diperoleh secara cepat terutama jika dibandingkan dengan analisis RFLP yang memerlukan banyak tahapan3. Beberapa jenis primer arbitrary dapat dibeli dan digunakan untuk analisis genom semua organisme (Welsh dan McCleland 1990; Williams et al.1990).

Dilaporkan  untuk  keperluan  analisis  kekerabatan  antar  genotipe  tanaman,   teknik  RAPD mempunyai resolusi   yang   sebanding   dengan   teknik   RFLP   (dos   Santos   et   al.1994).Jumlah primer yang diperlukan dalam analisis sangat bergantung pada tujuan atau jenis informasi yang diinginkan. Jika tujuannya untuk mengungkapkan hubungan kekerabatan, maka analisisnya tidak dapat bertumpu pada satu atau beberapa karakter saja. Dalam hal tersebut Hallden et al.1994 melaporkan bahwa semakin banyak jumlah primer yang digunakan, semakin rendah nilai koefisien keragaman hasil analisis yang diperoleh. Sepuluh sampai dengan dua puluh primer dianggap sudah mencukupi untuk keperluan  analisis  kekerabatan  karena  dengan sepuluh primer  pengaruh kesalahan percobaan telah diperkecil   hingga   mendekati   nol.

Kelemahan RAPD sebagai berikut:1. Pemunculan pita DNA kadang – kadang tidak konsisten. Hal ini lebih sering terjadi jika suhu annealing yang digunakan terlalu tinggi. Dalam analisis kekerabatan hal ini dapat diatasi dengan menggunakan primer yang lebih banyak.2. Ruas DNA yang berulang sering berlipat ganda 3. Homologi urutan nukleotida pada pita-pita DNA dengan mobilitas yang sama pada gel tidak diketahui 4. Penanda RAPD bersifat dominan

Amplified fragment lengh polymorphism (AFLP)

AFLP merupakan teknik amplifikasi DNA yang segera dapat dilihat perbedaan fragmennya setelah PCR melalui gel agarose atau poliakrilamid. Teknik ini dapat digunakan untuk melihat adanya fragmen DNA 

yang berbeda karena adanya insersi ataupun delesi basa nukleotida dalam jumlah yang cukup besar. AFLP merupakan teknik yang lebih sensitive dari RAPD untuk menghasilkan polimorfisme antar genotip. AFLP banyak digunakan di antaranya untuk mendeteksi sifat-sifat yang berhubungan erat dengan lokus suatu   karakter   tertentu,   sidik   jari   DNA,   keragaman   genetic   (Vandenmark   1999),   penelusuran   pola segregasi   (Singh   dan   Cheah   1996),   penelusuran   hasil   mutasi,   menetapkan   jarak   genetic   dan mengidentifikasi keterpautan gen dengan resistensi penyakit (Scott et al.2000). AFLP memiliki beberapa kelebihan dibandingkan dengan RAPD antara lain amplifikasi DNA dapat bersifat spesifik dan lebih stabil (Vos  et   al.1995).  Cabrita  et   al.   (2001)  menyatakan  bahwa  AFLP  dapat  digunakan  untuk  mengenali hubungan  kekerabatan  yang  sangat  dekat  antar-genotip,  perbedaan antar  klon dalam satu  kultivar, keragaman yang disebabkan terjadinya mutasi yang sangat sedikit, atau adanya perbedaan genetik yang sangat   kecil.Fragmen yang dihasilkan dari analisis AFLP yang tampak sebagai pita DNA diterjemahkan menjadi data biner  berdasarkan ada atau tidaknya pita  yang dimiliki  secara bersama oleh  individu  tanaman yang dianalisis. Nilai satu (1) diberikan untuk yang memiliki pita dan nilai nol (0) untuk yang tidak memiliki pita.

Restriction fragment length polymorphism (RFLP)

RFLP merupakan teknik PCR yang menggunakan enzim restriksi untuk mendeteksi keragaman DNA. Amplikon dipotong dengan menggunakan enzim restriksi untuk mendapatkan fragmen DNA. Enzim restriksi yang umumnya digunakan yaitu enzim yang biasanya ditemukan pada organisme prokariotik. Organisme yang menghasilkan enzim restriksi endonuklease mampu melindungi genomnya sendiri dari metilasi nuklotida di dalam sekuen endonuklease yang dikenali. Secara umum ada dua macam tipe enzim restriksi yaitu:

1. Enzim yang mengenali sekuen spesifik tetapi memotong dibeberapa tempat2. Enzim yang memotong hanya pada situs yang dikenaliTipe enzim yang kedua yaitu enzim yang sangat penting. Umumnya sekuen potongannya diketahui. Biasanya panjangnya enzim restriksi ini 4 sampai 6 nukleotida.

Enzim pada kelompok ini membuat bentuk potongan yang berbeda yaitu:a. Bentuk potongan yang lancipb. Bentuk potongan yang tumpulSangat penting untuk mengenali enzim pemotong ini karena bersifat sangat spesifik dalam memotong sekuen nukleotida yang dikenalinya.

Parameter yang perlu diperhatikan dalam menggunakan teknik ini yaitu:1. Kemurnian DNASecara umum enzim restriksi sangat efisien dalam memotong situs DNA namun tegantung pada kemurnian DNA. Adanya kontaminasi seperti protein lain, fenol, kloroform, etanol, EDTA, SDS, konsentrasi garam yang tinggi dapat menjadi penghambat reaksi enzim restriksi.2. Buffer enzim restriksi

Untuk tiap-tiap enzim restriksi dibuat kondisi reaksi yang optimal oleh pabrik pembuat enzim.3. Faktor lainJumlah yang besar kadang-kadang diperlukan untuk memotong DNA sirkular pada plasmid atau DNA virus dibandingkan untuk memotong DNA linier

RT-PCR

Reverse transcriptase-PCR (RT-PCR) merupakan metode yang digunakan untuk mengamplifikasi cDNA dari mRNA. RT-PCR digunakan untuk mendapatkan kembali  dan menyalin utas 5’ dan 3’ dari mRNA, menghasilkan kumpulan cDNA yang banyak dari jumlah mRNA yang sangat sedikit. RT-PCR dapat dengan mudah digunakan untuk mengidentifikasi mutasi, polimorphisme dan mengukur kekuatan ekspresi gen. Konsep utama yang digaris bawahi pada teknik ini yaitu mengkonversi mRNA ke bentuk rantai tunggal untuk   cetakan   cDNA.   Primer   Oligodeoxynukleotida   di   hibridisasikan   ke   sehingga   cDNA   dapat teramplifikasi.   Tergantung  pada  tujuan  penelitian,  primer  untuk   sintesi   cDNA rantai  pertama  dapat disusun secara khusus untuk hibridisasi gen target atau dapat mengikat secara umum semua mRNA.Teknik RT-PCR memerlukan enzim transcriptase balik (reverse transcriptase). Enzim transcriptase balik adalah enzim DNA polymerase yang menggunakan molekul  RNA sebagai  cetakan untuk  mensintesis molekul DNA (cDNA) yang komplementer dengan molekul RNA tersebut. Beberapa enzim transcriptase balik yang dapat digunakan antara lain mesophilic viral reverse transcriptase (RTase) yang dikode oleh virus avian myoblastosis (AMV) maupun oleh virus moloney murine leukemia (M-MuLV), dan Tth DNA polymerase.   RTase   yang   dikode   oleh   AMV   maupun   M-MuLV   mampu   mensintesis   cDNA   sampai sepanjang 10 kb, sedangkan Tth DNA polymerase mampu mensintesis cDNA sampai sepanjang 1 – 2 kb.Berbeda dengan Tth DNA polymerase, enzim RTase AMV dan M-MuLV mempunyai aktivitas RNase H yang   akan   menyebabkan   terjadinya   degradasi   RNA   dalam   hybrid   RNA:   cDNA.   Aktivitas   degradasi semacam ini akan berkurang jika berkompetisi dengan proses sintesis DNA selama proses produksi untai pertama  cDNA.  Enzim  RTase  yang  berasal  dari  M-MuLV  mempunyai   aktivitas  RNasse  H  yang   lebih rendah   disbanding   dengan   yang   berasal   dari   AMV.Enzim M-MuLV mencapai aktivitas maksimum pada suhu 37°C sedangkan enzim AMV pada suhu 42°C dan Tth DNA polymerase mencapai aktivitas maksimum pada suhu 60 - 70°C. Penggunanaan enzim M-MuLV kurang menguntungkan jika RNA yang digunakan sebagai cetakan mempunyai struktur sekunder yang ekstensif. Di lain pihak, penggunaan Tth DNA polymerase kurang menguntungkan jika ditinjau dari kebutuhan enzim ini terhadap ion Mn karena ion Mn dapat mempengaruhi ketepatan (fidelity) sintesis DNA. Meskipun demikian, enzim Tth DNA polymerase mempunyai keunggulan karna dapat digunakan untuk   reaksi   transkripsi   balik   sekaligus   proses   PCR   dalam   satu   langkah   reaksi.Reaksi   transkripsi   balik   dapat   dilakukan   dengan   menggunakan   beberapa   macam   primer   yaitu:1. Oligo (dT) sepanjang 12 – 18 nukleotida yan akan melekat pada ekor poli (A) pada ujung 3’ mRNA mamalia.   Primer   semacam   ini   pada   umumnya   akan   menghasilkan   cDNA   yang   lengkap2.  Heksanukleotida  acak   yang  akan  melekat  pada   cetakan  mRNA  yang  komplementer  pada  bagian manapun.   Primer   semacam   ini   akan   menghasilkan   cDNA   yang   tidak   lengkap   (parsial).3.  Urutan  nukleotida  spesifik  yang  dapat  digunakan  secara   selektif  untuk  menyalin  mRNA  tertentu (Yuwono T 2006).

Single strand conformation polimorphim (SSCP)

Single   strand conformation polimorphims  merupakan salah  satu   teknik  PCR yang dapat  mendeteksi perbedaan   nukleotida   dari   DNA   produk   PCR   dengan   perbedaan   satu   nukleotida.   Metode   ini memanfaatkan perbedaan laju migrasi utas tunggal DNA setelah didenaturasi dalam formamide dye dan perlakuan panas pada gel poliakrilamid yang diikuti dengan pewarnaan perak (Sambrook et al.1989). Metode SSCP dikenalkan pada tahun 1989 sebagai alat deteksi baru untuk polimorphisme DNA, variasi sekuen, SSCP menawarkan suatu yang murah, gampang dan metode yang sensitive terhadap variasi genetic   (Sunnucks   et   al.2000).Gerakan pita ganda DNA pada gel elekroforesis pada umumnya tergantung pada ukuran dan panjang basa. Sedangkan gerakan pita tunggal sangat jelas dipengaruhi oleh perubahan yang sangat kecil dalam sekuen. Perubahan yang sangat kecil jelas terjadi karena secara alami pita tunggal tidak stabil. Dengan demikian  dapat   terjadi   lekukan karena ada atau tidak adanya pita  pasangannya yang menyebabkan pasangan basa  terletak  diantara pita  dan menghasilkan  struktur  pita  3D yang unik.  Perubahan satu nukleotida   berpengaruh   terhadap   gerakan   dalam   gel   elektroforesis.Untuk  mendapatkan pita   tunggal,  amplikon dipanaskan  pada suhu tinggi  dan kemudian  didinginkan secara mendadak. Pita tunggal yang diperoleh dirunning pada gel poliakrilamida.

Polymerase Chain Reaction (PCR)

A. Pengertian PCRReaksi Polimerase Berantai  atau dikenal sebagai Polymerase Chain Reaction (PCR), merupakan suatu proses  sintesis  enzimatik untuk  melipatgandakan  suatu  sekuens  nukleotida tertentu  secara  in  vitro. Metode ini dikembangkan pertama kali oleh Kary B. Mulis pada tahun 1985. Metode ini sekarang telah banyak digunakan untuk berbagai macam manipulasi dan analisis genetic. Pada awal perkembanganya metode ini hanya digunakan untuk melipatgandakan molekul DNA, tetapi kemudian dikembangkan lebih lanjut sehingga dapat digunakan pula untuk melipatgandakan dan melakukan kuantitas molekul mRNA. Dengan menggunakan metode PCR dapat meningkatkan jumlah urutan DNA ribuan bahkan jutaan kali dari jumlah semula, sekitar 106-107 kali. Setiap urutan basa nukleotida yang diamplifikasi akan menjadi dua kali jumlahnya. Pada setiap  siklus PCR akan diperoleh 2n kali banyaknya DNA target. Kunci utama pengembangan PCR adalah menemukan bagaimana cara amplifikasi hanya pada urutan DNA target dan meminimalkan   amplifikasi   urutan   non-target.   Metode   PCR   dapat   dilakukan   dengan   menggunakan komponen dalam jumlah yang sangat sedikit, misalnya DNA cetakan yang diperlukan hanya sekitar 5µg, oligonukliotida yang digunakan hanya sekitar 1 mM dan reaksi ini biasa dilakukan dalam volume 50-100 µl.  DNA cetakan yang digunakan  juga tidak perlu  dimurnikan  terlebih dahulu sehingga  metode PCR dapat   digunakan   untuk   melipatgandakan   suatu   sekuens   DNA   dalam   genom   bakteri.Konsep asli teknologi PCR mensyaratkan bahwa bagian tertentu sekuen DNA yang akan dilipatgandakan harus diketahui terlebih dahulu sebelum proses pelipatgandaan tersebut dapat dilakukan. Sekuen yang diketahui tersebut penting untuk menyediakan primer, yaitu suatu sekuens oligonukleotida pendek yang berfungsi mengawali sintesis rantai DNA dalam reaksi berantai polimerasi.

B. Komponen – Komponen PCR

Ada beberapa macam komponen utama dalam proses PCR, yaitu antara lain:1. DNA cetakan    DNA cetakan, yaitu fragmen DNA yang akan dilipatgandakan.  Fungsi DNA templat di dalam proses PCR adalah sebagai cetakan untuk pembentukan molekul DNA baru yang sama. Templat DNA ini dapat berupa DNA kromosom, DNA plasmid ataupun fragmen DNA apapun asal di dalam DNA templat tersebut mengandung fragmen DNA target yang dituju.    Reaksi pelipatgandaan suatu fragmen DNA dimulai dengan melakukan denaturasi DNA template (cetakan) sehingga rantai DNA yang berantai ganda (double stranded) akan terpisah menjadi rantai tunggal (single stranded). Denatirasi DNA dilakukan dengan menggunakan panas  selama 1 – 2 menit, kemudian suhu diturunkan menjadi sekitar   sehingga primer akan “menempel” (annealing) pada cetakan yang telah terpisah menjadi rantai tunggal. Primer akan membentuk jembatan hydrogen dengan cetakan pada daerah sekuen yang komplementer dengan dengan sekuen primer. Suhu   yang digunakan untuk penempelan primer pada dasarnya merupakan kompromi. Amplifikasi akan lebih efisien jika dilakukan pada suhu yang lebih rendah ( ).2. Oligonukleotida primerOligonukleotida primer, yaitu suatu sekuen oligonukleotida pendek (15 – 25 basa nukleotida) yang digunakan untuk mengawali sintesis rantai DNA. Primer yang digunakan dalam PCR ada dua yaitu oligonukleotida yang mempunyai sekuen yang identik dengan salah satu rantai DNA cetakan pada ujung 5’-fosfat, dan oligonukleotida yang kedua identik dengan sekuen pada ujung 3’OH rantai DNA cetakan yang lain. Proses annealing biasanya dilakukan selama 1 – 2 menit. Setelah dilakukan annealing oligonukleotida primer dengan DNA cetakan, suhu inkubasi dinaikkan menjadi   selama 1,5 menit. Pada suhu ini DNA polymerase akan melakukan proses polimerasi rantai DNA yang baru berdasarkan informasi yang ada pada DNA cetakan. Setelah terjadi polimerasi, rantai DNA yang baru akan membentuk jembatan hydrogen dengan DNA cetakan. DNA rantai ganda yang terbentuk dengan adanya ikatan hydrogen antara rantai DNA cetakan dengan rantai DNA yang baru hasil polimerasi selanjutnya akan didenaturasi lagi dengan menaikkan suhu ingkubasi menjadi   . Rantai DNA yang baru tersebut selanjutnya akan berfungsi sebagai cetakan bagi reaksi polimerasi berikutnya.Reaksi-reaksi seperti yang sudah dijelaskan tersebut diulangi lagi sapai 25 – 30 klai (siklus) sehingga pada akhir siklus akan didapatkan molekul-molekul DNA rantai ganda yang baru hasil polimerasi dalam jumlah yang lebih banyak dibandingkan dengan jumlah DNA cetakan yang digunakan. Banyaknya siklus amplifikasi tergantung pada kosentrasi DNA target di dalam campuran reaksi. Paling tidak, diperlukan 25 siklus untuk melipatgandakan satu kopin sekuen DNA target di dalam genom mamalia agar hasilnya dapat dilihat secara langsung, misalnya dengan elektroforosis gel agarose. Akan tetapi, pada umumnya kosentrasi DNA polimerasi Taq menjadi terbatas setelah 25 – 30 siklus amplikasi.3. Deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP)Shanghai ShineGene Molecular Biotech,Inc. (2009) menyatakan bahwa campuran dNTP adalah larutan air pada pH 7,0 yang mengandung dATP, dCTP, dGTP dan dTTP, masing-masing pada konsentrasi akhir baik 10mm atau 25mm. dNTP yang siap digunakan merupakan solusi yang dirancang untuk menghemat  waktu dan untuk menyediakan reproduktifitas yang lebih tinggi  dalam aplikasi PCR dan lainnya. 4. DNA PolimerasePada awal perkembangannya, DNA polymerase yang digunakan dalam PCR adalah fragmen Klenow DNA polymerase I yang berasal dari Escherichia coli (Mullis dan Fallona, 1989). Fragmen Klenow adalah DNA 

polymerase yang telah dihilangkan aktivitas eksonuklease (5’ → 3’)-nya. Beberapa kelemahan fragmen Klenow antara lain adalah bahwa enzim ini tidak tahan panas, laju polemerase untuk menggabungkan nukleotida dengan suatu primer secara terus-menerus tanpa terdisosiasi dari komplek primer-DNA cetakan. Hampir semua DNA polymerase mempunyai prosesivitas yang rendah sehingga akan terdisosiasi dari komplek primer-DNA cetakan setelah menggabungkan kurang dari 10 nukleotida. Salah satu perkecualian adalah T7 DNA polymerase yang mampu menggabungkan ribuan nukleotida tanpa terdisosiasi dari komplek primer-DNA cetakan.

a.    Taq DNA PolimeraseTaq DNA polymerase yang beraasal dari bakteri Thermus aquaticus BM, yaitu suatu strain yang tidak mempunyai endonuklease retriksi TaqI. Taq DNA polymerase tersusun atas satu rantai polipeptida dengan berat molekul kurang lebih 95 kD. Enzim ini mempunyai kemampuan polimerasi DNA yang sangat tinggi, tetapi tidak mempunyai aktivitas eksonuklease 3’ → 5’. Enzim ini paling aktif pada pH9 (pada suhu 200 C) dan suhu aktivitas optimumnya sekitar 750C – 800C.Kelebihan enzim Taq DNA polimerase adalah bahwa enzim ini tahan terhadap suhu tinggi yang diperlukan untuk memisahkan rantai DNA cetakan. Dengan kelebihan semacam ini maka tidak diperlukan penambahan enzim pada tiap-tiap siklus PCR seperti yang harus dilakukan kalau enzim yang dig unakan adalah fragmen Klenow DNA polymerase I (Gelfand dan White, 1990). Kelebihan lain enzim Taq DNA polymerase adalah laju polimerasinya yang sangat tinggi serta prosesivitasnya yang juga lebih tinggi  disbanding dengan fragmen Klenow.Taq DNA polymerase mempunyai suhu optimum yang tinggi untuk sintesis DNA yaitu 75 – 80  ͦC. aktivitas spesifik enzim ini dalam menggabungkan nukleotida mencapai 150 nukleotida per detik per molekul enzim. Waktu paruh (half-time) Taq DNA polymerase pada suhu 95  ͦC adalah 40 menit (Gelfand dan White, 1990). Deterjen non-ionik Tween 20 (0,5 -1 %) dapat digunakan untuk meningkatkan efisiensi Taq DNA polymerase. Senyawa tambahan lain yang juga dapat meningkatkan efisiensi polimerasi Taq DNA polymerase adalah DMSO, gelatin, gliserol, dan ammonium sulfat.Salah satu kelemahan enzim Taq DNA polymerase adalah bahwa enzim tersebut mempunyai potensi untuk melakukan kesalahan dalam menggabungkan nukleotida sehingga ada kemungkinan terjadi mutasi pada fragmen gen hasil amplifikasi. Meskipun demikian dengan kondisi yang tepat, kesalahan penggabungan nukleotida semacam itu tidak terjadi seperti misalnya hasil amplifikasi fragmen gen HIV-1 (5400 nukleotida) dengan siklus amplifikasi 30 kali. Demikian juga halnya dengan hasil amplifikasi gen ß-globin (14990 nukleotida). Dengan demikian , rata-rata frekuensi kesalahan penggabungan nukleotida sekitar 5 X   kesalahan per nukleotida yang digabungkan per siklus, dengan menggunakan 25 siklus.Taq DNA polymerase mempunyai keunikan yaitu bahwa enzim ini mampu menambahkan satu nukleotida,terutama dATP, pada ujung  -3’ fragmen DNA hasil polimerasi meskipun tanpa ada cetakanya. Dengan demikian, ujung fragmen DNA hasil polimerasi dengan metode PCR pada umumnya tidak pepat (blunt-ended), melainkan ada tambahan satu nukleotida pada kedua ujungnya. Kenyataan semacam ini mempunyai implikasi penting karena fragmen DNA hasil polimerasi dengan metode PCR dapet diligase dengan suatu plasmid vector tertentu tanpa menggunakan enzim DNA ligase. Hal ini juga perlu diperhatikan jika frag men DNA hasil PCR akan diligasikan dengan suatu plasmid dengan metode ligasi pepat (blunt-ended ligation). Sebelum dilakukan ligasi , fragmen DNA tersebut harus dibuat pepat/tumpul dengan menggunakan aktivitas polymerase 5’ → 3’ fragmen Klenow.

Aktivitas Taq DNA polymerase dipengaruhi oleh kosentrasi ion magnesium. Aktivitas Taq DNA polymerase mencapai maksimal pada kosentrasi    sebesar 2,0 mM jika kosentrasi dNTP yang digunakan adalah 0,7 – 0,8 mM. kosentrasi   lebih tinggi dari 2,0 mM akan menghambat aktivitas Taq DNA polymerase. Di samping itu, aktivitas enzim polymerase ini juga akan menurun 20-30% jika kosenrasi total dNTP yang digunakan mencapai 4-6 mM.

b.    Tth DNA polimerse Enzim DNA polimerse lain yang juga dapat digunakan untuk melakukan PCR adalah Tth DNA polimerse. Enzim ini diisolasi dari eubakteri thermofilik Thermus thermophilus HB8. Tth DNA polimerse mempunyai prosesivitas yang tinggi dan tidak mempunyai aktivitas eksonuklease 3’ → 5’. Enzim ini menunjukkan aktivitas tertinggi pada pH 9 (pada suhu 25 ) dan suhu sekitar  . Selain aktivitas polymerase, enzim ini juga mempunyai aktiviatas transcriptase balik (reverse transcriptase) intrinsik yang sangat efisien dengan adanya ion mangan. Aktivitas trankriptase balik tersebut jauh lebih tinggi disbanding dengan aktivitas serupa yang dimiliki oleh DNA polymerase I yang ada pada Escherichia coli maupun pada Taq  DNA polymerase. Tth DNA polimerse juga dapat menggunakan substrad yang dimodifikasi sehingga juga dapat digunakan untuk melabel fragmen DNA dengan radionukleotida, digoxigenin maupun biotin.Oleh karena enzim Tth DNA polimerse mempunyai aktivitas transkiptase balik yang tinggi pada suhu tinggi maka enzim ini dapat digunakan untuk mengatasi masalah yang timbul akibat adanya struktur skunder pada molekul RNA. Dengan demikian, enzim ini dapat digunakan untuk melakukan RT-PCR (reverse Transkriptase PCR). Molekul cDNA yang diperoleh dari hasil reaksi transkripsi balik dapat sekaligus diamplifikasi dengan menggunakan Tth DNA polimerse dengan adanya ion  . Enzim ini dapat dilakukan untuk melakukan RT-PCR molekul RNA sampai ukuran 1000 pasangan basa.

c.    Pwo DNA polymeraseEnzim Pwo DNA polymerase diisolasi dari archaebacterihiperthermofilik Pyrococcus woesei. Enzim Pwo DNA polymerase mempunyai berat molekul sekitar 90 kD. Enzim ini mempunyai prosesivitas polimerasi 5’   3’ yang tinggi, mempunyai aktivitas eksonuklease  , dan tidak menunjukkan aktivitas eksonuklease  .Pwo DNA polymerase mempunyai stabilitas thermal yang lebih tinggi dibandingkan dengan Taq DNA polymerase. Waktu paruh enzim ini lebih dari 2 jam pada suhu , sedangkan Taq DNA polymerase hanya mempunyai waktu paruh 5 menit pada suhu ini. Aktivitas eksonuklease 3’   5’ (aktivitas proof-reading dalam proses sintesis DNA) yang dimiliki oleh Pwo DNA polymerase meningkatkan ketepatan (fidelity) proses sintesis DNA sepuluh kali lebih tinggi dibandingkan dengan ketepatan yang dimiliki oleh Taq DNA polymerase. Jika Taq DNA polimerse digunakan untuk mengamplikasi sekuen DNA sepanjang 200 bp sebanyak satu juta kali maka kurang lebih 56% produk amplifikasinya akan mangandung satu atau lebih kesalahan. Sebalikya, jika enzim Pwo DNA polymerase yang digunakan untuk amplifikasi maka hanya 10% produk amplifikasinya yang mengandung kesalahan. Ketepatan proses polimerasi DNA secara in vitro merupakan salah satu parameter paling penting dalam PCR. Hal ini terutama sangat penting jika DNA atau RNA cetakan yang digunakan hanya berjumlah sangat sedikit.Hasil amplifikasi menggunakan Pwo DNA polymerase adalah molekul DNA dengan ujung pepat/tumpul (blunt-ended) sehingga dapat digunakan dalam  proses ligasi ujung tumpul secara langsung tanpa harus dilakukan modifikasi terhadap ujung-ujung molekul DNA. Oleh karena sifat ketepatanya yang tinggi maka enzim ini sangat berguna untuk aplikasi:

1)    Cloning produk PCR2)    Studi polimorfisme alel dalam transkrip RNA individual3)    Karakterisasi mutasi yang jarang di dalam suatu jaringan4)    Karakterisasi status alel suatu sel tunggal atau DNA molekul tunggal5)    Karakterisasi populasi sel dalam suatu kultur

d.    Pfu  dan Tli DNA polymeraseDNA polymerase lain yang dapat digunakan untuk PCR adalah Pfu DNA polymerase dan Tli DNA polymerase. Pfu DNA polymerase diisolasi dari  Pyrococcus furiosis, mempunyai berat molekul 92 kD, aktif pada suhu   dan mempunyai aktivitas eksonuklease  . Enzim ini diketahui mempunyai laju kesalahan yang paling kecil disbanding dengan enzim DNA polymerase yang lain. Produk amplifikasi dengan menggunakan enzim ini adalah molekul DNA dengan ujung tumpul.Tli DNA polymerase diisolasi dari jasad Thermococcus litoralis,  sangat stabil terhadap panas, aktivitas optimum pada suhu   dan dapat berfungsi meskipun diinkubasi pada suhu  . Berat molekul enzim ini dalah 90 kD. Enzim juga mempunyai aktivitas eksonuklease  .

5. PCR buffer dan konsentrasi Mg2+Buffer standar untuk PCR tersusun atas 50mM KCl, 10mM Tris-Cl (pH8.3) dan 1.5mM MgCl2. Buffer standard ini akan bekerja dengan baik untuk DNA template dan primer dengan kondisi tertentu, tetapi mungkin tidak optimum dengan kombinasi yang lain.  Produk PCR buffer ini terkadang dijual dalam bentuk tanpa atau dengan MgCl2.Konsentrasi ion magnesium dalam PCR buffer merupakan faktor yang sangat kritikal, karena kemungkinan dapat mempengaruhi proses annealing primer, temperatur dissosiasi untai DNA template, dan produk PCR. Hal ini disebabkan konsentrasi optimal ion Mg2+ itu sangat rendah. Hal ini penting untuk preparasi DNA template yang tidak mengandung konsentrasi chelating agent yang tinggi, seperti EDTA atau phosphat. Ion Mg2+ yang bebas bila terlalu rendah atau tidak ada, maka biasanya tidak menghasilkan produk akhir PCR, sedang bila terlalu banyak ion Mg2+yang bebas akan menghasilkan produk PCR yang tidak diinginkan.

C. Peralatan Khusus yang Digunakan dalam PCRPCR memerlukan alat khusus dalam prosesnya, alat-alat tersebut antara lain:1. Mighty-small II SE-250 vertical gel electrophoresis unit (Hoefer)

2. Perkin-Elmer/Cetus Thermal Cycler

3. Perkin-Elmer/Cetus Thermal Cycler adalah peralatan laboratorium yang digunakan untuk analisis PCR, atau replikasi cepat dari urutan DNA tertentu.

4. Sterile   Thin-wall   0.5  ml   Thermocycler  microfuge   tubes:   (TC-5,  Midwest   Scientific).   Alat   ini memiliki sebuah thermal block dengan lubang-lubang untuk memasukkan tabung campuran PCR.

D. Tahapan Proses PCR Berdasarkan gambar diatas, Polymerase Chain Reaction (PCR) terdiri dari tiga proses, yaitu:

1. DenaturasiDenaturasi merupakan proses memisahkan DNA menjadi utas tunggal. Tahap denaturasi DNA biasanya dilakukan pada kisaran suhu 92 – 95 oC. Denaturasi awal dilakukan selama 1 – 3 menit diperlukan untuk meyakinkan bahwa DNA telah terdenaturasi menjadi untai tunggal.Denaturasi yang tidak berlangsung secara sempurna dapat menyebabkan utas DNA terputus. Tahap denaturasi yang terlalu lama dapat mengakibatkan hilangnya aktivitas enzim polimerase.

2. AnnealingAnnealing merupakan proses penempelan primer. Tahap annealing primer merupakan tahap terpenting dalam PCR, karena jika ada sedikit saja kesalahan pada tahap ini maka akan mempengaruhi kemurnian dan hasil akhir produk DNA yang diinginkan. Faktor yang mempengaruhi tahap ini antara lain suhu annealing dan primer. Suhu annealing yang terlalu rendah dapat mengakibatkan timbulnya pita elektroforesis yang tidak spesifik, sedangkan suhu yang tinggi dapat meningkatkan kespesifikan amplifikasi.Kenaikan suhu setelah tahap annealing hingga mencapai 70–740C bertujuan untuk mengaktifkan enzim TaqDNA polimerase. Proses pemanjangan primer (tahap extension) biasanya dilakukan pada suhu 72 oC, yaitu suhu optimal untuk TaqDNA polimerase. Selain itu, pada masa peralihan suhu dari suhu annealing ke suhu extension sampai 70 oC juga menyebabkan terputusnya ikatan-ikatan tidak spesifik antara DNA cetakan dengan primer karena ikatan ini bersifat lemah. Selain suhu, semakin lama waktu extension maka jumlah DNA yang tidak spesifik semakin banyak.

3. ExtensionExtension merupakan proses pemanjangan DNA. Dalam tahap extension atau sintesis DNA, enzim polimerase bergabung bersama dengan nukleotida dan pemanjangan primer lengkap untuk sintesis sebuah DNA utas ganda. Reaksi ini akan berubah dari satu siklus ke siklus selanjutnya mengikuti perubahan konsentrasi DNA.Hasil sintesa DNA dalam satu siklus dapat berperan sebagai cetakan (template) pada siklus berikutnya sehingga jumlah DNA target menjadi berlipat dua pada setiap akhir siklus. Dengan kata lain DNA target meningkat secara eksponensial, sehingga setelah 30 siklus akan menjadi milyaran amplifikasi DNA target. 

E. Aplikasi PCRPCR dirancang pada tahun 1985 dab telah memberikan dampak besar pada penelitian biologis dan bioteknologi. PCR telah digunakan untuk memperkuat DNA dari berbagai macam sumber misalnya fragmen DNA kuno dari gajah purba (mammoth) berbulu yang telah membeku selama 40.000 tahun; DNA dari sedikit darah;, jaringan, atau air  mani yang ditemukan di tempat kejadian perkara kriminal; DNA dari sel embrionik tunggal untuk diagnosis kelainan genetik sebelum kelahiran dan DNA gen virus dari sel yang diinfeksi oleh virus yang sulit terdeteksi seperti HIV (Campbell dkk., 2004:395).     Menurut Darmo dan Ari (2000), teknik PCR dapat didayagunakan (kadang dengan modifikasi) guna fasilitasi analisis gen. Selain itu telah dikembangkan banyak sekali aplikasi praktis. Sebagai contoh teknik dan aplikasi PCR dapat disebutkan sebagai berikut: kloning hasil PCR; sekuensing hasil PCR; kajian evolusi molekular; deteksi mutasi ( penyakit genetik; determinasi seks pada sel prenatal; kajian forensik 

(tersangka kriminal, tersangka ayah pada kasus paternal); dan masih banyak lainnya.    Pendapat lain mengenai manfaat dan aplikasi PCR juga dikemukakan oleh Sunarto (1996) yang menyebutkan bahwa PCR dapat digunakan sebagai alat diagnosis penyakit thalesemia. Menurut Sunarto sebelum cara PCR ditemukan analisis DNA dilakukan dengan prosedur yang panjang dan rumit, yaitu pertama-tama membentuk perpustakaan (library construction) melalui digesti dengan endonuklease restriktif dan kloning, kemudian skrining, mapping, subkloning dan terakhir sekuensing. Tetapi dengan adanya PCR dalam waktu 24 jam sejak pencuplikan vili korialis (chorionic villous sampling) diagnosis prenatal sudah dapat ditegakkan dan berdasarkan prinsip PCR telah dikembangkan cara diagnostik molekular yang terbukti sangat akurat.    Berdasarkan uraian diatas penemuan dan manfaat teknik PCR ini berdampak sangat luas terhadap kemajuan sains dan teknologi secara umum yaitu antara lain sebagai berikut:1. Memperkuat gen spesifik sebelum diklon.

2. Membuat fragmen gen DNA secara berlimpah

3. Dapat mendeteksi DNA gen virus yang sulit untuk dideteksi

4. Dapat   mendeteksi/   mendiagnosis   DNA   sel   embrionik   yang   mengalami   kelainan   sebelum dilahirkan.

5. Bidang kedokteran forensik.  Contohnya mendeteksi  penyakit  yang dapat  menginfeksi,  variasi dan  mutasi dari gen.

6. Mengetahui  hubungan kekerabatan antar spesies  atau untuk  mengetahui  dari  mana spesies tersebut berasal.

7. Melacak asal usul seseorang dengan membandingkan “finger print"

F. Kelebihan dan Kelemahan PCR

Kelebihan1.    Memiliki spesifisitas tinggi

2.    Sangat cepat, dapat memberikan hasil yang sama pada hari yang sama

3.    Dapat membedakan varian mikroorganisme

4.    Mikroorganisme yang dideteksi tidak harus hidup

5.    Mudah di set up   

Kelemahan

-Sangat mudah terkontaminasi

-Biaya peralatan dan reagen mahal

-Interpretasi hasil PCR yang positif belum tervalidasi untuk semua penyakit infeksi (misalnya infeksi pasif atau laten)

-Teknik prosedur yang kompleks dan bertahap membutuhkan keahlian khusus untuk melakukannya

Teknik 4: Replikasi DNA ( DNA Replication )                                                                                                                 

Teknik replikasi DNA adalah satu proses biologi yang berlaku dalam semua organisma hidup dan proses penyalinan DNA ini adalah asas bagi penerusan penghasilannya. Proses ini bermula dengan satu daripada dua lembar (one double-stranded) molekul DNA dan seterusnya menghasilkan dua salinan molekul yang serupa. Setiap untaian molekul DNA yang menjadi dua lembar yang asal (original double-stranded DNA) bertindak sebagai templat untuk penghasilan sepasang lembar yang lengkap (complementary strand).

Di dalam sel, proses replikasi DNA bermula di lokasi tertentu dalam genom, iaitu dipanggil "origin" (asal). Pembukaan lembar (strand) DNA pada tempat "asal", seterusnya penghasilan lembar baru, akan menghasilkan produk replikasi. Di samping itu, enzim DNA polimerase, iaitu sejenis enzim yang menghasilkan DNA baru dengan menambah nukleotida, dan dipadankan dengan satu lembar (strand) templat. Ianya seterusnya menghasilkan beberapa protein lain yang berkaitan dengan produk replikasi, dan membantu dalam permulaan dan penerusan penghasilan DNA.

Replikasi DNA juga boleh dilakukan secara in vitro (buatan, di luar sel). Enzim DNA Polimerase, diasingkan dari sel, dan primers DNA buatan yang digunakan untuk memulakan penghasilan DNA di urutan yang dikenali dalam molekul templat. Reaksi polymerase chain (PCR),  menggunakan apa-apa teknik penghasilan secara bukan semula jadi (artificial) melaui kitaran yang teratur untuk menguatkan sasaran keratan DNA yang spesifik dari kolam DNA (DNA pool).

Picture: Stylized DNA replication fork with nucleotides matched, 5'->3' synthesis shown, no enzymes in diagram.

Teknik-teknik lain

Selain daripada teknik-teknik yang diatas, juga terdapat pelbagai teknik lain yang digunakan dalam makmal bioteknologi, termasuk di Malaysia. Teknik-teknik berikut di ringkaskan, dan disampaikan dalam bahasa inggeris.

1) Cloning genesIn nature, DNA molecules recombine for various functions -- even DNA between different species.  But twenty years ago, despite the work of Barbara McClintock and others, the extent of this recombination was not appreciated.  DNA was still thought to be the "master molecule," not to be violated by "unnatural" manipulation.  When scientists began to manipulate DNA in the test tube,  many scientists feared that disastrous monsters would result, with unspecified dangers to people.  In 1977 scientists at the Asilomar Conference proposed sweeping regulation on so-called "recombinant DNA," technologies which recombine DNA from different species in the test tube.Since then, the dangers have appeared to be little  more than those of "natural" genetic mixing.  But we remain concerned about issues such as: Engineering   food crops   to   resist  pesticides.   The  pesticide   resistance  genes  can escape  into natural populations of weeds. 

Engineering  a  human symbiont  microbe,  such as E. coli,   to  produce  a  deadly   toxin  such as botulin.  In theory this could be done, although it's not clear where such an organism would live, or how well it could "compete" with natural flora. 

Societal dilemmas of human cloning.  How far shall we use reproductive technology to shape future humans? 

Techniques of Recombinant DNA How do we manipulate these natural processes for biotechnology; for instance, to make a bacterium that produces large quantities of insulin? One approach would be to cut the appropriate  gene from human DNA and paste,  or splice,   it   into a vector such as a  plasmid or  phage DNA.   Our  "scissors" are the class  of enzymes called restriction endonucleases

Restriction EndonucleasesAn "endonuclease" is an enzyme that cuts duplex DNA in the middle, not at an end (for exonuclease).   Different species of bacteria have evolved different restriction endonucleases, each to cut foreign DNA that gets into their cells by mistake.  To be cut, the DNA has to lack their own pattern of protective methylation.   There are well over a hundred restriction enzymes, each cutting in a very precise way a specific base sequence of the DNA molecule.

A   restriction endonuclease  cuts  DNA only  at  a   specific   site,  usually   containing  4-6  base  pairs.   The enzyme has  to  cut   the DNA backbone twice,   recognizing   the same type of  site;   therefore,   the site "reads" the same way backwards as forwards--a palindrome.

This "sticky ends" from two different DNA molecules can hybridize together; then the nicks are sealed using ligase.  (Where does ligase come from?  What is its natural function?) The result is recombinant DNA.   When   this   recombinant   vector   is   inserted   into   E.   coli,   the   cell  will   be   able   to   process   the instructions to assemble the amino acids for insulin production. More importantly, the new instructions are passed along to the next generation of E. coli cells in the process known as gene cloning. 

Restriction site AnalysisHow can we use restriction sites to analyze the plasmid products of ligation, and tell whether we in fact have ligated the correct molecule:Problem: Suggest several "incorrect" ways the plasmid could recombine.More Problems:Use the PLASMID Program.  You MUST practice restriction analysis with this program; it will be on the quiz and/or the test.

How do we get the recombinant molecule into a bacterial cell?  Usually bytransformation (for a plasmid) or by in vitro packaging into a phage head coat (for a phage vector such as lambda phage). 

The   above   is   a   highly   simplified   description   of   recombinant   DNA   technology.How   would   we   actually   locate   the   appropriately   cloned   gene?   There   are   many   different   ways, depending on the specific case.  Here is one example, in which a partial sequence of the protein enables us   to reverse   the   code and   determine   an   approximate   DNA   sequence   to   use   for   a radiolabeled probe.  The DNA probe will hybridize to clones containing the correct DNA, even if it is just one piece cut out of an entire genome.

 

The radioactive probe is made by determining a short segment of the protein sequence, then "back translating" to the possible DNA sequences.  Short DNA sequences are synthesized to match the  protein sequence.  Then these DNA oligomers (known as "oligos") are radiolabeled, and applied to the blotted clones.  They should hybridize only to clones containing sequence encoding the desired protein.

Reverse transcription: cDNA CloningSuppose we need to clone a gene containing lots of introns.  What will happen when the bacterium tries to express it?To overcome this  problem,  we can start with mRNA isolated   from tissues that  produce the desired protein.  We then use reverse transcriptase enzyme (produced by a retrovirus related to HIV) to reverse transcribe the mRNA into a DNA molecule that now is free of introns.  Now we can ligate "sticky ends" onto the cDNA and recombine it into a phage or plasmid vector.Problem:  Know the differences between genomic cloning and cDNA cloning. Explain the relative ADVANTAGES and DISADVANTAGES of each technique--depending on the aim of your research.  

2) Transgenic

i)Cloning in Animals. Animals have two different classes of cells: germ line and somatic. Only alterations in the germ cells can be transmitted to future generations.  However, some forms of somatic cell gene therapy can be useful in treating patients.  For example, people with cystic fibrosis can receive the cloned CFTR gene in a nasal spray,   which   then   infects   the   lining   of   their   lungs   and   improves   lung   function.   The   infected (transformed) epithelial cells eventually are lost, however, during normal processes of tissue growth, so the treatment needs to be repeated. Germ-line cloning.  There are two basic ways to clone a gene in the mammalian germ line. Inject a DNA fragment containing your gene into the nucleus of a fertilized egg (germ-line gene cloning) or of body tissues in a mature host (somatic gene cloning).  The DNA gets taken up at random somewhere in one of the chromosomes. 

An example of germ-line cloning is the injection of angiopoietin cDNA into the fertilized mouse egg. (An example of somatic cloning is gene therapy for cystic fibrosis: inhale a vector containing the CF gene, which gets incorporated into the DNA of cells lining the lungs.  Somatic cloned genes are not inherited by offspring.)   Put a transgene containing positive and negative selective markers into an embryonic stem cell tissue culture.  The ES cells take up the gene by homologous recombination, replacing the host allele.  The ES cells now are injected into a blastula of an unrelated host, and some of the next generation progeny   arise   from   the   ES   cells.   To   learn   more   about   this, read   Capecchi's   article   on   Targeted Transgenes, on reserve. 

Once you have cloned a valuable gene into an animal, say a sheep that makes insulin in its milk, how can we produce lots of identical progeny quickly without sexual reproduction?    This is what the popular press calls  "cloning."    (More after spring break.) But  when you create a clone, how do you know it worked?  You need to know: DNA: Did the transgene really incorporate into the genome?  Where? 

RNA: Is the RNA expressed?  (Or prevented from expression, by a null allele?) 

Protein: Is a desired protein expressed? 

ii)Cloning in Plants. Plants don't have separate somatic and germ cells, so creating transgenic plants is easier than creating transgenic animals. Techniques include the use of microprojectile bombardment (the "gene gun") and the use of Agrobacterium tumefaciens.

Gene sequence analysis

The sequence of DNA base pairs can be analyzed by

Restriction   mapping.   Construct   a   "road   map"   of   restriction   sites.   A   program   to   do   this is WebCutter. 

DNA Sequence Analysis.  Cut and clone various restriction fragments, and determine the exact sequence of base pairs.  All sequence information is deposited in GenBank.  If you just want the sequence of the peptide translated from the RNA, you have to look for insulin mRNA or cDNA. 

Once we have a piece of DNA cloned,   it   is amplified (available  in many copies) and we now have a living clonewhich provides, in theory, an indefinite source of the DNA sequence.  How do we analyze the sequence?

DNA Sequence Determination Once you have identified a particular region of DNA of interest, you need to find out the precise sequence of DNA nucleotides.  This is done by di-deoxy sequencing, in which a DNA polymerase is put together with dNTPs in four different reactions, each containing a small amount of one di-deoxy NTP (ATP, TTP, CTP, or GTP).  The di-deoxy nucleotide lacks a 3'OH to continue chain extension, so the chain terminates.  Each reaction produces a population of fragments terminated at A, T, C, or G.

 The fragments are either radiolabeled or enzymatically labeled.  They can be separated on a gel, or on a fluorescence   analyzer.   All   published   DNA   sequences   in   the   world   are   deposited   in GenBank.  

  

     

 

 

Historically, the products of dideoxy sequencing reactions were subjected to electrophoresis in four different lanes of a gel. Each lane contained a reaction using a different dideoxy terminator nucleotide. The data looked like the image at right.

Image from your textbook, Freeman, S. (2002) Biological Science.

Today,   products   of   all   four sequencing reactions are loaded in a single gel lane or capillary tube and subjected to electrophoresis.  Molecular   labels   consist   of fluorescent   dyes   instead   of radioactive   nucleotides.   The   gel looks   something   like   this: 

Sequences  of  DNA   in   the   gel   lanes   are   read  by   a   computerized fluorescence detection system that measures the intensity of  light emission   from   each   "band."    The   final   output   is   a   "trace"   or "electrophoretogram"   that   plots   the   intensity   of   different   color emissions vs. the length of the DNA being sequenced.  By observing the progression of peaks of  different colors,  the DNA sequence is derived   (A C G T).   The   processed   data   look   like   this: 

Image from http://www.qiagen.com/

Southern, Northern, and Western Blots

Blots are named for the target molecule.Southern   Blot--DNA   cut   with   restriction   enzymes   -   probed   with   radioactive   DNA. Northern Blot--RNA - probed with radioactive DNA or RNA. 

Example--used   to   measure   angiopoietin angiopoietin   expression   from   cDNA in   transgenic   mouse. Western Blot--Protein - probed with radioactive or enzymatically-tagged antibodies.

These molecules must then be immobilized on a solid support, so that they will remain in position during probing and washing. The probe is then added, the non-specifically bound probe is removed, and the probe is detected. The place where the probe is detected corresponds to the location of the immobilized target molecule. This process is diagrammed below:

In the case of Southern, Northern, and Western blots, the initial separation of molecules is done on the basis of molecular weight, by gel electrophoresis.

Preparing for Blots 

Southern Blots.  DNA is first cut with restriction enzymes and the resulting double-stranded DNA fragments have an extended rod conformation without pre-treatment. 

Northern Blots.  Although RNA is single-stranded, RNA molecules often have small regions that can   form   base-paired   secondary   structures.   To   prevent   this,   the   RNA   is   pre-treated  with formaldehyde. 

Western  Blots.   Proteins  have  extensive  2'   and  3'   structures  and  are  not  always  negatively charged. Proteins are treated with the detergent SDS (sodium dodecyl sulfate) which removes 2' and 3' structure and coats the protein with negative charges. 

Transfer to Solid Support.  After the DNA, RNA, or protein has been separated by molecular weight, it must be transferred to a solid support before hybridization. (Hybridization does not work well in a gel.) This   transfer  process   is   called  blotting   and   is  why   these  hybridization   techniques  are   called  blots. Usually, the solid support is a sheet of nitrocellulose paper (sometimes called a filter because the sheets of nitrocellulose were originally used as filter  paper),  although other materials are sometimes used. DNA, RNA, and protein stick well to nitrocellulose in a sequence-independent manner.After a series of treatment steps, the probe is added.   The probe hybridized to the target molecules is visualized either by autoradiography or by enzyme reaction.

Summary. The important properties of the three blotting procedures of DNA analysis:

DNA Microarrays

We can now put most of the protein-encoding genes onto a microarray chip, using technology based on the DNA silicon chip industry.   The chip can be used to hybridize to cellular  RNA, and measure the expression rates of a large number of genes in a cell.

Axon   Industries.  From "Everything's Great When It Sits on a Chip," The Scientist,  Volume 13, #11, May 24, 1999

Transgenics

Cloning in Animals. Animals have two different classes of cells: germ line and somatic. Only alterations in the germ cells can be transmitted to future generations.  However, some forms of somatic cell gene therapy can be useful in treating patients.  For example, people with cystic fibrosis can receive the cloned CFTR gene in a nasal spray, which then infects the lining of their lungs and improves lung function.  The infected (transformed) epithelial cells eventually are lost, however, during normal processes of tissue growth, so the treatment needs to be repeated.

Germ-line cloning. There are two basic ways to clone a gene in the mammalian germ line.

Inject a DNA fragment containing your gene into the nucleus of a fertilized egg (germ-line gene cloning) or   of   body   tissues   in   a  mature   host   (somatic   gene   cloning).   The  DNA   gets   taken  up   at   random somewhere in one of the chromosomes. 

An example of germ-line cloning  is the injection of angiopoietin cDNA into the fertilized mouse egg. (An example of somatic cloning is gene therapy for cystic fibrosis: inhale a vector containing the CF gene, which gets incorporated into the DNA of cells lining the lungs.  Somatic cloned genes are notinherited by offspring.) 

Put a transgene containing positive and negative selective markers into an embryonic stem cell tissue culture.  The ES cells take up the gene by homologous recombination, replacing the host allele.  The ES cells now are injected into a blastula of an unrelated host, and some of the next generation progeny arise from the ES cells.  

Once you have cloned a valuable gene into an animal, say a sheep that makes insulin in its milk, how can we produce lots of identical progeny quickly without sexual reproduction?    This is what the popular press calls "cloning."   (More after spring break.)

But when you create a clone, how do you know it worked?  You need to know:

DNA: Did the transgene really incorporate into the genome?  Where?  RNA: Is the RNA expressed?  (Or prevented from expression, by a null allele?)  Protein: Is a desired protein expressed? 

Cloning in Plants. Plants don't have separate somatic and germ cells, so creating transgenic plants is easier than creating transgenic animals. Techniques include the use of microprojectile bombardment (the "gene gun") and the use of Agrobacterium tumefaciens.