PENENTUAN DERAJAT HIDROLISIS SUATU PROTEIN

MELALUI TITRASI FORMAL ASAM AMINO

Oleh :

I PUTU RAIWATA MERTANJAYA (NIM: 0813031019)

JURUSAN PENDIDIKAN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS PENDIDIKAN GANESHA

SINGARAJA

2011

PENENTUAN DERAJAT HIDROLISIS SUATU PROTEIN

MELALUI TITRASI FORMAL ASAM AMINO

Oleh: I Putu Raiwata Mertanjaya

Jurusan Pendidikan Kimia, Undiksha

ABSTRAK

Protein dapat dihidrolisis menjadi asam amino menggunakan enzim protease melalui

titrasi formal asam amino. Penentuan salah satu gugus akan memberikan indikasi untuk

mengetahui derajat hidrolisis suatu protein. Dalam titrasi ini, digunakan formaldehid yang

bertujuan untuk membentuk dimetilol sehingga gugus aminonya yang sudah terikat tidak

akan mempengaruhi reaksi antara gugus karbonil (asam) dengan basa (NaOH) sehingga

titik akhir titrasi dapat diakhiri dengan tepat. Selain itu, agar dapat bereaksi dengan gugus

amino yang tidak bermuatan sehingga memungkinkan gugus amonium membuffer di daerah

pH yang lebih rendah dan dapat dititrasi pada titik akhir secara kuantitatif menggunakan

suatu indikator. Sehingga akan didapatkan kurva hubungan banyaknya larutan NaOH yang

digunakan terhadap waktu. Berdasarkan kurva tersebut ditentukan slop dan tangen. Nilai

tangen tersebut merupakan daya hidrolisis suatu protein (gelatin). Derajat hidrolisis protein

oleh enzim protease adalah 0,059.

Kata-kata kunci : asam amino, formaldehid

ABSTRACT

Proteins can be hydrolyzed into amino acids using the enzyme protease through

formal titration of amino acids. Determination of one group will give an indication to

determine the degree of hydrolysis of a protein. In this titration, which aims to use

formaldehyde to form dimethylol so that the amino group that has been tied does not affect

the reaction between the carbonyl group (acid) with a base (NaOH) so that the end point of

titration can be terminated properly. In addition, in order to react with an uncharged amino

group allowing ammonium group buffering at a lower pH region and can be titrated at the

end point quantitatively using an indicator. So that would be obtained curve number NaOH

solution used with respect to time. Based on these curves are determined slope and tangent.

Tangent value is the hydrolysis of a protein (gelatin). The degree of hydrolysis of proteins by

protease enzyme is 0.059.

Key words: amino acids, formaldehyde

PENDAHULUAN

Protein merupakan senyawa organik kompleks yang mempunyai bobot molekul tinggi

dan merupakan polimer dari monomer-monomer asam amino yang dihubungkan oleh ikatan

peptida (Tika, 2010). Bobot molekul protein sangat besar, tetapi hidrolisis asam semua

protein menghasilkan sekelompok senyawa organik sederhana dengan bobot molekul rendah,

yaitu α-asam amino. Molekul-molekul building block ini minimum mengandung satu gugus

karboksilat dan satu gugus α-amino, serta satu gugus rantai samping R yang berbeda.

Protein dalam makanan bisa kita temukan dalam kacang-kacangan, telur, dan lain

sebagainya. Salah satu contoh protein yang sering kita temukan dalam kehidupan sehari-hari

adalah telur. Kandungan penyusun telur dalam dibagi menjadi protein putih telur dan protein

kuning telur. Komposisi putih telur kandungan total protein 10-11% dasar basah, ovalbulmin

70% dari total protein, canalbumin 9% dari total protein, ovoummucoid 13% dari total

protein. Sedangkan kuning telur terdiri atas hipovitelin dan hipotellenin.

Protein dapat dipecah menjadi asam-asam amino melalui suatu cara yaitu dengan

hidrolisis. Apabila suatu protein mengalami hidrolisis, maka asam-asam amino penyusunnya

akan teruraikan. Hidrolisis protein dapat dilakukan dengan menggunakan enzim protease dari

tripsin. Asam amino bebas yang dihasilkan dari hidrolisis ini apabila direaksikan dengan

formaldehid berlebih akan membentuk derivat metilol. Reaksi ini menyebabkan asam amino

bebas bentuk isoelektrik kehilahan satu proton dari gugus –NH3+ (Tika, 2010).

H3N+CHRCOO

- H2NCHRCOO

- + H

+

H2NCHRCOO- + 2HCHO (HOCH2)2NCHRCOO

- (Tika, 2010).

Asam amino merupakan ion dipolar, yang pada umumnya mempunyai dua atau lebih

pKa. Asam amino yang menyusun suatu protein tertentu, memiliki kadar asam amino yang

tidak sama. Protein jika dihidrolisis akan menghasilkan asam amino bebas. Asam amino tidak

larut di dalam eter karena merupakan senyawa dipolar, dan dalam air menunjukkan struktur

kutub ganda ( zwitter-ion), yaitu:

Gambar 1 . Struktur dipolar asam amino

(Nurlita, 2002).

Pada gambar tersebut, gugus amino diprotonasi dan hadir sebagai ion amonium, sedangkan

gugus karboksil kehilangan protonnya dan hadir sebagai anion karboksilat. Struktur ini

konsisten dengan sifat asam amino yang seperti garam, yang memiliki titik leleh agak tinggi.

R CH COOH

NH2

COO-

NH3+

CHR

Asam amino bersifat amfoterik, artinya berperilaku sebagai asam dan mendonasikan

protonnya pada basa kuat, atau dapat juga berperilaku sebagai basa dan menerima proton dari

asam kuat. Perilaku ini dinyatakan dalam kesetimbangan berikut untuk asam amino dengan

gugus amino dan satu gugus karboksil.

Asam amino pada bentuk ion dipolar asam amino pada

pH rendah pH tinggi

Gambar 2. Kesetimbangan asam amino pada berbagai pH

Titrasi formal asam amino adalah metode penetapan asam amino berupa titrasi dengan

larutan basa setelah ditambahkan larutan formaldehid untuk menghilangkan kebasaan gugus

amino. Pada titrasi ini akan diperoleh kurva titrasi asam amino dari hasil hidrolisis protein

menggunakan enzim protease. Selama hidrolisis suatu protein, sejumlah gugus karboksil dan

gugus amino terus bertambah. Penentuan secara kuantitatif salah satu gugus akan dapat

memberikan indikasi untuk mengetahui derajat hidrolisis dari suatu protein.

Menurut teori zwitter-ion apabila suatu asam amino dalam larutan dititrasi dengan

basa, ini berarti hidrogen dari gugus amonium yang dititrasi. Gugus amonium dari asam

amino adalah buffer pada pH tinggi (di atas pH 11), karenanya tidak mungkin untuk

mentitrasinya pada titik akhir suatu indikator. Hal yang sama terjadi karena gugus karboksil

adalah buffer pada pH rendah, tidak mungkin juga untuk mentitrasinya dengan asam (Tika,

2007). Oleh karena itu, ditambahkan formaldehid pada larutan asam amino tersebut agar

bereaksi dengan gugus amino yang tidak bermuatan sehingga memungkinkan gugus

amonium membuffer pada daerah pH yang lebih rendah dan dapat dititrasi pada titik akhir

secara kuantitatif menggunakan suatu indikator.

Reaksi yang terjadi dalam titrasi dengan menggunakan formaldehid merupakan reaksi

pembentukan dimetilol. Dimana larutan protein yang telah dinetralkan dengan basa (NaOH),

kemudian ditambahkan formaldehid sehingga membentuk dimetilol. Dengan terbentuknya

dimetilol ini, berarti gugus aminonya yang sudah terikat tidak akan mempengaruhi reaksi

antara karboksil (asam) dengan basa (NaOH), sehingga titik akhir titrasi dapat diakhiri

dengan tepat. Indikator yang digunakan adalah fenolftalein sehingga titik akhir titrasi dapat

diakhiri dengan tepat, ditandai dengan perubahan warna larutan dari tidak berwarna menjadi

merah muda yang tidak hilang selama 30 detik.

Reaksi yang terjadi selama titrasi adalah sebagai berikut.

R CH COOH COO-

NH3+ NH2

CHR

NH3+

COO-CHRHO-

H+

HO-

H+

(pada pH netral)

Gambar 3. Reaksi asam amino dengan NaOH serta formaldehid

Reagen yang digunakan dalam praktikum ini adalah gelatin, yang merupakan produk

alami yang diperoleh dari hidrolisis parsial kolagen. Gelatin adalah protein larut dan bersifat

gelling agent (bahan pembuat gel) atau sebagai ion gelling agent. Sumber bahan baku gelatin

dapat berasal dari tulang dan kulit sapi atau babi. Gelatin terdiri dari glisin dengan komposisi

besar, protein dan 4-hidroksiresidu. Tipe strukturnya yaitu Ala-Gly-Pro-Arg-Gly-4.Hyp-Gly-

Pro. Struktur gelatin adalah sebagai berikut:

Gambar 4. Struktur gelatin (Tika, 2010)

NH3+

R CH C

NH2

O

OH

NaOH OCCHR

O-

O-R CH C

O

NH3+

+ HCHO OH

OCCHR

NH CH2OH

HCHO

CH2OHN

R CH CO

OHHOH2C

formalin

dimethilol

NaOHHOH2C

OH

OCCHR

N CH2OH+

HOH2CO-Na+

OCCHR

N CH2OH

O

NH

N

C O

CH2

C

NHCHO

OHN

O

O-

CH

CH2

CH2

C

O

CNH

O

CCH2C

O

NH2+

NH2C

NH

CH2

CH2

CHNH

O

CN

O

CNH

O

CH3

CH CNH CH2

TUJUAN DAN MANFAAT

Tujuan

Adapun tujuan dari percobaan ini adalah untuk (1) menghidrolisis protein dengan

enzim protease dan menentukan derajat hidrolisisnya, (2) membuat kurva hubungan antara

volume NaOH terhadap waktu, dan (3) membuat kurva mg nitrogen asam amino terhadap

waktu pada titrasi formal asam amino.

Manfaat

Manfaat percobaan ini bagi praktikan adalah (1) mengetahui cara hidrolisis protein

dengan enzim protease, (2) mengetahui cara menentukan derajat hirolisis protein oleh enzim

protease, dan (3) memperkuat pemahaman tentang hidrolisis protein oleh enzim protease.

METODE

Waktu dan Tempat

Percobaan ini dilakukan pada hari Rabu, tanggal 23 Maret 2011 dari pukul 08.00-

12.30 WITA, bertempat di Laboratorium Kimia Organik, Jurusan Pendidikan Kimia,

Universitas Pendidikan Ganesha, Singaraja.

Alat dan Bahan

Alat dan bahan yang digunakan dalam percobaan ini dapat dilihat pada tabel berikut.

Tabel 1. Alat dan Bahan

Nama Alat Jumlah Nama Bahan Jumlah

Gelas kimia 50 mL 1 buah Larutan Gelatin 50 mL

Gelas kimia 100 mL 3 buah Larutan NaOH 0,2 M 100 mL

Labu Erlenmeyer 3 buah Larutan HCl 0,1 M 50 mL

Buret 50 mL dan statif 1 set Indikator PP 10 mL

Gelas ukur 25 mL 1 buah Larutan Formalin 5 mL

Batang pengaduk 1 buah Larutan Tripsin 20 mL

Kaca arloji 1 buah Aquades 500 mL

Termometer (100oC) 1 buah NaOH 0,02 M 100 mL

Pemanas Listrik 1 buah

Pipet tetes 1 buah

Indikator universal 1 buah

Prosedur Kerja

Sebanyak 100 mL larutan gelatin disiapkan, dan ditambahkan 1 ml larutan PP dan

larutan NaOH 0,2 M tetes demi tetes sampai warna merah muda timbul. Larutan HCl 0,1 M

ditambahkan tetes demi tetes sampai tepat warna merah muda tadi hilang. Larutan gelatin

direndam dalam inkubator air pada suhu 38oC. Pada gelas kimia lain, sebanyak 25 mL larutan

tripsin ditambahkan dengan beberapa tetes indikator PP dan tetes demi tetes larutan NaOH

0,2 M sampai warna merah muda timbul. Kemudian diteteskan larutan HCl 0,1 M sampai

warna merah muda hilang. Larutan tripsin direndam dalam inkubator air pada suhu 38oC

selama beberapa menit. Larutan tripsin ditambahkan kedalam larutan gelatin kemudian

diaduk secara perlahan. Sebanyak 10 mL dari campuran tersebut diambil dan dimasukkan

kedalam labu erlenmeyer 100 mL (larutan ini digunakan sebagai kontrol atau waktu nol

menit). Campuran dididihkan untuk merusak enzim dan setelah itu didinginkan. Sebanyak 15

mL formalin netral dan 3 tetes larutan pp ditambahkan. Pada interval waktu 15, 30, 60, dan

90 menit dari waktu nol dilakukan hal yang sama seperti pada kontrol. Titrasi dilakukan pada

larutan tersebut dengan larutan NaOH 0,02 M sampai titik akhir titrasi yang ditandai dengan

timbulnya warna merah muda.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Derajat hidrolisis protein (gelatin) oleh enzim protease dari tripsin dapat ditentukan

dengan titrasi formal asam amino. Larutan gelatin ditambahkan larutan PP dan larutan NaOH

0,2 M. Penambahan larutan NaOH dihentikan ketika warna larutan telah menjadi merah

muda yang ditimbulkan oleh adanya indikator PP dalam suasana basa. Tujuan penambahan

NaOH adalah agar larutan gelatin bersifat basa. Kemudian larutan ditambahkan dengan

larutan HCl 0,1 M sampai warna merah muda larutan hilang (pH 8,0). Pada pH 8,0 larutan

gelatin akan mampu bereaksi dengan sempurna dengan enzim protease, yaitu tripsin. Pada pH

8 merupakan pH yang optimum bagi enzim untuk menghasilkan asam amino.

Perlakuan yang sama juga dilakukan terhadap larutan enzim protease (tripsin),

perlakuan. Tujuan menjaga pH larutan 8,0 adalah untuk mengaktifkan enzim tripsin dalam

memecah protein (gelatin), karena tripsin bekerja efektif pada pH 7,7-8,0. Di samping itu,

agar terjadi hidrolisis secara sempurna antara gelatin dengan tripsin, kedua larutan juga

diinkubasi pada suhu 38 oC, karena enzim protease dapat bekerja optimal pada suhu ini.

Larutan gelatin dan larutan tripsin kemudian dicampurkan dan larutan ditempatkan

pada labu Erlenmeyer dan dimasukkan dalam inkubator air pada suhu 38oC sehingga terjadi

pemecahan protein menjadi asam amino. Campuran ini adalah kontrol dan waktu ke nol.

Pada waktu ke nol, 15, 30,45, 60, 75, dan 90 menit diambil sebanyak 10 mL larutan

(campuran gelatin dengan tripsin). Larutan itu didihkan pada masing-masing interval waktu

yang bertujuan untuk merusak protein. Setelah didinginkan, larutan yang diperlakukan pada

masing-masing interval waktu tersebut ditambahkan formaldehid (formalin) dan indikator PP

kemudian dilakukan titrasi.

Reaksi yang terjadi dalam titrasi dengan menggunakan formaldehid merupakan reaksi

pembentukan dimetilol. Dimana, larutan protein yang telah dinetralkan dengan basa (NaOH),

kemudian ditambahkan sehingga membentuk dimetilol. Dengan terbentuknya dimetilol ini,

berarti gugus aminonya yang sudah terikat tidak akan mempengaruhi reaksi antara karboksil

(asam) dengan basa (NaOH), sehingga titik akhir titrasi dapat diakhiri dengan tepat. Di

samping itu, untuk memungkinkan gugus amonium membuffer pada daerah pH yang lebih

rendah dan dapat dititrasi pada titik akhir suatu indikator.

Reaksi yang terjadi selama titrasi adalah sebagai berikut.

(pada pH netral)

Gambar 5. Reaksi asam amino dengan NaOH serta formaldehid

Secara teoritis menurut teori zwitter-ion, kalau suatu asam amino dalam larutan

dititrasi dengan basa, ini berarti hidrogen dari gugus amonium yang dititrasi. Karena gugus

amonium dari asam amino adalah buffer pada pH tinggi (di atas pH 11), karenanya tidak

mungkin untuk mentitrasinya pada titik akhir suatu indikator. Hal yang sama terjadi karena

gugus karboksil adalah buffer pada pH rendah, tidak mungkin juga untuk mentitrasinya

dengan asam (Tika, 2007).

NH3+

R CH C

NH2

O

OH

NaOH OCCHR

O-

O-R CH C

O

NH3+

+ HCHO OH

OCCHR

NH CH2OH

HCHO

CH2OHN

R CH CO

OHHOH2C

formalin

dimethilol

NaOHHOH2C

OH

OCCHR

N CH2OH+

HOH2CO-Na+

OCCHR

N CH2OH

Dalam percobaan ini, larutan gelatin didegradasi dengan menggunakan enzim tripsin.

Tripsin merupakan enzim proteolitik yang terdiri dari satu rantai polipeptida. Enzin ini akan

mendegradasi gelatin menghasilkan asam amino penyusunnya. Reaksinya digambarkan

sebagai berikut:

Gambar 6. Struktur Gelatin

Gambar 7. Asam-asam amino hasil pemecahan gelatin

Reaksi degradasi diatas dapat terjadi apabila terjadi hidrolisis total dari asam amino

tersebut. Pada tahap titrasi, indikator yang digunakan adalah PP. Titrasi formal ini hanya

tepat untuk menentukan suatu proses terjadinya pemecahan protein dan kurang tepat untuk

penentuan protein. Dalam titrasi ini secara teori, semakin lama reaksi antara gelatin dengan

tripsin maka makin banyak volume NaOH yang diperlukan untuk mentitrasi banyaknya asam

O

NH

N

C O

CH2

C

NHCHO

OHN

O

O-

CH

CH2

CH2

C

O

CNH

O

CCH2C

O

NH2+

NH2C

NH

CH2

CH2

CHNH

O

CN

O

CNH

O

CH3

CH CNH CH2

NH CCH

CH3

O

OH + CH2NH2 C

O

OH +OOH

O

C

+CH

CH2

CH2

NH

C NH2

NH2+

O

CNH2 OH

+ CH2 CNH2 OH

C

O

C

CH2

CH2

CH

OH

O

+NH2

NH2

OH+ OH

CHO NH

CH2

OC

NH2

OH

+C

ONH2

OH

amino yang konsentrasinya bertambah seiring dengan bertambahnya kontak antara larutan

gelatin dan tripsin.

Daya hidrolisis dapat ditentukan dengan membuat kurva hubungan antara volume

NaOH yang dipergunakan dalam titrasi terhadap waktu. Berdasarkan kurva tersebut

ditentukan slop dan tangen. Nilai tangen tersebut merupakan daya hidrolisis enzim tripsin.

Tabel 2. Hubungan Waktu dengan Volume NaOH

Waktu (menit) Volume NaOH 0,2 M (mL)

0 15,20

15 15,35

30 17,00

45 18,60

60 19,41

75 20,20

90 20,55

Hubungan antara volume NaOH yang digunakan dalam titrasi terhadap waktu dapat

dilihat pada grafik berikut

Gambar 8. Kurva Hubungan Waktu dengan Volume NaOH

Daya hidrolisis dari enzim tripsin dalam titrasi formal ini adalah:

90

20,1555,20tg

y = 0.067x + 15.02R² = 0.958

0

5

10

15

20

25

0 20 40 60 80 100Vo

lum

e N

aOH

0,0

2 M

(m

L)

Waktu (menit)

Hubungan Waktu dengan Volume NaOH

Series1

Linear (Series1)

= 90

5,35

= 0,059

Karena 1 mL NaOH 0,1 N sama dengan 1,4 mg nitrogen asam amino, maka:

mgX

X

X

28,0

028,01,0

4,11,0

02,0

Jadi 1 mL larutan NaOH 0,02 N ekivalen dengan 0,28 mg nitrogen asam amino.

Pada 0 menit, VNaOH = 15,20 mL, maka 15,20 x 0,28 = 4,2560 mg

Pada 15 menit, VNaOH = 15,35 mL, maka 15,35 x 0,28 = 4,2980 mg

Pada 30 menit, VNaOH = 17,00 mL, maka 17,00 x 0,28 = 4,7600 mg

Pada 30 menit, VNaOH = 18,60 mL, maka 18,60 x 0,28 = 5,2080 mg

Pada 60 menit, VNaOH = 19,32 mL, maka 19,41 x 0,28 = 5,4348 mg

Pada 75 menit, VNaOH = 20,20 mL, maka 20,20 x 0,28 = 5,6560 mg

Pada 90 menit, VNaOH = 20,55 mL, maka 20,55 x 0,28 = 5,7540 mg

Waktu (menit) Jumlah Nitrogen Asam Amino

(mg)

0 4,2560

15 4,2980

30 4,7600

45 5,2080

60 5,4348

75 5,6560

90 5,7540

Kurva hubungan antara jumlah nitrogen asam amino terhadap waktu dapat dilihat

pada grafik berikut.

Gambar 9. Grafik Hubungan Waktu dengan Jumlah Nitrogen Asam Amino

SIMPULAN

Titrasi formal asam amino dapat digunakan untuk menentukan derajat hidrolisis

protein oleh enzim protease (tripsin). Derajat hidrolisis enzim protease adalah 0,059. Jumlah

asam amino yang terurai bertambah sesuai pertambahan waktu, dibuktikan dengan

meningkatnya penggunaan NaOH dalam titrasi seiring pertambahan waktu.

DAFTAR PUSTAKA

Frieda Nurlita, dkk. 2002. Kimia Organik II. Singaraja : IKIP N Singaraja.

Redhana, I Wayan dan Siti Maryam. 2003. Penuntun Praktikum Biokimia. Singaraja:

IKIP Negeri Singaraja.

Tika, I Nyoman. 2007. Penuntun Praktikum Biokimia. Singaraja: Universitas

Pendidikan Ganesha.

-------. 2010. Penuntun Praktikum Biokimia. Singaraja: Universitas Pendidikan

Ganesha

y = 0.018x + 4.207R² = 0.958

0.000

1.000

2.000

3.000

4.000

5.000

6.000

7.000

0 20 40 60 80 100

Jum

lah

mg

Nit

roge

n A

sam

Am

ino

(m

g)

Waktu (menit)

Hubungan antara Waktu dengan mg Nitrogen Asam Amino

Series1

Linear (Series1)