TEKNIK PEMURNIAN ENZIM

(Tugas Teknologi Enzim Industri)

MUTI DIANDA SARI

P051114021

PROGRAM STUDI BIOTEKNOLOGI

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

2013

TEKNOLOGI ENZIM

PEMURNIAN EN)IM

Enzim merupakan salah satu jenis substrat biologis yang memiliki fungsi yang sangat penting

dalam kehidupan manusia. Selain dimanfaatkan sebagai biokatalisataor, enzim banyak berperan

dalam industri komersial dalam bidang pangan maupun medis dan farmakologi. Untuk mendapatkan

suatu produk yang maksimal, maka dalam setiap kali reaksi biologis digunakan enzim untuk

mempermudah proses maupun menghemat biaya produksi suatu proses. Enzim yang digunakanpun

sebaiknya merupakan enzim yang memiliki kemurnian yang tinggi.

Memperoleh enzim dengan kemurnian yang tinggi, tidaklah mudah butuh biaya serta proses

yang lama untuk memperoleh enzim dengan tingkat kemurnian yang tinggi. Ada banyak faktor yang

berpengaruh dalam memperoleh enzim dengan kemurnian yang tinggi. Pemurnian merupakan tahap

yang penting setelab enzim diisolasi. Pemurnian enzim dapat dilakukan dengan beberapa cara

antara lain dialisis, elektroforesis dan kromatografi. Teknik dialisis bekerja dengan cara pengendapan

dalam garam organik (salting out) atau pelarut organik (aseton), dan melalui membran ultrafiltrasi.

Teknik elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan

perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Sedangkan teknik kromatografi

merupakan teknik pemisahan molekul berdasarkan perbedaan pola pergerakan antara fase gerak

dan fase diam untuk memisahkan komponen (berupa molekul) yang berada pada larutan.

Berikut akan dibahas satu persatu tentang teknik-teknik pemurnian enzim:

1. DIALISIS

Dialisis adalah suatu teknik pemisahan dengan cara menggunakan membran yang

memisahkan dua fasa cairan. Membran tersebut bersifat semipermeabel terhadap partikel

solute. Partikel solut berpindah melalui membran ke larutan dengan konsentrasi rendah.

Dialisis digunakan untuk memisahkan garam-garam dari suspensi dalam biokimia dengan

tujuan mencegah koagulasi. Dialysis adalah metode pemisahan molekul besar (seperti pati

atau protein) dari molekul kecil (seperti glukosa atau asam amino) dengan difusi selektif

melalui membrane semipermeabel. Misalnya, jika larutan campuran pati dan glukosa

dimasukkan dalam wadah tertutup terbuat dari bahan semipermeabel (seperti selofan) lalu

direndam dalam gelas kimia berisi air, maka molekul glukosa yang lebih kecil akan melewati

membrane menuju ke air, sedangkan molekul besar, yaitu pati, akan tertinggal di dalam

wadah. Prinsip dasar dari dialisi ini adalah perbedaan molekul-molekul. Alat yang digunakan

yaitu wadah tertutup terbuat dari bahan semipermeabel (sperti selofun), gelas piala. Dialysis

ini digunakan untuk memisahkan molekul-molekul yang memiliki perbedaan ukuran.

Membrane sel pada makhluk hidup bersifat semipermeabel, dan dialysis berlangsung secara

alami dalam ginjal untuk mengeluarkan limbah bernitrogen. Ginjal buatan (mesin dialysis)

menggunakan asas ini untuk menggantikan fungsi ginjal sakit.

Gambar 1. Teknik Pemisahan Dialisis

2. ELEKTROFORESIS

Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan

perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Hasil dari berbagai manipulasi DNA dan

analisis DNA dapat dimonitor melalui proses elektroforesis yang merupakan suatu teknik pemisahan

senyawa yang bermuatan dengan meletakkannya pada suatu medan listrik.

Elektroforesis memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul. Jika molekul yang

bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub

ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke

kutub positif. Teknik ini dipelopori pada tahun 1937 oleh ahli kimia Swedia Arne Tiselius untuk

pemisahan protein. Sekarang telah meluas ke banyak pemisahan kelas yang berbeda lain dari

biomolekul termasuk asam nukleat, karbohidrat dan asam amino.

Menurut Andrews (1993), lektroforesis merupakan teknik yang umum digunakan untuk analisis

DNA dan protein. Melalui teknik ini dapat ditentukan:

1. Berat molekul suatu bahan

2. Banyaknya jenis protein pada suatu sampel

3. Adanya pemalsuan bahan atau kerusakan/kontaminasi bahan

4. Adanya antibodi terhadap virus atau bakteri pathogen tertentu

5. Titik isoelektrik protein

Hartati dan Lisdiyati (1997) menyebutkan terdapat dua macam macam teknik elektroforesis yang

telah berkembang yaitu, elektroforesis horizontal maupun vertikal. Sedangkan menurut Suranto

(2002), berdasarkan jenisnya ada dua macam elektroforesis yaitu:

1. Elektroforesis bebas (free electrophoresis): molekul atau partikel yang akan dipisahkan

tersebar di seluruh larutan. Pemberian arus listrik pada larutan yang mengandung partikel

tersebut akan menyebabkan terbentuknya batas di antara dua larutan.

2. Elektroforesis zona: merupakan jenis elektroforesis yang paling banyak digunakan,

mempergunakan media penunjang, seperti kertas, selulosa asetat, agarosa atau

poliakrilamid.

Peralatan untuk elektroforesis secara umum terdiri dari 2 komponen utama, yaitu power supply

sebagai sumber arus listrik dan tangki elektroforesis. Untuk menghantarkan listrik, gel diletakkan

dalam suatu bufer. Bufer yang sama digunakan untuk membuat gel (Tchin et al., 2011). Untuk

pewarnaan digunakan Ethidium Bromida, suatu zat pewarna yang dapat menyisip/interkalasi di

antara basa DNA pada dua utas DNA yang berlainan. Ethidium Bromida (EtBr) akan berpendar di

bawah paparan sinar UV (Lepais and Bacles, 2011). Pewarna ini dapat ditambahkan pada gel dan

bufer sehingga tidak perlu melakukan staining sesudah proses elektroforesis. Keuntungannya adalah

lebih praktis, tetapi kemungkinan kontaminasi EtBr lebih besar. EtBr adalah zat yang bersifat

karsinogenik sehingga harus dihindari kontak langsung (Andrews, 1993).

Untuk analisis DNA gel yang digunakan adalah agarosa, suatu polisakarida (Allen et al., 1984).

Elektroforesis yang dilakukan adalah sistem horizontal. DNA yang bermuatan negatif akan bergerak

ke arah kutub positif melalui molekul-molekul agarosa (Hartati dan Lisdiyati, 1997). Selain agarosa,

gel poliakrilamid juga dapat digunakan untuk memisahkan DNA, terutama untuk fragmen yang

berukuran kecil (antara 5 bp-

2. Konsentrasi gel

Konsentrasi agarosa yang digunakan akan menentukan besarnya pori-pori gel yang akan

memisahkan DNA. Untuk mendapatkan resolusi yang tinggi digunakan konsentrasi agarosa

yang lebih tinggi. Agarosa umumnya dipakai dalam konsentrasi antara 1%-3%.

3. Ukuran molekul

Molekul yang berukuran lebih kecil akan lebih mudah melalui pori-pori gel sehingga laju

migrasinya lebih cepat. Tetapi ini hanya berlaku untuk fragmen yang berukuran antara 0,5-

15 kbp dan bila konformasinya sama. Kecepatan migrasi akan berbanding terbalik dengan

log 10 dari jumlah pasangan basa.

4. Bentuk molekul

DNA dapat memiliki beberapa kemungkinan bentuk, yaitu supercoil (SC), sirkular (S), linear

(L). Laju migrasi masing-masing dari yang paling cepat adalah SC > L > S. Untuk SC dan S, laju

migrasinya lebih ditentukan oleh bentuk molekul daripada ukurannya.

5. Arah medan listrik

Molekul DNA akan bermigrasi dengan kecepatan yang berbanding terbalik dengan ukuran

molekulnya jika medan listrik tetap/konstan. Jika arah medan listrik diubah, molekul yang

besar akan membutuhkan waktu yang lebih lama untuk reorientasi. Elektroforesis dengan

mengubah arah medan listrik secara periodik dikenal dengan Pulsed Field Gel Electrophoresis

(PFGE).

6. Adanya Ethidium Bromida (EtBr) di dalam gel

Hal ini mengakibatkan pengurangan tingkat kecepatan migrasi molekul DNA linear sebesar

15%.

7. Komposisi Larutan Bufer

Apabila tidak ada kekuatan ion di dalam larutan, maka aliran listrik menjadi sedikit dan

migrasi DNA sangat lambat, sedangkan larutan buffer berkekuatan ion tinggi akan

meningkatkan panas sehingga aliran listrik akan menjadi sangat maksimal.

Teknik elektroforesis dapat dibedakan berdasarkan medium penyangganya, antara lain :

1. Elekroforesis Kertas

Dengan menggunakan medium kertas, pemisahan dan analisis terhadap asam

amino, peptida, nukleotida, dan ion-ion logam yang kecil dapat dilakukan. Kelemahan

elektroforesis kertas yaitu adanya gangguan yang disebabkan oleh adanya gugus OH- yang

terdapat pada selulosa yang dapat berinteraksi dengan molekul polar sehingga daya migrasi

molekul tersebut terganggu dan menjadi lebih rendah . Kelemahan ini dapat diatasi dengan

cara asetilasi gugus hidroksil dengan menggunakan kertas selulosa asetat yang tidak polar.

Hal ini menyebabkan migrasi molekul polar tidak terganggu, resolusi lebih baik, dan proses

pemisahan berlangsung lebih cepat. Keuntungan penggunaan kertas selulosa asetat adalah

proses migrasi lebih cepat, pemisahan spot menjadi lebih kecil, mudah memisahkan sampel

dengan spektrofotometri, dan mudah dilarutkan dalam pelarut dalam jumlah sedikit. Pada

elektroforesis kertas selulosa asetat, kertas selulosa asetat harus dibersihkan dengan cara

kering dalam percobaan ini. Cara kering lebih baik resolusinya dan spotnya lebih kecil

daripada cara basah.

Gambar 2. Elektroforesis Kertas

2. Elektroforesis Gel

Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular.

Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan

listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya

oleh gaya gerak listrik di dalam matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada

ukuran molekul bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis,

namun dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum

digunakan dalam metode-metode lain seperti spektrometri massa, PCR, kloning, sekuensing

DNA, atau immuno-blotting yang merupakan metode-metode karakterisasi lebih lanjut.

Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang (crosslinked) yang

porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk memisahkan protein atau asam

nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya

merupakan gel poliakrilamida, dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida

dan zat yang memungkinkan pertautan silang (cross-linker), menghasilkan jaringan

poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam nukleat yang

lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang digunakan adalah agarosa (dari

ekstrak rumput laut) yang sudah dimurnikan.

Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur (well)

pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan kepadanya.

Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu

kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah

menuju elektroda positif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat

yang dimilikinya. Untuk menjaga agar laju perpindahan asam nukleat benar-benar hanya

berdasarkan ukuran (yaitu panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida

digunakan untuk menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein

didenaturasi dengan deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat

protein tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif.

Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining) agar

molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat. Etidium bromida, perak, atau pewarna

"biru Coomassie" (Coomassie blue) dapat digunakan untuk keperluan ini. Jika molekul

sampel berpendar dalam sinar ultraviolet (misalnya setelah "diwarnai" dengan etidium

bromida), gel difoto di bawah sinar ultraviolet. Jika molekul sampel mengandung atom

radioaktif, autoradiogram gel tersebut dibuat.

Pita-pita (band) pada lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel akan tampak setelah

proses pewarnaan; satu lajur merupakan arah pergerakan sampel dari "sumur" gel. Pita-pita

yang berjarak sama dari sumur gel pada akhir elektroforesis mengandung molekul-molekul

yang bergerak di dalam gel selama elektroforesis dengan kecepatan yang sama, yang

biasanya berarti bahwa molekul-molekul tersebut berukuran sama. "Marka" atau penanda

(marker) yang merupakan campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda dapat

digunakan untuk menentukan ukuran molekul dalam pita sampel dengan meng-

elektroforesis marka tersebut pada lajur di gel yang paralel dengan sampel. Pita-pita pada

lajur marka tersebut dapat dibandingkan dengan pita sampel untuk menentukan

ukurannya. Jarak pita dari sumur gel berbanding terbalik terhadap logaritma ukuran

molekul.

Gambar 3. Elektroforesis Gel

3. KROMATOGRAFI

Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan perbedaan pola pergerakan

antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen (berupa molekul) yang berada pada

larutan. Molekul yang terlarut dalam fase gerak, akan melewati kolom yang merupakan fase diam.

Molekul yang memiliki ikatan yang kuat dengan kolom akan cenderung bergerak lebih lambat

dibanding molekul yang berikatan lemah. Dengan ini, berbagai macam tipe molekul dapat

dipisahkan berdasarkan pergerakan pada kolom. Setelah komponen terelusi dari kolom, komponen

tersebut dapat dianalisis dengan menggunakan detektor atau dapat dikumpulkan untuk analisis

lebih lanjut.

Berdasarkan bahan dan peralatan yang digunakan kromatografi dibedakan menjadi 4 jenis, antara

lain :

1. Kromatografi Kertas (Paper Chromatography)

Kromatografi kertas merupakan salah satu metode pemisahan berdasarkan

distribusi suatu senyawa pada dua fasa yaitu fasa diam dan fasa gerak. Pemisahan

sederhana suatu campuran senyawa dapat dilakukan dengan kromatografi kertas,

prosesnya dikenal sebagai analisis kapiler dimana lembaran kertas berfungsi sebagai

pengganti kolom. Kromatografi kertas adalah salah satu pengembangan dari kromatografi

partisi yang menggunakan kertas sebagai padatan pendukung fasa diam. Oleh karena itu

disebut kromatografi kertas. Sebagai fasa diam adalah air yang teradsorpsi pada kertas

dan sebagai larutan pengembang biasanya pelarut organik yang telah dijenuhkan dengan

air. Dalam kromatografi kertas fasa diam didukung oleh suatu zat padat berupa bubuk

selulosa. Fasa diam merupakan zat cair yaitu molekul H2O yang teradsorpsi dalam selulosa

kertas.fasa gerak berupa campuran pelarut yang akan mendorong senyawa untuk

bergerak disepanjang kolom kapiler. Analisis kualitatif menggunakan kromatografi kertas

dilakukan dengan cara membandingkan harga relative response factor (Rf). Nilai Rf identik

dengan time retention (tR) atau volume retention (VR).

Harga Rf zat baku dapat diidentifikasikan komponen campuran, karena harga

besaran ini bersifat khas untuk setiap zat asal digunakan jenis pengembang yang sama.

Kadang-kadang pemisahan dalam satu arah belum memberikan hasil yang memuaskan.

Untuk mendapatkan hasil yang lebih baik, dapat dipakai cara kromatografi kertas dua

dimensi, yang mana letak kertas diubah sehingga arah pemisahan juga berubah.

Secara umum kromatografi kertas dilakukan dengan menotolkan larutan yang berisi

sejumlah komponen pada jarak 0,5 sampai 1 cm dari tepi kertas. Setelah penetesan

larutan pada kertas, maka bagian bawah kertas dicelupkan dalam larutan

pengambang(developing solution). Larutan ini umumnya terdiri atas campuran beberapa

pelarut organik yang telah dijenuhkan dengan air. Sistem ini akan terserap oleh kertas dan

sebagai akibat dari gaya kapiler akan merambat sepanjang kertas tersebut. Rambatan ini

dapat diusahakan dalam modus naik atau menurun. Selama proses pemisahan dilakukan,

sistem secara keseluruhannya disimpan dalam tempat tertutup, ruang didalamnya telah

jenuh dengan uap sistem pelarut ini.

Gambar 4. Kromatografi Kertas

2. Kromatografi Lapis Tipis (Thin Layer Chromatography)

Salah satu metode pemisahan yang sederhana ialah kromatografi lapis tipis. Pada

dasarnya prinsip pada KLT sama dengan kromatografi kertas hanya KLT mempunyai

kelebihan yang khas dibandingkan dengan kromatografi kertas yaitu keserbagunaan,

kecepatan, dan kepekaannya. KLT dapat dipakai dengan dua tujuan. Pertama, dipakai

sebagai metode untuk mencapai hasil kualitatif, kuantitatif, ataupun preparatif. Kedua,

dipakai untuk menjajaki sistem pelarut dan sistem penyangga yang akan dipakai pada

kromatografi kolom atau kromatografi cair kinerja tinggi/KCKT. Analisis dari KLT dapat

membantu menentukan pelarut terbaik apa yang akan dipakai dan berapa perbandingan

antar pelarut yang akan digunakan sebagai fasa gerak pada kromatografi kolom.

Kromatografi lapis tipis sangat berhubungan dengan kromatografi kolom, hal ini karena

fasa-fasa senyawa yang digunakan dalam teknik keduanya sama. Alumina dan silika gel

adalah fasa diam yang biasa digunakan, dan fasa geraknya menggunakan eluen yang

sama. Walaupun demikian, tetap terdapat perbedaan antara KLT dan kromatografi kolom.

Fasa gerak (cair) di dalam kromatografi kolom bergerak turun, sedangkan dalam KLT

bergerak naik. Bahan fasa diam yang digunakan dalam kromatografi kolom yang berupa

kolo digatika dega suatu lapisa tipis tealya pada KLT, yag erata pada seluruh bagian permukaannya. Bahan-bahan dari gelas atau lembaran-lembaran

plastik dapat digunakan sebagai bahan pendukung fasa diam untuk lapis tipisnya.

Sangat dimungkinkan bagi kita untuk menyiapkan lembaran KLT yang dari gelas,

tetapi untuk yang bahan pendukungnya plastik hanya tersedia secara komersil. Lembaran

yang pendukungnya plastik sangat menarik karena dapat dipotong dengan gunting

menjadi lembaran-lembaran yang lebih kecil dengan berbagai ukuran. Biasanya lembaran

kecil itu berukuran 13 inci tetapi untuk lembaran yang lebih kecil dapat disesuaikan.

KLT mempunyai beberapa keuntungan, diantaranya: waktu yang dibutuhkan tidak lama (2

5 menit) dan sampel yang dipakai hanya sedikit sekali (2 g. Kerugiaya dega menggunakan KLT adalah tidak efektif untuk skala industri. Walaupun lembaran KLT yang

digunakan lebih lebar dan tebal, pemisahannya sering dibatasi hanya sampai beberapa

miligram sampel saja .

Larutan sampel ditotolkan pada plat dengan pipet mikro atau injektor pada jarak 1 2 cm dari batas plat. Setelah kering plat siap untuk dikembangkan dengan fasa gerak

sampai pada batas tertentu. Proses pengembangan dikerjakan dalam wadah tertutup

yang diisi eluen dan telah dijenuhi uap eluen agar dihasilkan pemisahan yang baik.

Langkah selanjutnya yaitu mengeringkan sisa eluen dalam plat, kemudian melakukan

identifikasi yang dapat dilakukan dengan beberapa cara, yaitu: pengamatan langsung

(untuk noda/bercak yang tampak), dengan lampu ultraviolet, atau dengan pereaksi

semprot penimbul warna. Dalam penelitian ini menggunakan pereaksi yang digunakan

adalah Dragendorff.

Gambar 5. Kromatografi Lapis Tipis

3. Kromatografi Cair (Liqiud Chromatography)

Teknik kromatografi cair dibagi menjadi 4, yaitu :

1. Kromatografi Penukar Ion

Kromatografi penukar ion merupakan metode pemisahan berdasar-kan muatan

molekul di bawah kondisi pH dan kekuatan ion tertentu. interaksi elektrostatik dari

berbagai jenis ligan bermuatan pada matriks dengan gugus yang dapat berionisasi

pada protein akan menimbulkan mekanisme pemisahan. Penukar anion yang

bermuatan positif dipilih untuk mengikat molekul asam, sedangkan penukar kation

yang bermuatan negatif memberikan mekanisme pemisahan untuk molekul bersifat

basa. Karena enzim memiliki aktivitas, maka sebelum dilakukan pemisahan dengan

metode tersebut terlebih dahulu diketahui pH optimum enzim, sehingga aktivitas

enzim tetap dapat dipertahankan.

Protein memiliki muatan positif dan negatif terutama disebabkan oleh rantai

samping dari asam amino penyusunnya. Muatan positif di-sumbangkan oleh asam

amino histidin, lisin, arginin dan gugus amino dari N-terminal, sedangkan muatan

negatif disumbangkan oleh aspartat, glutamat dan gugus karboksil pada C-terminal.

Muatan bersih protein bergantung pada jumlah relatif gugus bermuatan positif dan

negatif yang bervariasi berdasarkan pH lingkungan. Tingkat keasaman protein atau

ezi dega julah uata positif da egatif saa dikeal seagai pH isoelektrik atau titik isoelektrik pl. Pada uuya protei eiliki nilai pH sekitar 5,0-9,0. Protein yang memiliki pH di atas nilai pl akan bermuatan negatif, sedangkan pH di

bawah nilai pl akan bermuatan positif.

Gambar 6. Prinsip kerja kromatografi penukar ion

Prinsip kromatografi penukar ion adalah penggunaan matriks penukar ion yang

mengikat secara kovalen gugus fungsi bermuatan negatif pada penukar kation, atau

gugus fungsi yang bermuatan positif pada penukar anion seperti terlihat pada gambar

8. Matriks berupa polimer elastis dan mengandung senyawa resin sintetik yang

terbuat dari bahan dekstran: selulosa atau sefadeks. Matriks penukar kation yaitu

karboksimetil selulosa (CMC), dan matriks penukar kation yaitu dietil aminoetil

(DEAE)-selulosa dan DEAE-sefadeks.

2. Kromatografi Filtrasi Gel

Kromatografi filtrasi gel merupakan teknik pemisahan protein dan makro molekul

biologi lain berdasarkan ukuran molekul, jadi bekerja sebagai suatu penyaring molekul

seperti terlihat pada gambar 10. Proses pemisahan ini menggunakan gel yaitu

dekstran (polimer gula yang larut dalam air) dan mengalami reaksi ikatan silang (cross

linkage) sehingga dekstran menjadi tidak larut dalam air, tetapi masih dapat

menyerap molekul air dalam molekulnya.

Daya serap matriks bergantung pada jumlah ikatan silang yang terjadi di dalamnya.

Matriks atau gel dekstran disebut juga sebagai sefadeks, misalnya sefadeks G-50.

Huruf dan nomor menunjukkan bahwa safadeks tersebut dapat dikembangkan

(Swelling) dengan air atau larutan penyangga dengan besar pengembangnya 50 kali.

Gel atau matriks ini berpori yang dikemas di dalam kolom dan dielusi dengan fase cair

mobil. Molekul yang lebih kecil akan masuk ke dalam pori matriks dan bergerak lebih

lambat, sedangkan molekul yang lebih besar akan bergerak lebih cepat karena tidak

tertahan di dalam pori matriks. Dengan demikian kromatogram molekul-molekul yang

lebih besar akan muncul sebagai komponen awal seperti terlihat pada gambar 10.

Gambar 7. Prinsip kerja kromatografi filtrasi gel

3. Kromatografi Interaksi Hidrofobik

Kromatografi interaksi hidrofobik merupakan metode pemisahan berdasarkan

perbedaan hidrofobisitas pada permukaan protein. Hal ini bergantung pada interaksi

hidrofobik antara permukaan protein dengan gugus hidrofobik yang terikat secara

kovalen pada matriks. Pada kondisi kekuatan ion yang tinggi, protein atau enzim akan

terikat kuat pada matriks melalui interaksi hidrofobik, hal seperti ini dapat terlihat

pada gambar 9. Matriks yang umum digunakan bersifat nonpolar, turunan jenis

sefarosa yakni fenil sefarosa atau butil sefarosa.

Gambar 8. Prinsip kerja Kromatografi interaksi hidrofobik

Suatu campuran protein dimasukkan ke dalam kolom interaksi hidrofobik dalam kondisi

ionik yang tinggi. Pada kekuatan ion yang tinggi protein terikat kuat pada matriks melalui

interaksi hidrofobik. Semakin hidrofobik suatu protein, maka semakin kuat ikatannya.

Protein yang terikat pada matriks dapat terlepas jika dielusi dengan eluen yang kekuatan

ionnya semakin menurun yaitu dengan konsentrasi garam dari tinggi ke yang lebih rendah.

4. Kromatografi Afinitas

Prinsip kromatografi afinitas adalah pengikatan spesifik ligan dengan reseptor. Jadi,

dalam kromatografi afinitas minimum harus ada dua senyawa yang berikatan spesifik.

Tujuan dari kromatografi afinitas adalah untuk memisahkan semua molekul dari

kekhususan tertentu dari keseluruhan seluruh molekul dalam campuran. Pemurnian

dengan teknik kromatografi afinitas disebut pemurnian satu tahap (one step

purification) Dalam proses pemurnian satu tahap menggunakan kromatografi afinitas

diperlukan interaksi spesifik antara protein rekombinan dengan suatu ligan.

Dalam kasus ini pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat

spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap

sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada

sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi).

Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari

campuran yang sangat kompleks. Skema yang paling urnum untuk melakukan

krmatografi afinitas adalah dengan melakukan tahap elusi gradien. Skema ini

melibatkan injeksi sampel ke dalam kolom afinitas dengan adanya fase gerak (dengan

pH yang tepat) dan komposisi pelarut untuk ikatan solut-ligan. Pelarut ini, yang

menggambarkan fase geraklemah pada kolom afinitas, disebut dengan bufer aplikasi.

Selama fase aplikasi pemisahan, senyawa-senyawa yang komplemen dengan ligan

afinitas akan berikatan karena sampel dilewatkan kolom dengan bufer aplikasi.

Meskipun demikian, karena selektifitas interaksi solut-Iigan yang tinggi, sampel-

sampel lain yang tidak terikat akan melewati kolom tanpa tertahan. Setelah

komponen-kopoe yag tidak tertaha telah terui seara sepura dari kolo, solut yang tertahan dapat dielusi dengan menggunakan pelarut yang mampu

mengeluarkannya dari kolom atau yang mampu memecah kompleks ligan-solut.

Pelarut ini merupakan fase gerak yang kuat dan seringkali dikenal sebagai bufer elusi.

Begitu solut yang dikehendaki keluar dari kolom, maka solut dapat diukur atau

dikumpulkan untuk penggunaan lebih lanjut. Kolom selanjutnya diiregenerasi dengan

cara mensetimbangkan kembali menggunakan bufer aplikasi sebelum injeksi lanjut

Komplementer molekul yang mengikat (ligan) pertama kovalen digabungkan ke larut

matriks, seperti kecil agarosa manik-manik, dan matriks dituangkan ke dalam kolom.

Suatu campuran tidak murni mengandung protein untuk diisolasi ini kemudian

diterapkan pada kolom dan memungkinkan untuk berinteraksi dengan ligan amobil

Pada tahap ini, protein yang akan diisolasi mengikat secara khusus untuk ligan amobil

sementara sisa molekul dalam aliran campuran melalui kolom. Protein kepentingan

kemudian dapat dielusi dari kolom di bawah kondisi yang mengganggu interaksinya

dengan ligan bufer pengelusi mengandung zat yang berfungsi untuk memutuskan

ikatan antara protein yang akan diambil dengan lingannya. Jadi, buffer pengelusi ini

dapat berkompetisi tempat dengan ligan terikat, sehingga protein lepas dan

selanjutnya keluar bersama eluen.

Munculnya puncak pada grafik serapan fraksi-fraksi protein hasil pemurnian

tergantung pada bufer pengelusi. Jika bufer pengelusi kurang kuat untuk memutuskan

ikatan antara ligan dengan protein, maka akan terjadi tailing, yaitu puncak yang

melebar. Selain itu, volume matriks juga mempengaruhi lebarnya puncak, karena ligan

yang ada semakin banyak. Jadi, semakin besar volume matriks semakin lebar puncak

serapan, sehingga protein yang dihasilkan lebih banyak.

Gambar 9. Prinsip Kerja Kromatografi Afinitas

4. Kromatografi Gas (Gas Chromatography)

Kromatografi gas adalah suatu metode yang didasarkan pemisahan fisik zat organik atau

anorganik yang stabil pada pemanasan dan mudah diatsirikan. Kromatografi sebagai

instrument untuk analisis fisika kimia menduduki posisi yang sangat penting dan banyak

dipakai, hal ini disebabkan oleh :

1. Aliran fase gerak (gas) sangat terkontrol dan kecepatannya tetap

2. Sangat mudah terjadi pencampuran uap sample ke dalam aliran fase gerak

3. Pemisahan fisik terjadi di dalam kolom yang jenisnya banyak sekali, panjang dan

suhunya dapat diatur.

4. Banyak detektor yang dapat dipakai.

5. Mudah digabung dengan instrumen lain (GC-MS, GC-FTIR-MS)

Kelima hal tersebut di atas telah melebarkan jangkauan penggunaan kromatografi gas yang

sampai saat ini secara luas banyak digunakan / dibutuhkan untuk analisis fisiko-kimia

(kualitatif dan kuantitatif).Pada kromatografi gas sample diuapkan di dalam gerbang suntik

(injection port) dan selanjutnya mengalami pemisahan fisik pada kolom setelah dielusi

dengan fase gerak (gas pembawa) yang inert (lembam). Ada dua metode kromatografi gas,

yaitu :

1. Kromatografi Gas Padat (KGP) : Fase diam pada KGP adalah butiran-butiran

adsorben padat dan fase geraknya adalah gas. Mekanisme pemisahan komponen

sample adalah perbedaan fisik adsorpsi oleh fase diam. Ada beberapa kelemahan

KGP yaitu : adsorpsi fase diam terhadap komponen-komponen sample bersifat

semipermanen terutama terhadap molekul yang aktif atau molekul yang polar. Di

samping itu, KGP sering kali memberikan bentuk kromatogram yang berekor.

Kelemahan yang lain dari KGP adalah efektivitas pemisahan komponen sanhat

dipengaruhi oleh bobot molekul. KGP lebih efektif untuk pemisahan komponen-

komponen dengan massa relative (Mr) rendah.

2. Kromatografi Gas Cair (KGC) dikemukakan pertama kali oleh Martin dan Synge.

Pada KGC sebagai fase diamnya adalah cairan yang disalut tipis pada permukaan

butiran padat sebagai pendukung, sedangkan fase geraknya adalah gas yang

lembam. mekanisme pemisahannya adalah perbedaaan partisi komponen-

komponen sample diantara fase diam dan fase geraknya.

Gambar 10. Kromatografi Gas

REVIEW JURNAL

Berdasarka jural Purifikasi Protein Fusi MBP-Mga Streptococcus pyogenes Hasil Ekspresi Heterolog di Escherichia coli (jurnal terlampir) telah dilakukan optimasi proses pemurnian protein fusi MBP-Mga Streptococcus pyogenes dari Escherichia coli pMALMga rekombinan yang

mengandung gen mga49. Pemurnian dilakukan menggunakan kolom kromatografi afinitas dengan

ligan amilosa. Kemudian di analisis menggunakan SDS-page dan menghasilkan pita tunggal dengan

ukuran 104 kDa yang menunjukkan protein fusi MBP-Mga murni.

Pemurnian terhadap protein ekstrak kasar E. coli pMALMga hasil overekspresi dilakukan

masing-masing 4 kali pengulangan untuk yang dicuci dengan bufer pencuci 100X volume kolom dan

4 kali pengulangan untuk yang dicuci dengan bufer pencuci 50X volume kolom. Hasil pengukuran

serapan fraksi-fraksi protein MBP-Mga hasil pemurnian dengan kolom resin amilosa yang

sebelumnya dicuci dengan bufer pencuci 100X volume kolom untuk 4 kali pengulangan masing-

masing menunjukkan 1,897 g/ml, 1,890 g/ml, 1,901 g/ml dan 1,898 g/ml. Sedangkan hasil

pengukuran serapan fraksi-fraksi protein MBP-Mga hasil pemurnian dengan kolom resin amilosa

yang sebelumnya dicuci dengan bufer pencuci 50X volume kolom untuk 4 kali pengulangan masing-

masing adalah 1,897 g/ml, 1,890 g/ml, 1,901 g/ml dan 1,898 g/ml.

Protein fusi MBP-Mga hasil pemurnian yang dicuci dengan bufer pencuci 100X volume kolom

terdapat pada fraksi ketiga sampai kelima, sedangkan protein fusi MBP-Mga hasil pemurnian yang

dicuci dengan bufer pencuci 50X volume kolom terdapat pada fraksi ketiga sampai ketujuh.

Munculnya puncak pada grafik serapan fraksi-fraksi protein fusi MBP-Mga hasil pemurnian

tergantung pada bufer pengelusi. Jika bufer pengelusi kurang kuat untuk memutuskan ikatan antara

ligan (amilosa) dengan protein fusi MBP-Mga, maka akan terjadi tailing, yaitu puncak yang melebar.

Selain itu, volume matriks juga mempengaruhi lebarnya puncak, karena ligan yang ada semakin

banyak. Jadi, semakin besar volume matriks semakin lebar puncak serapan, sehingga protein MBP-

Mga yang dihasilkan lebih banyak. Dari data hasil penelitian, diketahui bahwa pemurnian protein fusi

MBP-Mga dengan teknik kromatografi afinitas menggunakan kolom resin amilosa memberikan hasil

yang reprodusibel.

Kemudian dilakukan analisis SDS-Page untuk melihat hasil pemurnian dengan kolom resin

amilosa. Protein yang digunakan sebagai pembanding terhadap protein MBP-Mga murni hasil

pemurnian adalah protein marker dan protein ekstrak kasar E.Coli pMALMga yang diinduksi selama 2

jam dengan IPTG 0,3 mM dalam medium LB yang mengandung 0,2% glukosa. Hasil pemurnian

protein fusi MBP-Mga yang dicuci dengan bufer pencuci 100X dan 50X volume kolom memberikan

kadar yang hampir sama, tetapi pemurnian protein fusi MBP-Mga yang dicuci dengan bufer pencuci

100X volume kolom memberikan hasil yang lebih murni, karena pada elektroforegram memberikan

satu pita dengan massa molekul relatif sekitar 104 kDa. Protein Mga yang difusikan dengan protein

MBP terdiri dari 533 asam amino dan pI 5,88.