4

II. TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Lignoselulosa

Lignoselulosa merupakan biomassa yang berasal dari tanaman dengan

komponen utama lignin, hemiselulosa dan selulosa. Ketersediaannya yang cukup

melimpah, terutama sebagai limbah pertanian, perkebunan, dan kehutanan,

menjadikan bahan ini berpotensi sebagai salah satu sumber energi melalui proses

konversi baik proses fisika, kimia maupun biologis. Lignoselulosa mengandung

tiga komponen penyusun utama yaitu lignin (10-25%), hemiselulosa (20-35%),

dan selulosa (35-50%) (Lynd et al., 2002). Di alam, biasanya komponen utama

penyusun lignoselulosa membentuk kerangka utama dinding sel tumbuhan

(Holtzapple et al., 2003).

Gambar 1. Selulosa, lignin dan hemiselulosa yang saling berikatan pada dinding

sel tumbuhan (Holtzapple et al., 2003).

2.2 Lignin

Lignin merupakan zat organik yang memiliki polimer banyak dan

merupakan hal yang penting dalam dunia tumbuhan. Lignin adalah polimer

berkadar aromatik-fenolik yang tinggi, berwarna kecoklatan, dan relatif lebih

mudah teroksidasi. Lignin tersusun atas jaringan polimer fenolik yang berfungsi

merekatkan serat selulosa dan hemiselulosa sehingga menjadi sangat kuat (Sun

and Cheng, 2002). Struktur kimia lignin sangat kompleks dan tidak berpola sama.

5

Gugus aromatik ditemukan pada lignin, yang saling dihubungkan dengan rantai

alifatik, yang terdiri dari dua sampai tiga karbon. Proses pirolisis lignin

menghasilkan senyawa kimia aromatis berupa fenol, terutama kresol.

Gambar 2. Satuan penyusun lignin (Sixta, 2006).

2.3 Hemiselulosa

Hemiselulosa merupakan polisakarida yang mempunyai berat molekul

lebih kecil daripada selulosa. Hemiselulosa tersusun dari bermacam-macam jenis

gula. Lima gula netral, yaitu glukosa, mannosa, galaktosa (heksosan), xilosa dan

arabinosa (pentosan) merupakan konstituen utama hemiselulosa (Fengel and

Wegener, 1995). Rantai utama hemiselulosa dapat terdiri hanya satu jenis

monomer (homopolimer), seperti xilan, atau terdiri atas dua jenis atau lebih

monomer (heteropolimer), seperti glukomannan.

Gambar 3. Struktur xilan (a) dan glukomannan (b) yang merupakan hemiselulosa

dominan pada tumbuhan (Sixta, 2006).

6

2.4 Selulosa

Jumlah selulosa di alam sangat berlimpah sebagai sisa tanaman atau dalam

bentuk sisa pertanian seperti jerami padi, kulit jagung, gandum, kulit tebu dan

tumbuhan lainnya (Han and Chen, 2007). Komposisi selulosa berkisar antara 35-

50% dari komposisi total penyusun dinding sel tumbuhan (Koolman, 2001).

Selulosa (C6H10O5)n adalah polimer glukosa yang berbentuk rantai linier dan

dihubungkan oleh ikatan β-1,4 glikosidik. Struktur yang linier menyebabkan

selulosa bersifat kristalin dan tidak mudah larut. Selulosa tidak mudah didegradasi

secara kimia maupun mekanis.

Unit penyusun selulosa adalah selobiosa karena unit keterulangan dalam

molekul selulosa adalah dua unit gula (D-glukosa). Polimer rantai panjang

selulosa terikat bersama oleh ikatan hidrogen dan ikatan van der Walls, yang

mana menyebabkan selulosa terpaket dalam mikrofibril. Mikrofibril selulosa

memiliki bagian kristalin yang besar (2/3 dari total selulosa) dan bagian terkecil

yang tak berbentuk (amorphous). Semakin kristalin selulosa, akan semakin susah

selulosa tersebut untuk terlarut dan terdegradasi (Mussatto and Teixeira, 2010).

Gambar 4. Struktur selulosa (Yuanisa, 2015).

Rantai selulosa terdiri dari satuan glukosa anhidrida yang saling berikatan

melalui atom karbon pertama dan ke empat. Ikatan yang terjadi adalah ikatan ß-

1,4-glikosidik. Secara alamiah molekul-molekul selulosa tersusun dalam bentuk

fibril-fibril yang terdiri dari beberapa molekul selulosa yang dihubungkan dengan

ikatan glikosidik. Fibril-fibril ini membentuk struktur kristal yang dibungkus oleh

lignin. Komposisi kimia dan struktur yang demikian membuat kebanyakan bahan

yang mengandung selulosa bersifat kuat dan keras. Sifat kuat dan keras yang

dimiliki oleh sebagian besar bahan berselulosa membuat bahan tersebut tahan

terhadap peruraian secara enzimatik.

7

Gambar 5. Kumpulan rantai selulosa dalam mikrofibril yang membentuk dinding

sel tanaman (Djerbi et al., 2005).

2.5 Degradasi Selulosa

Degradasi adalah suatu reaksi perubahan kimia atau peruraian suatu

senyawa atau molekul menjadi senyawa atau molekul yang lebih sederhana.

Misalnya, penguraian polisakarida selulosa menjadi monosakarida (glukosa).

Proses penguraian selulosa secara alami memerlukan bantuan mikroorganisme

(bakteri selulolitik) yang mengeluarkan enzim selulase. Selulosa dihidrolisis oleh

enzim selulase dengan memotong ikatan 1,4 β-glukosida pada rantai panjang

selulosa. Selulosa pada lingkungan aerobik akan terurai menjadi glukosa dan

karbondioksida yang akan bergabung ke dalam sel yang sedang tumbuh,

sedangkan selulosa pada lingkungan anaerobik akan terurai menjadi alkohol dan

asam organik (Prihatiningrum, 2002).

Proses degradasi selulosa dapat dilakukan secara enzimatik dengan

bantuan mikroorganisme. Bakteri merupakan salah satu jenis mikroorganisme

yang mampu mendegradasi selulosa dan memiliki kelimpahan terbanyak di alam

dibanding mikroorganisme lainnya (Hasibuan, 2009). Setiap bakteri mempunyai

strategi yang berbeda-beda dalam mendegradasi selulosa tergantung pada

karakteristik bakteri tersebut.

Bakteri memiliki kecendrungan untuk mendegradasi selulosa dan

kemampuan ini dimiliki oleh hampir semua bakteri pendegradasi selulosa baik

8

secara aerob maupun anaerob (Glazer and Nikaido, 2007). Sebagian besar spesies

bakteri aerob ditemukan di dalam tanah. Beberapa bakteri pada kondisi aerob

yang mampu untuk mendegradasi selulosa diantaranya Acinetobacter junii, A.

amitratus, A. cellulolyticus, Anoxybacillus sp, Bacillus subtilis, B. pumilus, B.

licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. circulans, B. flexus, Bacteroides sp,

Cellulomonas biazotea, Cellvibrio gilvus, Eubacterium cellulosolvens,

Geobacillus sp, Microbispora bispora, Paenibacillus curdlanolyticus,

Pseudomonas cellulose, Salinivibrio sp, Rhodothermus marinus (Kuhad et al.,

2011).

Faktor-faktor yang mempengaruhi degradasi antara lain :

a) Substrat

Ukuran dan komponen senyawa yang menyusun substrat merupakan salah

satu faktor yang mempengaruhi degradasi. Degradasi akan berlangsung lebih

cepat bila ukuran substrat lebih kecil dan senyawa penyusunannya lebih

sederhana. Sebaliknya, jika ukuran substrat lebih besar dan senyawa

penyusunannya lebih kompleks dibutuhkan waktu lebih lama untuk

mendegradasinya.

b) Sumber nitrogen

Nitrogen diperlukan karena dapat mempengaruhi aktivitas bakteri untuk

menghasilkan enzim ekstraseluler. Bahan yang digunakan sebagai sumber

nitrogen adalah ammonium nitrat, ammonium sulfat dan urea. Jika enzim

ekstraseluler yang dihasilkan oleh enzim banyak, maka degradasi akan

berlangsung lebih cepat. Sebaliknya, jika enzim ekstraseluler yang dihasilkan

oleh bakteri sedikit, maka degradasi akan berlangsung lebih lama.

c) pH

pH aktivitas enzim sangat penting untuk proses degradasi, karena enzim-

enzim tertentu hanya akan mengurai suatu substrat sesuai aktivitasnya pada

pH tertentu. Jika pH sesuai dengan aktivitas enzim, maka kerja enzim

ekstraseluler untuk mendegradasi substrat akan optimal.

d) Suhu

Selain pH, suhu juga mempengaruhi kerja enzim untuk mendegradasi substrat.

Peningkatan suhu menyebabkan energi kinetik pada molekul substrat dan

9

enzim meningkat, sehingga degradasi juga meningkat. Namun suhu yang

terlalu tinggi menyebabkan rusaknya enzim yang disebut denaturasi,

sedangkan suhu yang terlalu rendah dapat menghambat kerja enzim. Bila kerja

terhambat atau struktur enzim rusak maka degradasi tidak dapat berlangsung

dengan baik.

2.6 Bakteri Selulolitik

Mikroorganisme yang mampu mendegradasi selulosa dinamakan

mikroorganisme selulolitik. Bakteri yang dapat mendegradasi selulosa disebut

juga bakteri selulolitik. Beberapa genus bakteri selulolitik adalah Clostridium,

Cellulomonas, Bacillus, Thermomonospora, Ruminococcus, Bacteroides,

Acetivibrio, Misrobispora, dan Streptomyces yang dapat memproduksi enzim

selulase secara efektif (Saratale et al., 2012). Bakteri selulolitik memiliki

kemampuan dalam menghidrolisis bahan-bahan dari alam yang mengandung

selulosa menjadi produk yang lebih sederhana (Marganingtyas, 2011).

Bakteri selulolitik dapat mendegradasi molekul komplek pada substrat

tidak larut dalam air dengan menggunakan berbagai enzim melalui berbagai cara

dalam memutuskan bagian yang berbeda di dalam substrat. Pemanfaatan bakteri

selulolitik sebagai penghasil enzim selulase digunakan untuk menghidrolisis

selulosa karena bakteri tersebut menghasilkan enzim selulase sebagai respon

terhadap adanya selulosa pada lingkungannya. Proses perombakkan secara

enzimatis terjadi dengan adanya enzim selulase sebagai agen perombak yang

bersifat spesifik untuk menghidrolisis ikatan β-(1,4)-glikosidik, rantai selulosa

dan derivatnya (Ambriyanto, 2010). Hidrolisis sempurna selulosa akan

menghasilkan monomer selulosa yaitu glukosa, sedangkan hidrolisis tidak

sempurna akan menghasilkan disakarida dari selulosa yaitu selobiosa (Fan et al.,

1982).

2.7 Enzim Selulase

Enzim selulase adalah enzim ekstraseluler yang dihasilkan di dalam sel

kemudian dikeluarkan ke medium pertumbuhannya. Enzim selulase dapat

dihasilkan oleh bakteri dan fungi. Enzim selulase diproduksi untuk mengkatalis

10

pemecahan selulosa menjadi glukosa dengan pemutusan ikatan β-1,4-glukosidik

yang terdapat pada selulosa (Kurniawan, 2014). Proses hidrolisis selulosa oleh

mikroorganisme terjadi di luar sel dan enzim selulase yang dihasilkan merupakan

enzim ekstraseluler. Selulase dapat diaplikasikan untuk memperhalus bubur kertas

pada industri kertas, menjaga warna kain agar tetap cemerlang pada industri

tekstil, meningkatkan kualitas pada industri pangan, sebagai dekomposer bahan-

bahan organik, meningkatkan nutrisi pakan ternak, berperan penting dalam

biokonversi selulosa menjadi berbagai komoditas senyawa kimia dan dapat

mengurangi dampak negatif dari polusi limbah terhadap lingkungan (Hartanti,

2010).

Enzim selulase dapat diklasifikasikan menjadi tiga kelompok yaitu endo-

β-1,4-glukonase (CMCase, Cx selulase endoselulase, atau carboxymethyl

cellulase), ekso-β-1,4-glukonase (aviselase, selobiohidrolase, C1 selulase), dan β-

1,4-glukosidase atau selobiase (Meryandini et al., 2009). Ketiga komponen enzim

tersebut bekerjasama dalam menghidrolisis selulosa yang tidak dapat larut

menjadi glukosa (Fikrinda, 2000).

Enzim selulase atau enzim yang dikenal dengan nama sistematik β-1,4

glukan-4-glukano hidrolase adalah enzim yang dapat menghidrolisis selulosa

dengan memutus ikatan glikosidik β-1,4 dalam selulosa, selodektrin, selobiosa,

dan turunan selulosa lainnya menjadi gula sederhana atau glukosa. Sistem

pemecahan selulosa menjadi glukosa terdiri atas tiga jenis enzim selulase yaitu

endo-β-1,4-glukonase, ekso-β-1,4-glukonase, dan β-glukosidase (Silva et al.,

2005). Proses pemecahan selulosa oleh enzim selulase ditunjukkan pada (Gambar

6).

Gambar 6 memperlihatkan tahap-tahap pemecahan selulosa oleh kompleks

enzim selulase (endoglukonase, eksoglukonase, dan β-glukosidase). Tahap

pertama, enzim endoglukonase menyerang daerah amorf dari selulosa secara acak

dan membentuk makin banyak ujung-ujung nonpereduksi yang memudahkan

kerja eksoglukonase. Enzim eksoglukonase selanjutnya menghidrolisis daerah

kristal dari selulosa dengan membebaskan dua unit glukosa. Kerja sama kedua

enzim ini menghasilkan unit-unit sakarida yang lebih kecil yang selanjutnya

dihidrolisis oleh β-glukosidase menghasilkan glukosa.

11

Gambar 6. Skema tahapan pemecahan selulosa (Karmakar and Ray, 2011).

2.8 Media Isolasi

Media yang digunakan dalam isolasi bakteri selulolitik dinamakan

medium selulolitik. Media tersebut merupakan campuran garam-garam mineral

dan CMC (Carboxy Metil Cellulosa) yang berfungsi sebagai sumber karbon.

CMC merupakan substrat yang umumnya digunakan untuk pengujian aktivitas

endoglukanase (Zhang et al., 2006). Substrat CMC memiliki kelarutan yang lebih

tinggi dibandingkan selulosa lainnya, sehingga lebih mudah dihidrolisis oleh

enzim selulase (Yanuar et al., 2003).

Carboxy Metil Cellulosa (CMC) digunakan sebagai media produksi enzim

karena dalam media ini mengandung selulosa yang digunakan sebagai substrat

pada reaksi enzimatis. Selain itu, media ini mengandung sumber C, N, dan

beberapa mineral lainnya yang diperlukan. Sumber karbon yang berfungsi sebagai

sumber energi sel dan unsur utama dalam pembentukkan sel dipenuhi oleh adanya

CMC. CMC merupakan substrat terbaik untuk menginduksi sintesis enzim

selulolitik ekstraseluler (Alam et al., 2004) dan berdasarkan Narasimha et al

(2005), konsentrasi CMC 1% merupakan konsentrasi yang optimum untuk

produksi selulase.

Menurut Pratiwi (2008) dalam media pertumbuhan garam-garam mineral

seperti KH2PO4 dan MgSO4 digunakan sebagai nutrient untuk membantu

pertumbuhan sel sedangkan logam magnesium pada MgSO4 merupakan kofaktor

bagi aktivitas enzim selulase. Fosfat banyak digunakan dalam pembuatan media.

Banyaknya penggunaan fosfat tersebut dikarenakan zat tersebut merupakan bahan

12

anorganik yang menyangga dalam batas fisiologis yang penting yaitu sekitar

netral dan relatif tidak beracun untuk mikroba. Selain itu dalam konsentrasi yang

sesuai, fosfat merupkan sumber fosfor yang sangat penting untuk pertumbuhan

bakteri tersebut.

Mineral, vitamin dan faktor pertumbuhan lainnya biasanya digunakan

untuk mensintesa sel dari substansi sederhana (Cullison, 1979). Beberapa mikro

mineral termasuk Fe dan Mn sangat penting dalam nutrisi mikroorganisme.

Peningkatan aktivitas mikroorganisme dalam mencerna substrat bila ditambahkan

Fe dan Mn menunjukkan bahwa minera-mineral ini memainkan suatu peranan

dalam metabolisme pencernaan substrat oleh mikroba (Hungate, 1966).

2.9 Uji Degradasi Selulosa

Uji bakteri selulolitik (penghasil selulase) secara kualitatif (skrining)

dilakukan untuk menyeleksi dan mengetahui kemampuan isolat bakteri dalam

menghasilkan enzim selulase. Coughlan (1990) menyatakan bahwa analisis

kualitatif aktivitas bakteri selulolitik dapat dilakukan pengukuran zona bening

yang terbentuk disekitar koloni. Pembentukkan zona bening menunjukkan bahwa

selulosa yang terdapat dalam media dihidrolisis oleh enzim selulase menjadi

senyawa sederhana yaitu selobiosa yang kemudian disederhanakan menjadi dua

molekul glukosa (Perez et al., 2002).

Uji Gram’s Iodine merupakan salah satu metode skrining dengan menguji

aktivitas selulolitik secara kualitatif yang bertujuan untuk mengidentifikasi bakteri

selulolitik. Metode ini sering digunakan untuk menyeleksi mikroorganisme dalam

mendegradasi polisakarida secara sederhana, cepat dan biaya yang efisien (Jo et

al., 2011). Isolat yang digunakan dalam pengujian Gram’s Iodine adalah isolat

terbaik hasil isolasi yang mampu tumbuh pada media isolasi (Marcon et al.,

2006). Reagent yang digunakan dalam uji Gram’s Iodine adalah larutan iodine

yang terdiri dari I2 dan KI yang dilarutkan dengan aquades. Uji Gram’s Iodine

diperkuat dengan penggunaan larutan iodine dengan tujuan untuk mewarnai

bakteri yang tumbuh pada cawan petri dan dapat menunjukkan warna coklat gelap

(Kasana et al., 2008).

13

Selulosa di alam lebih banyak ditemukan dalam bentuk selulosa kristalin

(Fikrinda et al., 2000). Upaya untuk memperoleh isolat bakteri selulolitik yang

dapat dimanfaatkan dalam konversi selulosa alam, maka selain aktivitasnya dalam

mendegradasi selulosa, isolat bakteri selulolitik juga perlu diuji kemampuannya

tumbuh pada substrat yang terdiri dari selulosa kristalin. Kertas saring (filter

paper) merupakan salah satu jenis substrat berupa selulosa kristalin yang

berikatan dengan lignin membentuk kompleks lignoselulosa yang sulit

didegradasi. Untuk mengetahui kemampuan isolat bakteri yang telah diisolasi

dalam mengurai selulosa kristalin, maka dapat dilakukan pengujian dengan

menumbuhkannya pada medium selulolitik dengan penambahan kertas filter

(Whatman no. 1).

2.10 Faktor-faktor yang Mempengaruhi Pertumbuhan Mikroba

a) Waktu

Pertumbuhan dapat diamati dari meningkatnya jumlah sel. Pertumbuhan

mikroba pada umumnya meningkat maksimal selama empat hari. Pada

saat mikroba diinkubasi diatas empat hari, lama kelamaan bakteri tidak

akan tumbuh karena nutrisi pada medium sudah semakin berkurang dan

menyebabkan mikroba tidak bisa tumbuh/mati. Waktu pertumbuhan

mikroba dimulai dari beberapa menit, beberapa jam sampai beberapa hari

tergantung kecepatan pertumbuhan mikroba pada media dan lamanya

inkubasi mikroba (Case et al., 1984).

b) pH

Mikroba mempunyai kemampuan dalam mendegradasi selulosa pada

medium selulolitik dan dapat tumbuh pada pH asam dan basa.

Pertumbuhan yang paling baik ditunjukkan pada pH tujuh (netral)

dibandingkan pH asam dan basa (Wibowo et al., 2012)

c) Sifat mikroorganisme

Kemampuan suatu bahan tertentu bergantung pada komponen

mikroorganisme yang diuji dengan bahan tersebut. Yang terpenting adalah

spesies mikroorganisme, fase pertumbuhan kultur mikroorganisme, adanya

14

struktur khusus seperti spora atau kapsul, sejarah pertumbuhan kultur

sebelumnya dan jumlah organisme dalam sistem uji (Brock et al., 2003).

d) Usia mikroorganisme

Tingkat kerentanan mikroorganisme sangat ditentukan oleh umur biakan

mikroorganisme. Pada prinsipnya, kerentanan mikroorganisme yang tinggi

yaitu pada fase pertumbuhan eksponensial, sedangkan pada fase stasioner

dianggap kurang efektif karena metabolisme sel mikroba tidak terlalu aktif

(Brock et al., 2003).