Bahagian Penyelidikan (Research)

Saintis Penyelidikan (Research Scientist)

Seorang Saintis Penyelidikan menjalankan kerja kerja sains berasaskanprojek, terutamanya dalam

menghasilkan penemuan-penemuan baru dalam penyelidikan, atau membangunkan teknik saintifik

yang lebih baik. Tugasnya termasuk menganalisa

data, menginterpretasi hasil,menjalankan eksperimen saintifik, dan merekodkan hasil eksperimen.Selain

itu, seorang Saintis Penyelidikan juga boleh memainkan peranan dalam menguruskan peralatan

makmal dan perolehan bahan, sertabekerjasama dengan rakan sepasukan untuk membincangkan

strategipenyelidikan. Beliau akan mengemukakan laporan mengenai penemuan penyelidikan,

membuat ringkasan, menyemak semula protokol ujikaji sertamenguruskan kerja-kerja

penerbitan. Saintis Penyelidikan memerlukansekurang-kurangnya ijazah asas (BSc)

dan pengalaman bekerja dalammakmal

Methods

Dalam menjalankan eksperimen-eksperimen bioteknologi, terdapat pelbagai teknik yang dijalankan

bersesuaian dengan tujuan eksperimen. Teknik-teknik tersebut bukan hanya diguna di Malaysia, malah

turut diguna di seluruh makmal yang menjalankan eksperimen bioteknologi. Antaranya ialah

pemprofilan DNA (DNA Profiling), electroporasi gel (Gel Electroporation), Polymerase Chain Reaction

(PCR), DNA recombinant dan sebagainya. Penerangan lanjut adalah seperti di bawah.

Teknik 1: DNA Profiling/DNA Fingerprinting (Pemprofilan DNA)

'DNA Profiling' adalah teknik yang digunakan oleh ahli sains forensik untuk membantu sama ada dalam

penyiasatan, atau pun dalam kerja mengenalpasti individu-individu tertentu berdasarkan profil DNA

tertentu. Teknik ini juga biasanya dikenali sebagai 'DNA Fingerprinting', atau 'DNA Testing', atau 'DNA

Typing', atau 'genetic fingerprinting'. Sepertimana yang kita sedia maklum, setiap orang mempunyai

profil DNA yang unik, dan teknik pemprofilan DNA ini akan digunakan untuk menentukan bahawa set

DNA yang mahu dikenal pasti tersebut dimiliki oleh individu tertentu. Kebiasaannya, teknik ini digunakan

untuk memastikan hubungan anak dan ibubapa (parental testing), ataupun dalam penyiasatan jenayah.

Teknik ini telah ditemui oleh Sir Alec Jeffreys pada tahun 1985. Dalam dunia forensik, teknik ini

merupakan satu teknik yang sangat menarik kerana ianya tidak memerlukan cap jari milik seseorang

individu itu, kerana ianya (merujuk DNA) boleh di dapati di mana-mana bahagian sel yang lain, dan

setiap individu mempunya set DNA yang unik, termasuklah di mana-mana bahagian sel, dari rambut

hinggalah ke kaki. Contoh yang biasa digunakan ialah analisis DNA di sel rambut, ataupun titisan darah di

tempat kejadian. Sesungguhnya teknik ini adalah sangat luar biasa kerana sangat membantu dalam

pencegahan jenayah, kerana penjenayah sangat sukar untuk tidak meninggalkan kesan 100% dalam

tindakan jenayahnya.

Walaubagaimanapun, teknik ini masih mempunyai kelemahan, dimana setiap sel yang dijumpai,

walaupun ianya unik, namun masih tidak ada 100% kepastian tentang pemilik sel itu yang sebenar.

Namun, setidak-tidaknya, teknik ini memberikan kemungkinan tentang pemilik sel itu. Selain itu, teknik

ini juga masih mendapat tentangan daripada beberapa pihak, iaitu isu yang berkaitan pengumpulan

bank DNA, yang berkemungkinan tidak sah disisi undang-undang negara. Namun setakat ini, kelebihan

teknik ini masih lagi mengatasi kekurangannya, dan oleh sebab itu ianya masih logik untuk diaplikasikan.

Sebagai contoh dalam bidang bioteknologi, teknik ini digunakan untuk mengelakkan pembiak-bakaan

(inbreeding). Dalam teknik ini, saintis akan memastikan proses mengawan berlaku antara individu yang

tidak berkaitan secara genetik (melalui peningkatan dalam 'gene pool', mengurangkan perubahan

ekspresi gen perosak atau yang membawa maut, 'deleterious/lethal genes'). Dengan mengenal pasti

profil DNA, haiwan ternakan dewasa yang paling berjaya boleh dikenal pasti, dimana keturunan mereka

akan mempunyai petanda DNA tersebut. Jadi, ahli saintis akan mengutamakan burung ini untuk

membiakkan lagi spesis dalam jumlah yang besar.

Teknik 2: Elektroporasi Gel (Gel Electrophoresis)

Pada awal pengenalan teknik memanipulasi DNA, keratan/potongan DNA dipisahkan di makmal oleh

graviti. Pada tahun 1970-an, alat yang berkuasa elektroforesis gel DNA telah dibangunkan. Proses ini

menggunakan elektrik untuk menghasilkan keratan/potongan DNA yang berasingan mengikut saiz dan

cas seperti yang dihasilkan melalui gel matriks (agar) dan dibezakan mengikut jarak keratan/potongan

DNA, iaitu merupakan satu teknik yang dipanggil 'gel elektroforesis'.

Gel diletakkan di dalam bekas elektroforesis, yang kemudiannya disambungkan ke punca kuasa. Apabila

arus elektrik digunakan, molekul yang lebih besar bergerak dengan lebih perlahan-lahan melalui gel

manakala molekul yang lebih kecil bergerak lebih pantas. Molekul mempunyai saiz yang berbeza,

seterusnya membentuk kumpulan-kumpulan yang berbeza gel.

Istilah "gel" dalam contoh ini merujuk kepada matriks digunakan untuk mengandungi, kemudian

memisahkan molekul sasaran. Dalam kebanyakan kes, gel polimer crosslinked yang komposisi dan

keliangan dipilih berdasarkan berat tertentu dan komposisi sasaran untuk dianalisis. Apabila

memisahkan kecil protein atau asid nukleik (DNA, RNA, atau oligonucleotides) gel biasanya terdiri

daripada kepekatan yang berbeza acrylamide dan rentas pemaut, menghasilkan rangkaian jejaring yang

berbeza bersaiz polyacrylamide.

"Elektroforesis" merujuk kepada daya elektromotif (EMF) yang digunakan untuk menggerakkan molekul

melalui matriks gel. Dengan meletakkan molekul di telaga dalam gel dan menggunakan medan elektrik,

molekul akan bergerak melalui matriks pada kadar yang berbeza, yang ditentukan sebahagian besarnya

oleh massa mereka apabila caj kepada nisbah jisim (Z) spesis semua seragam, ke arah anod jika bercas

negatif atau ke arah katod jika bercas positif.

Picture: Gel electrophoresis: 6 "DNA-tracks". In the first row (left), DNA with known fragment sizes

was used as a reference. Different bands indicate different fragment sizes.

Teknik 3: Polymerase Chain Reaction (PCR)

Tindak balas polymerase berangkai (PCR) merupakan satu teknik saintifik dalam biologi molekul untuk

menambah bilangan satu atau beberapa salinan DNA mengikut beberapa magnitud tertentu, untuk

menjana beribu-ribu kepada berjuta-juta salinan daripada urutan DNA tertentu.

Teknik ini telah dibangunkan pada tahun 1983 oleh Kary Mullis, dan kini, PCR telah menjadi satu teknik

yang biasa dan akan digunakan dalam makmal penyelidikan perubatan dan biologi untuk pelbagai

aplikasi. Ini termasuk pengklonan DNA (DNA cloning), phylogeny berasaskan DNA, atau analisis fungsi

gen; diagnosis penyakit keturunan; mengenal pasti cap jari genetik (digunakan dalam sains forensik dan

ujian paterniti); dan pengesanan dan diagnosis penyakit berjangkit.

Kaedah ini bergantung kepada kitaran thermal (thermal cycling), yang terdiri daripada kitaran

pemanasan berulang-ulang, dan penyejukan tindak balas untuk meleburkan DNA dan replikasi enzim

DNA. Primers (serpihan DNA pendek) yang mengandungi urutan pelengkap kepada kawasan sasaran

bersama-sama dengan enzim polimerase DNA adalah komponen utama bagi membolehkan proses

pemilihan, dan ianya berlaku secara berulang-ulang. Ketika PCR sedang berlaku, DNA yang dihasilkan

sendiri akan digunakan sebagai template untuk replikasi, dalam proses tindak balas berangkai, di mana

template DNA eksponen dikuatkan. Teknik PCR boleh diubahsuai untuk melaksanakan pelbagai

manipulasi genetic.

Hampir semua aplikasi PCR menggunakan enzim DNA polimerase yang mempunyai haba stabil, seperti

polimerase Taq (Taq polymerase), enzim yang pada berasal daripada bakteria aquaticus Thermus.

Polimerase DNA mengumpulkan DNA yang baru daripada blok DNA yang asal, nukleotida (nucleotide),

dengan menggunakan DNA yang hanya mempunyai satu lembar (strand) sebagai template

oligonucleotide (juga dipanggil primers DNA), yang diperlukan untuk permulaan penghasilan DNA.

Majoriti kaedah PCR menggunakan teknik kitaran haba (thermal cycling), iaitu, sebagai gantian

pemanasan dan penyejukan sampel PCR kepada suhu-suhu tertentu secara bersiri.

Ternyata hal ini gak lepas dari yang namanya PCR alias Polymerase Chain Reaction. Proses yang

berlangsung secara in vitro dalam tabung reaksi sebesar 200 µl ini mampu menggandakan atau

mengkopi DNA hingga miliaran kali jumlah semula. Maka pantes aja dengan berbekal DNA yang

terkandung dalam sampel yang cuma secuil itu bisa diperoleh banyak sekali informasi sesuai kebutuhan

kita.

Reaksi PCR meniru reaksi penggandaan atau replikasi DNA yang terjadi dalam makhluk hidup. Secara

sederhana PCR merupakan reaksi penggandaan daerah tertentu dari DNA cetakan (template) dengan

batuan enzim DNA polymerase.

PCR terdiri atas beberapa siklus yang berulang-ulang, biasanya 20 sampai 40 siklus. Nah, sekarang

bayangkan bahwa pada setiap siklus DNA polymerase akan menggandakan DNA sebanyak 2 kali, dan

coba hitung berapa salinan utas ganda DNA yang akan dihasilkan setelah 30 siklus? Yup, 2 pangkat 30

alias 1.073.741.824 kali! Tentu saja nilainya tidak tepat seperti itu, kita masih harus memperhitungkan

efisiensi reaksi, tapi tetap saja hasilnya akan sangat banyak.

Komponen PCR

Selain DNA template yang akan digandakan dan enzim DNA polymerase, komponen lain yang

dibutuhkan adalah:

Primer

Primer adalah sepasang DNA utas tunggal atau oligonukleotida pendek yang menginisiasi sekaligus

membatasi reaksi pemanjangan rantai atau polimerisasi DNA. Jadi jangan membayangkan kalau PCR

mampu menggandakan seluruh DNA bakteri E. coli yang panjangnya kira-kira 3 juta bp itu. PCR hanya

mampu menggandakan DNA pada daerah tertentu sepanjang maksimum 10000 bp saja, dan dengan

teknik tertentu bisa sampai 40000 bp. Primer dirancang untuk memiliki sekuen yang komplemen dengan

DNA template, jadi dirancang agar menempel mengapit daerah tertentu yang kita inginkan.

dNTP (deoxynucleoside triphosphate)

dNTP alias building blocks sebagai ‘batu bata’ penyusun DNA yang baru. dNTP terdiri atas 4 macam

sesuai dengan basa penyusun DNA, yaitu dATP, dCTP, dGTP dan dTTP.

Buffer

Buffer yang biasanya terdiri atas bahan-bahan kimia untuk mengkondisikan reaksi agar berjalan

optimum dan menstabilkan enzim DNA polymerase.

Ion Logam

Ion logam bivalen, umumnya Mg++, fungsinya sebagai kofaktor bagi enzim DNA polymerase. Tanpa ion

ini enzim DNA polymerase tidak dapat bekerja.

Ion logam monovalen, kalsium (K+).

Tahapan Reaksi

Setiap siklus reaksi PCR terdiri atas tiga tahap, yaitu:

1-Denaturasi

Denaturasi dilakukan dengan pemanasan hingga 96oC selama 30-60 detik. Pada suhu ini DNA utas ganda

akan memisah menjadi utas tunggal.

2-Annealing

Setelah DNA menjadi utas tunggal, suhu diturukan ke kisaran 40-60oC selama 20-40 detik untuk

memberikan kesempatan bagi primer untuk menempel pada DNA template di tempat yang komplemen

dengan sekuen primer.

3-Ekstensi/elongasi

Dilakukan dengan menaikkan suhu ke kisaran suhu kerja optimum enzim DNA polymerase, biasanya 70-

72oC. Pada tahap ini DNA polymerase akan memasangkan dNTP yang sesuai pada pasangannya, jika

basa pada template adalah A, maka akan dipasang dNTP, begitu seterusnya (ingat pasangan A adalah T,

dan C dengan G, begitu pula sebaliknya). Enzim akan memperpanjang rantai baru ini hingga ke ujung.

Lamanya waktu ekstensi bergantung pada panjang daerah yang akan diamplifikasi, secara kasarnya

adalah 1 menit untuk setiap 1000 bp.

Selain ketiga proses tersebut biasanya PCR didahului dan diakhiri oleh tahapan berikut:

4-Pra-denaturasi

Dilakukan selama 1-9 menit di awal reaksi untuk memastikan kesempurnaan denaturasi dan

mengaktifasi DNA Polymerase (jenis hot-start alias baru aktif kalau dipanaskan terlebih dahulu).

5-Final Elongasi

Biasanya dilakukan pada suhu optimum enzim (70-72oC) selama 5-15 menit untuk memastikan bahwa

setiap utas tunggal yang tersisa sudah diperpanjang secara sempurna. Proses ini dilakukan setelah siklus

PCR terakhir

PCR dilakukan dengan menggunakan mesin Thermal Cycler yang dapat menaikkan dan menurunkan

suhu dalam waktu cepat sesuai kebutuhan siklus PCR. Pada awalnya orang menggunakan tiga penangas

air (water bath) untuk melakukan denaturasi, annealing dan ekstensi secara manual, berpindah dari satu

suhu ke suhu lainnya menggunakan tangan. Tapi syukurlah sekarang mesin Thermal Cycler sudah

terotomatisasi dan dapat diprogram sesuai kebutuhan.

Aplikasi teknik PCR

Kita harus berterima kasih kepada Kary B Mullis yang telah menemukan dan mengaplikasikan PCR pada

tahun 1984. Saat ini PCR sudah digunakan secara luas untuk berbagai macam kebutuhan, diantaranya:

Isolasi Gen

Kita tahu bahwa DNA makhluk hidup memiliki ukuran yang sangat besar, DNA manusia saja panjangnya

sekitar 3 miliar basa, dan di dalamnya mengandung ribuan gen. Oh ya, gen itu apaan ya?

Sebagaimana kita tahu bahwa fungsi utama DNA adalah sebagai sandi genetik, yaitu sebagai panduan

sel dalam memproduksi protein, DNA ditranskrip menghasilkan RNA, RNA kemudian diterjemahkan

untuk menghasilkan rantai asam amino alias protein. Dari sekian panjang DNA genome, bagian yang

menyandikan protein inilah yang disebut gen, sisanya tidak menyandikan protein atau disebut ‘junk

DNA’, DNA ‘sampah’ yang fungsinya belum diketahui dengan baik.

Kembali ke pembahasan isolasi gen, para ahli seringkali membutuhkan gen tertentu untuk diisolasi.

Sebagai contoh, dulu kita harus mengekstrak insulin langsung dari pancreas sapi atau babi, kemudian

menjadikannya obat diabetes, proses yang rumit dan tentu saja mahal serta memiliki efek samping

karena insulin dari sapi atau babi tidak benar-benar sama dengan insulin manusia.

Berkat teknologi rekayasa genetik, kini mereka dapat mengisolasi gen penghasil insulin dari DNA

genome manusia, lalu menyisipkannya ke sel bakteri (dalam hal ini E. coli) agar bakteri dapat

memproduksi insulin juga [http://www.littletree.com.au/dna.htm]. Dan ajaib! Hasilnya insulin yang

sama persis dengan yang dihasilkan dalam tubuh manusia, dan sekarang insulin tinggal diekstrak dari

bakteri, lebih cepat, mudah, dan tentunya lebih murah ketimbang cara konvensional yang harus

‘mengorbankan’ sapi atau babi.

Nah, untuk mengisolasi gen, diperlukan DNA pencari atau dikenal dengan nama ‘probe’ yang memiliki

urutan basa nukleotida sama dengan gen yang kita inginkan. Probe ini bisa dibuat dengan teknik PCR

menggunakan primer yang sesuai dengan gen tersebut.

DNA Sequencing

Urutan basa suatu DNA dapat ditentukan dengan teknik DNA Sequencing, metode yang umum

digunakan saat ini adalah metode Sanger (chain termination method) yang sudah dimodifikasi

menggunakan dye-dideoxy terminator, dimana proses awalnya adalah reaksi PCR dengan pereaksi yang

agak berbeda, yaitu hanya menggunakan satu primer (PCR biasa menggunakan 2 primer) dan adanya

tambahan dideoxynucleotide yang dilabel fluorescent. Karena warna fluorescent untuk setiap basa

berbeda, maka urutan basa suatu DNA yang tidak diketahui bisa ditentukan.

Forensik

Identifikasi seseorang yang terlibat kejahatan (baik pelaku maupun korban), atau korban

kecelakaan/bencana kadang sulit dilakukan. Jika identifikasi secara fisik sulit atau tidak mungkin lagi

dilakukan, maka pengujian DNA adalah pilihan yang tepat. DNA dapat diambil dari bagian tubuh

manapun, kemudian dilakukan analisa PCR untuk mengamplifikasi bagian-bagian tertentu DNA yang

disebut fingerprints alias DNA sidik jari, yaitu bagian yang unik bagi setiap orang. Hasilnya dibandingkan

dengan DNA sidik jari keluarganya yang memiliki pertalian darah, misalnya ibu atau bapak kandung. Jika

memiliki kecocokan yang sangat tinggi maka bisa dipastikan identitas orang yang dimaksud.

Konon banyak kalangan tertentu yang memanfaatkan pengujian ini untuk menelusuri orang tua

‘sesungguhnya’ dari seorang anak jika sang orang tua merasa ragu.

Diagnosa Penyakit

Penyakit Influenza A (H1N1) yang sebelumnya disebut flu babi sedang mewabah saat ini, bahkan satu

fase lagi dari fase pandemi. Penyakit berbahaya seperti ini memerlukan diagnosa yang cepat dan akurat.

PCR merupakan teknik yang sering digunakan. Teknologi saat ini memungkinkan diagnosa dalam

hitungan jam dengan hasil akurat. Disebut akurat karena PCR mengamplifikasi daerah tertentu DNA

yang merupakan ciri khas virus Influenza A (H1N1) yang tidak dimiliki oleh virus atau makhluk lainnya.

Masih banyak aplikasi PCR lainnya yang sangat bermanfaat. Maka tak salah panitia Nobel

menganugrahkan hadiah Nobel bidang kimia yang bergengsi ini kepada Kary B Mullis hanya 9 tahun

setelah penemuannya (1993).

Jenis2 PCR

Reaksi berantai polimerase atau lebih umum dikenal sebagai PCR (Polymerase Chain

Reaction)merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan DNA secara enzimatik tanpa menggunakan

organisme. Dengan teknik ini, DNA dapat dihasilkan dalam jumlah besar dengan waktu relatif singkat

sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA. Teknik ini dirintis oleh Kary Mullis

pada tahun 1983. Penerapan PCR banyak dilakukan di bidang biokimia dan biologi molekuler karena

relatif mudah dan hanya memerlukan jumlah sampel yang kecil.

PCR adalah suatu teknik yang melibatkan beberapa tahap yang berulang (siklus) dan pada setiap siklus

terjadi duplikasi jumlah target DNA untai ganda. Untai ganda DNA template (unamplified DNA)

dipisahkan dengan denaturasi termal dan kemudian didinginkan hingga mencapai suatu suhu tertentu

untuk memberi waktu pada primer menempel (anneal primers) pada daerah tertentu dari target DNA.

Polimerase DNA digunakan untuk memperpanjang primer (extend primers) dengan adanya dNTPs

(dATP, dCTP, dGTP dan dTTP) dan buffer yang sesuai. Umumnya keadaan ini dilakukan antara 20 – 40

siklus. Target DNA yang diinginkan (short ”target” product) akan meningkat secara eksponensial setelah

siklus keempat dan DNA non-target (long product) akan meningkat secara linier seperti tampak pada

bagan di atas.

Real-Time PCR

Real-Time PCR merupakan suatu perangkat platform instrumentasi, yang terdiri atas satu buah thermal

cycler, satu buah komputer, lensa untuk eksitasi fluoresen dan pengumpul emisi, serta perangkat lunak

untuk akuisisi dan analisis data. Prinsip kerja Real-Time PCR adalah mendeteksi dan menguantifikasi

reporter fluoresen. Sinyal fluoresen akan meningkat seiring dengan bertambahnya produk PCR dalam

reaksi. Dengan mencatat jumlah emisi fluoresen pada setiap siklus, reaksi selama fase eksponensial

dapat dipantau. Peningkatan produk PCR yang signifikan pada fase eksponensial berhubungan dengan

jumlah inisiasi gen target.

Berbeda dengan PCR konvensioal, pada real-time PCR tahap deteksi dan tahap penggandaan materi

genetik dilakukan secara bersamaan (simultan), deteksi produk PCR dilakukan pada fase eksponensial

sehingga hasil yang diperoleh berada pada rentang daerah dengan presisi hasil tinggi. Selain itu, deteksi

dilakukan menggunakan pelacak bertanda fluoresense. Pelacak adalah reagen yang menentukan

kespesifikan hasil. Penggunaan fluoresense dalam tahap deteksi menawarkan sensitivitas yang tinggi.

Dengan demikian, real time PCR menawarkan sensitivitas yang tinggi dan rentang linearitas yang cukup

luas sehingga hasil penentuan kandungan DNA atau RNA di dalam spesimen menjadi sangat akurat.

Contoh produk komersial yang menggunakan real time PCR yaitu Cobas Taqman.

Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (Rt-Pcr)

RT-PCR merupakan singkatan Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction. Seperti namanya,

proses RT-PCR merupakan bagian dari proses PCR biasa. Perbedaanya dengan PCR yang biasa, pada

proses ini berlangsung satu siklus tambahan yaitu adanya perubahan RNA menjadi cDNA

(complementary DNA) dengan menggunakan enzim Reverse Transkriptase. Reverse Transcriptase adalah

suatu enzim yang dapat mensintesa molekul DNA secara in vitro menggunakan template RNA.

Seperti halnya PCR biasa, pada pengerjaan RT-PCR ini juga diperlukan DNA Polimerase, primer, buffer,

dan dNTP. Namun berbeda dengan PCR, template yang digunakan pada RT-PCR adalah RNA murni. Oleh

karena primer juga dapat menempel pada DNA selain pada RNA, maka DNA yang mengkontaminasi

proses ini harus dibuang. Untuk proses amplifikasi mRNA yang mempunyai poly(A) tail pada ujung 3′,

maka oligo dT, random heksamer, maupun primer spesifik untuk gen tertentu dapat dimanfaatkan

untuk memulai sintesa cDNA.

Reverse transcriptase biasanya digunakan untuk mensintesis rantai pertama cDNA dari RNA. Reverse

transkriptase dapat dipurifikasi dari beberapa sumber, seperti: avian myeloblastosis virus (AMV) dan

Molones murine leucemia virus (MMLV). AMV reverse transkriptase adalah RNA-dependent DNA

plimerase yang menggunakan RNA rantai tunggal sebagai template dan dapat mensintesis cDNA dengan

arah 5’→3’ jika terdapat primer. Sama seperti aktivitas DNA polimerase.

Nested PCR

Nested PCR adalah suatu teknik perbanyakan replikasi sampel DNA menggunakan bantuan enzim DNA

polymerase yang menggunakan dua pasang primer untuk mengamplifikasi fragmen. Pasangan primer

yang pertama akan mengamplifikasi fragmen yang cara kerjanya mirip dengan PCR pada umumnya.

Pasangan primer yang kedua biasanya disebut nested primers ( sepasang primer tersebut terletak di

dalam fragmen pertama) yang berikatan di dalam fragmen produk PCR yang pertama untuk

memungkinkan terjadinya amplifikasi produk PCR yang kedua dimana hasilnya lebih pendek dari yang

pertama.Nested PCR adalah PCR yang sangat spesifik dalam melakukan amplifikasi karena jika ada

fragmen yang salah diamplifikasi maka kemungkinan bagian tersebut diamplifikasi untuk kedua kalinya

oleh primer yang kedua sangat rendah.

Nested PCR merupakan variasi dari reaksi polymerase chain reaction (PCR) biasa. Nested PCR dan PCR

biasa sama-sama berguna untuk mempernanyak fragmen DNA tertentu dalam jumlah banyak. Pada

nested PCR digunakan 2 pasang primer sedangkan pada PCR biasa hanya menggunakan 1 pasang primer.

Oleh karena itu, hasil fragmen DNA dari nested PCR lebih spesifik (lebih pendek) dibandingkan dengan

PCR biasa. Waktu yang diperlukan dalam reaksi nested PCR lebih lama daripada PCR biasa karena pada

nested PCR pada nested PCR dilakukan 2 kali reaksi PCR sedangkan pada PCR biasa hanya 1 kali reaksi

PCR. Selain itu , keuntungan nested PCR adalah meminimalkan kesalahan amplifikasi gen dengan

menggunakan 2 pasang primer.

Prinsip kerja nested PCR tidak jauh berbeda dengan PCR biasa, namun nested PCR akan bekerja

menggunakan 2 pasang primer untuk mengamplifikasi fragmen DNA spesifik melalui 2 proses PCR secara

terpisah.Pertama-tama DNA mengalami denaturasi lalu memasuki fase penempelan, diaman sepasang

primer pertama melekat di kedua utas tunggal DNA dan mengamplifikasi DNA diantara kedua primer

tersebut dan terbentuklah produk PCR pertama. Kemudian produk PCR pertama tersebut dijalankan

pada proses PCR kedua dimana pasangan primer kedua (nested primer)akan mengenali sekuen DNA

spesifik yang berada di dalam fragmen produk PCR pertama dan memulai amplifikasi bagian diantara

kedua primer tersebut. Hasilnya adalah sekuens DNA yang lebih pendek daripada sekuens DNA hasil PCR

pertama.

Multiplex PCR

Multiplex PCR digunakan untuk mendeteksi beberapa target DNA sekaligus. Multiplex PCR merupakan

beberapa set primer dalam campuran PCR tunggal untuk menghasilkan amplikon dari berbagai ukuran

yang spesifik untuk sekuens DNA yang berbeda. Dengan penargetan gen sekaligus, informasi tambahan

dapat diperoleh dari lari-tes tunggal yang tidak akan membutuhkan beberapa kali reagen dan lebih

banyak waktu untuk melakukan. Temperatur Annealing untuk masing-masing set primer harus

dioptimalkan untuk bekerja dengan benar dalam reaksi tunggal, dan ukuran amplikon. Artinya,

panjangnya pasangan basa harus berbeda cukup untuk membentuk band yang berbeda ketika

divisualisasikan dengan elektroforesis gel .

ELISA PCR

Teknik PCR-ELOSA adalah suatu metode untuk mendeteksi suatu segmen nukleotida menggunakan PCR

dan ELISA. Amplikon PCR didenaturasi, diimobilisasi pada microwell plate lalu diidentifikasi secara

hibridisasi DNA dan imunologis (ELISA). Sejumlah istilah telah digunakan untuk teknik tersebut

diantaranya PCR and DIG-ELISA detection, ELISA-based oligonucleotide ligation assay,

PCRoligonucleotide ligation assay, DIAPOPS (Detection of immobilised amplified products in one phase

system).PCR-ELISA merupakan metode yang digunakan untuk menangkap asam nukleat yang meniru

prinsip dari enzim linked immunosorbant yang terkait. Dimana dalam sebuah pengujian hibridisasi hasil

produk dari PCR akan terdeteksi dengan metode ini. Dengan metode inilah dapat dilakukan pengukuran

sequen internal pada produk PCR. Metode ini lebih dipilih karena lebih murah dibandingkan metode

Real Time PCR. PCR-ELISA telah digunakan sejak akhir 1980-an dan telah berkembang untuk mendeteksi

sequen tertentu dalam produk PCR. Meskipun banyak metode yang tersedia untuk mendeteksi sequen

tersebut, ELISA PCR berguna untuk mendeteksi dan membedakan antara beberapa sasaran dari sequen

yang diinginkan. ELISA PCR ini juga berguna untuk screening beberapa sampel, terutama bila jumlah

sampel tidak menjamin. Salah satu aspek yang paling berguna dari PCR-ELISA adalah kemampuannya

dalam membedakan antara produk reaksi perubahan polimerase yang dihasilkan dari seperangkat

primer yang mengandung variasi sequen, yaitu sequen yang bervariasi antar primer.

Random amplified polymorphic DNA (RAPD)

RAPD adalah teknik molekuler untuk mendeteksi keragaman DNA didasarkan pada penggandaan DNA

(Griffiths et al.1999). RAPD juga merupakan penanda DNA yang memanfaatkan primer acak

oligonukleotida pendek (dekamer) untuk mengamplifikasi DNA genom organisme.

Prinsip teknik RAPD didasarkan pada kemampuan primer menempel pada cetakan DNA. Primer yang

didesain berupa primer tunggal pendek agar dapat menempel secara acak pada DNA genom organisme.

Dengan demikian akan terdapat banyak pola fragmen DNA. Perbedaan ini dapat dilihat dengan adanya

pola pita pada gel agarosa setelah diwarnai dengan pewarnaan DNA seperti etidium bromide.

Disamping ditentukan oleh ada tidaknya situs penempelan primer, keberhasilan teknik ini ditentukan

juga oleh kemurnian dan keutuhan DNA cetakan. DNA cetakan yang tidak murni akan mengganggu

penempelan primer pada situsnya dan akan menghambat aktifitas enzim polymerase DNA. Enzim ini

berfungsi untuk melakukan polimerisasi DNA. Sedangkan DNA cetakan yang banyak mengalami

fragmentasi dapat menghilangkan situs penempelan primer.

Data pita DNA hasil RAPD umumnya dianalisis dengan mengubah menjadi data biner satu dan nol

berdasarkan ada atau tidak adanya pita. Primer acak yang digunakan jumlahnya dapat banyak dan tidak

terbatas sehingga data biner yang terbentuk berupa matriks biner peubah ganda (Roslim et al.2002).

Keunggulan teknik RAPD terletak pada beberapa kemudahan sebagai berikut:

1. Pengetahuan latar belakang genom organisme tidak diperlukan

2. Hasil RAPD dapat diperoleh secara cepat terutama jika dibandingkan dengan analisis RFLP yang

memerlukan banyak tahapan

3. Beberapa jenis primer arbitrary dapat dibeli dan digunakan untuk analisis genom semua organisme

(Welsh dan McCleland 1990; Williams et al.1990).

Dilaporkan untuk keperluan analisis kekerabatan antar genotipe tanaman, teknik RAPD mempunyai

resolusi yang sebanding dengan teknik RFLP (dos Santos et al.1994).

Jumlah primer yang diperlukan dalam analisis sangat bergantung pada tujuan atau jenis informasi yang

diinginkan. Jika tujuannya untuk mengungkapkan hubungan kekerabatan, maka analisisnya tidak dapat

bertumpu pada satu atau beberapa karakter saja. Dalam hal tersebut Hallden et al.1994 melaporkan

bahwa semakin banyak jumlah primer yang digunakan, semakin rendah nilai koefisien keragaman hasil

analisis yang diperoleh. Sepuluh sampai dengan dua puluh primer dianggap sudah mencukupi untuk

keperluan analisis kekerabatan karena dengan sepuluh primer pengaruh kesalahan percobaan telah

diperkecil hingga mendekati nol.

Kelemahan RAPD sebagai berikut:

1. Pemunculan pita DNA kadang – kadang tidak konsisten. Hal ini lebih sering terjadi jika suhu annealing

yang digunakan terlalu tinggi. Dalam analisis kekerabatan hal ini dapat diatasi dengan menggunakan

primer yang lebih banyak.

2. Ruas DNA yang berulang sering berlipat ganda

3. Homologi urutan nukleotida pada pita-pita DNA dengan mobilitas yang sama pada gel tidak diketahui

4. Penanda RAPD bersifat dominan

Amplified fragment lengh polymorphism (AFLP)

AFLP merupakan teknik amplifikasi DNA yang segera dapat dilihat perbedaan fragmennya setelah PCR

melalui gel agarose atau poliakrilamid. Teknik ini dapat digunakan untuk melihat adanya fragmen DNA

yang berbeda karena adanya insersi ataupun delesi basa nukleotida dalam jumlah yang cukup besar.

AFLP merupakan teknik yang lebih sensitive dari RAPD untuk menghasilkan polimorfisme antar genotip.

AFLP banyak digunakan di antaranya untuk mendeteksi sifat-sifat yang berhubungan erat dengan lokus

suatu karakter tertentu, sidik jari DNA, keragaman genetic (Vandenmark 1999), penelusuran pola

segregasi (Singh dan Cheah 1996), penelusuran hasil mutasi, menetapkan jarak genetic dan

mengidentifikasi keterpautan gen dengan resistensi penyakit (Scott et al.2000). AFLP memiliki beberapa

kelebihan dibandingkan dengan RAPD antara lain amplifikasi DNA dapat bersifat spesifik dan lebih stabil

(Vos et al.1995). Cabrita et al. (2001) menyatakan bahwa AFLP dapat digunakan untuk mengenali

hubungan kekerabatan yang sangat dekat antar-genotip, perbedaan antar klon dalam satu kultivar,

keragaman yang disebabkan terjadinya mutasi yang sangat sedikit, atau adanya perbedaan genetik yang

sangat kecil.

Fragmen yang dihasilkan dari analisis AFLP yang tampak sebagai pita DNA diterjemahkan menjadi data

biner berdasarkan ada atau tidaknya pita yang dimiliki secara bersama oleh individu tanaman yang

dianalisis. Nilai satu (1) diberikan untuk yang memiliki pita dan nilai nol (0) untuk yang tidak memiliki

pita.

Restriction fragment length polymorphism (RFLP)

RFLP merupakan teknik PCR yang menggunakan enzim restriksi untuk mendeteksi keragaman DNA.

Amplikon dipotong dengan menggunakan enzim restriksi untuk mendapatkan fragmen DNA. Enzim

restriksi yang umumnya digunakan yaitu enzim yang biasanya ditemukan pada organisme prokariotik.

Organisme yang menghasilkan enzim restriksi endonuklease mampu melindungi genomnya sendiri dari

metilasi nuklotida di dalam sekuen endonuklease yang dikenali. Secara umum ada dua macam tipe

enzim restriksi yaitu:

1. Enzim yang mengenali sekuen spesifik tetapi memotong dibeberapa tempat

2. Enzim yang memotong hanya pada situs yang dikenali

Tipe enzim yang kedua yaitu enzim yang sangat penting. Umumnya sekuen potongannya diketahui.

Biasanya panjangnya enzim restriksi ini 4 sampai 6 nukleotida.

Enzim pada kelompok ini membuat bentuk potongan yang berbeda yaitu:

a. Bentuk potongan yang lancip

b. Bentuk potongan yang tumpul

Sangat penting untuk mengenali enzim pemotong ini karena bersifat sangat spesifik dalam memotong

sekuen nukleotida yang dikenalinya.

Parameter yang perlu diperhatikan dalam menggunakan teknik ini yaitu:

1. Kemurnian DNA

Secara umum enzim restriksi sangat efisien dalam memotong situs DNA namun tegantung pada

kemurnian DNA. Adanya kontaminasi seperti protein lain, fenol, kloroform, etanol, EDTA, SDS,

konsentrasi garam yang tinggi dapat menjadi penghambat reaksi enzim restriksi.

2. Buffer enzim restriksi

Untuk tiap-tiap enzim restriksi dibuat kondisi reaksi yang optimal oleh pabrik pembuat enzim.

3. Faktor lain

Jumlah yang besar kadang-kadang diperlukan untuk memotong DNA sirkular pada plasmid atau DNA

virus dibandingkan untuk memotong DNA linier

RT-PCR

Reverse transcriptase-PCR (RT-PCR) merupakan metode yang digunakan untuk mengamplifikasi cDNA

dari mRNA. RT-PCR digunakan untuk mendapatkan kembali dan menyalin utas 5’ dan 3’ dari mRNA,

menghasilkan kumpulan cDNA yang banyak dari jumlah mRNA yang sangat sedikit. RT-PCR dapat dengan

mudah digunakan untuk mengidentifikasi mutasi, polimorphisme dan mengukur kekuatan ekspresi gen.

Konsep utama yang digaris bawahi pada teknik ini yaitu mengkonversi mRNA ke bentuk rantai tunggal

untuk cetakan cDNA. Primer Oligodeoxynukleotida di hibridisasikan ke sehingga cDNA dapat

teramplifikasi. Tergantung pada tujuan penelitian, primer untuk sintesi cDNA rantai pertama dapat

disusun secara khusus untuk hibridisasi gen target atau dapat mengikat secara umum semua mRNA.

Teknik RT-PCR memerlukan enzim transcriptase balik (reverse transcriptase). Enzim transcriptase balik

adalah enzim DNA polymerase yang menggunakan molekul RNA sebagai cetakan untuk mensintesis

molekul DNA (cDNA) yang komplementer dengan molekul RNA tersebut. Beberapa enzim transcriptase

balik yang dapat digunakan antara lain mesophilic viral reverse transcriptase (RTase) yang dikode oleh

virus avian myoblastosis (AMV) maupun oleh virus moloney murine leukemia (M-MuLV), dan Tth DNA

polymerase. RTase yang dikode oleh AMV maupun M-MuLV mampu mensintesis cDNA sampai

sepanjang 10 kb, sedangkan Tth DNA polymerase mampu mensintesis cDNA sampai sepanjang 1 – 2 kb.

Berbeda dengan Tth DNA polymerase, enzim RTase AMV dan M-MuLV mempunyai aktivitas RNase H

yang akan menyebabkan terjadinya degradasi RNA dalam hybrid RNA: cDNA. Aktivitas degradasi

semacam ini akan berkurang jika berkompetisi dengan proses sintesis DNA selama proses produksi untai

pertama cDNA. Enzim RTase yang berasal dari M-MuLV mempunyai aktivitas RNasse H yang lebih

rendah disbanding dengan yang berasal dari AMV.

Enzim M-MuLV mencapai aktivitas maksimum pada suhu 37°C sedangkan enzim AMV pada suhu 42°C

dan Tth DNA polymerase mencapai aktivitas maksimum pada suhu 60 - 70°C. Penggunanaan enzim M-

MuLV kurang menguntungkan jika RNA yang digunakan sebagai cetakan mempunyai struktur sekunder

yang ekstensif. Di lain pihak, penggunaan Tth DNA polymerase kurang menguntungkan jika ditinjau dari

kebutuhan enzim ini terhadap ion Mn karena ion Mn dapat mempengaruhi ketepatan (fidelity) sintesis

DNA. Meskipun demikian, enzim Tth DNA polymerase mempunyai keunggulan karna dapat digunakan

untuk reaksi transkripsi balik sekaligus proses PCR dalam satu langkah reaksi.

Reaksi transkripsi balik dapat dilakukan dengan menggunakan beberapa macam primer yaitu:

1. Oligo (dT) sepanjang 12 – 18 nukleotida yan akan melekat pada ekor poli (A) pada ujung 3’ mRNA

mamalia. Primer semacam ini pada umumnya akan menghasilkan cDNA yang lengkap

2. Heksanukleotida acak yang akan melekat pada cetakan mRNA yang komplementer pada bagian

manapun. Primer semacam ini akan menghasilkan cDNA yang tidak lengkap (parsial).

3. Urutan nukleotida spesifik yang dapat digunakan secara selektif untuk menyalin mRNA tertentu

(Yuwono T 2006).

Single strand conformation polimorphim (SSCP)

Single strand conformation polimorphims merupakan salah satu teknik PCR yang dapat mendeteksi

perbedaan nukleotida dari DNA produk PCR dengan perbedaan satu nukleotida. Metode ini

memanfaatkan perbedaan laju migrasi utas tunggal DNA setelah didenaturasi dalam formamide dye dan

perlakuan panas pada gel poliakrilamid yang diikuti dengan pewarnaan perak (Sambrook et al.1989).

Metode SSCP dikenalkan pada tahun 1989 sebagai alat deteksi baru untuk polimorphisme DNA, variasi

sekuen, SSCP menawarkan suatu yang murah, gampang dan metode yang sensitive terhadap variasi

genetic (Sunnucks et al.2000).

Gerakan pita ganda DNA pada gel elekroforesis pada umumnya tergantung pada ukuran dan panjang

basa. Sedangkan gerakan pita tunggal sangat jelas dipengaruhi oleh perubahan yang sangat kecil dalam

sekuen. Perubahan yang sangat kecil jelas terjadi karena secara alami pita tunggal tidak stabil. Dengan

demikian dapat terjadi lekukan karena ada atau tidak adanya pita pasangannya yang menyebabkan

pasangan basa terletak diantara pita dan menghasilkan struktur pita 3D yang unik. Perubahan satu

nukleotida berpengaruh terhadap gerakan dalam gel elektroforesis.

Untuk mendapatkan pita tunggal, amplikon dipanaskan pada suhu tinggi dan kemudian didinginkan

secara mendadak. Pita tunggal yang diperoleh dirunning pada gel poliakrilamida.

Polymerase Chain Reaction (PCR)

A. Pengertian PCR

Reaksi Polimerase Berantai atau dikenal sebagai Polymerase Chain Reaction (PCR), merupakan suatu

proses sintesis enzimatik untuk melipatgandakan suatu sekuens nukleotida tertentu secara in vitro.

Metode ini dikembangkan pertama kali oleh Kary B. Mulis pada tahun 1985. Metode ini sekarang telah

banyak digunakan untuk berbagai macam manipulasi dan analisis genetic. Pada awal perkembanganya

metode ini hanya digunakan untuk melipatgandakan molekul DNA, tetapi kemudian dikembangkan lebih

lanjut sehingga dapat digunakan pula untuk melipatgandakan dan melakukan kuantitas molekul mRNA.

Dengan menggunakan metode PCR dapat meningkatkan jumlah urutan DNA ribuan bahkan jutaan kali

dari jumlah semula, sekitar 106-107 kali. Setiap urutan basa nukleotida yang diamplifikasi akan menjadi

dua kali jumlahnya. Pada setiap siklus PCR akan diperoleh 2n kali banyaknya DNA target. Kunci utama

pengembangan PCR adalah menemukan bagaimana cara amplifikasi hanya pada urutan DNA target dan

meminimalkan amplifikasi urutan non-target. Metode PCR dapat dilakukan dengan menggunakan

komponen dalam jumlah yang sangat sedikit, misalnya DNA cetakan yang diperlukan hanya sekitar 5µg,

oligonukliotida yang digunakan hanya sekitar 1 mM dan reaksi ini biasa dilakukan dalam volume 50-100

µl. DNA cetakan yang digunakan juga tidak perlu dimurnikan terlebih dahulu sehingga metode PCR

dapat digunakan untuk melipatgandakan suatu sekuens DNA dalam genom bakteri.

Konsep asli teknologi PCR mensyaratkan bahwa bagian tertentu sekuen DNA yang akan dilipatgandakan

harus diketahui terlebih dahulu sebelum proses pelipatgandaan tersebut dapat dilakukan. Sekuen yang

diketahui tersebut penting untuk menyediakan primer, yaitu suatu sekuens oligonukleotida pendek yang

berfungsi mengawali sintesis rantai DNA dalam reaksi berantai polimerasi.

B. Komponen – Komponen PCR

Ada beberapa macam komponen utama dalam proses PCR, yaitu antara lain:

1. DNA cetakan

DNA cetakan, yaitu fragmen DNA yang akan dilipatgandakan. Fungsi DNA templat di dalam proses

PCR adalah sebagai cetakan untuk pembentukan molekul DNA baru yang sama. Templat DNA ini dapat

berupa DNA kromosom, DNA plasmid ataupun fragmen DNA apapun asal di dalam DNA templat

tersebut mengandung fragmen DNA target yang dituju.

Reaksi pelipatgandaan suatu fragmen DNA dimulai dengan melakukan denaturasi DNA template

(cetakan) sehingga rantai DNA yang berantai ganda (double stranded) akan terpisah menjadi rantai

tunggal (single stranded). Denatirasi DNA dilakukan dengan menggunakan panas selama 1 – 2 menit,

kemudian suhu diturunkan menjadi sekitar sehingga primer akan “menempel” (annealing) pada

cetakan yang telah terpisah menjadi rantai tunggal. Primer akan membentuk jembatan hydrogen

dengan cetakan pada daerah sekuen yang komplementer dengan dengan sekuen primer. Suhu yang

digunakan untuk penempelan primer pada dasarnya merupakan kompromi. Amplifikasi akan lebih

efisien jika dilakukan pada suhu yang lebih rendah ( ).

2. Oligonukleotida primer

Oligonukleotida primer, yaitu suatu sekuen oligonukleotida pendek (15 – 25 basa nukleotida) yang

digunakan untuk mengawali sintesis rantai DNA. Primer yang digunakan dalam PCR ada dua yaitu

oligonukleotida yang mempunyai sekuen yang identik dengan salah satu rantai DNA cetakan pada ujung

5’-fosfat, dan oligonukleotida yang kedua identik dengan sekuen pada ujung 3’OH rantai DNA cetakan

yang lain. Proses annealing biasanya dilakukan selama 1 – 2 menit. Setelah dilakukan annealing

oligonukleotida primer dengan DNA cetakan, suhu inkubasi dinaikkan menjadi selama 1,5 menit. Pada

suhu ini DNA polymerase akan melakukan proses polimerasi rantai DNA yang baru berdasarkan

informasi yang ada pada DNA cetakan. Setelah terjadi polimerasi, rantai DNA yang baru akan

membentuk jembatan hydrogen dengan DNA cetakan. DNA rantai ganda yang terbentuk dengan adanya

ikatan hydrogen antara rantai DNA cetakan dengan rantai DNA yang baru hasil polimerasi selanjutnya

akan didenaturasi lagi dengan menaikkan suhu ingkubasi menjadi . Rantai DNA yang baru tersebut

selanjutnya akan berfungsi sebagai cetakan bagi reaksi polimerasi berikutnya.

Reaksi-reaksi seperti yang sudah dijelaskan tersebut diulangi lagi sapai 25 – 30 klai (siklus) sehingga pada

akhir siklus akan didapatkan molekul-molekul DNA rantai ganda yang baru hasil polimerasi dalam jumlah

yang lebih banyak dibandingkan dengan jumlah DNA cetakan yang digunakan. Banyaknya siklus

amplifikasi tergantung pada kosentrasi DNA target di dalam campuran reaksi. Paling tidak, diperlukan 25

siklus untuk melipatgandakan satu kopin sekuen DNA target di dalam genom mamalia agar hasilnya

dapat dilihat secara langsung, misalnya dengan elektroforosis gel agarose. Akan tetapi, pada umumnya

kosentrasi DNA polimerasi Taq menjadi terbatas setelah 25 – 30 siklus amplikasi.

3. Deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP)

Shanghai ShineGene Molecular Biotech,Inc. (2009) menyatakan bahwa campuran dNTP adalah larutan

air pada pH 7,0 yang mengandung dATP, dCTP, dGTP dan dTTP, masing-masing pada konsentrasi akhir

baik 10mm atau 25mm. dNTP yang siap digunakan merupakan solusi yang dirancang untuk menghemat

waktu dan untuk menyediakan reproduktifitas yang lebih tinggi dalam aplikasi PCR dan lainnya.

4. DNA Polimerase

Pada awal perkembangannya, DNA polymerase yang digunakan dalam PCR adalah fragmen Klenow DNA

polymerase I yang berasal dari Escherichia coli (Mullis dan Fallona, 1989). Fragmen Klenow adalah DNA

polymerase yang telah dihilangkan aktivitas eksonuklease (5’ → 3’)-nya. Beberapa kelemahan fragmen

Klenow antara lain adalah bahwa enzim ini tidak tahan panas, laju polemerase untuk menggabungkan

nukleotida dengan suatu primer secara terus-menerus tanpa terdisosiasi dari komplek primer-DNA

cetakan. Hampir semua DNA polymerase mempunyai prosesivitas yang rendah sehingga akan

terdisosiasi dari komplek primer-DNA cetakan setelah menggabungkan kurang dari 10 nukleotida. Salah

satu perkecualian adalah T7 DNA polymerase yang mampu menggabungkan ribuan nukleotida tanpa

terdisosiasi dari komplek primer-DNA cetakan.

a. Taq DNA Polimerase

Taq DNA polymerase yang beraasal dari bakteri Thermus aquaticus BM, yaitu suatu strain yang tidak

mempunyai endonuklease retriksi TaqI. Taq DNA polymerase tersusun atas satu rantai polipeptida

dengan berat molekul kurang lebih 95 kD. Enzim ini mempunyai kemampuan polimerasi DNA yang

sangat tinggi, tetapi tidak mempunyai aktivitas eksonuklease 3’ → 5’. Enzim ini paling aktif pada pH9

(pada suhu 200 C) dan suhu aktivitas optimumnya sekitar 750C – 800C.

Kelebihan enzim Taq DNA polimerase adalah bahwa enzim ini tahan terhadap suhu tinggi yang

diperlukan untuk memisahkan rantai DNA cetakan. Dengan kelebihan semacam ini maka tidak

diperlukan penambahan enzim pada tiap-tiap siklus PCR seperti yang harus dilakukan kalau enzim yang

dig unakan adalah fragmen Klenow DNA polymerase I (Gelfand dan White, 1990). Kelebihan lain enzim

Taq DNA polymerase adalah laju polimerasinya yang sangat tinggi serta prosesivitasnya yang juga lebih

tinggi disbanding dengan fragmen Klenow.

Taq DNA polymerase mempunyai suhu optimum yang tinggi untuk sintesis DNA yaitu 75 – 80 C. aktivitas

spesifik enzim ini dalam menggabungkan nukleotida mencapai 150 nukleotida per detik per molekul

enzim. Waktu paruh (half-time) Taq DNA polymerase pada suhu 95 C adalah 40 menit (Gelfand dan

White, 1990). Deterjen non-ionik Tween 20 (0,5 -1 %) dapat digunakan untuk meningkatkan efisiensi Taq

DNA polymerase. Senyawa tambahan lain yang juga dapat meningkatkan efisiensi polimerasi Taq DNA

polymerase adalah DMSO, gelatin, gliserol, dan ammonium sulfat.

Salah satu kelemahan enzim Taq DNA polymerase adalah bahwa enzim tersebut mempunyai potensi

untuk melakukan kesalahan dalam menggabungkan nukleotida sehingga ada kemungkinan terjadi

mutasi pada fragmen gen hasil amplifikasi. Meskipun demikian dengan kondisi yang tepat, kesalahan

penggabungan nukleotida semacam itu tidak terjadi seperti misalnya hasil amplifikasi fragmen gen HIV-1

(5400 nukleotida) dengan siklus amplifikasi 30 kali. Demikian juga halnya dengan hasil amplifikasi gen ß-

globin (14990 nukleotida). Dengan demikian , rata-rata frekuensi kesalahan penggabungan nukleotida

sekitar 5 X kesalahan per nukleotida yang digabungkan per siklus, dengan menggunakan 25 siklus.

Taq DNA polymerase mempunyai keunikan yaitu bahwa enzim ini mampu menambahkan satu

nukleotida,terutama dATP, pada ujung -3’ fragmen DNA hasil polimerasi meskipun tanpa ada

cetakanya. Dengan demikian, ujung fragmen DNA hasil polimerasi dengan metode PCR pada umumnya

tidak pepat (blunt-ended), melainkan ada tambahan satu nukleotida pada kedua ujungnya. Kenyataan

semacam ini mempunyai implikasi penting karena fragmen DNA hasil polimerasi dengan metode PCR

dapet diligase dengan suatu plasmid vector tertentu tanpa menggunakan enzim DNA ligase. Hal ini juga

perlu diperhatikan jika frag men DNA hasil PCR akan diligasikan dengan suatu plasmid dengan metode

ligasi pepat (blunt-ended ligation). Sebelum dilakukan ligasi , fragmen DNA tersebut harus dibuat

pepat/tumpul dengan menggunakan aktivitas polymerase 5’ → 3’ fragmen Klenow.

Aktivitas Taq DNA polymerase dipengaruhi oleh kosentrasi ion magnesium. Aktivitas Taq DNA

polymerase mencapai maksimal pada kosentrasi sebesar 2,0 mM jika kosentrasi dNTP yang digunakan

adalah 0,7 – 0,8 mM. kosentrasi lebih tinggi dari 2,0 mM akan menghambat aktivitas Taq DNA

polymerase. Di samping itu, aktivitas enzim polymerase ini juga akan menurun 20-30% jika kosenrasi

total dNTP yang digunakan mencapai 4-6 mM.

b. Tth DNA polimerse

Enzim DNA polimerse lain yang juga dapat digunakan untuk melakukan PCR adalah Tth DNA polimerse.

Enzim ini diisolasi dari eubakteri thermofilik Thermus thermophilus HB8. Tth DNA polimerse mempunyai

prosesivitas yang tinggi dan tidak mempunyai aktivitas eksonuklease 3’ → 5’. Enzim ini menunjukkan

aktivitas tertinggi pada pH 9 (pada suhu 25 ) dan suhu sekitar . Selain aktivitas polymerase, enzim ini

juga mempunyai aktiviatas transcriptase balik (reverse transcriptase) intrinsik yang sangat efisien

dengan adanya ion mangan. Aktivitas trankriptase balik tersebut jauh lebih tinggi disbanding dengan

aktivitas serupa yang dimiliki oleh DNA polymerase I yang ada pada Escherichia coli maupun pada Taq

DNA polymerase. Tth DNA polimerse juga dapat menggunakan substrad yang dimodifikasi sehingga juga

dapat digunakan untuk melabel fragmen DNA dengan radionukleotida, digoxigenin maupun biotin.

Oleh karena enzim Tth DNA polimerse mempunyai aktivitas transkiptase balik yang tinggi pada suhu

tinggi maka enzim ini dapat digunakan untuk mengatasi masalah yang timbul akibat adanya struktur

skunder pada molekul RNA. Dengan demikian, enzim ini dapat digunakan untuk melakukan RT-PCR

(reverse Transkriptase PCR). Molekul cDNA yang diperoleh dari hasil reaksi transkripsi balik dapat

sekaligus diamplifikasi dengan menggunakan Tth DNA polimerse dengan adanya ion . Enzim ini dapat

dilakukan untuk melakukan RT-PCR molekul RNA sampai ukuran 1000 pasangan basa.

c. Pwo DNA polymerase

Enzim Pwo DNA polymerase diisolasi dari archaebacterihiperthermofilik Pyrococcus woesei. Enzim Pwo

DNA polymerase mempunyai berat molekul sekitar 90 kD. Enzim ini mempunyai prosesivitas polimerasi

5’ 3’ yang tinggi, mempunyai aktivitas eksonuklease , dan tidak menunjukkan aktivitas eksonuklease .

Pwo DNA polymerase mempunyai stabilitas thermal yang lebih tinggi dibandingkan dengan Taq DNA

polymerase. Waktu paruh enzim ini lebih dari 2 jam pada suhu , sedangkan Taq DNA polymerase hanya

mempunyai waktu paruh 5 menit pada suhu ini. Aktivitas eksonuklease 3’ 5’ (aktivitas proof-reading

dalam proses sintesis DNA) yang dimiliki oleh Pwo DNA polymerase meningkatkan ketepatan (fidelity)

proses sintesis DNA sepuluh kali lebih tinggi dibandingkan dengan ketepatan yang dimiliki oleh Taq DNA

polymerase. Jika Taq DNA polimerse digunakan untuk mengamplikasi sekuen DNA sepanjang 200 bp

sebanyak satu juta kali maka kurang lebih 56% produk amplifikasinya akan mangandung satu atau lebih

kesalahan. Sebalikya, jika enzim Pwo DNA polymerase yang digunakan untuk amplifikasi maka hanya

10% produk amplifikasinya yang mengandung kesalahan. Ketepatan proses polimerasi DNA secara in

vitro merupakan salah satu parameter paling penting dalam PCR. Hal ini terutama sangat penting jika

DNA atau RNA cetakan yang digunakan hanya berjumlah sangat sedikit.

Hasil amplifikasi menggunakan Pwo DNA polymerase adalah molekul DNA dengan ujung pepat/tumpul

(blunt-ended) sehingga dapat digunakan dalam proses ligasi ujung tumpul secara langsung tanpa harus

dilakukan modifikasi terhadap ujung-ujung molekul DNA. Oleh karena sifat ketepatanya yang tinggi

maka enzim ini sangat berguna untuk aplikasi:

1) Cloning produk PCR

2) Studi polimorfisme alel dalam transkrip RNA individual

3) Karakterisasi mutasi yang jarang di dalam suatu jaringan

4) Karakterisasi status alel suatu sel tunggal atau DNA molekul tunggal

5) Karakterisasi populasi sel dalam suatu kultur

d. Pfu dan Tli DNA polymerase

DNA polymerase lain yang dapat digunakan untuk PCR adalah Pfu DNA polymerase dan Tli DNA

polymerase. Pfu DNA polymerase diisolasi dari Pyrococcus furiosis, mempunyai berat molekul 92 kD,

aktif pada suhu dan mempunyai aktivitas eksonuklease . Enzim ini diketahui mempunyai laju kesalahan

yang paling kecil disbanding dengan enzim DNA polymerase yang lain. Produk amplifikasi dengan

menggunakan enzim ini adalah molekul DNA dengan ujung tumpul.

Tli DNA polymerase diisolasi dari jasad Thermococcus litoralis, sangat stabil terhadap panas, aktivitas

optimum pada suhu dan dapat berfungsi meskipun diinkubasi pada suhu . Berat molekul enzim ini

dalah 90 kD. Enzim juga mempunyai aktivitas eksonuklease .

5. PCR buffer dan konsentrasi Mg2+

Buffer standar untuk PCR tersusun atas 50mM KCl, 10mM Tris-Cl (pH8.3) dan 1.5mM MgCl2. Buffer

standard ini akan bekerja dengan baik untuk DNA template dan primer dengan kondisi tertentu, tetapi

mungkin tidak optimum dengan kombinasi yang lain. Produk PCR buffer ini terkadang dijual dalam

bentuk tanpa atau dengan MgCl2.

Konsentrasi ion magnesium dalam PCR buffer merupakan faktor yang sangat kritikal, karena

kemungkinan dapat mempengaruhi proses annealing primer, temperatur dissosiasi untai DNA template,

dan produk PCR. Hal ini disebabkan konsentrasi optimal ion Mg2+ itu sangat rendah. Hal ini penting

untuk preparasi DNA template yang tidak mengandung konsentrasi chelating agent yang tinggi, seperti

EDTA atau phosphat. Ion Mg2+ yang bebas bila terlalu rendah atau tidak ada, maka biasanya tidak

menghasilkan produk akhir PCR, sedang bila terlalu banyak ion Mg2+yang bebas akan menghasilkan

produk PCR yang tidak diinginkan.

C. Peralatan Khusus yang Digunakan dalam PCR

PCR memerlukan alat khusus dalam prosesnya, alat-alat tersebut antara lain:

1. Mighty-small II SE-250 vertical gel electrophoresis unit (Hoefer)

2. Perkin-Elmer/Cetus Thermal Cycler

3. Perkin-Elmer/Cetus Thermal Cycler adalah peralatan laboratorium yang digunakan

untuk analisis PCR, atau replikasi cepat dari urutan DNA tertentu.

4. Sterile Thin-wall 0.5 ml Thermocycler microfuge tubes: (TC-5, Midwest Scientific). Alat

ini memiliki sebuah thermal block dengan lubang-lubang untuk memasukkan tabung campuran

PCR.

D. Tahapan Proses PCR

Berdasarkan gambar diatas, Polymerase Chain Reaction (PCR) terdiri dari tiga proses, yaitu:

1. Denaturasi

Denaturasi merupakan proses memisahkan DNA menjadi utas tunggal. Tahap denaturasi DNA biasanya

dilakukan pada kisaran suhu 92 – 95 oC. Denaturasi awal dilakukan selama 1 – 3 menit diperlukan untuk

meyakinkan bahwa DNA telah terdenaturasi menjadi untai tunggal.

Denaturasi yang tidak berlangsung secara sempurna dapat menyebabkan utas DNA terputus. Tahap

denaturasi yang terlalu lama dapat mengakibatkan hilangnya aktivitas enzim polimerase.

2. Annealing

Annealing merupakan proses penempelan primer. Tahap annealing primer merupakan tahap terpenting

dalam PCR, karena jika ada sedikit saja kesalahan pada tahap ini maka akan mempengaruhi kemurnian

dan hasil akhir produk DNA yang diinginkan. Faktor yang mempengaruhi tahap ini antara lain suhu

annealing dan primer. Suhu annealing yang terlalu rendah dapat mengakibatkan timbulnya pita

elektroforesis yang tidak spesifik, sedangkan suhu yang tinggi dapat meningkatkan kespesifikan

amplifikasi.

Kenaikan suhu setelah tahap annealing hingga mencapai 70–740C bertujuan untuk mengaktifkan enzim

TaqDNA polimerase. Proses pemanjangan primer (tahap extension) biasanya dilakukan pada suhu 72 oC,

yaitu suhu optimal untuk TaqDNA polimerase. Selain itu, pada masa peralihan suhu dari suhu annealing

ke suhu extension sampai 70 oC juga menyebabkan terputusnya ikatan-ikatan tidak spesifik antara DNA

cetakan dengan primer karena ikatan ini bersifat lemah. Selain suhu, semakin lama waktu extension

maka jumlah DNA yang tidak spesifik semakin banyak.

3. Extension

Extension merupakan proses pemanjangan DNA. Dalam tahap extension atau sintesis DNA, enzim

polimerase bergabung bersama dengan nukleotida dan pemanjangan primer lengkap untuk sintesis

sebuah DNA utas ganda. Reaksi ini akan berubah dari satu siklus ke siklus selanjutnya mengikuti

perubahan konsentrasi DNA.

Hasil sintesa DNA dalam satu siklus dapat berperan sebagai cetakan (template) pada siklus berikutnya

sehingga jumlah DNA target menjadi berlipat dua pada setiap akhir siklus. Dengan kata lain DNA target

meningkat secara eksponensial, sehingga setelah 30 siklus akan menjadi milyaran amplifikasi DNA

target.

E. Aplikasi PCR

PCR dirancang pada tahun 1985 dab telah memberikan dampak besar pada penelitian biologis dan

bioteknologi. PCR telah digunakan untuk memperkuat DNA dari berbagai macam sumber misalnya

fragmen DNA kuno dari gajah purba (mammoth) berbulu yang telah membeku selama 40.000 tahun;

DNA dari sedikit darah;, jaringan, atau air mani yang ditemukan di tempat kejadian perkara kriminal;

DNA dari sel embrionik tunggal untuk diagnosis kelainan genetik sebelum kelahiran dan DNA gen virus

dari sel yang diinfeksi oleh virus yang sulit terdeteksi seperti HIV (Campbell dkk., 2004:395).

Menurut Darmo dan Ari (2000), teknik PCR dapat didayagunakan (kadang dengan modifikasi) guna

fasilitasi analisis gen. Selain itu telah dikembangkan banyak sekali aplikasi praktis. Sebagai contoh teknik

dan aplikasi PCR dapat disebutkan sebagai berikut: kloning hasil PCR; sekuensing hasil PCR; kajian

evolusi molekular; deteksi mutasi ( penyakit genetik; determinasi seks pada sel prenatal; kajian forensik

(tersangka kriminal, tersangka ayah pada kasus paternal); dan masih banyak lainnya.

Pendapat lain mengenai manfaat dan aplikasi PCR juga dikemukakan oleh Sunarto (1996) yang

menyebutkan bahwa PCR dapat digunakan sebagai alat diagnosis penyakit thalesemia. Menurut Sunarto

sebelum cara PCR ditemukan analisis DNA dilakukan dengan prosedur yang panjang dan rumit, yaitu

pertama-tama membentuk perpustakaan (library construction) melalui digesti dengan endonuklease

restriktif dan kloning, kemudian skrining, mapping, subkloning dan terakhir sekuensing. Tetapi dengan

adanya PCR dalam waktu 24 jam sejak pencuplikan vili korialis (chorionic villous sampling) diagnosis

prenatal sudah dapat ditegakkan dan berdasarkan prinsip PCR telah dikembangkan cara diagnostik

molekular yang terbukti sangat akurat.

Berdasarkan uraian diatas penemuan dan manfaat teknik PCR ini berdampak sangat luas terhadap

kemajuan sains dan teknologi secara umum yaitu antara lain sebagai berikut:

1. Memperkuat gen spesifik sebelum diklon.

2. Membuat fragmen gen DNA secara berlimpah

3. Dapat mendeteksi DNA gen virus yang sulit untuk dideteksi

4. Dapat mendeteksi/ mendiagnosis DNA sel embrionik yang mengalami kelainan sebelum

dilahirkan.

5. Bidang kedokteran forensik. Contohnya mendeteksi penyakit yang dapat menginfeksi,

variasi dan mutasi dari gen.

6. Mengetahui hubungan kekerabatan antar spesies atau untuk mengetahui dari mana

spesies tersebut berasal.

7. Melacak asal usul seseorang dengan membandingkan “finger print"

F. Kelebihan dan Kelemahan PCR

Kelebihan

1. Memiliki spesifisitas tinggi

2. Sangat cepat, dapat memberikan hasil yang sama pada hari yang sama

3. Dapat membedakan varian mikroorganisme

4. Mikroorganisme yang dideteksi tidak harus hidup

5. Mudah di set up

Kelemahan

-Sangat mudah terkontaminasi

-Biaya peralatan dan reagen mahal

-Interpretasi hasil PCR yang positif belum tervalidasi untuk semua penyakit infeksi (misalnya infeksi pasif

atau laten)

-Teknik prosedur yang kompleks dan bertahap membutuhkan keahlian khusus untuk melakukannya

Teknik 4: Replikasi DNA (DNA Replication)

Teknik replikasi DNA adalah satu proses biologi yang berlaku dalam semua organisma hidup dan proses

penyalinan DNA ini adalah asas bagi penerusan penghasilannya. Proses ini bermula dengan satu

daripada dua lembar (one double-stranded) molekul DNA dan seterusnya menghasilkan dua salinan

molekul yang serupa. Setiap untaian molekul DNA yang menjadi dua lembar yang asal (original double-

stranded DNA) bertindak sebagai templat untuk penghasilan sepasang lembar yang lengkap

(complementary strand).

Di dalam sel, proses replikasi DNA bermula di lokasi tertentu dalam genom, iaitu dipanggil "origin" (asal).

Pembukaan lembar (strand) DNA pada tempat "asal", seterusnya penghasilan lembar baru, akan

menghasilkan produk replikasi. Di samping itu, enzim DNA polimerase, iaitu sejenis enzim yang

menghasilkan DNA baru dengan menambah nukleotida, dan dipadankan dengan satu lembar (strand)

templat. Ianya seterusnya menghasilkan beberapa protein lain yang berkaitan dengan produk replikasi,

dan membantu dalam permulaan dan penerusan penghasilan DNA.

Replikasi DNA juga boleh dilakukan secara in vitro (buatan, di luar sel). Enzim DNA Polimerase,

diasingkan dari sel, dan primers DNA buatan yang digunakan untuk memulakan penghasilan DNA di

urutan yang dikenali dalam molekul templat. Reaksi polymerase chain (PCR), menggunakan apa-apa

teknik penghasilan secara bukan semula jadi (artificial) melaui kitaran yang teratur untuk menguatkan

sasaran keratan DNA yang spesifik dari kolam DNA (DNA pool).

Picture: Stylized DNA replication fork with nucleotides matched, 5'->3' synthesis shown, no enzymes

in diagram.

Teknik-teknik lain

Selain daripada teknik-teknik yang diatas, juga terdapat pelbagai teknik lain yang digunakan dalam

makmal bioteknologi, termasuk di Malaysia. Teknik-teknik berikut di ringkaskan, dan disampaikan dalam

bahasa inggeris.

1) Cloning genes

In nature, DNA molecules recombine for various functions -- even DNA between different species. But

twenty years ago, despite the work of Barbara McClintock and others, the extent of this recombination

was not appreciated. DNA was still thought to be the "master molecule," not to be violated by

"unnatural" manipulation. When scientists began to manipulate DNA in the test tube, many scientists

feared that disastrous monsters would result, with unspecified dangers to people. In 1977 scientists at

the Asilomar Conference proposed sweeping regulation on so-called "recombinant DNA," technologies

which recombine DNA from different species in the test tube.

Since then, the dangers have appeared to be little more than those of "natural" genetic mixing. But we

remain concerned about issues such as:

Engineering food crops to resist pesticides. The pesticide resistance genes can escape into

natural populations of weeds.

Engineering a human symbiont microbe, such as E. coli, to produce a deadly toxin such as

botulin. In theory this could be done, although it's not clear where such an organism would live, or how

well it could "compete" with natural flora.

Societal dilemmas of human cloning. How far shall we use reproductive technology to shape

future humans?

Techniques of Recombinant DNA

How do we manipulate these natural processes for biotechnology; for instance, to make a bacterium

that produces large quantities of insulin?

One approach would be to cut the appropriate gene from human DNA and paste, or splice, it into

a vector such as a plasmid or phage DNA. Our "scissors" are the class of enzymes called restriction

endonucleases

Restriction Endonucleases

An "endonuclease" is an enzyme that cuts duplex DNA in the middle, not at an end (for exonuclease).

Different species of bacteria have evolved different restriction endonucleases, each to cut foreign DNA

that gets into their cells by mistake. To be cut, the DNA has to lack their own pattern of protective

methylation. There are well over a hundred restriction enzymes, each cutting in a very precise way a

specific base sequence of the DNA molecule.

A restriction endonuclease cuts DNA only at a specific site, usually containing 4-6 base pairs. The

enzyme has to cut the DNA backbone twice, recognizing the same type of site; therefore, the site

"reads" the same way backwards as forwards--a palindrome.

This "sticky ends" from two different DNA molecules can hybridize together; then the nicks are sealed

using ligase. (Where does ligase come from? What is its natural function?) The result is recombinant

DNA. When this recombinant vector is inserted into E. coli, the cell will be able to process the

instructions to assemble the amino acids for insulin production. More importantly, the new instructions

are passed along to the next generation of E. coli cells in the process known as gene cloning.

Restriction site Analysis

How can we use restriction sites to analyze the plasmid products of ligation, and tell whether we in fact

have ligated the correct molecule:

Problem: Suggest several "incorrect" ways the plasmid could recombine.

More Problems:

Use the PLASMID Program. You MUST practice restriction analysis with this program; it will be on the

quiz and/or the test.

How do we get the recombinant molecule into a bacterial cell? Usually bytransformation (for a plasmid)

or by in vitro packaging into a phage head coat (for a phage vector such as lambda phage).

The above is a highly simplified description of recombinant DNA technology.

How would we actually locate the appropriately cloned gene? There are many different ways,

depending on the specific case. Here is one example, in which a partial sequence of the protein enables

us to reverse the code and determine an approximate DNA sequence to use for a radiolabeled

probe. The DNA probe will hybridize to clones containing the correct DNA, even if it is just one piece cut

out of an entire genome.

The radioactive probe is made by determining a short segment of the protein sequence, then "back

translating" to the possible DNA sequences. Short DNA sequences are synthesized to match the protein

sequence. Then these DNA oligomers (known as "oligos") are radiolabeled, and applied to the blotted

clones. They should hybridize only to clones containing sequence encoding the desired protein.

Reverse transcription: cDNA Cloning

Suppose we need to clone a gene containing lots of introns. What will happen when the bacterium tries

to express it?

To overcome this problem, we can start with mRNA isolated from tissues that produce the desired

protein. We then use reverse transcriptase enzyme (produced by a retrovirus related to HIV) to reverse

transcribe the mRNA into a DNA molecule that now is free of introns. Now we can ligate "sticky ends"

onto the cDNA and recombine it into a phage or plasmid vector.

Problem: Know the differences between genomic cloning and cDNA cloning.

Explain the relative ADVANTAGES and DISADVANTAGES of each technique--depending on the aim of

your research.

2) Transgenic

i)Cloning in Animals.

Animals have two different classes of cells: germ line and somatic. Only alterations in the germ cells can

be transmitted to future generations. However, some forms of somatic cell gene therapy can be useful

in treating patients. For example, people with cystic fibrosis can receive the cloned CFTR gene in a nasal

spray, which then infects the lining of their lungs and improves lung function. The infected

(transformed) epithelial cells eventually are lost, however, during normal processes of tissue growth, so

the treatment needs to be repeated. Germ-line cloning. There are two basic ways to clone a gene in the

mammalian germ line.

Inject a DNA fragment containing your gene into the nucleus of a fertilized egg (germ-line gene

cloning) or of body tissues in a mature host (somatic gene cloning). The DNA gets taken up at random

somewhere in one of the chromosomes.

An example of germ-line cloning is the injection of angiopoietin cDNA into the fertilized mouse egg. (An

example of somatic cloning is gene therapy for cystic fibrosis: inhale a vector containing the CF gene,

which gets incorporated into the DNA of cells lining the lungs. Somatic cloned genes are not inherited

by offspring.)

Put a transgene containing positive and negative selective markers into an embryonic stem cell

tissue culture. The ES cells take up the gene by homologous recombination, replacing the host allele.

The ES cells now are injected into a blastula of an unrelated host, and some of the next generation

progeny arise from the ES cells. To learn more about this, read Capecchi's article on Targeted

Transgenes, on reserve.

Once you have cloned a valuable gene into an animal, say a sheep that makes insulin in its milk, how can

we produce lots of identical progeny quickly without sexual reproduction? This is what the popular

press calls "cloning." (More after spring break.) But when you create a clone, how do you know it

worked? You need to know:

DNA: Did the transgene really incorporate into the genome? Where?

RNA: Is the RNA expressed? (Or prevented from expression, by a null allele?)

Protein: Is a desired protein expressed?

ii)Cloning in Plants.

Plants don't have separate somatic and germ cells, so creating transgenic plants is easier than creating

transgenic animals. Techniques include the use of microprojectile bombardment (the "gene gun") and

the use of Agrobacterium tumefaciens.

Gene sequence analysis

The sequence of DNA base pairs can be analyzed by

Restriction mapping. Construct a "road map" of restriction sites. A program to do this

is WebCutter.

DNA Sequence Analysis. Cut and clone various restriction fragments, and determine the exact

sequence of base pairs. All sequence information is deposited in GenBank. If you just want the

sequence of the peptide translated from the RNA, you have to look for insulin mRNA or cDNA.

Once we have a piece of DNA cloned, it is amplified (available in many copies) and we now have a

living clonewhich provides, in theory, an indefinite source of the DNA sequence. How do we analyze the

sequence?

DNA Sequence Determination

Once you have identified a particular region of DNA of interest, you need to find out the precise

sequence of DNA nucleotides. This is done by di-deoxy sequencing, in which a DNA polymerase is put

together with dNTPs in four different reactions, each containing a small amount of one di-deoxy NTP

(ATP, TTP, CTP, or GTP). The di-deoxy nucleotide lacks a 3'OH to continue chain extension, so the chain

terminates. Each reaction produces a population of fragments terminated at A, T, C, or G.

The fragments are either radiolabeled or enzymatically labeled. They can be separated on a gel, or on a

fluorescence analyzer. All published DNA sequences in the world are deposited in GenBank.

Historically, the products of

dideoxy sequencing reactions

were subjected to

electrophoresis in four different

lanes of a gel. Each lane

contained a reaction using a

different dideoxy terminator

nucleotide. The data looked like

the image at right.

Image from your textbook, Freeman, S. (2002) Biological Science.

Today, products of all four

sequencing reactions are loaded

in a single gel lane or capillary

tube and subjected to

electrophoresis. Molecular labels

consist of fluorescent dyes

instead of radioactive

nucleotides. The gel looks

something like this:

Sequences of DNA in the gel lanes are read by a computerized

fluorescence detection system that measures the intensity of light

emission from each "band." The final output is a "trace" or

"electrophoretogram" that plots the intensity of different color

emissions vs. the length of the DNA being sequenced. By observing

the progression of peaks of different colors, the DNA sequence is

derived (A C G T). The processed data look like this:

Image from http://www.qiagen.com/

Southern, Northern, and Western Blots

Blots are named for the target molecule.

Southern Blot--DNA cut with restriction enzymes - probed with radioactive DNA.

Northern Blot--RNA - probed with radioactive DNA or RNA.

Example--used to measure angiopoietin angiopoietin expression from cDNA in transgenic mouse.

Western Blot--Protein - probed with radioactive or enzymatically-tagged antibodies.

These molecules must then be immobilized on a solid support, so that they will remain in position during

probing and washing. The probe is then added, the non-specifically bound probe is removed, and the

probe is detected. The place where the probe is detected corresponds to the location of the immobilized

target molecule. This process is diagrammed below:

In the case of Southern, Northern, and Western blots, the initial separation of molecules is done on the

basis of molecular weight, by gel electrophoresis.

Preparing for Blots

Southern Blots. DNA is first cut with restriction enzymes and the resulting double-stranded DNA

fragments have an extended rod conformation without pre-treatment.

Northern Blots. Although RNA is single-stranded, RNA molecules often have small regions that

can form base-paired secondary structures. To prevent this, the RNA is pre-treated with

formaldehyde.

Western Blots. Proteins have extensive 2' and 3' structures and are not always negatively

charged. Proteins are treated with the detergent SDS (sodium dodecyl sulfate) which removes 2'

and 3' structure and coats the protein with negative charges.

Transfer to Solid Support. After the DNA, RNA, or protein has been separated by molecular weight, it

must be transferred to a solid support before hybridization. (Hybridization does not work well in a gel.)

This transfer process is called blotting and is why these hybridization techniques are called blots.

Usually, the solid support is a sheet of nitrocellulose paper (sometimes called a filter because the sheets

of nitrocellulose were originally used as filter paper), although other materials are sometimes used.

DNA, RNA, and protein stick well to nitrocellulose in a sequence-independent manner.

After a series of treatment steps, the probe is added. The probe hybridized to the target molecules is

visualized either by autoradiography or by enzyme reaction.

Summary. The important properties of the three blotting procedures of DNA analysis:

DNA Microarrays

We can now put most of the protein-encoding genes onto a microarray chip, using technology based on

the DNA silicon chip industry. The chip can be used to hybridize to cellular RNA, and measure the

expression rates of a large number of genes in a cell.

Axon Industries.

From "Everything's Great When It Sits on a Chip," The Scientist, Volume 13, #11, May 24, 1999

Transgenics

Cloning in Animals.

Animals have two different classes of cells: germ line and somatic.

Only alterations in the germ cells can be transmitted to future generations. However, some forms

of somatic cell gene therapy can be useful in treating patients. For example, people with cystic fibrosis

can receive the cloned CFTR gene in a nasal spray, which then infects the lining of their lungs and

improves lung function. The infected (transformed) epithelial cells eventually are lost, however, during

normal processes of tissue growth, so the treatment needs to be repeated.

Germ-line cloning. There are two basic ways to clone a gene in the mammalian germ line.

Inject a DNA fragment containing your gene into the nucleus of a fertilized egg (germ-line gene cloning)

or of body tissues in a mature host (somatic gene cloning). The DNA gets taken up at random

somewhere in one of the chromosomes.

An example of germ-line cloning is the injection of angiopoietin cDNA into the fertilized mouse egg.

(An example of somatic cloning is gene therapy for cystic fibrosis: inhale a vector containing the CF gene,

which gets incorporated into the DNA of cells lining the lungs. Somatic cloned genes are notinherited by

offspring.)

Put a transgene containing positive and negative selective markers into an embryonic stem cell tissue

culture. The ES cells take up the gene by homologous recombination, replacing the host allele. The ES

cells now are injected into a blastula of an unrelated host, and some of the next generation progeny

arise from the ES cells.

Once you have cloned a valuable gene into an animal, say a sheep that makes insulin in its milk, how can

we produce lots of identical progeny quickly without sexual reproduction? This is what the popular

press calls "cloning." (More after spring break.)

But when you create a clone, how do you know it worked? You need to know:

DNA: Did the transgene really incorporate into the genome? Where?

RNA: Is the RNA expressed? (Or prevented from expression, by a null allele?)

Protein: Is a desired protein expressed?

Cloning in Plants.

Plants don't have separate somatic and germ cells, so creating transgenic plants is easier than creating

transgenic animals. Techniques include the use of microprojectile bombardment (the "gene gun") and

the use of Agrobacterium tumefaciens.