universiti putra malaysia pembentukan kaedah...
TRANSCRIPT
UNIVERSITI PUTRA MALAYSIA
PEMBENTUKAN KAEDAH PENGESAN RACUN MAKHLUK PEROSAK MENGGUNAKAN TEKNIK ELEKTROD ENZIM DAN ENZIM IMUNOASAI
FARIDAH BT. SALAM
FSAS 1996 17
PEMBENTUKAN KAEDAH PENGESAN RACUN MAKHLUK PEROSAK MENGGUNAKAN TEKNIK ELEKTROD ENZIM DAN ENZIM IMUNOASAI
OLEH
FARIDAH BT. SALAM
Tesis yang dikemukakan sebagai Memenuhi Keperluan untuk memperolehi Ijazah Master Sains di Fakulti Sains dan Pengaj ian Alam Sekitar
U niversiti Pertanian Malaysia
Mei,1996
PENGHARGAAN
Alhamdullilah, bersyukur saya kehadrat Allah S.W.t. kerana dengan izinNya saya
dapat menyempumakan projek penyelidikan dan penulisan tesis ini sehingga kepada
noktahnya.
Setinggi-tinggi jutaan terima kasih saya ucapkan kepada pengerusi saya iaitu Prof.
Dr. Abu Bakar Salleh yang telah memberi tunjukajar yang bermakna di peringkat akhir
penyelidikan dan penulisan tesis. Prof. Dr. Kamaruzaman Ampon yang telah menyelia
saya dengan penuh kesabaran sebelum beliau bertukar ke Universiti Sabah. Juga kepada
Prof. Madya Dr. Che Nyonya Abd. Razak yang telah memberi semangat dan perangsang
semasa memulakan penyelidikan.
Begitu juga dengan kakitangan makmal, kak Rohaida dan Yati yang telah banyak
membantu dan bekeIjasama dalam mendapatkan bahan kimia dan penggunaan alatan
makmal. Juga kepada Prof. Madya Dr. Noraini Samad yang telah membenarkan
penggunaan alat pembaca ELISA Tidak ketinggalan juga kepada Shake, Zan, Maz, Su,
Yam, Khanom dan Rena yang menghidupkan suasana riang di makmal penyelidikan.
Untuk keluarga tercinta, Jamil, Liana dan Fikri serta ibu dan ayah tersayang segala
pengorbanan kalian tidak akan dilupakan.
I
KANDUNGAN
MUKASURAT
PENGHARGAAN............................ . ... . . . . . ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I
SENARAI JADUAL.... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . VI
SENARAI RAJAH .. .. ...... ... .. . . ... . ..... ............... . .. .. ......... .. ... . .... .... . . .. VII
NAMA SINGKATAN..................................................................... IX
ABSTRAK....................................................................................... XI
ABSTRACT.......... ... ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . XIII
BAB
I PENGENALAN ..................................................................... . 1
II SOROTAN LITERA TUR
Racun makhluk perosak. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 Racun rumpai 2,4-D. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 Paration. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 Karbofuran. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
Kesan racun makhluk perosak. . . . . .. . . . . . . . ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
Pemonitoran alam sekitar.. .. . .. . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 Biosensor. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 Bioreseptor. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
Enzim. . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 Mikroorganisma. . . . . . . . . ............. ...... ............. ............ .......... 13 Tisu dan organel. . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
Reseptor imunologi. . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4
"Transducertl. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4
Sekatgerak bioreseptor. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 Pemerangkapan fizikal. . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 Tautsilang. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 Aruhan elektromagnet. . . . . . . . . . . . . . . .... . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . 16
Elektrod enzim. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... . .. . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7
I I
Asetilkolin .................................................................... . Asetilkolinesterase ........................................................ . Kolin oksidase .............................................................. . Aplikasi elektrod enzim ................................................. .
Enzim imunoasai .................................................................... . Hapten .......................................................................... . Perlekatan hapten-protein ............................................. . P
..
. enClnan antIgen ........................................................... .
Penghasilan antibodi ..................................................... . Fonnat enzim imunoasai ............................................... . E . . . k 'f nztm Imunoasat ompetetI ......................................... . Kelebihan teknik enzim imunoasai ................................. .
ill BAHAN DAN KAEDAH
17 18 19 19
20 20 21 22 22 23 24 27
Sumber bahan kimia................................................................ 29
Instrumentasi.......................................................................... 30
Kaedah elektrod enzim............................................................ 30
Alat pengesan makhluk perosak....................................... 30
Kaedah penyediaan membran dialisis............................... 32
Cara menyekatgerakkan enzim ........................................ 32
Kaedah asai aktiviti enzim AchE dan ChO bebas.............. 34
Kaedah asai aktiviti elektrod enzim.................................. 35
Penentuan julat perencat bagi enzim bebas....................... 35
Penentuan julat perencat bagi elektrod enzim.............. ..... 36
Penentuan kesan pengaktifan 2-PAM ke atas pengaktifan aktiviti enzim bebas yang didedahkan kepada Paration pada kepekatan Iso................................. 36
Penentuan kesan 2-P AM ke atas aktiviti elektrod enzim yang telah didedahkan kepada Paration pada kepekatan Iso................................. 37
Kesan perencat keatas aktiviti elektrod enzim................................................................. 37
I I I
Kaedah enzim immunoasai .................................................... .
Penyediaan konjugat 2,4-D - BSA. ................................. .
Penyediaan konjugat 3-Hidroksikarbofuran tiroglobulin .. .
Penyediaan konjugatParation terturun BSA. .................. .
Immunosasi dalam amab ................................................ .
Penyediaan konjugat IgG - Alkalin fosfatase .................. .
Penentuan kesan agen penghalang te�had..ap perlekatan yang tidak spesifik pada pennukaan pepejal
0 0 ok
0
plnng ffil rotlter ............................................................. .
Kaedah ELISA . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Penentuan titer IgG 2,4-D, Paration.dan Karbofuran menggunakan kaedah kompetetif ELISA secara langsung ................................................. .
Penentuan graf piawai 2,4-D, Paration dan Karbofuran Menggunakan kaedah kompetetif ELISA secara langsung .................................................. .
Penentuan kespesifikan antibodi 2,4-D terhadap lain-lain terbitan 2,4-D ...................................... .
Penyediaan sampel tanah ................................................. .
Pengekstrakkan 2,4-D ..................................................... .
Penyediaan sampel air ..................................................... .
Penyediaan sampel sayur -sayuran dan buah-buahan ........ .
IV KEPUTUSAN DAN PERBINCANGAN
Kaedah enzim elektrod ........................................................... .
Aktiviti enzim bebas ....................................................... .
Akt· . . 0 k k IVltI enzlm se atgera ............................................... .
Julat perencat bagi enzim bebas ...................................... .
Julat perencat bagi enzim sekatgerak .............................. .
IV
38
38 38 39
40
44
44
45
48
48
49
50 50 51
5 1
52
52
53
60
63
Pengaktifan AchE dengan 2-PAM................................... 67
Kaedah enzim imunoasai......................................................... 68
Titer antibodi.................................................................. 71
Pengoptimuman kaedah ELISA....................................... 77
Penganalisisan sampel air.................................................. 87
Penganalisisan 2,4-D dalam sampel tanah......................... 87
Penganalisisan sampel buah-buahan dan sayuran............... 9 1
Perbandingan julat kepekatan racun makhluk perosak yang dapat dikesan menggunakan kaedah elektrod enzim dan enzim imunoasai................................................................ 95
V KESIMPULAN...................................................................... 98
RUJUKAN.... ....................................................................... ...... ..... 100
VITA................................................................................................ 108
PENERBITAN................................................................................ 109
v
SENARAI JAD UAL
Jadual �ukasurat
1 Kesan barah oleh racun makhluk perosak terhadap haiwan percubaan dan manusia (Fan, 1993)........................................................ 9
2
3
4
5
Iadual penyuntikan amab ...................................................... .
Senarai agen penghalang lain yang pernah dilaporkan ................................................................ .
Perbandinganjulat kepekatan racun yang dapat dikesan mengunakan kaedah ELISA. .................................... .
Pengekstrakkan 2,4-D menggunakan 2 kaedah dan tiga jenis pelarut berbeza dan pengasaiannya menggunakan kaedah ELISA secara langsung ........................................... .
6 Kit ELISA komersial untuk
41
82
86
90
pengesanan racun makhluk perosak........................................ 94
7 Perbandingan kepekatan racun makhluk perosak yang dapat dikesan oleh kaedah elektrod enzim dan enzim immunoasai........................................................... 96
VI
Rajah
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1 0
1 1
1 2
1 3
1 4
1 5
1 6
SENARAI RAJAH
Mukasurat
Struktur kimia 2,4-0 ................................................. .
Struktur kimia Paration ............................................. .
Struktur kimia Karbofuan .......................................... .
P · . b' nnslp losensor ....................................................... .
Kaedah penangkapan kompetetif. ............................. .
Kaedah "Sandwich" asai ............................................ .
Carta kaedah elektrod enzim ..................................... .
Graf penulenan IgG menggunakan turus o EAE-selulosa ......................................................... .
Carta alir kaedah kompetetif ELISA secara langsung ............................................ .
Carta alir kaedah DAS-ELISA. ................................. .
Carta alir kaedah Nitroselulosa-ELISA. ..................... .
Penentuan kadar tindakbalas yang dimangkinkan oleh AchE mengikut peningkatan kepekatan substrat. ................................ .
Penentuan kadar tindakbalas mengikut peningkatan kepekatan AchE .................................... .
Penentuan kadar tindakbalas mengikut peningkatan kepekatan ChO ..................................... .
Penentuan amaun AchE untuk disekatgerak pada membran elektrod (kepekatan ChO adalah konstan, 7U/ml) ..................................... .
Penentuan aktiviti enzim sekatgerak mengikut peningkatan kepekatan substrat AcI. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
VII
5
6
7
1 1
25
26
31
43
45
46
47
55
56
57
58
59
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
Julat kepekatan racun makhluk perosak yang dapat merencat aktiviti enzim AchE bebas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Penentuan kadar tindakbalas AchE pada separuh perencatan maksimum (Iso) mengikut peningkatan kepekatan substrat Ad ........................... .
Julat kepekatan perencat yang dapat merencat aktiviti enzim AchE yang disekatgerak ........ .
Kesan 2-P AM ke atas aktiviti enzim bebas yang telah didedahkan kepada Paration Iso ............................................................... .
Kesan 2-P AM ke atas aktiviti enzim sekatgerak yang telah didedahkan kepada Paration Iso ................. .
Titer IgG terhadap 2,4-D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Titer IgG terhadap Paration ...................................... .
Titer IgG terhadap Karbofuran ................................. .
Kespesifikan antibodi 2,4-D terhadap lain-lain terbitan 2,4-D .............................................. .
Kaedah DAS-ELISA. ................................................ .
Strip NC-ELISA. ...................................................... .
Kesan agen penghalang terhadap perlekatan yang tidak spesifik pada plat mikrotiter. .................................................. .
Graf piawai 2,4-D ...................................................... .
Graf piawai Paration .................................................. .
Graf piawai Karbofuran ............................................. .
Penganalisaan 2,4-D dalam sampel air dari sumber yang berbeza ...................................... .
Kandungan residu Paration dan Karbofuran dalam sampel buah-buahan dan sayuran dari ladang MARDI. ................................................. .
VI I I
61
62
65
69
70
73
74
75
76
78
79
81
83
84
85
88
92
NAMA SINGKATAN
AchE Asetilkolinesterase
ChO Kolin Oksidase
AcI Asetilkolin Iodida
BSA Albumin Serum Lembu
ECA Albumin Telur Ayam
OA Ovalbumin
2,4-D 2,4-Dwiklorofenoksi asid asetik
IgG Immunoglobulin G
2-PAM Piridin-2-Aldoximide Metiodida Klorida
NBS N-Hidroksisuksinimid
DCC N,N'-Dwisikloheksilkarbodiimid
NH2 Kumpulan amina
OR Kumpulan hidroksil
COOR Kumpulan karboksil
SH Kumpulan sulfilhidril
ELISA "Enzyme-linked Immunosorbent Assay"
DAS-ELISA "Double Antibody Sandwich"-ELISA
NC-ELISA Nitroselulosa-ELISA
ppm Bahagian per sejuta
ppb Bahagian per bilion
Ach Asetilkolin
BuchE Butirilkolinesterase
IX
MCPA
CPA
2,4,5-T
sm
PBS-T
PBS
BOD
FCA
PIA
DE-52
BaM
4-Kloro-2-metilfenoksi asid asetik
(±)-2-(4-Klorofenoksi) asid propionik
2,4,5-Triklorofenoksi asid propionik
sentimeter
Kepekatan perencat yang menyebabkan setengah perencatan maksimum
Penimbal fosfat bergaram yang mengandungi 0.05% Tween-20
Penimbal fosfat bergaram
"Biological Oxygen Demand"
Adjuvan Freund's lengkap
Adjuvan Freund's tak lengkap
DwietiIaminoetiIselulosa
Alat Pemonitoran oksigen
x
Abstrak tesis yang dikernukakan kepada Senat Universiti Pertanian Malaysia sebagai rnernenuhi syarat untuk rnendapatkan Ijazah Master Sains
PEMB ENTUKAN KAED AH PENGESAN RACUN MAKHLUK PERO SAK MENGGUNAKAN TEKNIK ELEKTROD ENZ� D AN ENZ�
� MUNO ASAI
Oleh
F ARIDAH B TE SALAM Mei, 1996
Pengerusi : Prof Abu Bakar Salleh, PhD Fakulti : Sains dan Pengajian Alarn Sekitar
Kaedah elektrod enzirn dan kaedah enzirn irnunoasai telah dibentuk untuk
rnenganggarkan kepekatan racun rnakhluk perosak dalarn pernonitoran alarn sekitar.
Enzirn Asetilkolinesterase (AchE) dan Kolin Oksidase (ChO) yang disekatgerak pada
rnernbran elektrod oksigen secara fizikal, taut silang dan pernerangkapan gelatin telah
digunakan sebagai elektrod enzirn. Sekatgerak enzirn secara taut silang didapati paling
sensitif untuk penentuan racun rnakhluk perosak. Racun Paration, Karbofuran dan asid
2,4-Dwiklorofenoksi asetik (2,4-D) telah digunakan untuk rnenguji darjah kesensitifan
elektrod enzirn. Elektrod enzirn dengan enzirn yang disekatgerak secara taut silang
rnenunjukkan separuh perencatan rnaksirnurn (I50) bagi Paration ialah 0.00001 11g!L dan
0.000211g/L bagi Karbofuran. Tiada kesan perencatan bagi racun 2,4-D. Julat kepekatan
racun yang boleh dikesan oleh elektrod enzirn adalah 0.00001-0.0001 11g!L bagi Paration
dan 0.00001-0.00 111g/L bagi Karbofuran. 2-amino-2-(hidroksimetil)-1,3-propandiol (2-
PAM) pada kepekatan 1 x 10-3M didapati sesuai digunakan sebagai bahan pengaktif bagi
enzirn pada elektrod yang telah didedahkan kepada racun rnakhluk perosak.
XI
Dalam kaedah enzim imunoasai, antibodi poliklonal terhadap racun Paration,
Karbofuran dan 2,4-D disediakan dengan mengimunkan amab dengan imunogen yang
terdiri daripada konjugat Paration terturun-serum albumin lembu (BSA), 3- hidroksi
Karbofuran-Tiroglobulin dan 2,4-D-BSA Titer imunoglobulin G (IgG) terhadap Paration
adalah 1: 102400, 1: 51200 bagi Karbofuran dan 1: 512000 bagi 2, 4- D. Antibodi terhadap
2,4-D didapati boleh bertindaksilang dengan kesemua terbitan 2,4- D yang dikaji. Tiga
kaedah asai imunojerapan berpaut enzim (ELISA) telah dibentuk iaitu kaedah " Double
Antibody Sandwich-ELISA" (DAS- ELISA), Nitroselulosa- ELISA (NC-ELISA) dan
kompetetifELISA secara langsung. Kaedah kompetetif ELISA secara lang sung didapati
berkesan untuk pengesanan ketiga-tiga jenis racun yang dikaji. Larutan 1 % susu tepung
tanpa lemak merupakan agen penghalang terbaik untuk kaedah ini. Julat kepekatan racun
yang boleh dikesan adalah 0.01 ng/ml hingga 500 ng/ml bagi Paration, 0.01 ng/ml hingga
100 ng/ml bagi Karbofuran dan 1 ng/ml hingga 1000 ng/mt bagi 2,4- D.
Kaedah elektrod enzim dan enzim imunoasai dapat mengesan racun makhluk
perosak pada kepekatan yang rendah iaitu kurang daripada 1 Ilg/L (lppm). Kaedah
elektrod enzim adalah sensitif terhadap racun kumpulan organofosfat (Paration) dan
karbamat (Karbofuran) tetapi tidak sensitif terhadap racun daripada kumpulan lain ( 2,4-
D). Elektrod enzim merupakan kaedah yang cepat di mana ia dapat menentukan
kehadiran racun makhluk perosak dalam masa kurang daripada lima minit manakala
kaedah enzim imunoasai adalah kaedah yang sensitif untuk kesemua jenis racun makhluk
perosak tetapi memerlukan masa asai yang lama.
XI I
Abstract of thesis submitted to the Senate ofUniversiti Pertanian Malaysia in fulfilment of the requirement for the degree of Master of Science
D EVELOP MENT O F AN ENZY ME ELECTROD E AND ENZY ME IM MUNO ASSAY TECHNIQ UES FO R P ESTICID ES D ETERMINATIO N
By
F ARID AH B T S ALAM May, 1 996
Chairman: Prof Abu Bakar Salleh, PhD. Faculty: Science and Environmental Study
An enzyme electrode and enzyme immunoassay techniques were developed to
determine the concentration of pesticides in environmental monitorings.
Acetycholinesterase (AchE) and Choline Oxidase (ChO) immobilized by physical, cross-
linking and gelatin entrapment were used as enzyme electrode. Cross-linked enzyme was
the most sensitive for pesticide detection. Parathion, Carbofuran and 2,4-
Dichlorophenoxy acetic acid (2,4-D) were used to test the sensitivity of the enzyme
electrode. The electrode with cross-linking enzyme showed 50% inhibition by Parathion
and Carbofuran at a concentration of 0.00001 �g/L and 0.0002 �g/L respectively. There
was no inhibition for 2,4-D. The detection limit of the pesticide concentration for cross-
linking enzyme was found between of 0.00001 �g/L and 0.0001 �g/L for Parathion and
0.00001 �glL to 0.001 �g/L for Carbofuran. 2-PAM (1 x 1 0-3 M) was found to be
useful for reactivation of the enzyme electrode after it had been exposed to pesticides.
XII I
In an enzyme immunoassay method, polyclonal antibodies against Parathion,
Carbofuran and 2, 4-D were raised in rabbits by immunization with haptein reduced
Parathion-BSA, 3 -hydroxy-Carbofuran-Thyroglobulin and 2, 4-D-BSA conjugate. The
IgG titer against Parathion, Carbofuran and 2,4-D were found at 1: 102400, 1: 51200 and
1: 512000 respectively. The 2,4-D antibody showed the cross reactivity with alI 2,4-D
derivatives which had been tested. Of the three ELISA methods used (Double antibody
sandwich-ELISA, Nitrocellulose-ELISA and Direct competitive ELISA), direct
competitive ELISA was found to be the most sensitive in the detection of the pesticides
tested. One percent of non fat dry milk solution was found to be the best blocking agent
in this ELISA method. The decetion limit of the pesticides concentration was at between
0.01 ng/ml to 500 ng/ml for Parathion, 0.01 ng/ml to 100 ng/ml for Carbofuran and 1
to 1000 ng/ml for 2, 4-D.
Both of the methods studied could determine low concentrations of the
pesticides (less than 1 flg/L, 1 ppm). The enzyme electrode was sensitive to
organophophorus and cabarmate pesticides but was not sensitive for the other pesticides.
It was found that the electrode enzyme was the fastest method for detection of
pesticides, while the enzyme immunoassay was more sensitive for all types of pesticides.
X IV
B AB I
PENGENALAN
Penggunaan racun makhluk perosak semakin meningkat di negara ini kerana
sebahagian besar daripada racun perosak tersebut digunakan dalam sektor pertanian
untuk mengawal perosak-perosak tanaman. Kejayaan penggunaannya terbukti boleh
meningkatkan pengeluaran hasil pertanian dan beIjaya membasmi serangga pembawa
kuman penyakit. Tetapi, di samping kejayaan penggunaan racun perosak, tidak dapat
dinafikan bahawa penggunaannya yang sangat tinggi juga boleh menimbulkan berbagai
bagai kesan buruk ke atas persekitaran dan juga kepada manusia sendiri.
Pendedahan racun makhluk perosak di kalangan petani sering mengakibatkan
gangguan kesihatan seperti gangguan fizikal dan mental. Selain itu, masalah aras sisa
racun perosak yang tinggi dalam bahan makanan khususnya sayur-sayuran dan buah
buahan yang dijual di negara ini juga boleh menyebabkan keracunan pada manusia dan
ternakan. Penumpukan sisa racun yang kekal agak lama di dalam tanah juga boleh
menyebabkan kerosakkan kepada tanaman. Di samping itu, ia juga boleh mengakibatkan
pencemaran kepada sistem saliran di mana akan meninggalkan kesan buruk kepada
organisma bukan sasaran seperti ikan dan hidupan-hidupan lain (Yunus dan Lim, 1980).
Justru itu langkah pengawasan perlu di ambil terhadap masalah pencemaran racun
makhluk perosak di negara ini.
1
2
Antara kaedah-kaedah pengesanan sisa racun makhluk perosak yang biasa
digunakan adalah berdasarkan kepada kaedah-kaedah konvensional seperti kromatografi
gas, kromatografi cecair berpotensi tinggi dan kromatografi lapisan nipis. Walaupun
teknik-teknik ini sensitif, tetapi ia memerlukan penelitian dan kos yang mahal. Jadi
kaedah yang mudah dikendali, kos yang rendah dan sensitif diperlukan untuk mengesan
kehadiran racun makhluk perosak di persekitaran.
Pendekatan yang digunakan dalarn kajian ini ialah menggunakan kaedah biosensor
terutarnanya kaedah elektrod enzim dan enzim imunoasai untuk mengesan sisa racun
makhluk perosak yang berada di persekitaran. Kaedah ini didapati lebih cekap, sensitif,
spesifik, mudah dikendalikan pada jumlah sarnpel yang banyak dan tidak memerlukan kos
yang tinggi.
Dalarn kajian ini alat pengesan racun makhluk perosak dibentuk berdasarkan
kepada daIjah perencatan racun terhadap aktiviti enzim Asetilkolinesterase (AchE) yang
disekatgerak bersama enzim Kolin Oksidase (ChO) pada membran dialisis dan diikat
pada mikro-elektrod oksigen. AchE menghidrolisiskan substrat Asetilkolin Iodida (AcI)
kepada asetat, kolin dan ion iodida, kemudian ChO mengoksidakan kolin kepada betain
dan hidrogen peroksida. Penggunaan oksigen untuk pengoksidaan kolin diukur
menggunakan elektrod oksigen yang disambung kepada alat pemonitoran oksigen.
Kepekatan racun makhluk perosak dalam sarnpel adalah berkadar songsang dengan
amaun oksigen yang digunakan dalarn tindakbalas enzim ChO. Dalarn kajian ini model
racun yang digunakan adalah Paration, Karbofuran dan 2,4-Dwiklorofenoksi asid asetik
(2,4-D). Racun kumpulan organofosfat dan karbamat atau racun lain yang bersifat
3
neurotoksik sahaja yang boleh merencat aktiviti enzim AchE. Oleh yang demikian
elektrod enzim hanya boleh mengesan kehadiran racun-racun daripada kumpulan ini
sahaja dan kesensitifannya adalah bergantung kepada amaun enzim dan kaedah
sekatgerak enzim pada membran elektrod. Jadi kaedah enzim imunoasai dibentuk untuk
menentukan jenis racun yang berbeza dengan lebih spesifik. Kaedah ini adalah
berdasarkan kepada perlekatan yang spesifik di antara racun dengan antibodi terhadap
racun tersebut. Antibodi dilabel dengan enzim alkalin fosfatase dan penambahan substrat
p-nitro-fenilfosfat akan menghasilkan produk berwarna yang dicerap menggunakan
spektrofotometer. Keamatan warna yang terbentuk adalah berkadar songsang dengan
kepekatan racun dalam sampel. Walaupun kaedah ini memerlukan penghasilan antibodi
untuk setiap jenis racun yang digunakan tetapi ia mempunyai beberapa keistimewaan iaitu
kespesifikan antibodi yang tinggi terhadap sesuatu jenis racun boleh digunakan untuk
membezakan terbitan-terbitan suatu jenis racun yang berada dalam sesuatu sampel. Di
samping itu darjah kesensitifannya adalah sangat tinggi di mana ia dapat menentukan
amaun racun yang sangat rendah dalam sesuatu sampel.
Jadi objektif kajian ini adalah untuk membentuk satu kaedah yang cepat dan
spesifik untuk mengesan racun makhluk perosak yang berada di persekitaran. Di antara
parameter yang dikaji adalah:
(a) Pengoptimuman kaedah elektrod enzim
(b) Pengoptimuman kaedah ELISA
(c) Aplikasi kedua-dua kaedah untuk sampel racun piawai dan sampel racun yang
berada di persekitaran.
B AB II
SO RO TAN LITERATUR
Raeun makhluk perosak
Racun makhIuk perosak merupakan bahan kimia yang digunakan untuk mengawal
at au membunuh makhluk perosak seperti serangga, roden, nematod, kulat, herba,
hamma, bakteria dan sebagainya. Selain itu, terdapat juga sebatian kimia yang tergolong
dalam racun mahluk perosak seperti bahan pengontang, peluruh daun, pengatur
tumbesaran, bahan pengusir, bahan pemandul, bahan penarik dan bahan penyahjangkitan.
Kebanyakan racun makhluk perosak adalah toksik terhadap haiwan dan manusia (Fan,
1 993). Racun mahluk perosak yang digunakan dalam penyelidikan ini ialah racun rumpai
iaitu asid 2,4-Dwiklorofenoksi asetik (2,4-D) dan racun serangga iaitu Paration dan
Karbofuran.
Raeun rumpai 2,4-D
Racun rumpai ini tergolong dalam kumpulan asid fenoksi berklorin. 2,4-D
merupakan racun yang mula-mula diperkenalkan dalam tahun 1944. 2,4-D merupakan
sebatian kimia yang bersifat hormon dan boleh didapati dalam bentuk garam atau ester.
Ia bersifat sistemik dan digunakan dengan meluas untuk mengawal rumpai berdaun lebar
4
5
dalam tanaman bijirin. Kadar yang digunakan ialah 0.28 hingga 2.3 kilogram per hektar
(Thompson et ai., 1984)
Penumpukan racun berlaku di bahagian meristem pucuk dan akar (Thompson et
ai. , 1984). Racun ini menyebabkan pertumbuhan pokok yang tidak normal di samping
mempengaruhi pernafasan, simpanan makanan dan pembahagian sel. Dalam tanah yang
lembab dan panas racun ini kekal antara satu hingga empat minggu (Thompson et ai.,
1984). 2,4-D bersifat neurotoksik pada manusia. Kesan teratogenik mungkin berlaku
pada individu yang terdedah kepada semburan 2,4-D (Hoar et ai. , 1986).
/CL
CL ---<IT>-- 0 - CH 2 - caOH
Rajah 1 : Struktur kimia 2,4-D
Paration
Paration adalah racun serangga dari kumpulan organofosforus. Sebatian
organofosforus merupakan sejenis ester daripada asid fosforus dan alkohol. Paration
bertindak terhadap sistem saraf Cara tindakan adalah merencat fungsi enzim
asetilkolinesterase di bahagian sinap. Corak tindakan racun ini telah dilaporkan oleh
O'Brien (1971) dan Corbett (1974). Semasa utusan melewati bahagian sinap, sel-sel saraf
akan merembeskan asetilkolin. Bahan ini bertindak sebagai pembawa utusan kepada sel
saraf yang berikutnya. Apabila tiada lagi maklumat, sejenis enzim iaitu asetilkolinesterase
akan bertindak ke atas asetilkolin ini. Tindakbalas yang berlaku adalah seperti berikut:
EH + AcCH ---,---EH.ACCH -----r--EAC -------·_EH + AcOH
Ch H20
6
Pada mulanya enzim (EH) bercantum dengan asetilkolin (AcCH) membentuk
komplek yang boleh bertindakbalas secara suapbalik. Komplek ini akan membebaskan
kolin (Ch). Jika air ditambah, komplek EAc akan membebaskan enzim bebas dan asid
asetik (AcOH). Ikatan P=O pada racun Paration mempunyai tarikan yang kuat terhadap
kumpulan OH pada enzim. Tindakan ini menyebabkan enzim tidak boleh bertindak
dengan asetilkolin. Ini menyebabkan asetilkolin berkumpul di bahagian sinap. Apabila
keadaan ini berlaku, corak biasa penghantaran maklumat akan terganggu. Bagi serangga
keadaan demikian boleh menyebabkan serangga tersebut hiperaktif, mengeletar, lumpuh
dan akan mati. Racun ini boleh menyebabkan kecacatan pada anak-anak ayam jika
disuntik ke dalam kandul yolka (Kurh & Dorough, 1977).
Terdapat beberapa simptom keracunan pada mamalia seperti kekejangan otot,
menggelepar dan pengecutan anak mata. Pekerja-pekerja yang sering terdedah kepada
racun ini akan mengalami kekurangan tenaga, lesu dan insommia (Kuhr & Dorough,
1977)
S II
(C2H50h-P-O � N02
Rajah 2: Struktur kimia Paration
7
Karbofuran
Karbofuran (2,3-dihidro-2,2-dimetil-7-benzofuranil N-metilkarbarnat) adalah
racun serangga yang bersifat sistemik dari kumpulan karbarnat. Ia digunakan sebagai
racun hamma dan nematod, mempunyai kelarutan yang sangat tinggi dalam air iaitu 700
mg per liter air pada suhu 25°C, ini memudahkan ia memasuki sistem tumbuhan.
Racun ini boleh digunakan pada daun dan pada tanah. Karbofuran kekal hanya
beberapa minggu dalarn tanah. Sebatian racun dalarn tanah boleh diserap oleh akar dan
akan mengawal perosak di bahagian daun. Masa separuh hayat dalarn tanah bergantung
kepada jenis tanah iaitu 30 hari dalarn pasir dan mencapai 80 hari dalam tanah yang kaya
dengan organik. Manakala dalarn tumbuhan, racun ini lebih bersifat persisten. Karbofuran
bertindak pada sistem saraf Corak tindakan adalah sarna seperti Paration.
(" o.co ·N
H 0 CIi;,
lO c�
Rajah 3: Struktur kimia Karbofuran
Kesan racun makhluk perosak
Sisa racun berkumpul dalam badan haiwan dan manusia melalui sistem rantaian
makanan. Kebanyakkan racun makhluk perosak berkumpul dalam tisu lemak haiwan dan
8
kekal agak lama. Banyak penyakit yang bersifat kronik senng dikaitkan dengan
kewujudan sisa racun dalam tubuh (Ames, 1992). Jadual l menunjukkan racun makhluk
perosak yang berpotensi menyebabkan barah berdasarkan kepada data eksperimen
terhadap haiwan percubaan dan kes keracunan.
Pemonitoran alam sekitar
Kualiti alam sekitar bergantung kepada pengawalan pencemaran yang berpunca
daripada bahan buangan kilang perindustrian, sisa bahan pertanian dan kenderaan
bermotor. Racun makhluk perosak merupakan sisa bahan pertanian yang menunjukkan
kegigihan yang rendah dalam alam sekitar tetapi bersifat toksik akut yang tinggi dalam
badan haiwan dan manusia (Moore & Moore, 1983).
Racun makhluk perosak biasanya dimonitor dengan menggunakan kaedah
konvenslonal seperti kaedah kromatografi gas, kromatografi cecair berpotensi tinggi dan
kromatografi lapisan nipis. Kaedah ini memerlukan masa analisa yang lama dan sampel
perlu diekstrak dan dipekatkan terlebih dahulu untuk mendapatkan nilai kepekatan racun
yang tepat. Kaedah pengesan BOD (Biological Oxygen Demand) digunakan juga dalam
pengawalan alam sekitar. Kaedah ini didapati memerlukan masa pengeraman sampel
selama 5 hari. Ekoran dari itu, kita memerlukan satu kaedah yang mampu mengesan dan
menentukan kuantiti bahan racun makhluk perosak yang berada di persekitaran dengan
cepat, mudah dan lebih spesifik. Biosensor menjadi fokus utama dalam kajian ini.
9
ladual 1 Kesan barah oleh racun makhluk perosak terhadap haiwan percubaan dan manusia (Fan, 1993)
Raeun Makhluk perosak
Alaklor ASld arsemk Atrazm Benonul KalsJUrn arsemt Kaftafol Kaptan Kordlrnefon Klorobenzllat Klorotaloml Kuprum arsemt Klpennetrm Klromazm Dammozlde Dlalatte Dlklofop-mehl Etaflunn Etll oblde Lmdane Lmuron Mankozeb Maneb Metomil MetJrarn Metolaktor Onzahn Oxadlazon Parakuat Paratlon PCNB O-femlfenon Pronamld Tetraklovmfos TJOdlkab Terbutnn TJOfanate-metJI Toxapane Tnflunn Zmeb
A Karsmogen pada manUSla
Aplikasi pada tanaman
hrnau Jagong kapas tebu peach, pome fruit Llffiau, padl Jambu batu kacang soya epal, almond kapas hrnau buah, sayur, kekacang sayuran kapas ternakan epal kacang soya hmau, kapas epal,orkId avokado bawang, kentang buahan, blJlfln keclI kapas buahan, blJlfln keell buahan, blJlfln keeil Jagong, kacang soya kacang soya vmeyards padl padl, kacang soya kapas, kekacang Ilffiau, orkld lettuce plr anggur kapas kapas, kacang soya buahan,kacang sayuran
B 1 Karsmogen pada manusla tetapl kaJlan tJdak mendalarn B2 Karsmogen pada halwan percubaan C Kemungkman berslfat karsmogemk pada manUSla
Kesan barah
C A C C C C B2 B l C B2 Bl C BI BI C BI BI B2 B2/C C B2 B2 C B2 C C C C C B2 B2 C C C C C B2 C B2