PUM899;! UNlVERSITI iVlALA YSIA SABAH

' . BORANG PENGESAHAN STArnS TESIS@

SES( PENGA.JIAN: ,)004-( ')'ocr

Saya wtt C\-(II"Ej GlINC,

I (HURUF BESAR)

mcnga~"U mcmbeaarkan tcsis~aljanalDolctor Falsafah)· ini·disimpan di Perpustakaan Univecsiti Malaysia Sabah dengfln syarat-sy"arat k:egunaan scperti berikut

- - , --1. Tests adalab bakmilik Universiti Mala)"$ia Sabah. 2. ~erpustakaan Universiti Malaysia S.bah dibenarkan membuat satinan untuk tujuan pengajian sabaja. 3. Pcrpustakaao dibcnarbn membuat salinan tesis ini scbagai bahan pcrtuJc:aran antara iostitusi pengajian

tinggi. 4. hSi la tandakan ( I )

0 SULIT

[ZJ TERHAD

0 TIDAK TERHAD

~ .

(TANOA TANGAN PENUUS)

(Mengandungi maklwnat yang berdarjah keselamatan atau

kepcnti!lgan Malaysia scpcrti yang tennaktub di dalam AKTA:·RA8SIA RASMI L972)

(Mcngandungi maldumat TERRAO yang tclah ditentukan oleh organisasilbadan di maca penyclidikan dijalankan)

Disahkan oleh

A1arMt Tctap : 1110 . \&-, N£W ~ovEiNMI:NT a~, :f~"\\I,", "'IIWIA" 21\\1)1 c:neu'\) 1l.1Y\'1\,(lu,tl\~(jYljA.k.

I

Nama Penyclia

Tarikh: __________ _

C A TA TAN: .. Potoog yang tidak bcrkcnaan . •• Iika (csis ini SULIT atau TERHAD, sila lampirkao sural daripada pihak bcrkua.worganisasi

hcrl<cnaan dc:ogan mc:nyatllkan sekaJi scbab dan (cmpoh Ic:sis ini pc:rlu dikefaskan scbagai SULIT danTERHAD.

@ Tc:sis dimakStldk.an scbagai tesis bagi Iju...ah Doktor Falsafah dan SaJjana S«ata penyelidikan, at3u disertasi bagi pcngajian sc:cara kerja kursus dan pcnyclidikan, alau Laporan Projck SlIjaoll Muda (LPSM).

. -,

PENGA WET ANKRIO BIll BENIH Paphiopedi/um rothschildianum

KAEDAH VITRIFlKASI

WEE CHING CHING

DISERTASI INI DIKEMUKAKAN UNTUK MEMENUHI SEBAHAGIAN DARIP ADA SY ARA T MEMPEROLEHI IJAZAH SARJANA MUDA SAINS

DENGAN KEPUJIAN

PROGRAM BIOTEKNOLOGI SEKOLAH SAINS DAN TEKNOLOGI

UNIVERSITI MALAYSIA SABAH

PERPUSTAKAAN UMVERSITI MALAYSIA SABAH

April 2007

PENGAKUAN

Saya akui karya ini adalah hasil keIja saya sendiri kecuali nukilan dan ringkasan yang

setiap satunya telah dijelaskan sumbemya.

20 April 2007

WEE CHING CHING

HS 2004 - 4551

II

111

PENGESAHAN

DIPERAKUKAN OLEH

Tandatangan

1. PENYELIA

(Dr. Zaleha Abdul Aziz)

2. PEMERIKSAI

(Dr. Jualang Azlan Gansau)

3. PEMERIKSA 2

(Dr. Lee Ping Chin)

4. DEKAN )~ljrJt<~:?-(SUPTIKS. Prof. Madya. Dr. Shariff A. Kadir S. Omang) ... . ~.-

iv

PENGHARGAAN

TerIebih dahulu saya ingin mengambil kesempatan ini untuk merakamkan setinggi­

tinggi penghargaan kepada penyelia saya, Dr Zaleha yang sudi memberikan saya

peluang untuk membuat projek ini dan juga segala panduan yang telah banyak

memantapkan saya daripada pelbagai segi dalam menyempurnakan disertasi ini.

Selain itu, saya juga ingin merakamkan ucapan terima kasih kepada Ruth Koo

atas segal a bimbingan dan tunjuk ajar sepanjang projek ini.

Saya juga ingin mengambil kesempatan ini mengucapkan terima kasih kepada

pembantu makmal Bioteknologi, Encik Musbah dan Cik Radizah yang telah membantu

dari segi material.

Akhimya, ucapan terima kasih juga ditujukan kepada keluarga saya yang

tersayang atas sokongan dan dorongan yang telah memberikan semangat kepada saya

untuk menjayakan projek ini.

v

ABSTRAK

Paphipedilum rothschildianum, sejenis Sabah endemik orkid, merupakan orkid yang

terancam di bawah lampiran I CITES (Convention on International Trade in

Endangered Species of Wild Fauna and Flora) . Oleh itu, spesies ini perlu dilindungi

daripada kepupusan. Dalam kajian semasa ini, pengawetankrio biji benih

P.rothschildianum dilaksanakan berdasarkan teknik vitrifikasi. Kesan prakultur dalam

kepekatan sukrosa yang berlainan (OM, 0.25M, 0.3M, OAM dan 0.5M) dan tempoh

prakultur yang berlainan (1 hari , 2 hari, 3 hari, 5 hari dan 7 hari) dinilaikan. Protokol

vitrifikasi melibatkan: loading selama 20 minit, pengdehidratan dengan larutan

vitrifikasi (PVS2) selama lima jam dalarn ais, simpan di dalam cecair nitrogen untuk

satu hari, penyahbekuan dalarn 40°C bekas air (water bath) dan pengkulturan biji benih

pada medium MS untuk percarnbahan. In vitro biocerakin ujian percarnbahan biji benih

P.rothschildianum dibandingkan dengan prosedur kimia yang standard bagi TrifeniI

Tetrozoliam Klorida (TTC) untuk menguji viabiliti biji benih. Walaupun TTC cerakin

merupakan yang paling mudah untuk menguji viabiliti biji benih, namun adalah tidak

tepat berbanding dengan ukuran peratus percarnbahan. Dari segi peratus percarnbahan,

medium prakultur yang paling berkesan adalah 0.5M sukrosa dengan peratus

percambahan 38.~6% ±3 .58 dan tujuh hari prakultur merupakan tempoh prakultur yang

paling berkesan dengan peratus percarnbahan 62.79%±3.52.

VI

ABSTRACT

Paphipedilum rolhschildianum, a type of Sabah endemic orchid, is an endangered

orchid of Appendix I of CITES (Convention on International Trade in Endangered

Species of Wild Fauna and Flora). Therefore, this species need to be protected from

extinction. In this study, cryopreservation of P. rOlhschildianum was undertaken based

on vitrification technique. The effect of preculture in different concentrations of

sucrose (OM, 0.25M, O.3M, O.4M and 0.5M) dan different preculture duration (1 day, 2

days, 3 days, 5 days and 7 days) were evaluated. Vitrification protocol involves:

loading for 20 min, dehydration with vitrification solution (PVS2) for five hours in ais,

store in liquid nitrogen for one day, thawing in 40°C water bath and culturing the seeds

on MS medium for germination. The in vitro bioassay germination test of P.

rothschildianum was compared with standard chemical procedures of triphenyl

tetrazolium chloride (TTC) for testing seed viability. Although TIC assays were most

convenient, however it was not accurate compared with measurement of percentage of

germination. In terms of percentage of germination, the most effective preculture

medium was 0.5M sucrose with percentage of germination 38.86% ±3.58 and seven

days of preculture was the most effective of preculture duration with percentage of

germination 62. 79o/o±3. 52.

Vll

KANDUNGAN

Muka Surat

PENGAKUAN II

PENGESAHAN III

PENGHARGAAN IV

ABSTRAK V

ABSTRACT vi SENARAlKANDUNGAN vii SENARAI JADUAL x SENARAI RAJAH

X III

SENARAI FOTO xiv SENARAI SIMBOL xv

BAB 1 PENDAHULUAN

BAB2 ULASAN LITERA TUR 4 2. I Orkid 4 2.2 Orkid di Kinabalu 6 2.3 Genus Paphiopedilum 8 2.4 Paphiopedi/um rothschildianum 10 2.5 Peringkat-peringkat Perkembangan Biji Benih Orkid 12 2.6 Pengawetankrio 13 2.7 Kaedah Pembekuan 14

2.7.1 Pembekuan Perlahan 14 2.7.2 Pembekuan Pantas IS 2.7.3 Pembekuan Titisan 16 2.7.4 Vitrifikasi 17 2.7.5 Enkapsulasi -Pengdihidratan 18

2.8 Faktor yang mempengaruhi kejayaan pengawetankrio 19

Vlll

2.8.1 Medium prakultur 19 2.8.2 Tempoh masa bahan tumbuhan didedahkan kepada

medium prakultur 20 2.8.3 Jenis larutan pelindung krio 20 2.8.4 Bahan tumbuhan 22

2.9 Nyahbekuan 23

2.10 Langkah pemulihan 23 2.11 Pengujian viabiliti 24

BAB3 BAHAN DAN KAEDAH 26

3.1 Pengambilan sample 26

3.2 Pensterilan dan pengkulturan biji benih orkid 26

3.3 Penyediaan larutan stok 27

3.3 .1 Larutan stok makronutrient MS (XIO ), gr1 27

3.3.2 Larutan stok mikronutrient MS (Xl 00), gr1 28

3.3.3 Larutan stok vitamin MS (X100), gr1 28

3.3.4 Larutan stock NaEDTA (XI 00), gr l 29

3.3 .5 Media prakultur (50ml) 30

3.3.6 Media Kepekatan MS Separuh (250ml) 31

3.3.7 Larutan loading (lOOml) 31

3.3.8 Larutan PVS 2 (lOOml) 32

3.3.9 Larutan unloading (lOOml) 33

3.3.10 Larutan cucian (250ml) 33 3.4 Pengkulturan biji benih orkid pada media prapengkulturan 34 3.5 Proses pengawetankrio biji benih 35 3.6 Penyahbekuan, pencucian dan pemulihan 35 3.7 Ujian viabiliti 36

3.7.1 Penyediaan larutan 2,3,5-trifeniI tetrazoliam klorida 36 3.7.2 Ujian Trifenil Tetrozoliam Klorida (ITC) 36 3.7.3 Ujian percambahan semula 37

BAB 4 KEPUTUSAN 38

4.1 Ujian viabiliti biji benih 38

4.2

BABS

BAB6

4.1.1 Ujian TIC untuk biji benih yang dikultur dalam medium prakultur

yang berlainan kepekatan sukrosa sebelum pengawetankrio dan

selepas pengawetankrio. 39

4.1.2 Ujian TIC untuk biji benih yang dikultur dalam 0.25 M sukrosa

dalam tempoh yang berlainan sebelum pengawetankrio dan

selepas pengawetankrio.

Percambahan biji benih setelah pengawetankrio

4.2.1 Percambahan biji benih yang dikultur dalam medium prakultur

43

46

dengan berlainan kepekatan sukrosa 46

4.2.2 Percambahan biji benih yang dikultur dalam medium yang

mengandungi 0.25 M sukrosa dalam tempoh yang berlainan 49

PERBINCANGAN 53

KESIMPULAN 63

RUJUKAN 65

IX

x

SENARAI JADUAL

No.ladual Muka Surat

3.1 Komposisi Stok Makronutrient Medium Murashige dan Skoog 27

3.2 Komposisi Stok Mikronutrient Medium Murashige dan Skoog 28

3.3 Komposisi Stok Vitamin Medium Murashige dan Skoog 29

3.4 Komposisi Stok NaEDT A Medium Murashige dan Skoog 29

3.5 fsipadu larutan Media MS untuk menyediakan media prakultur 30

3.6 fsipadu larutan sukrosa 2M untuk menyediakan media prakultur 30

3.7 Isipadu Stok MS Medium untuk menyediaan media kepekatan MS 31

separuh

3.8 Komposisi larutan loading 32

3.9 Komposisi larutan PVS 2 32

3.10 Komposisi larutan unloading 33

3.11 Komposisi larutan Cue ian 33

3.12 Kepekatan sukrosa dalam media prakultur yang berlainan 34

4.1 Kesan rawatan kepekatan sukrosa yang berlainan terhadap viabiliti biji 40

benih (kapsul 1) sebelum pengawetankrio yang diuji dengan ujian TIC

xi

SENARAI JADUAL

No.laduaI Muka Surat

4.2 Kesan rawatan kepekatan sukrosa yang berlainan terhadap viabiliti biji 41

benih (kapsuI 1) selepas pengawetankrio yang diuji dengan ujian TTC

4.3 Kesan rawatan kepekatan sukrosa yang berlainan terhadap viabiliti biji 42 benih (kapsul 2) sebelum pengawetankrio yang diuji dengan ujianTTC

4.4 Kesan rawatan kepekatan sukrosa yang berlainan terhadap viabiliti biji 42 benih (kapsul 2) selepas pengawetankrio yang diuji dengan ujian TTC

4.5 Kesan rawatan tempoh prakultur yang berlainan terhadap viabiliti biji 44 benih (kapsuI 3) sebelum pengawetankrio yang diuji dengan ujian TTC

4.6 Kesan rawatan tempoh prakultur yang berlainan terhadap viabiliti biji 44 benih (kapsuI 3) selepas pengawetankrio yang diuji dengan ujian TTC

4.7 Kesan rawatan tempoh prakultur yang berlainan terhadap viabiliti biji 45 benih (kapsuI 4) sebelum pengawetankrio yang diuji dengan ujian TTC

4.8 Kesan rawatan tempoh prakultur yang berlainan terhadap viabiliti biji 45 benih (kapsuI 4) selepas pengawetankrio yang diuji dengan ujian TTC

4.9 Kesan rawatan kepekatan sukrosa yang berlainan terhadap viabiliti biji 47 benih (kapsul 1) selepas pengawetankrio.

4.10 Kesan rawatan kepekatan sukrosa yang berlainan terhadap viabiliti biji

benih (kapsuI2) selepas pengawetankrio. 48

xii

SENARAI JADUAL

No. Jadual Muka Surat

4.11 Kesan rawatan tempoh prakultur yang berlainan terhadap viabiliti biji

benih (kapsuI4) sebelum pengawetankrio. 50

4.12 Kesan rawatan tempoh prakultur yang berlainan terhadap viabiliti biji

benih (kapsuI4) selepas pengawetankrio. 52

xiii

SENARAI RAJAH

No. Rajah Muka Surat

2.1 Biji benih orkid 6

2.2 Peta taburan genus Paphiopedi/um di India dan Selatan-timur Asia. 9

2.3 Bahagian berlainan Paphiopedi/um rothschildianum 11

2.4 Peringkat-peringkat perkembangan biji benih orkid 13

xiv

SENARAI FOTO

No. Foto Muka Surat

2.1 Paphiopedilum rothschildianum 12

4.1 Ujian viabiliti menggunakan ujian TIC untuk biji benih orkid 39

4.2 Peringkat-peringkat perkembangan biji benih orkid 46

%

f.ll

ml

M

MS

ABA

L

nm

mm

cm

m

km

mg

g

gr l

mg- I

°C min-I

s

min

j

v/v

w/v

PVS

DMSO

PEG

TIC

FDA

CITES

SENARAI SIMBOL DAN SINGKATAN

Peratus

Darjah celsius

Mikroliter

Mililiter

Kemolaran (bilangan mol solut oer liter larutan)

Murashige & Skoog

Asid absisik

Liter

Nanometer

Milimeter

Sentimeter

Meter

Kilometer

Miligram

Gram

Gram per liter

Miligram per liter

Darjah celsius per minit

Saat

Minit

Jam

Isipadu per isipadu

Jisim per isipadu

Plant Vitrification Solution

Dimethyl sulfoksida

Polyethylene glikol

2,3,5-trifenil tetrazoliam klorida

Fluorescein diacetate staining

xv

Convention on International Trade in Endangered Species

BABI

PENDAHULUAN

Paphiopedilum rothschildianum, merupakan spesies orkid Sabah yang daIam keadaan

terancarn dan merupakan spesies yang dilindungi sepenuhnya di bawah Enakmen

Kerajaan Sabab 1998. Spesies ini juga disenaraikan daIarn senarai pertama CITES

(Conl'ention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora).

CITES merupakan undang-undang dunia yang melindungi spesies yang harnpir pupus

dan menghad perdagangan hararn hidupan liar antarabangsa

Pada masa kini, orkid P. rothschildianum hanya boleh dijumpai di dua tempat

di sekitar Gunung Kinabalu (Cribb, 1998). OIeh sebab populasi spesies orkid ini sangat

keeil dan dalarn keadaan terancarn, pelbagai us aha telah dijaIankan untuk

melindunginya. Orkid ini telah ditanam di dua tempat iaitu Taman KinabaIu dan

Taman Pemuliharaan Orkid yang terletak berdekatan dengan kolarn air panas Poring.

Dari segi penyelidikan saintifik, pelbagai tumpuan penyelidikan sedang dilaksanakan,

sarna ada dilakukan sendiri oleh kakitangan Taman-Tarnan Sabah, atau sebagai

usahasama dengan penyelidik-penyelidik luar projek penyelidikan dan kultur tisu orkid

dengan bantuan Kebun Botanikal Royal di Kew, UK dan Universiti Malaysia Sabah

(Jamili Nais, 2006). Namun, kesemua usaha ini masih tidak dapat melindungi orkid

jenis ini sepenuhnya kerana percambahan ~iji benih orkid masih dipengaruhi oleh

faktor persekitaran seperti kelembapan, cahaya dan suhu. Oleh sebab kehilangan dan

kemusnahan hutan tropikal yang berterusan dan masalah in situ dan ex situ

pemuliharaan spesies orkid yang terancam ini, maka adalah perIu untuk

membangunkan melaksanakan satu kaedah altematif untuk pemuliharaan spesies

tropikal ini.

Pengawetankrio merupakan satu kaedah yang digunakan untuk menyimpan

sumber genetik tumbuhan untuk jangka waktu yang panjang pada suhu ultra rendah

(-196°C) dalam cecair nitrogen. Tumbuhan yang membiak secara vegetatif dan biji

benih rekalsitran adalah bahan yang sering disimpan menggunakan kaedah ini

(Ishikawa et af., 1996). Pada suhu ini, semua aktiviti sumber genetik tumbuhan akan

berhenti. Kaedah ini tidak memerIukan ruang yang besar dan genetik bahan yang

diawet dapat dikekalkan. Pengawetankrio telah dilaporkan beIjaya dalam beberapa

spesies (Uragami, 1993) dan banyak kaedah telah dicadangkan. Pengawetankrio tisu

biologikal hanya akan berjaya tanpa pembentukan intraselular kristal ais yang dapat

menyebabkan kerosakan kekal kepada membran sel dan seterusnya menghapuskan

sifat ketelapan pemilihan membran sel (panis et af., 2005). Teknik ini merupakan

pelengkap kaedah konventional untuk pemuliharaan germplasma.

2

Pengawetankrio adalah satu kaedah pemuliharaan yang boleh diaplikasi ke atas

P. rothschildianum. Mewujudkan satu sistem pengawetankrio untuk

P. rothschildianum akan dapat membantu program pemuliharaan jangka panjang untuk

spesies ini. Justeru kajian ini dijalankan bertujuan untuk menilai kesan medium

prakultur yang mengandungi kepekatan sukrosa yang berlainan terhadap

pengawetankrio biji benih P. rothschildianum dan menilai kesan tempoh masa biji

benih P. rothschildianum didedahkan kepada medium prakultur.

3

BAB2

VLASAN LITERA TUR

2.1 Orkid

Terdapat lebih kurang 350 famili tumbuhan berbunga yang terdapat di bumi

(Madgwick, 1991). Setiap famili dibahagikan kepada kumpulan besar yang dikenali

sebagai genera. Setiap genus mengandungi satu atau lebih spesies tumbuhan berbunga.

Orkid tergolong dalam famili yang dikenali sebagai Orchidaceae. Orkid adalah satu

kumpulan bungaan yang mempunyai banyak perbezaan dari aspek rupa bentuk dan

pokok. Orkid merupakan salah satu tumbuhan terbesar dalam famili tumbuhan di mana

ia mempunyai lebih kurang 25 000 spesies (Kull et ai., 2006) dan merupakan salah satu

komponen biodiversiti terpenting dalam hutan tropika.

Secara umum, orkid komersil boleh dikelaskan kepada dua kumpulan yang

besar, iaitu orkid simpodiwn dan monopodium (Bown, 199 I). Orkid simpodium adalah

orkid yang boleh tumbuh atas pokok (epifit) ataupun tanah (terestrial). Batangnya

adalah berbentuk bebawang semu, manjalar dan mempunyai pertumbuhan pelbagai

hala. Bebawang panjang beruas-ruas dan sebahagiannya pendek tanpa ruas. Akar dan

daun terbit daripadanya. Tunas baru akan mengeluarkan bunga apabila tiba tahap

kematangan. Bebawang tua akan mengeluarkan tunas barn pada pangkal rumpun

sebelum mengecut dan mati . Contoh orkid simpodium ialah Paphiopedilum, Oncidium,

Call1eya dan Dendrobium (Teo, 1995).

Sebaliknya, orkid monopodium ialah orkid yang tumbuh secara sehala yang

tidak berakhir dengan pengeluaran bunga. Orkid monopodium memiliki batang yang

keeil dan diliputi upih-upih daun. Akar udara yang keluar daripada batang terpaksa

menembusi upih daun. Batang orkid monopodium tidak bereabang dan boleh

mengeluarkan tunas-tunas barn setelah dipotong. Contoh orkid dalarn golongan Jill

ialah Arachnis, Renanthera, Aranda, Phalaenopsis dan Vanda (Teo, 1995).

Semua orkid mempunyai eiri-eiri umum yang harnpir sarna. Daunnya tidak

terbahagi dan berbentuk sarna ada tirus atau bujur. Menurut Bown (1991), daun orkid

saling bersilih ganti pada batang, biasanya daJarn dua baris dan urat daunnya adaJah

lurus ke bawah. Bunganya mempunyai tiga sepaJ dan tiga petal. Salah satu sepaJnya

terJetak di atas bunga manakala dua Iagi di bahagian tepi. Petal orkid puJa bersilang

dengan sepal. SaJah satu petalnya berbeza dengan yang Jain. La adalah dikenali sebagai

lip atau Iabelum dan biasanya Jebih besar dan Jebih berwarna terang. Kolum

merupakan gabungan stamen dan pistil. Cepu debunga terletak di bahagian atas kolurn,

stigma di bahagian tengah dan benang sari di bahagian bawah. Debunga pula terletak

5

6

dalam pundi yang dipanggil polinia dalam bilangan yang genap 2-12. Ovari terletak di

bawah sepal dan berfungsi sebagai tangkai bunga atau pedisel. Setelah persenyawaan,

ovari akan membesar menjadi buah orkid yang mengandungi biji benih. Biji benih

orkid dihasilkan dalam buah kapsul. Oleh sebab biji benih sangat halus, ia kelihatan

seperti serbuk (Rajah 2.1). Orkid mempunyai berat sebanyak 0.3-6.3 x 10-6 g (Burgeff,

1959). Sesetengah orkid menghasilkan bau yang harum tetapi terdapat juga di

antaranya yang menghasilkan bau busuk (Hudgson et ai., 1991).

-Rajah 2.1 Biji benih orkid (Madgwick, 1991).

2.2 Orkid di Sabah

Malaysia dianggarkan mengandungi lebih kurang 10% kepelbagaian spesies flora dan

6.5% spesies fauna dan dikelaskan sebagai salah satu daripada kawasan mega

kepelbagaian dunia (Zakri, 2006). Negeri Sabah kaya dengan berbagai-bagai jenis

7

tumbuhan. Dari segi kepelbagaian spesies tumbuhan berbanding dengan luas kawasan ,

penyelidikan saintifik setakat ini jelas membuktikan bahawa Kinabalu mempunyai

salah satu flora yang terkaya di muka bumi ini.

Secara amnya, orkid bertabur secara meluas di seluruh bahagian dunia kecuali

di kebanyakan gurun dan kawasan artik. Para ahli taksonomi menganggarkan terdapat

kira-kira 25 000 spesies orkid di seluruh dunia (Sheehan & Sheehan, 1995). Menurut

Cribb (1997), bomeo merupakan salah satu kawasan yang kaya dengan orkid. Terdapat

kira-kira 2500 hingga 3000 spesies orkid terdapat di Borneo iaitu merangkumi sepuluh

peratus daripada orkid dunia (pelancongan, 2006). Dianggarkan Kinabalu mempunyai

1000 hingga 1200 spesies orkid iaitu lebih kurang 5% daripada jumlah orkid yang

terdapat di seluruh dunia (Jamili Nais, 2006).

Gunung Kinabalu merupakan salah satu gunung tertinggi di Asia Tenggara

tersergam setinggi 4095 m di atas Taman Negara Kinabalu di pusat negeri Sabah.

Ketinggian gunung yang sangat curam ini menunjukkan ia menyokong kitaran

ekosistem dari hutan tropika sehinggalah ke kawasan berkeadaan separa-pergunungan

atau separa Alpine. Kinabalu sangat dikenali di seluruh dunia dengan kekayaan flora

orkidnya. Setakat ini, hanya sejumlah 711 spesies orkid dan 10% daripadanya adaIah

endemik telah dikaji, diberi nama dan didokurnenkan secara saintifik (Jamili Nais,

2006). Antara spesies yang endemik ialah Paphiopedi/um rOlhschildianum, orkid

selipar Kinabalu yang telah cukup terkenal di seluruh dunia kerana kecantikkannya

(Jamili Nais, 2006). Orkid-orkid lain yang boleh dijumpai di Kinabalu termasuklah

8

Renanlhera bella, Paraphalaneopsis labukensis, dan Phalaneopsis amabilis. Terdapat

banyak lagi spesies orkid yang masih belum cukup dikaji dan menanti masa untuk

ditemui di hutan Taman Kinabalu ini dan hampir setiap tahun spesies-spesies baru

ditemui, misaInya spesies-spesies seperti Dendrobium lamrianum yang telah

dinamakan sempena nama Pengarah Tam an-Taman Sabah, Datuk Lamri Ali (Jamili

Nais, 2006).

Taman Pemuliharaan Orkid yang terletak berdekatan dengan kolam air panas

Poring memiliki koleksi orkid hidup yang terbesar. Pusat ini aktif menjalankan aktiviti

pemuliharaan (Pejabat Daerah Ranau, 2005). Setakat ini Taman Orkid telah

mengumpulkan sejumlah lebih 500 spesis orkid liar kawasan tanah rendah (Pusat

Pelancongan Daerah, 2006). Kawasan ini teIah mendapat perhatian di mata dunia

terutama sekali pakar-pakar dan orang ramai dari dalam dan Iuar Negara.

2.3 Genus Paphiopedi/um

Paphiopedi/um berasal dari perkataan Greek 'Paphian', iaitu satu gelaran bagi

Aphrodite (dewi yang dikenali sebagai Venus bagi orang Rom) dan 'pedi/on' yang

bennaksud selipar (Cribb, 1998). Biasanya Paphiopedi/um juga merujuk kepada

Lady's atau Venus' orkid selipar disebabkan oleh bentuk bunga labelum yang Iuar

biasa. Fungsi Iabelum ialah memerangkap serangga supaya mereka terpaksa memanjat

ke atas meIalui staminode, di mana mereka mengumpul atau meninggal polinia

(Madgwick, 1991). Paphiopedi/um mempamerkan beberapa sifat sedia ada yang perlu

RUJUKAN

Ardititi, 1. 1974. Seed germination and tissue culture f orchids. Symposium on modern

methods in propagation, hybridizing and culture of orchids. Prague,

Czechoslovakia.

Bajaj, Y. P. S. 1978. Effect of super-low temperature on excised anthers and pollen­

embryos of Atropa, Nicotiana and Petunia. Phytomorphology 28, ms. 171-176.

Bhojwani, S. S. & Razd an , M. K. 1985. Plant Tissue Culture: Theory & Practice.

Elsevier Science Publishing Company Inc., New York.

Bown, D. 1991. Orchids. Heinemann, London.

Burgeff, H. 1959. Mycorrhiza o/Orchids. In The Orchids: A Scientific Survey. Ronald

Press Co., New York.

Burke, M. 1. 1987. The glassy Slate and survival 0/ anhydrous biological systems.

Cornell University Press, Ithaca, NY.

Cribb, P. 1997. Slipper Orchids 0/ Borneo. Natural History Publication (Borneo) Sdn.

Bhd., Sabah.

Cribb, P. 1998. The Genus PaphiopedUum. Natural History Publications (Borneo)

Sdn. Bhd., Sabah.

Dereuddre, 1., Hassen, N., Blandin, S. & Kaminski, M. 1991. Resistance of alginate­

coated somatic embryos of carrot (Daucus carota L.) to desiccation and

freezing in liquid nitrogen. Cryo-Letters 12, ms. 135-148.

66

Dumet, D., Engelmann, F., ChabriUange, N. & Duval, Y. 1993. Cryopreservation of

oilpalm (Elaeis guineensis Jacq.) somatic embryos involving a desiccation step.

Plant Cell Rep. 12, ms. 352-355.

Dussert, S., Mauro, M. C. & Engelmann, F. 1992. Cryopreservation of grape

embryogenic cells suspensions. Cryo-Letters 13, ms. 15-22.

Fabre, J. & Dereuddre, J. 1990. Encapsulation-dehydration: a new approach to

cryopreservation of Solanum shoot-tips. Cryo-Letters 11, ms. 413-426.

Fahy, G. M., Levy, D. 1. & Ali, S. E. 1987. Some emerging principles underlying the

physical properties, biological actions, and utility of vitrification solutions,

Cryobiology 24, ms. 196-213.

Fallon, K . M. & Phillips, R. 1989. Responses to water stress in adapted and unadapted

carrot cell suspension cultures. J Exp. Bot. 40, ms. 681 - 687.

Fang, 1. Y., Wetten, A. & Hadley, P. 2004. Cryopreservation of cocoa (Theobroma

cacao L.) somatic embryos for long-term germplasm storage. Plant Science

166, InS. 669-675.

Finkle, B. J. & Ulrich, 1. M. 1982. Cryoprotectant removal as a factor in the survival of

frozen rice and sugarcane cells. Cryobiology 19, ms. 329-335.

Gnanapragasam, S. & Vasil, I. K. 1992. Cryopreservation of immature embryos,

embryogenic callus and cell suspension cultures of gramineous species. Plant

Science 83, ms. 205-215.

Grout, B. W. w. & Henshaw, G. G. 1978. Freeze preservation of potato shoot-tip

cultures. Ann. Bot. 42, ms. 1227-1229.

67

Guillermo, S. 2000. Effects of preculture with sucrose and ABA on cell suspensions

water status and its relation with vitrification resistance. R. Bras. Fisiol. Veg.

12, ms.166-180.

Halimathul Saadiah A. Shafiei. 1995. Asas Teknologi Biji Benih. Dewan Bahasa dan

Pustaka, Selangor.

Ishikawa, M., Robertson, A. J. & Gusta, L. V. 1995. Comparison of viability tests for

assessing cross-adaption to freezing, heat and salt stress induced by abscisic

acid in bromegrass (Bromus inermis Leyss) suspension cultured cells. Plant

Science 107, ms. 83-93.

Ishikawa, M., Tandon, P., Suzuki, M. & Yamaguishi-Ciampi, A. 1996.

Cryopreservation of bromegrass (Bromus inermis Leyss) suspension cultured

cells using slow prefreezing and vitrification procedures. Plant Science 120,

ms.81-88.

Ishikawa, K., Harata, K., Mii, M., Sakai, A., Yoshimatsu, K. & Shimomura, K. 1997.

Cryopreservation of zygotic embryos of a Japanese terrestrial orchid (Bletilla

striata) by vitrification. Plant Cell Reports 16, ms. 754-757.

Jamili Nais. 2006. Warisan A lam Kinabalu: Flora.

http://www.bbec.sabah.gov.mylParkManagementlWAKinabalu.html.

Kartha, K. K. 1985. Cryopreservation of Plant Cells and Organs. CRC Press, Boca

Raton, Florida.

Kartha, K. K. 1987. Advances in the cryopreservation technology of plant cells and

organs. Proceedings of the Sixth International Congress on Plant Tissue and

Cell Culture: 447-458.

68

Kartha, K. K. & Leung, N. L. 1982. In vitro growth responses and plant regeneration

from cryopreserved meristems of cassava (Manihot esculenta Crantz).

Zpjlanzenphysiology 107, ms. 133-140.

Kendall, E. J., Qureshi, J. A., Kartha, K. K., Leung, N., Caswell, K. & Chen, T.H.H.

1990. Regeneration of freezing-tolerant spring wheat (Triticum aestivum L.)

plants from cryoslected callus. Plant Physiology 94, ms. 1756-1762.

Kitsaki, C. K., Zygouraki, S., Ziobora, M. & Kintzios, S. 2004. In vitro germination,

protoconn fonnation and plantlet development of mature versus immature

seeds from several Ophrys species (Orchidaceae). Plant Cell Rep 23, rns. 284-

290.

KuII, T., Hutchings, M . 1., 2006. A comparative analysis of decline in the distribution

ranges of orchid species in Estonia and the United Kingdom. Biological

Conservation 129, rns. 31-39.

Kumar, U. & Samar, A. K. 2003. Plant Biotechnology and Biodiversity Conservation.

Agrobios (India), Jodhpur.

Kuriyarna, A., Watanabe, K., Kawai, F. & Kanarnori, M. 1996. Sensitivity of

cryopreserved Lanvadula cells to ammonium ion. Journal of Plant Physiology

148, ms. 693-695.

Kuwano, K., Aruga, Y. & Saga, N. 1996. Cryopreservation of clonal garnetophytic

thalli of Porphyra (Rhodophyta). Plant Science 116, ms. 117-124.

Larnbardi, M. F. A. & Caccavale, A. 2000. Cryopreservation of white poplar (Populus

alba L.) by vitrification of in vitro grown shoot tips. Plant Cell Rep. 19, ms.

213-218.

69

Langis, R., Schnabel, B., Earle, E. D. & Steponkus, P. L. 1989. Cryopreservation of

Brassica campestris L. cell suspension by vitrification. Cryo-Letters 10, ms.

421-428.

Langis, R., Schnabel-Preikstas, B. J., Earle, E. D. & Steponkus, P. L. 1990.

Cryopreservation of carnation shoot tips by vitrification. Cryobiology 27, ms.

657-658.

Lecouteux, c., Florin, B., Tessereau, H., Bollon, H. & Petiard, V. 1991.

Cryopreservation of carrot embryos using a simplified freezing process. Cryo­

Letters 1, ms. 319-328.

Luyet, B. J. 1937. The vitrification of orgaruc colloids and of protoplasms.

Biodynamica 1, ms. 1-14.

Maddox, A. D. , Gonsalves, F. & Shields, R. 1993. Successful preservation of

suspension cultures of three Nicotiana species at the temperature of liquid

nitrogen. Plant Science 28, ms. 157-162.

Madgwick, W. 1991. Orchids. Heinemann Children's Reference, Britain.

Mazur, P. 1969. Freezing injury in plants. Plant Physiology 20, ms. 419-448.

Murashige, T. & Skoog, F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassay

with tobacco tissue cultures. Plant Physiology 15, ms. 473 -497.

Nag, K. K. & Street, H. E. 1975. Freeze preservation of cultured plant cells.

Physiology Plant 34, ms. 254-260.

70

Nishizawa, S., Sakai, A., Amano, Y. & Matsuzawa, T. 1993. Cryopreservation of

aparagus (Asparagus officinalis L.) embryogenic suspension cells and

subsequent plant regeneration by vitrification. Plant Science 91, ms. 67-73.

Panis, B., Totte, N., Nimmen, K.V., Withers, L.A. Swennen, R. 1996.

Cryopreservation of banana (Muss spp. ) meristem cultures after preculture on

sucrose. Plant Science 121, ms. 95-106.

Panis, B., Piette, B. & Swennen, R. 2005. Droplet vitrification of apical meristems: a

cryopreservation protocol applicable to all Musaceae. Plant Science 168, ms.

45-55.

Paques, M., Monod, V., Po is sonnier, M. & Dereuddre, J. 2002. Cryopreservation of

Eucalyptus sp. shoot tips by the encapsulation-dehydration procedure.

Springer-Verlag, Berlin.

Pejabat Daerah Rana~ 2005 . Akliviti Pelancongan.

http://www.sabah.gov.my/pd.mullamanPDRJpelancongan.htm

Pence, v.c. 1991. Cryopreservation of immature embryos of Theobroma cacao. Plant

Cell Rep. 10, ms. 144-147.

Peters, J. 2000. Tetrazolium testing handbook. Association of Official Seed Analysts.

Pritchard, H. W., Grout, B. W. W. & Short, C. 1986. Osmotic stress as a pregrowth

procedure for cryopreservation 3. Cryobiology of sycamore and soybean cell

suspensions. Ann. Bot. 57, ms. 378 - 387.

Pritchard, H. W. & Prendergast, F. G. 1990. Viability testing in terrestrial orchid seed.

Acta Universitatis Wratislaviensis 1055, ms. 11-16.

71

Pusat Pelancongan Daerah, 2006. Pelancongan.

http://www.sabah.gov.my/pd.tnmltnmdoc/pelancongan.btrnl.

Rasmussen, H.N. 1995. Terrestrial orchids from seed to mycotrophic plants.

Cambridge University Press, New York.

Ribeiro, R. C. S., lekkel, Z., Mulligan, B. 1., Cocking, E. c., Power, 1. B., Davey, M.

R. & Lynch, P. T. 1996. Regeneration of fertile plants from cryopreserved cell

suspensions of Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. Plant Science 115, ms. 115-

121.

Roberts, J. A., Beale, C. R., Benseler, J. C., McGough, H. N. & Zappi, D. C. 1995.

CITES Orchid Checklist. Royal Botanic Gardens, Kew.

Ryynanen, L. & Aronen, T. 2005. Vitrification, a complementary cryopreservation

method for Betula pendula Roth. Cryobiology 51, ms. 208-219.

Sadia, B., Anthony, P., Lowe, K. c., Power, B. J. & Davey, M. R. 2003. Culture

Treatments for Enhancing Post-thaw Recovery of Cryopreserved Suspension

Cells of Potato Cv. Desiree. Cellular & Molecular Biology Letters 8, ms. 979-

989.

Sakai, A., Yamakawa, M., Sakata, D., Harada, T. & Yajuwa, T. 1978. Development of

a whole plant from excised strawberry runner apex frozen to -196°C. Sci.,

Ser.B 36, ms. 31-38.

Sakai, A., Kobayashi, S. & Oiyama, I. 1991. Cryopreservation of nueellar eells of

navel orange (Citrus sinensis Osb.) by a simple freezing method. Plant Science

74, ms. 243-248.

72

Seufferheld, M. J., Stushnoff, C., Forsline, P. & Gonzalez, G. H.T. 1999.

Cryopreservation of cold-tender apple gennplasm. Scientia Horticulturae 124

ms.612-618.

Sheehan, T. & Sheehan, M. 1995. An Atlas of Orchids Pollination, European Orchids.

A.A. Balkema Publishers, Netherlands.

Steele, W. K. 1996. Large-scale seedling production of North American native

terrestrial orcIUds. In: Allen C (ed) North American native terrestrial orchids.

Propagation and production. North Am Native Terrestrial Orchid Conj Proc.

e. Allen, Germantown, Md.

Steponkus, P. L. & Lanphear, F. O. 1967. Refinement of the triphenyl tetrazolium

chloride method of detennining cold injury. Plant Physiology 421, ms. 1423-

1426.

Takagi, H. 2000. Recent developments in cryopreservation of shoot apices of tropical

species. In: Engelmann, F.,Takagi, H. (Eds.), Cryopreservation of Tropical

Germplasm. Current Research Progress and Application. JIRCAS, Rome.

Teo, K. H. 1995. Native Orchids of Peninsular Malaysia. Times Books International,

Selangor.

Towill, L. E. 1981. Solanum etuberosum: a model for studying the cryobiology of

shoot-tips in the tuber-bearing Solanum species. Plant Science Leiters 20, ms.

315-324.

U . A 1993 C O'Preservation oif cultured cells and organs of vegetables. In: ragaml,. . ry

Cryopreservation of Plant Genetic Resources, Technical assistance activities

for genetic resources projects N° 6. JICA, Japan.

,

73

Uragami, A., Sakai, A., Nagai, M. & Takahashi, T. A. 1989. Survival of cultured cells

and somatic embryos of Asparagus ojJicinalis L. cryopreserved by vitrification.

Plant Cell Rep. 8, ms. 418-421.

Uragami, A., Sakai, A. & Nakai, M. 1990. Cryopreservation of dried axillary buds

from plantlets of Asparagus ojJicinalis L. grown in vitro. Plant Cell Rep 9, ms.

328-331.

Vasil, 1. K. & Thorpe, T. A. 1994. Plant Cell and Tissue Culture. Kluwer Academic

Publishers, Netherlands.

Verleysen, H., Bockstaele, E. V. & Pierre, D. 2005. An encapsulation-<iehydration

protocol for cryopreservation of the azalea cultivar 'Nordlicht' (Rhododendron

simsii Planch.) Scientia Horticulturae 106, ms. 402-414.

Wang, Q., Gafny, R., Sabar, N., Sela, 1., Mawassi, M., Tanne, E. & Perl, A. 2002.

Cryopreservation of grapevine (Vitis vinifera L.) embryogenic cell suspensions

by encapsulation-dehydration and subsequent plant regeneration. Plant Science

162, ms.551-558.

W·dh 1m J M 1972 The use of fluorescein diacetate and phenosafranine for 1 0 ,.. .

detennining viability of cultured plant cells. Stain Technology 47, ms. 189-] 94.

Withers, L. A. ] 979. Freeze preservation of somatic embryos and clonal plantlets of

carrot (Daucus carota L.). Plant Physiology 63, ms. 460-467.

Withers, L. A. 1980. Preservation of germ plasm: Perspectives in Plant Cell and

Tissue Culture. Int. Rev. Cytol., Suppl.

Withers, L. A. 1985. Cryopreservation of Plant Cells and Organs: Cryopreservalion of

cultured plant cells and protoplasts. CRC Press Inc., Boca Raton, Florida.

74

Withers, L. A. & Street, H. E. 1977. Freeze-preservation of cultured plant cells.

Physiology Planl39, 171-178.

Withers, L. A. & King, P. 1. 1979. Proline: a novel cryoprotectant for the freeze

preservation of cultured cells of Zea mays L. Plant Physioogy 64, ms. 675-678.

Yamada, T., Sakai, A., Matsumura, T. & Higuchi, S. 1991. Cryopreservation of apical

meristems of white clover (Trifolium repens L.) by vitrification). Plant Science,

78, ms. 81-87.

Zakri A. Hamid, 2006. Kepelbagaian Biologi, Biakbaka Tumbuhan dan Bioteknologi:

Implikasi kepada Dunia Selatan (Abstrak).

http://pkukrnweb.ukm.my/-Iibrary/abzakrim.html.