uji antiinflamasi dg karagen

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  • 8/20/2019 Uji Antiinflamasi Dg Karagen

    1/11

    B r . J .

    P h a r m a c .

      1 9 7 1 ) , 4 2 ,

    3 9 2 - 4 0 2 .

    M e d i a t o r s

    o f

    t h e

    i n f l a m m a t i o n

    i n d u c e d

    i n

    t h e r a t p a w

    b y

    c a r r a g e e n i n

    PEARL

    CRUNKHORN

    A N D

    S .

    C

    R . MEACOCK

    L i l l y R e s e a r c h

    C e n t r e

    L i m i t e d , E r l

    Wood M a n o r ,

    W i n d l e s h a m , S u r r e y

    S u m m a r y

    1 . T h e t i m e c o u r s e o f

    o e d e m a

    f o r m a t i o n

    i n r a t s c a u s e d

    b y i n j e c t i o n

    o f c a r -

    r a g e e n i n

    i n t o

    t h e paw

    w a s f o l l o w e d f o r

    5 - 5 h o u r s . I n t a c t

    o r a d r e n a l e c t o m i z e d

    r a t s w h i c h h a d

    p r e v i o u s l y

    b e e n i n j e c t e d w i t h

    e l l a g i c a c i d

    o r

    s a l i v a

    t o

    r e d u c e

    c o n s i d e r a b l y

    t h e

    c o n c e n t r a t i o n o f

    b l o o d k i n i n o g e n s , o r

    w i t h

    m e t h y s e r g i d e

    t o

    a n t a g o n i z e

    5 - h y d r o x y t r y p t a m i n e

    ( 5 - H T ) s h o w e d a

    r e d u c e d

    i n f l a m m a t o r y

    r e s p o n s e .

    I t

    w a s

    c o n c l u d e d

    t h a t k i n i n s a n d

    5 - H T

    c o n t r i b u t e d

    s i g n i f i c a n t l y

    t o

    o e d e m a

    f o r m a t i o n d u r i n g

    t h i s p e r i o d .

    2 .

    M e p y r a m i n e a l o n e

    h a d

    n o

    e f f e c t

    o n o e d e m a f o r m a t i o n , b u t

    i n c o m b i n a t i o n

    w i t h e l l a g i c a c i d

    t r e a t m e n t , w i t h

    o r w i t h o u t m e t h y s e r g i d e ,

    i t c a u s e d

    a r e d u c t i o n

    s u g g e s t i n g

    t h a t h i s t a m i n e

    p l a y e d a m i n o r

    r o l e i n o e d e m a f o r m a t i o n

    d u r i n g

    t h e

    f i r s t

    3 h o u r s .

    3 .

    V a s c u l a r p e r m e a b i l i t y s t u d i e s i n d i c a t e d

    t h a t i n j e c t i o n o f e l l a g i c a c i d

    d i d

    n o t i n t e r f e r e w i t h

    t h e

    n o r m a l r e s p o n s e s

    i n s k i n t o i n t r a d e r m a l i n j e c t i o n s

    o f

    h i s t a m i n e ,

    5 - H T ,

    b r a d y k i n i n

    o r

    c o m p o u n d

    4 8 / 8 0 .

    M e p y r a m i n e a n d

    m e t h y -

    s e r g i d e ,

    a t

    t h e

    d o s e s u s e d

    i n t h e c a r r a g e e n i n

    e x p e r i m e n t s ,

    c o m p l e t e l y

    a n t a g o n i z e d

    h i s t a m i n e

    a n d

    5 - H T , r e s p e c t i v e l y ,

    a n d

    d i d

    n o t a f f e c t

    t h e

    s k i n

    r e s p o n s e s

    o f

    b r a d y k i n i n .

    4 .

    T r e a t m e n t i n

    v i v o w i t h

    e l l a g i c a c i d

    o r

    r a t s a l i v a

    w a s

    e q u a l l y

    e f f e c t i v e

    i n

    r e d u c i n g p l a s m a

    k i n i n o g e n

    c o n c e n t r a t i o n s b y

    a n a m o u n t

    e q u i v a l e n t

    t o m o r e

    t h a n

    1 0

    t i m e s t h e q u a n t i t y

    o f

    s u b s t r a t e

    1

    m e a s u r e d b y

    G a u t v i k

     

    R u g s t a d

      1 9 6 7 ) .

    5 .

    R a t s a l i v a , b u t n o t

    e l l a g i c a c i d ,

    l o w e r e d

    c o m p l e m e n t

    l e v e l s

    b y

    a p p r o x i -

    m a t e l y

    2 0 .

    I n t r o d u c t i o n

    T h e i n f l a m m a t o r y r e s p o n s e

    t o

    a n

    i n j e c t i o n

    o f

    c a r r a g e e n i n

    i n t o t h e

    r a t

    paw

    w a s

    i n t r o d u c e d b y

    W i n t e r ,

    R i s l e y

     

    N u s s

      1 9 6 2 )

    a n d

    d e v e l o p e d b y

    t h e s e

    w o r k e r s

      W i n t e r ,

    R i s l e y

     

    N u s s , 1 9 6 3 ;

    W i n t e r , 1 9 6 5 )

    a s a

    m o d e l

    o f

    i n f l a m m a t i o n

    i n

    t h e s e a r c h

    f o r

    a n t i - i n f l a m m a t o r y

    d r u g s .

    T h e c o m p o u n d s

    u s e d

    i n t h e s e

    s t u d i e s

    w e r e c h o s e n

    f o r

    t h e i r

    a b i l i t y

    t o

    s u p p r e s s

    o e d e m a

    r a t h e r t h a n

    f o r

    s p e c i f i c

    a n t a g o n i s t a c t i v i t y ,

    a n d

    t h e r e f o r e

    t h e r o l e a n d

    i m p o r t a n c e

    o f t h e

    v a r i o u s

    m e d i a t o r s

    r e l e a s e d

    d u r i n g

    t h e

    i n f l a m m a t o r y

    r e a c t i o n h a v e y e t

    t o b e

    c l e a r l y

    d e f i n e d .

    R e c e n t l y ,

    D i R o s a

     

    S o r r e n t i n o

      1 9 6 8 ,

    1 9 7 0 )

    h a v e

    s h o w n

    b o t h

    b y

    i n h i b i t i o n o f

    p l a s m a

    k a l l i k r e i n

    w i t h

    a p r o t i n i n

    a n d

    b y d e p l e t i o n

    o f

    , p l a s m a

    k i n i n o g e n

    w i t h

    c e l l u l o s e

    s u l p h a t e ,

    t h a t

    k i n i n s

    a r e

    r e l e a s e d

    i n

    t h e

    i n f l a m m a t o r y r e s p o n s e

    t o

    c a r r a g e e n i n

    i n t h e

  • 8/20/2019 Uji Antiinflamasi Dg Karagen

    2/11

    I n f l a m m a t o r y

    r e s p o n s e

    t o

    c a r r a g e e n i n

    r a t . T h e

    k i n i n o g e n c o n c e n t r a t i o n s

    o f

    f e m a l e

    W i s t a r

    r a t s

    w e r e

    g r e a t l y

    r e d u c e d

    b y

    i n t r a v e n o u s

    i n j e c t i o n

    o f

    e l l a g i c

    a c i d

      G a u t v i k

     

    R u g s t a d , 1 9 6 7 )

    o r

    r a t s a l i v a

    a n d

    t h e s e p r o c e d u r e s

    h a v e

    b e e n u s e d

    i n

    o u r

    i n v e s t i g a t i o n .

    T h e

    e x t e n t

    o f

    t h e

    c o n t r i b u -

    t i o n

    t o

    t h e

    o e d e m a

    f o r m a t i o n m a d e

    b y

    5 - h y d r o x y t r y p t a m i n e

    ( 5 - H T )

    i s

    i n d i c a t e d

    i n

    t h e

    s t u d i e s

    o f F e k e t e

     

    K u r t i

      1 9 7 0 )

    i n

    w h i c h

    m e t h y s e r g i d e ,

    a n

    a n t a g o n i s t

    o f

    5 - H T ,

    w a s f o u n d

    t o

    s u p p r e s s

    t h e

    c a r r a g e e n i n

    r e a c t i o n .

    I n

    t h i s

    s t u d y

    w e

    h a v e

    o b s e r v e d

    c h a n g e s

    i n

    t h e t i m e

    c o u r s e

    o f o e d e m a

    f o r m a t i o n ,

    i n a n i m a l s

    h a v i n g

    l o w

    c o n c e n t r a -

    t i o n s

    o f

    p l a s m a

    k i n i n o g e n

    a s

    w e l l

    a s i n a n i m a l s t r e a t e d w i t h

    a n t a g o n i s t s

    o f

    h i s t a m i n e

    a n d

    5 - H T i n

    a n

    a t t e m p t

    t o

    d e t e r m i n e

    t h e r e l a t i v e

    i m p o r t a n c e

    o f

    k i n i n s ,

    h i s t a m i n e

    a n d

    5-HT i n

    t h e

    p r o d u c t i o n

    o f

    o e d e m a

    b y c a r r a g e e n i n .

    M e t h o d s

    C a r r a g e e n i n

    i n f l a m m a t i o n

    F e m a l e W i s t a r r a t s ( 1 4 0 - 1 6 0

    g ,

    m a i n t a i n e d o n

    u n r e s t r i c t e d

    s u p p l i e s

    o f

    f o o d

    a n d

    w a t e r ,

    w e r e

    u s e d .

    W h i l e

    i n j e c t i o n s

    w e r e

    b e i n g

    g i v e n

    t h e

    a n i m a l s

    w e r e

    l i g h t l y

    a n a e s -

    t h e t i z e d

    w i t h

    e t h e r

    e x c e p t

    i n

    o n e s e r i e s o f

    e x p e r i m e n t s

    a s

    d e s c r i b e d

    i n

    R e s u l t s

    w h e n t h e y w e r e

    a n a e s t h e t i z e d

    w i t h

    p e n t o b a r b i t o n e s o d i u m

      A b b o t ) ,

      4 0

    m g / k g

    i . p .

    3 0

    m i n

    b e f o r e

    t r e a t m e n t .

    E l l a g i c

    a c i d

    ( K o c h - L i g h t

    L a b o r a t o r i e s )

    w a s u s e d i n

    a s t a n d a r d s o l u t i o n o f

    2

    x

    1 0 - M i n a 0 - 1 5

    M

    T r i s - H C l b u f f e r ,

    p H

    7 * 3 5

    ( G a u t v i k

     

    R u g s t a d ,

    1 9 6 7 ) . M e t h y -

    s e r g i d e

    b i m a l e a t e

      S a n d o z )

    a n d

    m e p y r a m i n e

    m a l e a t e

    ( M a y

    a n d

    B a k e r )

    w e r e

    d i s -

    s o l v e d

    i n 0

    9

    N a C l .

    R a t

    s a l i v a

    w a s

    c o l l e c t e d

    d u r i n g p e n t o b a r b i t o n e

    a n a e s t h e s i a

    a f t e r

    s t i m u l a t i o n

    o f

    s a l i v a t i o n b y

    a n

    i n t r a p e r i t o n e a l

    i n j e c t i o n

    o f

    p i l o c a r p i n e

      2

    m g / k g ) .

    I t

    w a s

    t h e n

    c e n t r i f u g e d

    a n d

    s t o r e d a t

    - 2 6 °

    C

    u n t i l u s e d .

    I n f l a m m a t i o n

    w a s

    i n d u c e d

    b y

    i n j e c t i n g

    0 - 1

    m l

    o f

    1

    h o m o g e n i z e d

    s u s p e n s i o n

    o f

    c a r r a g e e n i n ( G e l o z o n e

    S T 1 ,

    W h i f f e n , L o u g h b o r o u g h )

    i n 0

    9

    N a C l i n t o t h e

    p l a n t a r

    s u r f a c e

    o f

    t h e

    r i g h t

    h i n d

    paw o f

    e a c h r a t .

    T h e

    v o l u m e o f

    t h e i n f l a m e d

    paw

    w a s

    d e t e r m i n e d

    u s i n g

    a m e r c u r y

    p l e t h y s m o g r a p h

      U .

    B a s i l e , M i l a n ) .

    M e a s u r e m e n t s

    o f

    t h e

    r i g h t

    h i n d

    paw

    w e r e

    m a d e

    a f t e r

    1

    h ,

    2

    5

    h ,

    3

    5

    h ,

    4 - 5 h

    a n d

    5 5

    h

    a n d t h e a m o u n t

    o f

    o e d e m a

    w a s d e t e r m i n e d

    b y

    c o m p a r i s o n

    w i t h

    t h e v o l u m e o f

    t h e l e f t

    h i n d

    paw

    m e a s u r e d a t

    1

    h o u r .

    A t

    l e a s t f i v e

    r e a d i n g s w e r e

    t a k e n f o r e a c h

    paw

    a t

    a n y o n e

    t i m e .

    E l l a g i c

    a c i d

    s o l u t i o n

      0

    5

    m l )

    o r

    r a t s a l i v a

      0

    5

    m l )

    w a s

    i n j e c t e d

    s l o w l y i n t o a

    t a i l

    v e i n ,

    3

    t i m e s

    a t

    5

    m i n

    i n t e r v a l s ,

    3 0

    m i n b e f o r e t h e

    i n j e c t i o n

    o f c a r r a g e e n i n . I n

    t h o s e

    e x p e r i m e n t s

    w h e r e

    b o t h

    r e a g e n t s

    w e r e

    i n j e c t e d , a

    1 5

    m i n

    i n t e r v a l

    w a s

    a l l o w e d

    b e t w e e n

    t h e

    i n j e c t i o n s o f

    e l l a g i c

    a c i d

    a n d

    s a l i v a .

    M e p y r a m i n e

    a n d

    m e t h y s e r g i d e ,

    b o t h

    a t

    d o s e s

    o f

    2

    5

    mg b a s e / k g ,

    w e r e

    i n j e c t e d

    i n t r a v e n o u s l y 1 5

    m i n

    b e f o r e

    t h e

    c a r r a g e e n i n

    i n j e c t i o n . F u r t h e r

    i n j e c t i o n s o f m e t h y s e r g i d e

    w e r e g i v e n

    2 h a n d

    4

    h

    a f t e r t h e

    c a r r a g e e n i n i n j e c t i o n

    t o

    m a i n t a i n a n t a g o n i s m t o 5 - H T . I n

    s o m e e x p e r i -

    m e n t s

    m e t h y s e r g i d e

    a n d / o r

    m e p y r a m i n e w e r e

    g i v e n

    1 5 m i n a f t e r e l l a g i c

    a c i d .

    B i l a t e r a l

    a d r e n a l e c t o m y

    w a s

    p e r f o r m e d

    t h r o u g h

    t w o

    d o r s o l a t e r a l i n c i s i o n s w h i l e

    u n d e r

    p e n t o b a r b i t o n e a n a e s t h e s i a .

    E a c h a n i m a l w a s

    i n j e c t e d

    i n t r a p e r i t o n e a l l y

    w i t h

    0 5 m l

    b e m i g r i d e   N i c h o l a s ) t o

    h a s t e n

    r e c o v e r y f r o m a n a e s t h e s i a , a n d

    m a i n t a i n e d

    w i t h

    045

    N a C l

    i n

    t h e

    d r i n k i n g w a t e r . O n l y

    t h o s e a n i m a l s i n

    a l i v e l y h e a l t h y

    c o n d i t i o n

    w e r e

    u s e d 4

    d a y s l a t e r .

    I n c r e a s e d

    v a s c u l a r

    p e r m e a b i l i t y

    R a t s

    w e r e

    a n a e s t h e t i z e d

    w i t h m e t h o h e x i t o n e

    s o d i u m

      L i l l y ,

    4 0 m g / k g ) a n d t h e i r

    a b d o m e n s

    w e r e

    s h a v e d .

    T h e y w e r e

    t h e n i n j e c t e d

    i n t r a v e n o u s l y w i t h

    s o l u t i o n s o f

    3 9 3

  • 8/20/2019 Uji Antiinflamasi Dg Karagen

    3/11

    P e a r l C r u n k h o r n a n d S .

    C .

    R .

    M e a c o c k

    5 P o n t a m i n e S k y B l u e

    d y e

      G u r r , 0 - 2

    m l /

    1 0 0 g ) a n d m e p y r a m i n e o r

    m e t h y s e r g i d e .

    F i v e m i n u t e s

    l a t e r i n t r a d e r m a l i n j e c t i o n s

    w e r e made

    i n

    t h e a b d o m i n a l

    s k i n

    u s i n g

    s e r i a l d i l u t i o n s

    o f e i t h e r h i s t a m i n e   B r i t i s h D r u g H o u s e s ) ,

    5-HT

      S a n d o z ) , o r

    s y n -

    t h e t i c b r a d y k i n i n

    ( S a n d o z ) i n

    01

    m l o f

    T y r o d e s o l u t i o n , o r w i t h c o m p o u n d 4 8 / 8 0

    i n 0 9 9

    N a C l

    a d j u s t e d t o

    p H 7 - 3 . F o r t y - f i v e m i n u t e s l a t e r

    t h e

    a n i m a l s

    w e r e k i l l e d

    b y

    c e r v i c a l

    d i s l o c a t i o n .

    T h e

    i n f l a m m a t o r y

    r e s p o n s e

    w a s

    d e t e r m i n e d

    b y

    m e a s u r i n g

    t h e m e a n d i a m e t e r s

    o f

    t h e

    b l u e l e s i o n s o f

    t h e

    r e f l e c t e d

    s k i n a n d b y

    a s s e s s i n g t h e

    d y e i n t e n s i t y o n a n

    a r b i t r a r y 0 - 1 0 p o i n t

    s c a l e .

    R a t s p r e v i o u s l y

    t r e a t e d w i t h

    e l l a g i c

    a c i d w e r e

    n o t s u b j e c t e d

    t o

    s k i n

    r e a c t i o n s u n t i l

    3 0

    m i n

    a f t e r

    e l l a g i c

    a c i d t r e a t m e n t ,

    t o

    a l l o w

    b l o o d

    p r e s s u r e t o r e t u r n t o n o r m a l ( G a u t v i k  

    R u g s t a d ,

    1 9 6 7 ) .

    K i n i n o g e n

    c o n c e n t r a t i o n s

    K i n i n o g e n

    c o n c e n t r a t i o n s

    w e r e m e a s u r e d

    u s i n g

    d e n a t u r e d

    w h o l e

    b l o o d

    a s s u b -

    s t r a t e a c c o r d i n g t o

    t h e

    m e t h o d

    o f B r o c k l e h u r s t

      Z e i t l i n   1 9 6 7 ) ,

    w i t h t h e f o l l o w i n g

    s l i g h t m o d i f i c a t i o n s . T h e d e n a t u r e d

    s u b s t r a t e w a s h o m o g e n i z e d i n 0 - 0 2

    M s o d i u m

    p h o s p h a t e

    b u f f e r ,

    p H 7 - 3 5 .

    A l i q u o t s   1 m l )

    o f

    t h i s

    s u s p e n s i o n ,

    c o n t a i n i n g

    s u b s t r a t e

    f r o m

    0 - 3

    m l

    o f

    f r e s h b l o o d , w e r e i n c u b a t e d

    a t

    3 7 0

    C

    f o r 3 0 m i n w i t h e x c e s s

    c r y s t a l l i n e t r y p s i n T r y p t a r , A r m o u r ,

    1 - 3

    m g , a s

    p r e v i o u s l y

    d e t e r m i n e d

    f o r e a c h

    b a t c h

    o f e n z y m e )

    i n

    4 m l o f p h o s p h a t e b u f f e r .

    T h e

    r e l e a s e d k i n i n w a s

    m e a s u r e d o n

    t h e i s o l a t e d

    g u i n e a - p i g

    i l e u m

    b a t h e d i n o x y g e n a t e d T y r o d e

    s o l u t i o n a t

    3 7 0 C ,

    u s i n g

    s y n t h e t i c b r a d y k i n i n

    a s a s t a n d a r d .

    D i s p o s a b l e p o l y s t y r e n e s y r i n g e s a n d

    s i l i c o n i z e d

    n e e d l e s a n d

    g l a s s w a r e w e r e u s e d

    i n

    t h e

    c o l l e c t i o n

    o f

    a l l b l o o d s a m p l e s ,

    t h e e x t r a c -

    t i o n

    p r o c e s s ,

    a n d

    t h e

    a s s a y o f

    k i n i n .

    T o t a l

    h a e m o l y t i c

    c o m p l e m e n t

    d e t e r m i n a t i o n s

    S e r u m

    c o n c e n t r a t i o n s

    o f t o t a l h a e m o l y t i c c o m p l e m e n t

    w e r e

    m e a s u r e d

    b y

    t h e

    m e t h o d o f R o s e n b e r g

     

    T a c h i b a n a

      1 9 6 2 ) e x c e p t

    t h a t

    d o u b l e

    q u a n t i t i e s o f e a c h

    r e a g e n t

    w e r e

    u s e d a n d

    t h e

    d e g r e e

    o f

    e r y t h r o c y t e h a e m o l y s i s

    w a s

    d e t e r m i n e d

    f r o m

    t h e

    o p t i c a l d e n s i t y

    r e a d i n g

    o f

    t h e

    e r y t h r o c y t e

    s u p e r n a t a n t

    a t

    5 4 1

    m , u

    w i t h

    a

    U n i c a m S P 6 0 0

    s p e c t r o p h o t o m e t e r . C o m p l e m e n t

    t i t r e s

    w e r e

    e x p r e s s e d

    i n t e r m s

    o f

    C ' H 5 0

    u n i t s / m l , w h e r e

    o n e

    C ' H 5 0

    u n i t i s

    d e f i n e d a s

    t h e

    a m o u n t

    o f

    c o m p l e m e n t

    i n

    t h a t d i l u t i o n

    o f

    s e r u m w h i c h

    c a u s e d 50 l y s i s

    o f

    t h e s e n s i t i z e d

    e r y t h r o c y t e s .

    B l o o d

    s a m p l e s

    w e r e

    t a k e n

    f r o m t h e t a i l

    o r b y

    c a r d i a c

    p u n c t u r e .

    T h e

    s e r a

    w e r e

    h a r v e s t e d

    w i t h i n

    2

    h ,

    q u i c k - f r o z e n

    a n d

    s t o r e d

    a t - 2 6 °

    C

    u n t i l

    u s e d . S t a t i s t i c a l

    a n a l y s i s

    w a s

    b y

    S t u d e n t s

    t

    t e s t .

    R e s u l t s

    V a r i a t i o n i n a n i m a l

    r e s p o n s e

    t o

    t h e

    i n j e c t i o n

    o f c a r r a g e e n i n

    T h e

    t i m e c o u r s e

    o f

    o e d e m a

    f o r m a t i o n

    i n t h e

    p a w s

    o f t e n f e m a l e

    r a t s

    i s

    s h o w n

    i n

    F i g .

    1

    a n d

    i s

    t y p i c a l

    o f t h e v a r i a t i o n

    i n a n i m a l

    b e h a v i o u r

    s e e n

    t h r o u g h o u t

    t h i s

    i n v e s t i g a t i o n . E x p e r i m e n t s

    u s i n g

    m a l e

    a n i m a l s

      u n p u b l i s h e d

    o b s e r v a t i o n s ) ,

    a d r e n a l e c t o m i z e d

    f e m a l e a n i m a l s

    a n d

    a n i m a l s

    t r e a t e d

    w i t h

    a n t a g o n i s t s

    o f

    p o s s i b l e

    m e d i a t o r s p r o v i d e d

    d a t a

    w i t h

    s i m i l a r

    v a r i a t i o n s

    w i t h i n e a c h

    g r o u p ,

    a s d i d

    e x p e r i -

    m e n t s

    u s i n g

    a n y

    o n e

    t y p e

    o f

    a n i m a l

    o n

    t h e

    s a m e

    o r

    d i f f e r e n t

    d a y s .

    I n

    o r d e r

    t o

    i n c r e a s e

    t h e

    s i g n i f i c a n c e

    o f

    r e s u l t s , t h e r e f o r e ,

    l a r g e

    g r o u p s

    o f

    a n i m a l s

    o f

    t h e same

    s e x a n d

    s t r a i n

    h a d

    t o b e u s e d .

    3 9 4

  • 8/20/2019 Uji Antiinflamasi Dg Karagen

    4/11

    I n f l a m m a t o r y r e s p o n s e

    t o

    c a r r a g e e n i n

    E f f e c t

    o f e l l a g i c

    a c i d ,

    s a l i v a

    a n d m e t h y s e r g i d e

    R a t s

    w e r e t r e a t e d

    w i t h

    e l l a g i c

    a c i d ,

    s a l i v a o r

    m e t h y s e r g i d e

    a n d

    t h e

    t i m e

    c o u r s e

    o f

    f o r m a t i o n

    o f

    t h e o e d e m a c a u s e d

    b y c a r r a g e e n i n

    w a s

    f o l l o w e d .

    A l l t h r e e t r e a t -

    m e n t s s u p p r e s s e d o e d e m a b y 4 0 - 6 0 d u r i n g t h e

    f i r s t 5

    5

    h ,

    i n d i c a t i n g a

    s i g n i f i c a n t

    c o n t r i b u t i o n

    b y

    k i n i n s

    a n d

    5-HT

    t o

    o e d e m a

    f o r m a t i o n

    d u r i n g

    t h i s

    t i m e

    p e r i o d .

    T h e

    r e s u l t s w h i c h

    a r e

    i l l u s t r a t e d

    i n

    F i g .

    2

    a l s o i n d i c a t e

    t h a t

    m e t h y s e r g i d e

    o r

    s a l i v a

    w e r e

    m o r e e f f e c t i v e

    t h a n

    e l l a g i c a c i d . T r e a t m e n t

    w i t h

    e l l a g i c a c i d a n d s a l i v a t o g e t h e r

    w a s

    m o r e e f f e c t i v e i n t h e f i r s t

    3

    h

    t h a n t r e a t m e n t

    w i t h

    e a c h s e p a r a t e l y ( P < 0

    0 1

    a t

    2 - 5

    h ) .

    I n F i g .

    3

    i t c a n b e s e e n t h a t e l l a g i c a c i d a n d m e t h y s e r g i d e

    s u p p r e s s e d

    c a r r a g e e n i n

    o e d e m a

    i n a d r e n a l e c t o m i z e d a n i m a l s a n d

    t h e r e f o r e d i d n o t a c t

    i n d i r e c t l y

    b y a d r e n a l

    s t i m u l a t i o n .

    T h e t i m e

    c o u r s e

    o f

    o e d e m a f o r m a t i o n

    i n

    a n i m a l s t r e a t e d w i t h e l l a g i c

    a c i d ,

    m e p y r a m i n e

    a n d

    m e t h y s e r g i d e

    i n

    v a r i o u s c o m b i n a t i o n s i s

    g i v e n i n

    T a b l e

    1 . A n i m a l s

    p r e v i o u s l y a n a e s t h e t i z e d

    w i t h

    p e n t o b a r b i t o n e

    w e r e u s e d

    i n

    t h e s e

    e x p e r i m e n t s .

    T r e a t m e n t

    w i t h

    e l l a g i c

    a c i d

    o r

    m e t h y s e r g i d e

    a l o n e

    p r o d u c e d

    a

    s i g n i f i c a n t

    d e p r e s -

    s i o n i n o e d e m a

    f o r m a t i o n

    ( 4 5 ; P

  • 8/20/2019 Uji Antiinflamasi Dg Karagen

    5/11

    P e a r l C r u n k h o r n a n d S .

    C .

    R .

    M e a c o c k

    a p p e a r e d t o

    b e

    m o r e e f f e c t i v e

    t h a n

    e i t h e r c o m p o u n d

    a l o n e

    b u t t h e i n c r e a s e d

    s u p -

    p r e s s i o n

    w a s s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t

    o n l y a f t e r 2 5 h

    ( P < 0

    0 5 ) .

    M e p y r a m i n e w a s

    i n e f f e c t i v e

    a l o n e . H o w e v e r , w h e n

    c o m b i n e d

    w i t h

    e l l a g i c a c i d t r e a t m e n t ( b u t

    n o t

    w i t h m e t h y s e r g i d e )

    o r

    w i t h b o t h e l l a g i c

    a c i d a n d m e t h y s e r g i d e

    a s i g n i f i c a n t

    c o n t r i -

    b u t i o n

    t o t h e s u p p r e s s i o n

    o f o e d e m a f o r m a t i o n

    w a s o b s e r v e d

    d u r i n g

    t h e

    f i r s t

    3

    5

    h o u r s .

    S p e c i f i c i t y

    o f

    t r e a t m e n t w i t h e l l a g i c a c i d ,

    m e t h y s e r g i d e a n d m e p y r a m i n e

    T h e

    r e s u l t s

    i n T a b l e

    2 i n d i c a t e t h a t e l l a g i c

    a c i d d i d n o t

    a f f e c t

    t h e

    s i z e o f t h e

    s k i n

    l e s i o n s

    c a u s e d

    b y i n t r a d e r m a l

    i n j e c t i o n o f

    5 - H T ,

    h i s t a m i n e

    o r

    b r a d y k i n i n n o r

    d i d

    i t i n h i b i t

    t h e r e l e a s e o f

    i n f l a m m a t o r y

    m e d i a t o r s f r o m

    m a s t c e l l s b y c o m p o u n d 4 8 / 8 0 .

    I t

    f o l l o w e d ,

    t h e r e f o r e , t - h a t t h e t r e a t m e n t

    w i t h e l l a g i c a c i d h a d n o t i t s e l f

    c a u s e d

    d e g r a n u l a t i o n o f

    m a s t c e l l s .

    T h e

    r e s u l t s

    i n T a b l e

    3

    s h o w

    t h a t

    m e t h y s e r g i d e

    a t t h e

    d o s e a b l e

    t o

    s u p p r e s s c a r r a g e e n i n

    o e d e m a d i d n o t

    a n t a g o n i z e t h e

    i n c r e a s e i n

    v a s c u l a r

    p e r m e a b i l i t y

    c a u s e d

    b y

    b r a d y k i n i n

    o r h i s t a m i n e

    b u t c o m p l e t e l y s u p p r e s s e d

    t h a t

    d u e t o

    5 - H T . F u r t h e r

    e x p e r i m e n t s w i t h 5-HT

    e s t a b l i s h e d

    t h a t

    t h e a n t a g o n i s t

    a c t i v i t y o f

    m e t h y s e r g i d e h a d b e g u n

    t o d e c r e a s e a f t e r 3 h a n d

    c o n s e q u e n t l y 2

    h

    m a i n t e n a n c e d o s e s o f

    m e t h y s e r g i d e w e r e g i v e n i n a l l e x p e r i m e n t s

    r e p o r t e d

    i n

    t h i s

    s t u d y .

    I S O

    1 3 0

    A

      V

    I

    E

    0

    90

    i-70

    u

    C

    5 0

    3 0

    1 0

    T i m e

      h )

    F I G .

    2 . O e d e m a

    f o r m a t i o n

    i n d u c e d

    b y

    c a r r a g e e n i n

    i n r a t s : A , u n t r e a t e d

      t w e n t y ) ;

    B , t r e a t e d

    w i t h

    e l l a g i c

    a c i d

      n i n e t e e n ) ;

    C ,

    w i t h

    m e t h y s e r g i d e

      n i n e t e e n ) ;

    D , w i t h

    s a l i v a

      s i x t e e n ) ;

    E ,

    w i t h

    e l l a g i c

    a c i d

    a n d

    s a l i v a

      t w e l v e ) .

    V e r t i c a l

    b a r s s h o w

    + S . E .

    3 9 6

  • 8/20/2019 Uji Antiinflamasi Dg Karagen

    6/11

    I n f l a m m a t o r y r e s p o n s e t o

    c a r r a g e e n i n 3

    B e c k e r ,

    M o t a

     

    Wong

      1 9 6 8 )

    h a v e

    r e p o r t e d

    t h a t

    m e p y r a m i n e g i v e n

    i n t r a v e n o u s l y

    a t a c o n c e n t r a t i o n o f

    e i t h e r

    5 o r 05

    m g / k g

    p a r t i a l l y s u p p r e s s e s

    t h e c u t a n e o u s

    p e r m e a b i l i t y c h a n g e s

    i n d u c e d

    b y

    b r a d y k i n i n .

    T h e r e s u l t s

    i n

    T a b l e

    4

    s h o w

    t h a t

    w e

    f o u n d t h i s

    e f f e c t

    t o

    b e

    m a r g i n a l

    o r

    a b s e n t ,

    a n d

    i t w a s t h u s

    u n l i k e l y

    t h a t

    m e p y r a m i n e

    h a d

    a n t a g o n i z e d

    k i n i n s

    r e l e a s e d

    i n

    t h e

    c a r r a g e e n i n

    r e a c t i o n .

    F u r t h e r

    e x p e r i m e n t s

    e s t a b l i s h e d t h a t

    a

    s i n g l e

    i n t r a v e n o u s

    i n j e c t i o n

    o f 2 - 5

    m g / k g

    m e p y r a m i n e

    s u p p r e s s e d

    t h e

    i n f l a m m a t o r y

    a c t i v i t y

    o f h i s t a m i n e f o r a t l e a s t

    6

    h o u r s .

    1 6 0

    1 4 0

    1 2 0

    E

      2

    0

    >

    1 0 0

    6 6

    ° 6

    L .

    C

    4

    U- -

    O .

    0

    4 0

    2 0

    T i m e

      h )

    F I G .

    3 . Oedema f o r m a t i o n ( ±

    S . E . )

    i n d u c e d

    b y

    c a r r a g e e n i n

    i n

    a d r e n a l e c t o m i z e d

    r a t s :

    A ,

    u n -

    t r e a t e d

      f o u r t e e n ) ; B ,

    t r e a t e d w i t h

    e l l a g i c

    a c i d

      t w e n t y ) ;

    C ,

    w i t h

    m e t h y s e r g i d e

      t w e n t y ) .

    T A B L E

    1 .

    E f f e c t

    o f

    e l l a g i c

    a c i d

      A ) , m e p y r a m i n e

      B )

    a n d

    m e t h y s e r g i d e

      C ) ,

    a l o n e a n d

    i n

    c o m b i n a t i o n ,

    o n

    t h e

    i n f l a m m a t o r y r e s p o n s e

    o f

    c a r r a g e e n i n

    i n

    p a w s

    o f

    a n a e s t h e t i z e d r a t s

    N o .

    o f

    T r e a t m e n t r a t s

    A

    B

     

    A+B

    A+C

    B C

    A+B+C

    2 9

    2 6

    1 9

    1 9

    2 0

    1 5

    2 0

    1 6

    1 - 0 h

    9 3 - 9 ± 5 * 4

    5 5

    5 ± 5 - 3

    9 3 - 8 ± 5

    2

    5 0

    2 ± 3 - 3

    4 7 - 3

    ± 4 - 2

    4 4 - 8

    ± 4 - 3

    5 6 - 1 ±

    3 - 2

    3 3 - 7 ± 3 - 0

    A v e r a g e

      i n c r e a s e

    i n v o l u m e

      ± S . E . )

    a t

    2 - 5 h

    3

    5

    h

    45

    h

    1 0 5

    6 ± 4 - 9

    539±4-2

    1 0 7 - 2 ± 5 - 5

    6 2 - 5 ± 3 - 6

    4 2 - 4 ± 3 - 1

    4 9 - 1 ± 5

    8

    6 2 - 7 ± 2 - 9

    4 6 - 0 ± 4 - 2

    1 1 2 - 8 ± 5 - 0

    6 4 - 9 ± 4 - 3

    1 1 0 - 2 ± 5 - 0

    7 4

    5 ± + 3

    5

    5 1 - 5 ± 3 - 7

    5 2 1

    ± 6 - 4

    7 4 * 2 ± 4 - 0

    4 8 9 ± 3

    5

    1 1 8 - 8 ± 4 * 4

    7 6 - 3 ± 4 t 5

    1 1 1 - 0 + 4 - 6

    6 9 - 6 ± 2 t 9

    6 3 - 6 + 4 - 3

    6 0 - 0 ± : 6 - 0

    7 4 - 7 ± 5 * 7

    5 1 - 9 ± 4 - 2

    5 . 5

    h

    1 2 0 - 7 ± 4 - 5

    8 0 - 9 ± 3 - 8

    1 0 8 - 1

    ± 5 2

    7 0 A 4 ± 3 - 9

    7 5 - 1 ± 4

    0

    5 4 5 ± 5 6

    7 3 - 6 ± 4 - 1

    5 4 - 2 ± 5

    2

    3 9 7

    wV

  • 8/20/2019 Uji Antiinflamasi Dg Karagen

    7/11

    3 9 8

    P e a r l C r u n k h o r n

    a n d

    S .

    C .

    R .

    M e a o o c k

    T A B L E

    2 .

    E f f e c t

    o f e l l a g i c a c i d

    t r e a t m e n t

    o n t h e i n c r e a s e i n

    v a s c u l a r p e r m e a b i l i t y

    c a u s e d b y h i s t a m i n e ,

    5 - H T ,

    c o m p o u n d 4 8 / 8 0

    a n d

    b r a d y k i n i n

    i n

    r a t s k i n

    Mean

    d i a m e t e r o f l e s i o n s

    ( m m ± s . E . )

    a n d

    d y e i n t e n s i t y *

    I n f l a m m a t o r y a g e n t

      j u g

    f r e e

    b a s e )

    W i t h o u t t r e a t m e n t

    A f t e r t r e a t m e n t

    5 - H T

    0 - 2 1 6 - 0 + 1 * 3   9 ) 1 7 - 6 ± 0 - 7

      8 )

    0 . 1

    1 4

    0± 0 5

      8 )

    1 4 - 8 ± 0 - 2

      6 )

    0 - 0 5

    1 2 - 8 ± 0 - 5

      7 )

    1 3 - 6 ± 0 - 6

      6 )

    0 0 2 5 1 1 - 0 ± 0 - 5   6 ) 9 - 8 ± 0 - 7

      5 )

    H i s t a m i n e

    2 - 0 1 3 A 4 ± 0

    5   8 )

    1 4 - 4 A 0 - 7   8 )

    1 - 0

    1 1 - 4 ± 0 - 5   7 )

    1 1 - 4 ± 0 - 3

      7 )

    05

    9 - 2 + 0 - 3   6 )

    9 - 2 ± 0 - 6

      6 )

    0

    2 5

    8 - 2 ± 0 - 3

      4 )

    8 - 0 ± 0 - 3

      4 )

    C o m p o u n d 4 8 / 8 0

    0 . 1

    1 6 - 0 ± 0 - 3

      8 )

    1 6 - 0 ± 0 - 8

      8 )

    0 - 0 2 5

    1 4 - 5 ± 0 - 2

      6 ) 1 3 - 0 ± 1 - 0

      6 )

    0

    0 0 6 1 3 - 2 ± 0 - 3

      5 )

    1 0 - 8 ± 1 0

      5 )

    B r a d y k i n i n

    2 - 0

    1 4 - 6 ± 0 - 2

      8 )

    1 5 - 0 ± 0 - 0

      8 )

    1 . 0 1 3 - 6 ± 0 - 2   6 )

    1 3 - 2 ± 0 . 3   6 )

    0 - 5

    1 2 - 0 ± 0 - 5

      4 ) 1 2 - 8 ± 0 t 5

      5 )

    0 2 5

    1 0 - 8 ± 0 - 3

      4 )

    1 1 - 2 ± 0 - 3

      4 )

    *

    I n t e n s i t y

      i n

    p a r e n t h e s e s )

    i s e x p r e s s e d

    i n

    a r b i t r a r y

    u n i t s

    o n a 0 - 1 0 s c a l e .

    T A B L E 3 .

    E f f e c t

    o f

    m e t h y s e r g i d e

    b i m a l e a t e

    o n

    t h e i n c r e a s e

    i n

    v a s c u l a r p e r m e a b i l i t y

    c a u s e d b y

    b r a d y -

    k i n i n ,

    h i s t a m i n e a n d 5 - H T

    i n r a t

    s k i n

    Mean

    d i a m e t e r o f

    l e s i o n s

    ( m m ± S . E . )

    a n d d y e

    i n t e n s i t y *

    I n f l a m m a t o r y

    a g e n t

    W i t h o u t

    A f t e r

    m e t h y s e r g i d e

    A f t e r

    m e t h y s e r g i d e

      j g )

    t r e a t m e n t

      2 - 5

    m g / k g )

      5 - 0

    m g / k g )

    B r a d y k i n i n

    2 - 0

    1 5 0± 0

    3 8 )

    1 3 - 8 + 0 i 3   8 )

    1 4 - 2 ± 0 - 5

      8 )

    1 - 0

    1 2 - 6 ± 0 - 3

      7 )

    1 3 - 3 ± 0 - 5   7 )

    1 2

    2 ± 0 0 7

      7 )

    0

    5

    1 1 - 8 + 0 - 2

      6 )

    1 2

    3 ±0 3   6 ) 1 1 - 4 ± 0 - 5

      7 )

    0 2 5 1 0 - 8 + 0 - 3

      5 )

    1 0 5 +0 3

      6 )

    1 0 - 2 + 0 - 3

      5 )

    H i s t a m i n e

    2 - 0

    1 3 - 0 ± 0 3

      8 )

    1 2

    2±0

    7

      8 )

    1 2 - 4 ± 0 - 8

      7 )

    1 . 0

    1 1 - 6 ± 0 - 3

      7 )

    1 1 - 6 ± 0 - 5

      6 )

    1 0 - 8 + 0 - 5   7 )

    0 - 5

    1 0 - 2 ± 0 - 5

      6 ) 1 0 - 8 ± 0 - 8

      5 )

    7 T 4 ± 0 - 2   5 )

    0 2 5

    6 - 8 ± 0 - 5

      4 ) 7 - 8 ± 0 - 2   3

    6 - 4 ± 0 - 6   4 )

    5 - H T

    0 - 2 1 8 - 4 ± 0 - 2   8 )

    0 0

      0 )

    0 . 0

      0 )

    *

    I n t e n s i t y

      i n

    p a r e n t h e s e s )

    i s

    e x p r e s s e d

    i n a r b i t r a r y u n i t s

    o n

    a

    0 - 1 0

    s c a l e .

    T A B L E 4 .

    E f f e c t

    o f m e p y r a m i n e

    m a l e a t e

      2 - 5

    m g / k g ;

    i . v .

    o n t h e

    i n c r e a s e

    i n

    v a s c u l a r p e r m e a b i l i t y

    c a u s e d

    b y

    b r a d y k i n i n

    a n d h i s t a m i n e

    i n

    r a t

    s k i n

    Mean

    d i a m e t e r o f l e s i o n s

    ( m m ± s . E . )

    a n d

    d y e

    i n t e n s i t y *

    I n f l a m m a t o r y

    a g e n t

      , g )

    W i t h o u t t r e a t m e n t

    A f t e r m e p y r a m i n e

    B r a d y k i n i n

    2

    0 1 4 6 ± 0 t 2   8 )

    1 3 - 8 + 0 - 3

      8 )

    1 0

    1 3 - 6 ± 0 - 2

      6

    1 2 - 5 ± 0 - 3

      6 )

    0 - 5

    1 2 - 0 ± 0 - 5

      4 )

    1 1 - 5 ± 0 - 3

      5 )

    0 - 2 5

    1 0 - 8 ± 0 - 3

      4 )

    9 - 8 ± 0 - 5

      4 )

    H i s t a m i n e

    2 - 0

    1 3 - 0 ± 0 - 3

      8 )

    00

      0 )

    *

    I n t e n s i t y

      i n

    p a r e n t h e s e s )

    i s e x p r e s s e d

    i n

    a r b i t r a r y

    u n i t s o n

    a

    0 - 1 0

    s c a l e .

  • 8/20/2019 Uji Antiinflamasi Dg Karagen

    8/11

    I n f l a m m a t o r y r e s p o n s e t o

    c a r r a g e e n i n

    K i n i n o g e n

    c o n c e n t r a t i o n s

    K i n i n o g e n

    c o n c e n t r a t i o n s

    o f

    b l o o d

    w e r e

    m e a s u r e d e i t h e r

    0

    5

    h

    o r 2 5 h a f t e r

    t h e

    f i n a l

    i n j e c t i o n o f e l l a g i c

    a c i d

    a n d / o r r a t

    s a l i v a .

    From t h e r e s u l t s

    g i v e n

    i n

    T a b l e

    5

    i t w a s c o n c l u d e d

    t h a t   a ) b o t h e l l a g i c

    a c i d

      3

    x

    0

    5

    m l ,

    0 - 2

    mM)

    a n d

    s a l i v a

      3

    x

    0 5

    m l ) c a u s e d a

    p a r t i a l

    d e p l e t i o n

    o f

    k i n i n o g e n

    c o n c e n t r a t i o n s ,

      b ) t h e r e

    w a s n o

    s i g -

    n i f i c a n t

    d i f f e r e n c e b e t w e e n

    t h e e f f e c t s o f e i t h e r

    t r e a t m e n t ,   c t h e

    e f f e c t s

    o f e a c h w e r e

    n o t a d d i t i v e

    a n d d i d n o t l e a d t o a t o t a l

    d e p l e t i o n

    o f b l o o d

    k i n i n o g e n

    a n d   d )

    k i n i n o g e n c o n c e n t r a t i o n s h a d

    n o t b e g u n

    t o

    r e c o v e r

    2 - 5 h

    l a t e r . I n j e c t i o n

    o f

    t w i c e

    t h e

    q u a n t i t y

    o f

    e l l a g i c

    a c i d

    i n t o

    t w o a n i m a l s

    h a d n o a d d i t i o n a l e f f e c t o n

    k i n i n o g e n

    c o n c e n t r a t i o n s

    3 0

    m i n l a t e r .

    C o m p l e m e n t

    c o n c e n t r a t i o n s

    T h e e f f e c t s o n

    t o t a l

    h a e m o l y t i c c o m p l e m e n t c o n c e n t r a t i o n s

    o f

    i n t r a v e n o u s

    i n j e c -

    t i o n s

    o f

    e i t h e r

    e l l a g i c

    a c i d

    o r

    s a l i v a ,

    o r

    o f s u b c u t a n e o u s

    i n j e c t i o n s

    i n t o

    t h e

    r a t

    paw

    o f

    1

    c a r r a g e e n i n

      0

    1

    m l )

    a r e

    i l l u s t r a t e d

    i n

    F i g .

    4 .

    E l l a g i c

    a c i d

    t r e a t m e n t

    c a u s e d

    a

    t e m p o r a r y

    i n c r e a s e

    i n

    c o m p l e m e n t

    c o n c e n t r a t i o n s w h i c h

    w a s

    s i g n i f i c a n t a t

    3 0

    m i n u t e s .

    O n

    t h e

    o t h e r

    h a n d ,

    s a l i v a c a u s e d

    a

    20

    d e c r e a s e i n

    c o m p l e m e n t c o n -

    c e n t r a t i o n s

    w h i c h

    h a d

    o n l y

    r e c o v e r e d

    b y 5

    a t

    2 - 5

    h o u r s .

    L o c a l

    a c t i v a t i o n o f

    c o m p l e m e n t

    i n

    t h e

    r a t

    p a w

    b y

    c a r r a g e e n i n ,

    i f

    i t

    o c c u r r e d ,

    d i d n o t

    l e a d t o

    a d e c r e a s e

    i n

    s e r u m

    c o m p l e m e n t

    c o n c e n t r a t i o n s .

    I n

    f a c t

    a

    t e m p o r a r y

    i n c r e a s e

    w a s

    o b s e r v e d

    T A B L E

    5 .

    R e s i d u a l

    k i n i n o g e n

    c o n c e n t r a t i o n s

    o f

    r a t

    p l a s m a a f t e r i n j e c t i o n

    o f e l l a g i c

    a c i d a n d / o r

    r a t

    s a l i v a

    T i m e o f

    P l a s m a

    k i n i n o g e n

    l e v e l s

    T r e a t m e n t

    s a m p l i n g

      h )

    N o . o f

    r a t s

    ( B k

    u n i t s / m l + s . E . )

    No t r e a t m e n t

    0

    1 0

    3 - 5 1 ±

    0 - 2 3

    E l l a g i c

    a c i d

    0

    5 5

    1 - 0 5 O 0 - 0 5

    E l l a g i c

    a c i d

    2

    5

    5

    1 - 2 0 ± + 0 0 8

    S a l i v a

    0

    5

    7

    1 - 3 5 ± 0 - 1 2

    S a l i v a

    2 5

    7

    1 - 3 7 ± 0 - 2 4

    E l l a g i c a c i d , s a l i v a

    0 5

    7

    1 - 2 3 ± 0 - 2 7

    E l l a g i c

    a c i d ,

    s a l i v a

    2

    5 4

    1 - 1 3 ± 0 - 3 5

    3 4 0 _

    l

    2 6 0

    1 4 0

     

    0

     

    2

    3

    4

    5

    6

    T i m e

      h )

    F I G .

    4 .

    C o n c e n t r a t i o n s

    o f serum

    c o m p l e m e n t

    a f t e r

    s u b c u t a n e o u s

    i n j e c t i o n

    i n t o

    t h e

    p a w

    o f

    c a r r a g e e n i n

    ( - ) ,

    i n t r a v e n o u s

    i n j e c t i o n

    o f

    e l l a g i c

    a c i d

    - - - )

    a n d i n t r a v e n o u s

    i n j e c t i o n o f

    r a t s a l i v a

    (

    3 9 9

  • 8/20/2019 Uji Antiinflamasi Dg Karagen

    9/11

    P e a r l

    C r u n k h o r n a n d S .

    C .

    R .

    M e a c o c k

    w h i c h

    w a s s i g n i f i c a n t

    a t

    2

    h ; v a l u e s a t

    4 h a n d 6 h w e r e

    n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t

    f r o m c o n c e n t r a t i o n s

    b e f o r e c a r r a g e e n i n

    i n j e c t i o n .

    D i s c u s s i o n

    G a u t v i k

     

    R u g s t a d

      1 9 6 7 )

    f o u n d

    t h a t

    i n t r a v e n o u s

    i n j e c t i o n

    o f

    e l l a g i c

    a c i d

    i n r a t s

    l e d t o

    t h e e l i m i n a t i o n

    o f

    k i n i n o g e n

    s u b s t r a t e

    1   J a c o b s e n ,

    1 9 6 6 ) f r o m

    t h e

    c i r c u l a t i o n

    f o r a t

    l e a s t 6 h o u r s .

    T h e y r e p o r t e d

    t h a t b l o o d p r e s s u r e

    r e t u r n e d t o

    n o r m a l w i t h i n

    1 0 m i n

    a n d t h a t

    e l l a g i c

    a c i d

    i t s e l f c o u l d

    n o l o n g e r b e

    d e t e c t e d

    i n t h e

    c i r c u l a t i o n

    a f t e r

    1 5

    m i n u t e s .

    T r e a t m e n t w i t h

    e l l a g i c a c i d

    w a s

    t h e r e f o r e

    e x p e c t e d

    t o

    p r o v i d e a

    p e r i o d

    o f

    a l m o s t 6

    h i n

    w h i c h t o a s s e s s t h e c o n t r i b u t i o n

    o f

    k i n i n s

    t o t h e

    i n f l a m -

    m a t o r y

    r e a c t i o n c a u s e d

    b y a n i n j e c t i o n

    o f c a r r a g e e n i n . F u r t h e r m o r e ,

    t h i s

    p e r i o d

    o f

    k i n i n o g e n

    d e p l e t i o n

    c o v e r e d

    t h e d u r a t i o n

    o f t h e

    t e s t s

    m o s t w i d e l y

    u s e d t o

    a s s e s s

    t h e

    a c t i v i t y o f p o t e n t i a l

    a n t i - i n f l a m m a t o r y

    d r u g s .

    Oedema f o r m a t i o n

    i n

    r a t s

    d e p l e t e d

    o f

    k i n i n o g e n

    b y

    e l l a g i c a c i d ,

    a n d

    a l s o

    b y

    r a t

    s a l i v a ,

    w a s c o n s i d e r a b l y

    l e s s t h a n

    t h a t f o u n d i n

    u n t r e a t e d r a t s

      F i g .

    2 .

    T h e s e

    r e s u l t s

    s u p p o r t

    t h e c o n c l u s i o n s

    o f D i R o s a

      S o r r e n t i n o

    ( 1 9 6 8 ;

    1 9 7 0 ) t h a t k i n i n s

    r e l e a s e d d u r i n g

    t h e

    i n f l a m m a t o r y

    r e a c t i o n h a d

    a n i m p o r t a n t

    r o l e i n o e d e m a f o r m a -

    t i o n .

    T h e

    l a r g e r

    e f f e c t

    o f

    s a l i v a

    w a s

    a t

    f i r s t

    a t t r i b u t e d t o g l a n d u l a r

    k a l l i k r e i n

    w h i c h

    w o u l d

    a t t a c k

    k i n i n o g e n

    s u b s t r a t e

    2 ,

    s i n c e

    G a u t v i k  

    R u g s t a d   1 9 6 7 )

    s t a t e t h a t t h i s

    s u b s t r a t e i s

    n o t a f f e c t e d b y

    e l l a g i c

    a c i d

    t r e a t m e n t . H o w e v e r ,

    m e a s u r e m e n t

    o f

    p l a s m a

    k i n i n o g e n c o n c e n t r a t i o n s

    a f t e r

    t r e a t m e n t i n v i v o

    w i t h

    e l l a g i c

    a c i d

    o r s a l i v a ( T a b l e

    5 )

    s h o w e d

    t h a t e i t h e r

    o f

    t h e s e

    r e a g e n t s

    d e p l e t e d

    t h e

    k i n i n o g e n b y

    a n

    a m o u n t

    e q u i v a l e n t

    t o m o r e t h a n

    1 0

    t i m e s

    t h e

    q u a n t i t y

    o f

    s u b s t r a t e

    1

      2 0 0

    n g b r a d y k i n i n

    e q . / m l

    p l a s m a )

    m e a s u r e d

    b y

    G a u t v i k a n d

    R u g s t a d .

    T h e s e

    r e s u l t s

    c l e a r l y

    i n d i c a t e

    t h a t

    t r e a t m e n t

    i n v i v o

    w i t h e l l a g i c

    a c i d

    c a u s e s

    a

    l o s s

    o f

    m o r e

    t h a n

    s u b s t r a t e

    1 .

    P r o b a b l y

    t h e c o n c e n t r a t i o n s

    o f

    s u b s t r a t e

    2

    w e r e

    a l s o d i m i n i s h e d

    s i n c e

    t h e

    e f f e c t s

    o f

    e l l a g i c

    a c i d a n d

    s a l i v a

    w e r e

    n o t

    a d d i t i v e ,

    a c o n c l u s i o n w h i c h

    i s

    c o n t r a r y

    t o

    t h a t

    o f

    G a u t v i k a n d R u g s t a d .

    I t i s

    i n t e r e s t i n g

    t h a t a f t e r

    a l l

    o f

    t h e s e

    t r e a t m e n t s

    a c o n -

    s i d e r a b l e

    a m o u n t

    o f

    k i n i n o g e n r e m a i n e d ,

    w h i c h w a s

    p r e s u m a b l y

    n e i t h e r s u b s t r a t e

    1

    n o r 2 .

    I n

    o t h e r

    s t u d i e s

    ( M a r s d e n ,

    C r u n k h o r n

     

    M e a c o c k , u n p u b l i s h e d r e s u l t s )

    i t h a s

    b e e n

    s h o w n

    t h a t

    m a l e o p i m a r i c

    a c i d ,

    a n

    i n h i b i t o r o f

    c o m p l e m e n t

    a c t i v a t i o n

      G l o v s k y ,

    B e c k e r

     

    H a l b r o o k ,

    1 9 6 8 ) ,

    c a n

    s u p p r e s s

    t h e

    c a r r a g e e n i n

    r e a c t i o n .

    C a r r a g e e n i n

    a c t i v a t e s

    t h e

    c o m p l e m e n t

    s y s t e m

      D a v i e s ,

    1 9 6 5

     

    B o r s o s ,

    R a p p

     

    C r i s l e r ,

    1 9 6 5 ;

    W i l l o u g h b y ,

    C o o t e  

    T u r k , 1 9 6 9 )

    a n d

    t h e r e f o r e

    a

    r e d u c t i o n

    o f

    c o m p l e m e n t

    c o n -

    c e n t r a t i o n s

    b y

    e l l a g i c

    a c i d o r

    s a l i v a ,

    i f

    i t

    o c c u r r e d ,

    m i g h t

    b e

    e x p e c t e d

    t o

    h a v e

    a n

    a n t i - i n f l a m m a t o r y

    e f f e c t .

    M e a s u r e m e n t s

    o f

    s e r u m

    c o n c e n t r a t i o n s

    o f

    c o m p l e m e n t

      F i g .

    4 )

    d i d

    n o t

    i n d i c a t e

    c o m p l e m e n t

    a c t i v a t i o n b y

    t h e

    s u b c u t a n e o u s

    i n j e c t i o n

    o f

    c a r r a g e e n i n ,

    b u t

    t h i s

    c a n n o t

    b e t a k e n

    a s

    e v i d e n c e

    t h a t

    c o m p l e m e n t

    a c t i v a t i o n

    d i d

    n o t

    o c c u r

    l o c a l l y

    a t

    t h e s i t e

    o f

    i n f l a m m a t i o n .

    E l l a g i c

    a c i d

    a p p e a r e d

    t o c a u s e

    a

    t e m p o r a r y

    i n c r e a s e

    i n

    c o m p l e m e n t

    c o n c e n t r a t i o n s

    a n d

    t h e r e f o r e

    i t s

    a n t i - i n f l a m m a t o r y

    a c t i v i t y

    c o u l d

    n o t b e

    a t t r i b u t e d

    t o t h e s e e f f e c t s .

    R a t s a l i v a l o w e r e d

    c o m p l e m e n t

    c o n c e n t r a t i o n s

    b y

    a p p r o x i m a t e l y

    2 0

    a n d

    t h i s d i f f e r e n c e

    i n b e h a v i o u r

    o f

    e l l a g i c

    a c i d

    a n d

    s a l i v a

    may

    h a v e

    c o n t r i b u t e d

    t o

    t h e i r

    d i f f e r i n g

    a n t i - i n f l a m m a t o r y

    a c t i v i t y .

    I t

    s t i l l

    r e m a i n s

    t o b e

    e x p l a i n e d

    how t r e a t m e n t

    w i t h

    b o t h

    e l l a g i c

    a c i d

    a n d

    s a l i v a

    w a s

    m o r e e f f e c t i v e

    i n

    t h e

    f i r s t

    3 h

    t h a n

    t r e a t m e n t

    w i t h s a l i v a a l o n e .

    T h e

    a n i m a l s

    r e m a i n e d

    e q u a l l y

    a l e r t

    a n d

    a p p a r e n t l y

    n o r m a l

    a f t e r

    a l l o f t h e

    t r e a t m e n t s ,

    b u t i t

    i s

    4 0 0

  • 8/20/2019 Uji Antiinflamasi Dg Karagen

    10/11

    I n f l a m m a t o r y

    r e s p o n s e t o

    c a r r a g e e n i n

    4 0 1

    p o s s i b l e t h a t

    d u e

    t o

    e f f e c t s

    o t h e r

    t h a n t h o s e

    o n t h e k i n i n

    s y s t e m ,

    t h e c o m b i n e d

    s u b s t a n c e s

    p r o d u c e d a

    g r e a t e r

    c a r d i o v a s c u l a r

    r e s p o n s e

    t h a n

    e i t h e r

    g i v e n

    s i n g l y .

    M e t h y s e r g i d e h a d m a r k e d

    a n t i - i n f l a m m a t o r y

    a c t i v i t y

      F i g .

    2

    a n d

    T a b l e

    1 ,

    f r o m

    w h i c h

    i t w a s c o n c l u d e d

    t h a t

    5-HT

    c o n t r i b u t e d

    s u b s t a n t i a l l y

    t o o e d e m a

    f o r m a t i o n

    i n

    t h e

    f i r s t

    f e w

    h o u r s .

    T h e s e

    f i n d i n g s

    a r e

    c o n t r a r y

    t o

    t h o s e

    r e p o r t e d

    b y

    W i n t e r

      1 9 6 5 ) who

    u s e d

    c y p r o h e p t a d i n e

    a n d

    m e t h d i l a z i n e ,

    b o t h

    o f w h i c h

    a n t a g o n i z e

    5 - H T ,

    b u t

    a r e

    i n a g r e e m e n t

    w i t h

    t h e r e s u l t s

    o f

    F e k e t e

     

    K u r t i

      1 9 7 0 )

    who u s e d

    m e t h y -

    s e r g i d e ,

    a n d t h e

    r e s u l t s o f

    B h a l l a

     

    T a n g r i   1 9 7 0 )

    who

    u s e d

    b r o m o l y s e r g i c

    a c i d .

    E x p e r i m e n t s

    i n

    a d r e n a l e c t o m i z e d

    a n i m a l s   F i g .

    3 )

    s h o w e d

    t h a t

    t h e

    a n t i - i n f l a m m a t o r y

    a c t i v i t y

    o f

    e l l a g i c

    a c i d

    a n d

    m e t h y s e r g i d e c a n n o t

    b e

    a t t r i b u t e d t o

    a d r e n a l

    s t i m u l a t i o n .

    M e p y r a m i n e

    a l o n e h a d

    n o e f f e c t

    o n

    o e d e m a f o r m a t i o n

      T a b l e 1 , b u t i n

    c o m -

    b i n a t i o n

    w i t h

    e l l a g i c a c i d

    t r e a t m e n t ,

    w i t h o r w i t h o u t

    m e t h y s e r g i d e ,

    i t

    r e v e a l e d

    t h a t

    h i s t a m i n e p l a y e d a

    m i n o r

    r o l e i n

    o e d e m a f o r m a t i o n

    d u r i n g

    t h e f i r s t

    3

    h o u r s .

    I t

    w a s

    i m p o r t a n t t o

    e s t a b l i s h t h e

    d e g r e e

    o f

    s p e c i f i c

    a c t i v i t y

    o f t h e

    v a r i o u s

    t r e a t -

    m e n t s

    g i v e n

    t o

    t h e

    r a t s

    b e f o r e

    t h e

    i n d u c t i o n

    o f

    c a r r a g e e n i n

    i n f l a m m a t i o n .

    V a s c u l a r

    p e r m e a b i l i t y

    s t u d i e s

    i n d i c a t e d t h a t

    e l l a g i c

    a c i d

    t r e a t m e n t d i d

    n o t

    i n t e r f e r e

    w i t h

    t h e

    n o r m a l

    r e s p o n s e s

    i n

    s k i n

    o f

    h i s t a m i n e , 5 - H T , b r a d y k i n i n

    o r

    c o m p o u n d

    4 8 / 8 0   T a b l e

    2 .

    A l s o ,

    m e p y r a m i n e a n d

    m e t h y s e r g i d e ,

    a t

    t h e

    d o s e s

    u s e d i n

    t h e

    c a r r a g e e n i n

    e x p e r i m e n t s ,

    c o m p l e t e l y

    a n t a g o n i z e d

    h i s t a m i n e

    a n d

    5 - H T ,

    r e s p e c t i v e l y ,

    a n d

    d i d

    n o t

    a f f e c t

    t h e

    s k i n

    r e s p o n s e s

    o f

    b r a d y k i n i n

      T a b l e s

    3

    a n d

    4 .

    A f t e r a l l o w i n g

    f o r

    t h e

    c o n t r i b u t i o n s

    o f

    k i n i n s ,

    5 - H T ,

    h i s t a m i n e a n d

    a c t i v a t e d

    c o m p l e m e n t t h e r e r e m a i n s

    a

    c o n s i d e r a b l e

    i n f l a m m a t o r y

    r e a c t i o n

    n o t a c c o u n t e d

    f o r ,

    e s p e c i a l l y

    a f t e r t h e

    f i r s t

    4

    h o u r s . T h e

    d i r e c t

    e f f e c t s

    o f

    t h e

    m e d i a t o r s

    s t u d i e d a r e

    l i k e l y

    t o

    b e

    l e s s

    i m p o r t a n t

    a f t e r

    t h e

    f i r s t 3 - 4

    h , w h e n

    l e u c o c y t e s

    e m i g r a t e i n t o t h e

    t i s s u e

      D .

    A .

    W i l l o u g h b y ,

    p e r s o n a l

    c o m m u n i c a t i o n ) .

    I t

    i s

    p o s s i b l e

    t h a t t h e s e

    c e l l s

    r e l e a s e

    p r o t e o l y t i c

    e n z y m e s

    a n d a l s o

    i n i t i a t e t h e

    l o c a l

    g e n e r a t i o n o f

    p r o s t a g l a n d i n s

      W i l l i s , 1 9 6 9 ;

    A n d e r s o n ,

    B r o c k l e h u r s t

     

    W i l l i s , 1 9 7 1 ) .

    T h e y

    m i g h t

    t h u s

    m a i n t a i n

    t h e

    i n c r e a s e d

    v a s c u l a r

    p e r m e a b i l i t y

    a n d

    c o u l d

    c a u s e

    d a m a g e

    t o

    c o n n e c t i v e

    t i s s u e

    w i t h

    t h e

    r e l e a s e o r f o r m a t i o n o f

    a d d i t i o n a l

    u n k n o w n

    m e d i a t o r s .

    We

    w i s h t o

    a c k n o w l e d g e

    t h e

    h e l p f u l

    a d v i c e a n d

    c r i t i c i s m

    o f

    D r .

    W. E .

    B r o c k l e h u r s t . Com-

    p o u n d

    4 8 / 8 0

    w a s

    g e n e r o u s l y s u p p l i e d b y

    t h e

    W e l l c o m e

    R e s e a r c h

    L a b o r a t o r i e s ,

    B e c k e n h a m .

    REFERENCES

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    A .

    J . ,

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    W. E .

     

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    A . L .

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    t h e

    r o l e

    o f

    l y s o s o m e s

    i n

    t h e

    f o r m a t i o n o f

    p r o s t a g l a n d i n s

    d u r i n g c a r r a g e e n i n - i n d u c e d

    i n f l a m m a t i o n

    i n

    t h e

    r a t .

    P h a r m a c .R e s .

    C o m m . ,

    i n

    t h e

    P r e s s .

    B E C K E R , E .

    L . , M O T A ,

    I .

     

    WONG,

    D .

      1 9 6 8 ) .

    I n h i b i t i o n

    b y

    a n t i h i s t a m i n e s

    o f

    t h e

    v a s c u l a r

    p e r m e -

    a b i l i t y

    i n c r e a s e i n d u c e d

    b y

    b r a d y k i n i n .

    B r .

    J .

    P h a r m a c . ,

    3 4 ,

    3 3 0 - 3 3 6 .

    B H A L L A ,

    T . N .

     

    T A N G R i ,

    K .

    K.

      1 9 7 0 ) .

    T h e t i m e

    c o u r s e o f

    t h e

    c a r r a g e e n a n - i n d u c e d

    o e d e m a

    o f

    t h e

    paw o f

    t h e

    r a t .

    J .

    P h a r m .

    P h a r m a c . ,

    2 2 ,

    7 2 1 .

    B O R S O S ,

    T . ,

    R A P P ,

    H . J .

     

    C R I S L E R ,

    C .

      1 9 6 5 ) .

    T h e

    i n t e r a c t i o n

    b e t w e e n

    c a r r a g e e n a n

    a n d t h e

    f i r s t

    c o m p o n e n t

    o f

    c o m p l e m e n t .

    J .

    I m m u n o l . ,

    9 4 ,

    6 6 2 - 6 6 6 .

    B R O C K L E H U R S T , W.

    E .  

    Z E r r u N ,

    I .

    J .

      1 9 6 7 ) .

    D e t e r m i n a t i o n o f

    p l a s m a

    k i n i n

    a n d

    k i n i n o g e n l e v e l s

    i n

    m a n .

    J .

    P h y s i o l . ,

    L o n d . , 1 9 1 ,

    4 1 7 - 4 2 6 .

    D A V I E S ,

    G . E .

      1 9 6 5 ) .

    I n h i b i t i o n o f

    c o m p l e m e n t

    b y

    c a r r a g e e n i n .

    Mode

    o f

    a c t i o n ,

    e f f e c t o n

    a l l e r g i c

    r e a c t i o n s

    a n d o n

    c o m p l e m e n t

    o f

    v a r i o u s

    s p e c i e s .

    I m m u n o l o g y ,

    8 ,

    2 9 1 - 3 0 3 .

    D i

    R O S A ,

    M.

     

    S O R R E N T I N O ,

    L .

      1 9 6 8 ) .

    T h e

    m e c h a n i s m o f

    t h e

    i n f l a m m a t o r y e f f e c t

    o f

    c a r r a g e e n i n .

    E u r .

    J .

    P h a r m a c . ,

    4 ,

    3 4 0 - 3 4 2 .

    D i

    R o S A ,

    M.

     

    S O R R E N T I N O ,

    L .

      1 9 7 0 ) .

    Some

    p h a r m a c o d y n a m i c

    p r o p e r t i e s

    o f

    c a r r a g e e n i n

    i n

    t h e

    r a t .

    B r . J .

    P h a r m a c . , 3 8 ,

    2 1 4 - 2 2 0 .

    F E K E T E ,

    M .

     

    K U R T I ,

    A .

    M.

      1 9 7 0 ) .

    E f f e c t o f

    m o n o a m i n e

    o x i d a s e

    i n h i b i t o r s o n

    r a t paw

    o e d e m a

    i n d u c e d

    b y

    v a r i o u s

    p h l o g i s t i c

    a g e n t s .

    E u r . J .

    P h a r m a c . ,

    1 0 ,

    2 6 8 - 2 7 6 .

    G L O V S K Y ,

    M.

    M . ,

    B E C K E R ,

    E .

    L .

     

    H A L B R O O K ,

    N .

    J .

      1 9 6 8 ) . I n h i b i t i o n

    o f

    g u i n e a

    p i g

    c o m p l e m e n t

    b y

    m a l e o p i m a r i c

    a c i d a n d

    o t h e r

    d e r i v a t i v e s

    o f

    l e v o p i m a r i c

    a c i d .

    J .

    I m m u n o l . ,

    1 0 0 ,

    9 7 9 - 9 9 0 .

  • 8/20/2019 Uji Antiinflamasi Dg Karagen

    11/11

    4 0 2

    P e a r l C r u n k h o r n

    a n d

    S . C . R .

    M e a c o c k

    G A U T V I K ,

    K .

    M.

     

    R U G S T A D ,

    H .

    E .

      1 9 6 7 ) .

    K i n i n f o r m a t i o n a n d

    k i n i n o g e n d e p l e t i o n

    i n

    r a t s

    a f t e r

    i n t r a v e n o u s i n j e c t i o n

    o f

    e l l a g i c

    a c i d .

    B r . J . P h a r m a c . C h e m o t h e r . , 3 1 ,

    3 9 0 - 4 0 0 .

    J A C O B S E N ,

    S .

      1 9 6 6 ) .

    S u b s t r a t e s

    f o r p l a s m a

    k i n i n - f o r m i n g e n z y m e s

    i n r a t

    a n d

    g u i n e a

    p i g

    p l a s m a .

    B r . J .

    P h a r m a c .

    C h e m o t h e r . ,

    2 8 ,

    6 4 - 7 2 .

    R O S E N B E R G ,

    L .

    T .

     

    T A C H I B A N A ,

    D . K .

      1 9 6 2 ) .

    A c t i v i t y

    o f

    m o u s e c o m p l e m e n t . J .

    I m m u n o l . ,

    8 9 ,

    8 6 1 - 8 6 7 .

    W I L L I S ,

    A .

    L .   1 9 6 9 ) .

    P a r a l l e l

    a s s a y o f

    p r o s t a g l a n d i n - l i k e

    a c t i v i t y i n

    r a t

    i n f l a m m a t o r y

    e x u d a t e

    b y

    means o f

    c a s c a d e

    s u p e r f u s i o n .

    J . P h a r m .

    P h a r m a c . ,

    2 1 ,

    1 2 6 - 1 2 8 .

    W I L L O U G H B Y ,

    D .

    A . , C O O T E ,

    E .   T U R K ,

    J . L .

      1 9 6 9 ) .

    C o m p l e m e n t i n

    a c u t e

    i n f l a m m a t i o n .

    J .

    P a t h .

    9 7 ,

    2 9 5 - 3 0 5 .

    W I N T E R ,

    C .

    A . ,

    R I S L E Y ,

    E . A .

     

    N u s s ,

    G . W.

      1 9 6 2 ) .

    C a r r a g e e n i n - i n d u c e d

    o e d e m a i n h i n d paw o f

    t h e

    r a t a s

    a n

    a s s a y

    f o r

    a n t i - i n f l a m m a t o r y

    d r u g s .

    P r o c .

    S o c .

    e x p .

    B i o l .

    M e d . ,

    1 1 1 , 5 4 4 - 5 4 7 .

    W I N T E R ,

    C . A . ,

    R I S L E Y ,

    E . A .   N u s s , G .

    W.

      1 9 6 3 ) . A n t i - i n f l a m m a t o r y

    a n d a n t i p y r e t i c a c t i v i t i e s

    o f

    i n d o m e t h a c i n , l p - c h l o r o b e n z o y l ) - 5 - m e t h o x y - 2 - m e t h y l - i n d o l e - 3 - a c e t i c

    a c i d .

    J . P h a r m a c . ,

    1 4 1 ,

    3 6 9 - 3 7 6 .

    W I N T E R ,

    C . A .

      1 9 6 5 ) . A n t i - i n f l a m m a t o r y

    t e s t i n g

    m e t h o d s :

    c o m p a r a t i v e

    e v a l u a t i o n o f

    i n d o m e t h a c i n

    a n d o t h e r

    a g e n t s .

    I n :

    N o n - s t e r o i d a l

    A n t i - i n f l a m m a t o r y

    D r u g s ,

    e d .

    G a r a t t i n i , S .

     

    D u k e s ,

    M . N . G . ,

    p p . 1 9 0 - 2 0 2 .

    A m s t e r d a m : E x c e p t a

    M e d i c a

    F o u n d a t i o n .

      R e c e i v e d

    M a r c h 1 0 , 1 9 7 1 )