LAPORAN DEMO BIOTEKNOLOGI

Disusunoleh:Kelompok 3 dan 5

Bernadius Agustinus1006683412Chatrin1006683444Febrianto Dwikaguri1006775035Herlina Tri S. 1006775054Nucky O.0906552870Nurul Afiani1006659533R.R. Irma Rosita0906531506Ratna Wiyanti H.1006683816Rozi Fadjri1006659552Satrio Ang Jaya 1006683886

FAKULTAS FARMASIUNIVERSITAS INDONESIADEPOK2013BAB 1PENDAHULUAN1.1 Latar BelakangBioteknologi merupakan bidang yang sedang sangat berkembang di zaman yang modern ini. Kajian mengenai materi genetik dan rekayasa biologis akan sangat mempengaruhi bidang ini. Oleh sebab itu, diperlukan pengetahuan mengenai dasar-dasar ilmu bioteknologi. Pada laporan ini akan dibahas mengenai metode-metode teknik PCR (Polymerase Chain Reaction) dasar dan teknik kloning DNA.

1.2 Rumusan Masalah Bagaimana melakukan ekstraksi DNA dari sumbernya? Bagaimana memisahkan DNA dengan teknis Elektroforesis agaros gel? Bagaimana mengamplifikasikan DNA dengan metode PCR? Bagaimana cara mempurifikasi DNA hasil PCR? Bagaimana melakukan isolasi plasmid? Bagaimana mengkloning DNA yang telah diisolasi? Bagaimana mentransformasikan DNA ke dalam vektor?

1.3 Tujuan PenulisanPenulisan makalah ini bertujuan untuk memberikan informasi terhadap masalah-masalah yang telah dirumuskan dalam makalah ini.

1.4 Metode PenulisanMetode penulisan yang digunakan adalah metode pustaka. Data yang diambil berasal dari berbagai sumber, diantaranya berupa e-book, buku, dan situs internet yang berkaitan dengan terapi gen untuk kanker payudara.

1.5 Sistematika PenulisanBAB 1. PENDAHULUAN1.1 Latar Belakang1.2 Rumusan Masalah1.3 Tujuan Penelitian1.4 Metode Penulisan1.5 Sistematika PenulisanBAB 2. ISI2.1Ekstraksi DNA genomik2.2Elektroforesis agaros gel mini2.3Polymerase Chain Reaction2.4Purifikasi hasil PCR2.5Isolasi Plasmid2.6Pemotongan/digesti DNA Plasmid dengan enzim restriksi2.7Isolasi fragmen DNA dari gel agaros gel mini2.8Ligasi2.9Membuat sel E. coli kompeten dengan perlakuan CaCl2 dan kejutan panas.2.10TransformasiBAB 3. PENUTUP3.1 Kesimpulan 3.2 Saran

BAB 2ISI

1. TEKNIK EKSTRAKSI DASAR, PCR DASAR1.1. EKSTRAKSI DNA GENOMIK

I. TujuanEkstraksi DNA genomik bertujuan untuk memperoleh DNA genomik(>50-100 kb) dengan kualitas kemurnian yang tinggi.

II. ProtokolEkstraksi DNA genomik bertujuan untuk memperoleh DNA genomik (>50-100 kb) dengan kualitas kemurnian yang tinggi. Dalam prosesnya, protein (termasuk nuklease yang merusak DNA dan RNA) serta polisakarida (yang dapat menginhibisi beberapa enzim yang digunakan dalam biologi molecular) dibersihkan dari DNA yang terekstraksi.Dalam mengekstraksi DNA genomik, terdapat satu pertimbangan utama, yaitu pemilihan metode yang tepat sehingga DNA dapat dibersihkan dari protein dan polisakarida secara efisien. Kebanyakan metode ekstraksimemerlukan biaya yang mahal dan memerlukan waktu yang lama menggunakan teknik cesium chloride density gradient untuk mengeliminasi polisakarida. Beberapa metode lainnya ada yang tidak menggunakan teknik tersebut, namun hanya bisa digunakan untuk tipe spesies yang terbatas. Sedangkan dalam praktikum ini, digunakan metode ekstraksi DNA genomik yang dimodifikasi Murray dan Thompson (1980) dengan menggunakan Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB) atau Hexadecyl Trimethyl Ammonium Bromide (HTAB). Teknik Murray dan Thompson ini memungkinkan ekstraksi DNA dengan berat molekul tinggi tanpa menggunakan alat yang mahal dan waktu yang lama.(Murray & Thompson, 1980)Pada awalnya disiapkan kultur bakteri yang telah ditumbuhkan secara optimum sebanyak 1,5 mL kemudian dimasukan ke dalam tabung sentrifus mikro. Kultur bakteri tersebut disentrifus pada kecepatan 5000 rpm selama 2 menit untuk memisahkan supernatant dan DNA yang akan diekstraksi. Supernatan kemudian dibuang hingga tersisa residunya saja. Tahap ini bisa diulang jika residu yang diperoleh hanya sedikit. Residu yang yang diperoleh diresuspensikan di dalam 567 L dapar TE (Tris EDTA) untuk mengatur pH. Kemudian ditambahkan 30 L 10% SDS (Sodium Dodesil Sulfat) dan 3 L Proteinase-K (2mg/ml). Sodium dodesil sulfat digunakan untuk melisiskan sel bakteri untuk mengeluarkan konstituen selularnya, sedangkan Proteinase-K digunakan untuk mengkoagulasi protein hasil lisis sel. Kemudian campuran tersebut diinkubasikan pada suhu 37oC selama 1 jam.Setelah diinkubasi, campuran tersebut ditambahkan NaCl 5M sebanyak 65 L, kemudian dikocok kuat. Lalu ditambahkan CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) sebanyak 80 L, kemudian dikocok kuat dan dipanaskan pada suhu 65oC selama 30 menit. CTAB selain berfungsi dalam membantu lisis sel, juga berperan penting pemisahan asam nukleat dari polisakarida karena akan menyebabkan perbedaan kelarutan asam nukleat dan polisakarida dalam larutan, sehingga dapat dipisahkan dengan mudah.Sebanyak 650 L campuran kloroform-isoamilalkohol ditambahkan ke dalam campuran dan dikocok kuat selama 5 menit. Kloroform-isoamilalkohol berfungsi untuk membersihkan debris sel hasil dari lisis sel. Kemudian campuran disentrifus dengan kecepatan 10.000 rpm selama 20 menit.Supernatan yang mengandung DNA diambil dan dimasukan ke dalam tabung mikro 1,5 mL yang steril. Setelah itu ditambahkan 400 L isopropanol dingin untuk mengendapkan DNA. Benang-benang DNA akan dapat dilihat terbentuk setelah beberapa saat. Benang-benang DNA yang terbentuk diambil menggunakan pipet Pasteur yang telah dibentuk kait pada ujungnya. Benang-benang DNA dimasukkan ke dalam 1 mL etanol 70% dingin. Kemudian dilakukan sentrifus selama 2 menit untuk mengendapkan benang-benang DNA, dan supernatant dibuang secara hati-hati.DNA yang diperoleh dikeringkan menggunakan vakum kira-kira selama 30 menit, atau dalam desikator selama 15 menit, atau cukup dikeringkan pada suhu kamar selama 3-4 jam. Pelet DNA kemudian dilarutkan dalam 50 L dapat TE (Tris EDTA) atau dH2O bebas nuklease. Untuk mempermudah proses pelarutan diinkubasi pada suhu 50-55oC selama 10 menit. DNA harus benar-benar larut untuk digunakan dalam prosedur berikutnya. Larutan DNA kemudian disimpan dengan cara dibekukan pada suhu -20oC.

1.2. ELEKTROFORESIS AGAROS GEL MINI

I. TujuanElektroforesis agaros gel mini adalah teknik yang dilakukan bertujuan untuk menganalisis DNA hasil ekstraksi dan purifikasi maupun amplifikasi secara kualitatif

II. ProtokolYang pertama dilakukan adalah menimbang serbuk agaros sejumlah tertentu sehingga diperoleh konsentrasi 1-1,5% dalam 1xTAE. Setelah itu, agaros yang telah ditimbang dilarutkan dalam sejumlah volume tertentu 1xTAE, dengan catatan jika volume gel yang akan dibuat 30 ml, maka agaros yang ditimbang adalah 0,3 gram dan TAE yang dibutuhkan adalah 30 ml. Setelah larut, agaros didinginkan sampai kurang lebih 500C kemudian dituangkan ke dalam cetakan gel mini. Tahap ini bisa dimodifikasi dengan cara menambahkan ethidium bromida (EtBr) cair ke dalam cetakan gel yang sebelumnya telah dituangkan agaros yang sudah mencapai kurang lebih 500C. Jika masih panas, EtBr ditunggu hingga tidak ada uap lagi. Perlu berhati-hati dalam menuangkan dan mengaduk EtBr, karena uap yang mengandung EtBr dapat menyebabkan mutagenesis (bersifat karsinogenik). Fungsi EtBr ini adalah untuk meningkatkan daya fluoresensi dari DNA sehingga dapat terlihat jelas.Prosedur kerja yang digunakan untukRunning yaitu agaros yang telah membeku diletakkan dalam wadah elektroforesis, lalu diberi dapar secukupnya. Kemudian contoh yang akan dianalis dimasukkan ke dalam sumur gel, arus listrik 100 V dihidupkan selama 30 menit, lalu gel diangkat dan direndam dalam larutan ethidium bromidaselama 10 menit, kemudian pita DNA diamati dengan UV-transilluminator.DNA dapat ditentukan dengan melakukan migrasi di dalam gel agarosa, agar dapat divisualisasikan maka DNA yang ada di gel harus diwarnai dengan ethidium bromida, kemudian dilihat dengan sinar UV. Ethidium ini akan mengikat molekul DNA namun molekul ethidium bromida ini dapat berenergi tinggi sehingga dapat merusak sel. DNA merupakan molekul bermuatan negatif, sehingga bila diletakkan di medan listrik, DNA akan bergerak (migrasi) dari kutub negatif ke kutub positif. Pergerakan ini kecepatanya tergantung dari ukuran molekul, kerapatan media, dan arus listrik yang diberikan. Semakin kecil ukurannya, DNA akan bermigrasi semakin cepat. Semakin rapat media yang digunakan, semakin lambat DNA bermigrasi. Dan semakin besar arus yang diberikan, maka akan semakin cepat DNA bermigrasi. Sebelum dilakukan elektroforesis, suspensi DNA harus dicampur dengan penyangga muatan perwarna (loading dye) perwarna yang digunakan adalah bromofenol biru laju migrasi bromofenol biru dalam gel agarosa (0,5-1,4%) di dalam larutan penyangga 0,5 x TBE kira-kira sebanding dengan laju migrasi DNA utas ganda linear sebesar 300 pb.Dari hasil elektroforesis dapat disimpulkan:1. Arah pergerakan, ukuran, dan kecepatan DNA dapat diketahui.2. Keberadaan dan tingkat kemurnian DNA dapat juga diketahuimelalui proses spektrofotometri.3. Penggunaan Ethidium Bromida perlu diperhatikan dengan baik agar tidak merusak DNA karena molekulnya berenergi tinggi.

1.3. POLYMERASE CHAIN REACTIONI. TujuanPolymerase Chain Reaction adalah teknik molekuler yang dilakukan bertujuan untuk mengamplifikasi fragmen DNA dengan menggunakan suatu pasangan primer yang dirancang dengan khas.

II. ProtokolPraktikan membuat PCR master mix dengan komposisi sebagai berikut (volum akhir 25 l): dapar yang mengandung Mg2+ 2,5 l, enzim DNA Taq polymerase 1 l, dNTP 0,5 l, primer forward, primer reverse, ddH2O 18 l. Jika contoh yang akan diamplifikasi lebih dari satu, maka masing-masing jumlah komponen tersebut dikalikan dengan jumlah contoh ditambah satu (n+1), kemudian campur di dalam satu tabung mikro 1,5 l. Jika volum akhir 50 l, maka jumlah masing-masing komponen harus disesuaikan. Pembuatan master mix dilakukan di clean bench untuk menghindari adanya kontaminan. Untuk menghindari kontaminan, pengerjaan dilakukan pada area yang memiliki aliran udara laminair. Tahap berikutnya adalah mencampurkan 1 l hasil dari ekstraksi DNA ke dalam master mix yang telah dialiquot di dalam tabung PCR 0,2 atau 0,5 l, kemudian dicampur dengan mixer (vortex). Untuk memastikan semua komponen tercampur, dilakukan sentrifusi singkat (spindown) dengan sentrifus mikro, kemudian siap ditempatkan pada mesin PCR/ thermal cycler.Kemudian, mesin PCR diatur sesuai kondisi yang sudah dirancang sebelumnya. Tahap pertama adalah predenaturasi (94 oC; 5 menit) yang dilanjutkan dengan denaturasi (94 oC; 30 detik). Pada suhu 94 oC diharapkan template DNA yang ingin diamplifikasi akan terdenaturasi menjadi dua untai ssDNA, sehingga bisa diperbanyak. Setelah terbentuk untai tunggal DNA, masuk ke tahap annealing (55 oC; 30 detik). Pada tahap ini, primer forward dan reverse masing-masing menduduki sekuens target yang ingin diamplifikasi. Digunakan 2 primer: forward dan reverse, untuk memulai polimerasi dari 2 untai ssDNA Primer merupakan oligonukleotida spesifik untuk bagian target yang ingin diamplifikasi.Setelah itu, tahap ketiga adalah extension/ elongasi (72 oC; 1 menit). Pada tahap ini enzim polymerase bekerja dan terjadi polimerisasi DNA dengan adanya dNTP yang merupakan building block atau bahan dasar untuk membentuk amplikon-amplikon. dNTP terdiri dari dATP, dCTP, dGTP, dTTP yang merupakan basa-basa penyusun DNA. Ada 2 jenis enzim polymerase yang biasanya digunakan: Taq dan KOD. Enzim polymerase yang digunakan dalam PCR harus termostabil, karena suhu percobaan mencapai 94 oC.Untuk keperluan itulah dikembangkan enzim polymerase dari spesies yang dapat bertahan hidup di lingkungan panas. Taq polymerase bersumber dari Thermus aquaticus YT1 yang hidup di mata air panas di Yellowstone National Park. Sementara KOD berasal dari bakteri Thermococcus kodakaraensis KOD1 di pulau Kokadara, Jepang. Gen penyandi DNA polymerase mereka dibiakkan menggunakan E. coli sehingga dapat digunakan untuk PCR secara luas. Produk yang dihasilkan berupa enzim DNA polymerase yang stabil pada suhu tinggi (seperti yang terjadi dalam PCR). Adapun KOD dapat dikatakan lebih spesial karena memiliki aktivitas eksonuklease 3'5' (proof-reading), yang tidak dimiliki oleh Taq DNA Polymerase. Frekuensi mutasi yang terjadi pada penggunaan KOD polymerase lebih rendah dibandingkan Taq polymerase. Kedua enzim ini disimpan pada suhu -20 oC. Cara memegang enzim tersebut juga khusus, tidak boleh memegang pada bagian bawah/badan wadah, melainkan memegang pada bagian atas. Hal ini bertujuan untuk menjaga suhu enzim tetap terjaga. Penggunaan ruangan ber AC juga bertujuan untuk menjaga suhu ruangan tetap dingin dan tidak merusak komponen-komponen PCR seperti enzim.Enzim polymerase yang termostabil tersebut membutuhkan Mg2+sebagai kofaktor untuk mempercepat jalannya reaksi. Oleh karena itu digunakan dapar yang mengandung Mg2+, biasanya dalam bentuk MgCl2. Jumlah Mg2+harus dihitung dengan tepat, karena jika kekurangan Mg2+reaksi akan berjalan lambat, bahkan beberapa enzim polimerasi tidak akan teraktivasi. Sedangkan kelebihan Mg2+ menyebabkan reaksi berjalan terlalu cepat dan kemungkinan error dalam proses elongasi menjadi lebih besar.Setelah itu, tahap denaturasi, annealing, dan extension diulang kembali sekitar 25-30 siklus. Tujuannya adalah mendapatkan target DNA yang benar-benar diiginkan. Setelah 25-30 siklus, masuk ke tahap Post-extension (72 oC; 20 menit). Amplikon-amplikon sekarang telah terbentuk dan siap dipurifikasi. Jika amplikon tidak akan digunakan langsung, tetap tinggalkan di dalam mesin thermal cycler dengan suhu 4 oC (hold). Kondisi PCR ini adalah untuk metode PCR konvensional. Kondisi dapat dimodifikasi untuk metode-metode PCR lainnya sesuai kebutuhan.Selanjutnya, hasil PCR divisualisasi dan dipurifikasi dengan elektroforesis agaros gel mini (kualitatif) atau dengan spektrofotometer nanodrop (kuantitatif).

1.4. PURIFIKASI HASIL PCRI. TujuanPurifikasi hasil PCR adalah teknik yang bertujuan untuk memperoleh DNA hasil PCR (DNA amplikon) yang murni.

II. ProtokolUntuk melakukan purifikasi hasil PCR, pertama-tama praktikan mengelektroforesis 20 l DNA hasil amplifikasi PCR dan 5 l loading buffer di gel agarosa 1%. Selanjutnya pita yang diinginkan dipotong dengan menggunakan pisau silet atau cutter yang baru dan steril. Irisan gel dipindahkan ke dalam tabung mikro 1,5 ml yang baru dan steril. Setelah irisan gel dipindahkan ke dalam tabung, praktikan menambahkan 300 l dapar DF kemudian campuran divortex dan diinkubasi pada suhu 55-60C selama 10-15 menit hingga irisan gel terlarut sempurna. Selama inkubasi tabung mikro dibolak-balik setiap 2-3 menit. Kemudian campuran tersebut didiamkan hingga dingin pada suhu kamar.Setelah campuran tersebut sudah mulai dingin, praktikan memipet campuran tersebut dan memasukkannya ke dalam kolom DF yang terpasang pada tabung penampung. Selanjutnya campuran disentrifusi pada kecepatan maksimum (13.000 rpm) selama 30 detik. Cairan yang tertampung dibuang dan kolom DF ditempatkan kembali pada tabung penampung.Setelah itu dilakukan penambahan 600 l dapar pencuci (wash buffer) yang telah ditambah etanol dan dilakukan sentrifusi kembali pada kecepatan maksimum selama 30 detik. Cairan yang terkumpul dibuang kembali dan kolom DF ditempatkan kembali ke dalam tabung penampung, setelah itu campuran disentrifus pada kecepatan maksimum selama 3 menit sampai membran kolom mengering. Kolom DF yang telah kering selanjutnya dipindahkan ke dalam tabung mikro 1,5 ml yang baru dan steril. Kemudian ditambahkan 25 l akuabides steril ke dalam bagian tengah dari membran kolom DF agar pengendapan pada dinding kolom dapat dihindari. Selanjutnya akuabides dibiarkan terserap selama 2 menit kemudian disentrifusi pada kecepatan maksimum selama 1 menit untuk mendapatkan DNA murni. Setelah didapat DNA yang murni, DNA disimpan pada suhu -20C.Untuk mengamati DNA hasil purifikasi secara visual, DNA dianalisis kembali dengan elektroforesis agaros gel mini. Jika informasi sekuens DNA amplikon diperlukan, maka dapat dilakukan sekuensing DNA.

2. Isolasi Plasmid dan Kloning DNA2.1 Isolasi PlasmidIsolasi/ekstraksi DNA plasmid bertujuan untuk memperoleh DNA plasmid dengan kualitas kemurnian yang baik. Dapat dilakukan dengan menggunakan metode modifikasi Alkalin Lisis atau menggunakan kolom (kit).DH5 (pUC19) ditumbuhkan di dalam medium LB+Amp (100 g/mL) pada temperaturn 370C secara aerobik selama semalam. Selanjutnya 8 tabung mikro diambil dan pada empat tabung diberi label pUC19, kemudian 1,5 mL kultur bakteri dimasukkan ke dalam tabung mikro. Setelah itu sel bakteri dikumpulkan melalui sentrifusi pada sentrifuge mikro dengan kecepatan 10.000 rpm selama 2 menit, lalu supernatan dibuang sampai tinggal nya saja. Kemudian diresuspensikan di dalam 110 L Larutan A (Larutan glukosa-EDTA) dan didiamkan pada suhu ruang selama 5-10 menit. Sementara itu Larutan B dibuat di dalam tabung reaksi steril dengan memasukkan 4,25 mL dH2O steril, 0,5 mL 10% SDS dan 0,25 mL 4N NaOH. Kemudian Larutan B yang telah dibuat ditambahkan sebanyak 200 L pada masing-masing tabung mikro, lalu tabung mikro dibolak-balikkan dan secara perlahan tercampur sampai terjadi lisis (ditandai dengan perubahan larutan menjadi bening dan viskos/mengental). Setelah itu diinkubasi pada temperatur 00C (di atas pecahan es) selama 5-10 menit. Kemudian larutan C yaitu larutan KOAc/HOAc dingin sebanyak 150 L ditambahkan pada masing-masing tabung, lalu divorteks selama sekitar 10 detik. Setelah itu diinkubasi lagi pada temperatur 00C (di atas pecahan es) selama 5-10 menit. Selanjutnya disentrifusi dengan kecepatan 5.000 rpm selama 3 menit, supernatant dipindahkan ke tabung mikro lain yang steril dan ditambahkan 0,5 mL campuran fenol-CHCl3-isoamil alkohol. Kemudian divorteks sebentar sampai terbentuk suspensi lalu disentrifusi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 10 menit. Supernatan (fase cair) dipindahkan ke tabung mikro steril dan diusahakan untuk mengambil sebanyak mungkin supernatan tetapi tidak terkontaminasi dengan bagian fenol. Kemudian pada supernatan tersebut ditambahkan 1 mL etanol absolut dingin, dicampurkan dan diinkubasi pada temperatur 200C selama minimum 10 menit. Setelah itu disentrifusi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit, lalu dibuang supernatannya. Pelet (mengandung DNA+ RNA stabil + mungkin sedikit protein kontaminan dicuci dengan menambahkan 700 L 70% etanol dingin. Kemudian pelet dikeringkan di dalam chamber yang terhubung dengan pompa vakum selama beberapa menit, namun jangan sampai terlalu kering. Pelet disuspensikan di dalam 40-50 L 1xTE pH 8 kemudian disimpan di dalam freezer -200C.

2.2 Digesti DNA Plasmid dengan Enzim RestriksiPemotongan DNA Plasmid dengan enzim restriksi bertujuan untuk memperoleh fragmen DNA plasmid yang terpotong menjadi linier agar siap untuk disisipi dengan fragmen DNA sisipan. Teknik digesti ini banyak dipakai untuk mengklon DNA asing ke vektor, maupun pada verifikasi plasmid rekombinan.Komponen-komponen seperti DNA pUC19, buffer, enzim restriksi dan dH2O steril dimasukkan ke dalam 3 tabung mikro dengan jumlah seperti tabel di bawah ini.DNA (L)10xbuffer (L)Enzim restriksi/5 unit (L)dH2O steril (L)Total Volume (L)

pUC19 (2)201620

pUC19 (2)2BamHI (1)1520

pUC19 (2)2EcoRI (1)1520

Selanjutnya tabung mikro tersebut diinkubasi pada temperatur 370C selama minimum 2 jam. Namun perlu diingat bahwa tidak semua enzim restriksi optimum pada temperatur 370C. Selama menunggu proses inkubasi dapat disiapkan gel. Kemudian 5 L blue juice ditambahkan dan dipanaskan di dalam penangas air 650C selama 5 menit. Setelah itu tabung-tabung mikro tersebut dimasukkan ke dalam sumur-sumur elektroforesis dengan urutan dari paling kiri yaitu: Standar ukuran molekul pUC19 BamHI pUC19 EcoRI pUC19 utuhKemudian hasilnya disimpan di dalam chiller yang terdapat gel untuk menjaga suhunya tetap 00C ketika dikeluarkan dari chiller karena DNA sensitif terhadap suhu.

2.3Isolasi Fragmen DNA dari Gel AgarosaIsolasi fragmen DNA dari gel agarosa bertujuan untuk memperoleh fragmen DNA yang telah didigesti. Bahan-bahan yang diperlukan adalah hasil reaksi digesti, larutan NaI 3M, binding buffer, wash buffer, kolom binding, dH20 steril atau 1xTE pH 8. Alat yang dibutuhkan adalah pisau silet yang baru dan steril, pipet mikro 20-200l dan 1000l dengan tipnya, tabung mikro 1,5 ml, rak tabung mikro dan mikrosentrifus. Pertama-tama, gel mini yang sudah diwarnai dengan Ethidium Bromida ditaruh diatas plastik pelindung kaca. Kemudian pita DNA yang akan diisolasi diiris dengan silet yang baru dan bersih. Pita ini dilihat pada kondisi low exposure yaitu pada panjang gelombang panjang 300-350 nm dan diusahakan agar terpapar UV seminimal mungkin. Gel tidak boleh dipotong/diiris di atas kaca UV. Pekerjaan ini harus dilakukan dengan cepat karena DNA dapat terfragmen apabila diekspos sinar UV. Irisan gel berisi DNA, dikumpulkan, dipotong kecil-kecil dan dimasukkan ke tabung mikro baru dan steril yang sebelumnya sudah ditimbang. Setelah berisi potongan agarosa, ditimbang lagi. kemudian, larutan NaI 3M sebanyak tiga kali volume gel agarosa yang dicacah dicampurkan kedalam tabung. Kemudian tabung dibolak-balik agar potongan gel larut sempurna. Larutan garam NaI (chaotropic) yang berfungsi untuk melarutkan gel sehingga DNA dapat diekstraksi.Larutan pada tabung kemudian dimasukkan ke dalam kolom yang tersedia dan disisipkan pada penampung, disentrifusi sesuai protokol pada kit, dan cairan yang tertampung pada tabung penampung dibuang. Lalu, Binding Buffer ditambahkan kedalam kolom kemudian disentrifusi kembali. Cairan yang tertampung pada tabung penampung dibuang. DNA binding buffer biasanya mengandung EDTA untuk mengendapkan logam dan kontaminan lain, dan mengandung GuSCN (Guanidine tiosianat) yang berfungsi sebagai tempat terikatnya DNA. Dan mengandung alcohol yang berfungsi untuk membuang garam-garam atau protein. Cuci kolom dengan wash buffer (mengandung Tris-HCl dan etanol). Tahap ini dilakukan dua kali dan kolom dan penampung disentrifusi selama 2 menit untuk mengeringkan kolom. Tabung penampung lalu diganti dengan tabung mikro yang baru dan steril. Terakhir, pada kolom yang berisi DNA, ditambahkan dH2O atau 1xTE pH 8 sebanyak 20 sampai 30 l untuk kemudian disentrifusi. dH2O atau 1xTE pH 8 berfungsi untuk melarutkan DNA tetapi TE lebih mudah melarutkan DNA daripada air. Cairan hasil dari sentrifusi ini akan mengandung fragmen DNA pada cairan yang tertampung pada tabung mikro yang sudah diganti.

2.4LigasiLigasi bertujuan untuk menyambungkan fragmen DNA sisipan dengan vektor DNA sirkuler yang telah menjadi linier untuk memperoleh suatu DNA rekombinan. Semua pekerjaan Ligase ini dilakukan diatas es untuk menjaga kinerja enzim T4DNA Ligase. Disiapkan tiga tabung mikro. Tabung mikro pertama diisi DNA vektor pUC19-EcoRI+Pstl 3l, dan tabung kedua diisi dengan DNA sisipan Kanr-EcoRI+Pstl 5l serta tabung ketiga diisi dengan campuran pUC19-EcoRI+Pstl 3l dan Kanr-EcoRI+Pstl 5l. Masing-masing tabung ditambahkan 5X buffer Ligase 4l dan 1l enzim T4DNA Ligase. Dimana total volum pada masing-masing tabung mencapai 20l dengan menambahkan dH20 sampai 20 l. Setelah selesai, semua tabung diinkubasikan dalam lemari es selama satu malam. Campuran ini siap ditransformasikan ke sel kompeten E. coli DH5.

2.5Pembuatan Escherichia coli Kompeten Melalui Perlakuan CaCl2 dan Kejutan Panas.Pembuatan sel E. coli kompeten adalah untuk menyediakan sel yang siap digunakan untuk transformasi DNA rekombinan ke sel inang (E.coli) untuk memperoleh E. coli rekombinan. Adapun bahan-bahan yang dibutuhkan untuk membuat sel E.coli kompeten adalah Escherichia coli DH5 dan larutan 0,1 M CaCl2 dingin. Dibutuhkan peralatan berupa pipet mikro 0-20 L dan 20-200 L beserta tipnya, rak tabung mikro dan tabung mikro 1,5 mL. pertama-tama E. Coli DH5 ditumbuhkan pada kaldu LB pada suhu 37oC selama semalam, kemudian diinokulasikan masing-masing 0,4 mL ke dalam 10 mL LB di dalam Erlenmeyer 125 mL. Selanjutnya hasil inokulasi diiinkubasikan secara aerobik pada 37oC selama 3 jam. Secara aseptik (mikrobiologik), dimasukkan 1.5 mL kultur segar hasil inkubasi ke dalam tabung mikro steril untuk sentrifusi. Sel dijadikan pelet dengan sentrifusi 5000 rpm selama 1 menit pada mikrosentrifus berpendingin. Pelet masing-masing dicuci di dalam tabung dengan 1 mL 0.1 M CaCl2 dingin, lalu didiamkan di atas es selama 15 menit. Sel dijadikan pelet dengan sentrifusi 5000 rpm selama 1 menit, kemudian disuspensikan dalam 200 L larutan CaCl2 dingin, didiamkan di atas es selama 10 menit. Sel kompeten sudah siap digunakan untuk transformasi.

2.6TransformasiTransformasi bertujuan untuk mengintroduksikan DNA rekombinan yang telah dimurnikan ke sel inang (E. coli) untuk memperoleh E. coli rekombinan. Bahan-bahan yang dibutuhkan adalah Escherichia coli DH5 kompeten, larutan 0,1 M CaCl2 0.1 M CaCl2 dingin, Plasmid/DNA rekombinan hasil ligasi, medium LB; LA; LA + Ap (10 g/mL), larutan garam fisiologis, dan dH2O steril. Pertama-tama ke dalam dua tabung mikro steril dimasukkan masing-masing 100 L 0,1 M dH2O steril . Pada salah satu tabung (tabung K=kontrol) dimasukkan 20 L dH2O steril sedangkan pada tabung yang lain (tabung S=sampel) dimasukkan 20 L larutan 100-500 ng pUC19. Selanjutnya ditambahkan 200 L sel kompeten DH5. Tabung-tabung ini diletakkan diatas es (0oC) selama 90 menit dengan kadang-kadang digoyang dengan ujung jari telunjuk. Sementara itu disiapkan inkubator bergoyang pada 37oC untuk tabung reaksi. Dimasukkan masing-masing campuran transformasi pada tabung reaksi steril lalu ditambahkan 3 mL LB ke tiap-tiap tabung. Diinkubasikan dengan goyangan kuat 37oC selama 90 menit. Pada LA + Ap (10 g/mL) disebarkan 50 L suspensi dari tabung A dan masing-masing 50 dan 100 L suspensi dari tabung B, masing-masing 2-3 cawan, kemudian disentrifus secara singkat dan disebar lagi bagian (supernatan dibuang, kelebihan sedikit bagian supernatan digunakan utnuk meresuspensi sel). Pada LA, disebarkan 100 L suspensi tabung B dengan penegenceran 10-6 dan 10-7. Semua kultur diinkubasikan di cawan pada 37oC selama semalam (18-24 jam).

BAB 3PENUTUP

3.1 KesimpulanDalam praktikum ini, digunakan metode ekstraksi DNA genomik yang dimodifikasi Murray dan Thompson (1980) dengan menggunakan Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB) atau Hexadecyl Trimethyl Ammonium Bromide (HTAB). Setelah diekstraksi, fragmen DNA yang diperoleh akan diamplifikasi dengan metode PCR. Kemudian hasil amplifikasi DNA akan dimurnikan menggunakan metode elektroforesis agaros gel mini, sehingga akan didapatkan fragmen DNA yang murni.Hasil fragmen DNA yang telah murni kemudian diinsersikan ke dalam plasmid menggunakan metode heat shock. Plasmid yang berisi mengandung sisipan DNA kemudian ditransformasikan ke dalam sel kompeten. Pada akhir akan diperoleh sel rekombinan.

3.2 SaranBerdasarkan demo praktikum ini terlihat bahwa bioteknologi memiliki peranan cukup besar dalam kemajuan ilmu kesehatan. Oleh karena itu dibutuhkan penelitian lebih mendalam untuk menemukan metode yang lebih efektif dan efisien.

DAFTAR PUSTAKA

Malik, Amarila. (2009). Penuntun Kerja: Teknik Ekstraksi DNA dan PCR Dasar. Depok: Universitas Indonesia, Departemen Farmasi.Malik, Amarila. (2012). Penuntun Kerja: Isolasi Plasmid dan Kloning DNA. Depok: Universitas Indonesia, Departemen Farmasi.Murray HG, Thompson WF (1980). Rapid isolation of high molecular weight DNA. Nucleic Acids Res, 8, 4321-4325.

2