seminar ajeng siti fatimah g34061228anitanet.staff.ipb.ac.id/wp-content/plugins/as-pdf/achmad...

Achmad Farajallah | Seminar Ajeng Siti Fatimah G34061228Copyright Achmad Farajallah [email protected]://achamad.staff.ipb.ac.id/2011/11/29/seminar-ajeng-siti-fatimah-g34061228/

Seminar Ajeng Siti Fatimah G34061228

R Ajeng Siti Fatimah, Achmad Farajallah, Arif Wibowo. 2011. Karakterisasi GenomMitokondria Gen Cyt b pada Ikan Belida Anggota Famili Notopteridae.Diseminarkan tanggal 7 Januari 2011. Departemen Biologi FMIPA IPB.

PENDAHULUANLatar Belakang

Ikan belida merupakan ikan air tawar yang tergolong dalam famili Notopteridae,genus Chitala dengan daerah persebaran meliputi India, Pakistan, Bangladesh,Srilanka, Nepal, Thailand dan Indonesia (Jawa, Sumatera dan Kalimantan). Ikanbelida memiliki nilai ekonomi yang tinggi karena dagingnya yang enak selain itumemiliki pola sisik yang unik sehingga dimanfaatkan untuk ikan hias, di SumateraSelatan digunakan sebagai maskot dan pembuatan makanan khas lokal (Madang1999). Studi mengenai ikan air tawar memiliki aspek penting dalam biogeografi,karena persebarannya di laut (saltwater areas) yang tidak mudah dan garisevolusinya yang berkaitan erat dengan sejarah geologis (Inoue et al. 2009;Lundberg 1993)

Secara umum populasi Chitala sp. di seluruh dunia terus menurun. Penurunanpopulasi terutama diakibatkan kerusakan habitat dan penangkapan langsung darialam. Oleh karena itu, Conservation Assessment and Management Plan (CAMP)mengkategorikan Chitala sp. sebagai spesies langka (Sarkar et al. 2008).Pemerintah juga mengeluarkan SK Mentan No.716/Kpts/UM/ 10/1980 dan PP 7/1999yang menyatakan bahwa semua jenis ikan dari genus Chitala merupakan ikan yang

page 1 / 42


dilindungi. Salah satu upaya untuk melestarikan ikan belida ialah denganmengumpulkan informasi sebanyak-banyaknya baik informasi morfologi maupungenetik. Informasi genetik antara lain didapatkan dengan melakukan karakterisasigenom mitokondria sebagai dasar aplikasi lanjutan yang terkait dengan populasibelida.

Genom mitokondria hewan merupakan genom yang diwariskan secara maternaldan tidak mengalami rekombinasi. Dengan begitu, keragaman yang ditemukanpada genom mitokondria disebabkan oleh kejadian mutasi. Genom mitokondriatidak memiliki intron dan terdiri dari coding region dan non coding-region. Codingregion terdiri atas 2 gen penyandi rRNA, 22 tRNA, dan 13 protein, sedangkan noncoding-region merupakan satu ruas yang diduga berfungsi sebagai pengontroltranskripsi yang dikenal sebagai d-loop (Anderson et al. 1981; Avise JC 1994).Genom mitokondria sangat populer dijadikan sebagai penanda molekular untukmempelajari berbagai fenomena populasi hewan, baik analisis intraspesies maupuninterspesies (Moritz et al. 1987).

Tujuan

Penelitian ini bertujuan untuk mengkarakterisasi runutan nukleotida genommitokondria gen cyt b pada ikan belida anggota famili Notopteridae yang ada disungai Kampar sebagai dasar mempelajari populasi dan posisi filogenetiknya.

BAHAN DAN METODEBahan

Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah 12 sampel darah ikan belidayang diambil dari Sungai Kampar, Riau pada lima titik berbeda. Masing-masing titikberjarak antara 50-150 km. Sebanyak tiga sampel (WD22, WD23 dan WD24)berasal dari sungai Kampar kanan, Waduk Kuto Panjang, satu sampel (ST03) dariSungai Teso, tiga sampel (GG03, GG04 dan GG06) dari Langgam, dua sampel (KT10dan KT20) dari Kuala Tolam tiga sampel (RB08, RB09 dan RB11) dari Rantau Baru.Semua sampel yang digunakan merupakan koleksi Arif Wibowo SP. M.Si dari BalaiRiset Perikanan (BRP), Palembang.

Ekstraksi dan Isolasi DNA

page 2 / 42


Isolasi DNA dilakukan menggunakan Genomic DNA mini kit for blood (Geneaid) yangdimodifikasi. Sel-sel darah ikan belida yang disimpan dalam alkohol 70% dicucidengan air destilata dua kali kemudian disuspensikan dalam bufer STE (NaCl 1M,Tris-HCL 10mM, EDTA 0.1mM, pH 8) hingga volume 350µl. Sel-sel darah dilisisdengan SDS 1% dan proteinase K 0.125 mg/ml pada suhu 55oC selama 1 jam sambildikocok pelan. Metode ekstraksi DNA selanjutnya mengikuti petunjuk Genomic DNAmini kit for fresh blood (Geneaid).

Amplifikasi dan Visualisasi Fragmen DNA

Amplifikasi gen cyt b genom mitokondria menggunakan primer forward W8 danreverse W7 berdasarkan (Lavoue dan Sullivana (2004) yang mengapit ruas gen cytb. Pasangan primer ini mengapit ruas gen cyt b mulai dari basa ke-14359 hingga15594 dengan panjang 1236 nt.

Komposisi reaksi PCR dilakukan dengan volume akhir 50 µl terdiri atas sampel DNA5 µl, DW steril 16 µl, primer masing-masing 2 µl dan Taq ready mix 25 µl. ReaksiPCR dilakukan menggunakan mesin thermocycler BIOER dengan kondisi sebagaiberikut: tahap pradenaturasi 95°C selama 10 menit, tahap kedua yang terdiri dari35 siklus yang masing-masing mencakup tahap denaturasi 94°C selama satu menit,penempelan primer (annealing) pada suhu 42°C selama satu menit, pemanjangan (extension) pada suhu 72 °C selama 1,5 menit dan tahap terakhir yaitupemanjangan akhir (final extension) pada suhu 72 °C selama 7 menit. Produk PCRdiuji menggunakan PAGE 6% dalam bufer 1x TBE (10 Mm Tris-HCL, 1 M asam borat,dan EDTA 0.1 Mm) yang dijalankan pada kondisi 200 Mv selama 30 menit.Selanjutnya DNA diwarnai dengan pewarnaan sensitif perak (Tegelstrom 1986).

Tabel 1. Tujuh spesies anggota Notopteridae di GeneBank

No. No. Akses Spesies No.

No.Akses

Spesies

1 AP008921 Chitala blanci 5 AP008925

Notopterusnotopterus (Thai.)

page 3 / 42


2

page 4 / 42


AP008922

page 5 / 42


Chitala lopis

page 6 / 42


6

page 7 / 42


AP0089

page 8 / 42

Papyrocranus


26

page 9 / 42

congoensis


3

page 10 / 42


AP008923

page 11 / 42


Chitala ornate

page 12 / 42


7

page 13 / 42


AP008927

page 14 / 42


Xenomystus nigri

page 15 / 42


4

page 16 / 42


AP008924

page 17 / 42


Notopterusnotopterus (India)

page 18 / 42page 18 / 42


Perunutan Produk PCR

Produk PCR di atas gel poliakrilamid yang berukuran sesuai dengan desain primer dimurnikandengan metode agarose-gel-cutting yang diikuti dengan spin-coloumn DNA extraction from gel.Produk PCR yang sudah dimurnikan dijadikan cetakan dalam PCR for sequencing denganmenggunakan pasangan primer yang sama dengan ampilfikasi awal.

Analisis DNA

Hasil perunutan nukleotida diedit secara manual berdasarkan kromatogram. Runutan nukleotidayang sudah diedit kemudian saling disejajarkan dengan melibatkan beberapa runutan gen cyt banggota famili Notopteridae (Tabel 1) menggunakan Clustal W yang tertanam dalam MEGA 4.0(Molecular Evolutionary Genetics Analysis) (Kumar et al. 2008). Deskripsi perbandingan runutannukelotida dan analisis filogeni Neighbor Joining (NJ) dilakukan menggunakan MEGA 4.0berdasarkan model substitusi Kimura-2-paramater dengan bootstrap 1000x.

page 19 / 42


HASIL DAN PEMBAHASAN


Amplifikasi gen cyt b berhasil pada tujuh sampel (WD23, WD24, RB08, RB09, RB11, GG04 danGG06) menggunakan primer W8 dan W7 menunjukkan fragmen DNA multiband (Gambar 1). PitaDNA dengan ukuran yang sesuai target dipotong setelah dipisahkan menggunakan metode gelextraction-spin coloumn.

Gambar 1. Produk PCR hasil running menggunakan PAGE 6%. Kolom 1: RB 08, 2.RB09,3.RB11,4.WD23, 5. WD24, 6.GG04, 7.GG06,

Spesifisitas primer diduga merupakan penyebab terjadinya multiband. Primer yang digunakanmemiliki spesifitas 66% - 80% (forward) dan 76% - 86% (reverse) terhadap genom pada beberapaspesies pembanding.

page 20 / 42


Perunutan DNA

Keseluruhan sampel yang berhasil diamplifikasi berasal dari tiga lokasi yaitu Langgam (GG),Rantau Baru (RB) dan Waduk Kuto Panjang (WD) yang terdiri atas tujuh sampel yaitu RB08, RB09,RB11, GG04, GG06, WD23 dan WD24 menunjukkan homologi yang tinggi dengan spesiespembanding. Setelah diedit, panjang setiap sampel adalah 1047 nt dan rata-rata komposisinukleotida dari tujuh sampel tersebut ialah A= 29.2% ; T= 26.3% ; G= 13.8 % dan C= 30.7%. Dari1047 nt, sebanyak 1017 nt sama pada semua sampel. Sedangkan dari 30 nt berbeda yang terdiridari 1 nt mengalami insersi/delesi dan 24 nt mengalami substitusi hanya pada satu sampel.Sebanyak 5 nt berbeda minimal pada dua sampel. Laju insersi/delesi rendah pada coding region berbeda pada non-coding region yang memiliki laju insersi/delesinya lebih tinggi (Kumar S dan NeiM. 2000).

Analisis Filogeni

Analisis filogeni dilakukan menggunakan metode Kimura-2-parameter yaitu metode yangmenggunakan parameter transisi dan transversi untuk menghitung persentase besarnya perbedaanjarak genetik antar sampel. Topologi pohon filogeni menggunakan metode NJ dengan bootsrap1000x dan menggunakan data berdasarkan dua basa pertama setiap kodon (a) serta asam amino(b) dari tujuh sampel dan tujuh spesies pembanding. Substitusi sinonim seringkali terjadi di basake-1 dan ke-3 setiap kodon, sedangkan substitusi nonsinonim sering terjadi di basa ke-2 (Kumar Sdan Nei M 2000). Topografi keduanya menunjukkan bahwa ketujuh sampel dan Chitala lopis beradapada klade yang sama di kelompok 1. Jarak evolusi pada sampel WD 23 lebih besar dibandingkandengan sampel lainnya.

Gambar 2. Hasil rekonstruksi pohon filogeni pengelompokan tujuh sampel dan tujuh spesies

page 21 / 42


pembanding berdasarkan dua basa pertama setiap kodon (a) dan asam amino (b) pada ruas gencyt b mtDNA menggunakan metode NJ dengan bootsrap 1000x

Secara geografis, distribusi Notopteridae dibagi menjadi dua yaitu, Notopteridae Afrika danNotopteridae Asia. Kelompok 3 termasuk dalam Notopteridae Afrika sedangkan kelompok 1 dan 2termasuk dalam Notopteridae Asia (Roberts 1992). Notopteridae Afrika lebih berpotensial untukbermigrasi ke Asia yang dijelaskan ke dalam beberapa model distribusi (Inoue et al. 2009).

Jika runutan nukleotida pembanding ikut dianalisis, rasio transisi terhadap transversi yang terkecilyaitu 0 ditemukan antara RB09 dengan RB11, sedangkan yang terbesar yaitu 9.3 ditemukan antaraC. ornata dengan GG06. Persentase rasio yang bernilai ≤ 1 adalah 38.5% sedangkan persentaserasio yang bernilai >1 adalah 61.5%. Pada gen cyt b, laju transisi lebih besar daripada lajutransversi. Jarak genetik merupakan nilai kekerabatan yang diukur dari jumlah mutasi nukleotidadan dianalisis berdasarkan dua basa pertama setiap kodon. Sampel RB09 dan RB11 tidak memilikijarak genetik, sedangkan jarak terbesar ditemukan antara spesies pembanding Papyrocranus danWD23 sebesar 0.102 dengan 232 nt yang berbeda.

Waduk Kuto Panjang berada di bagian hulu Sungai Kampar sedangkan Langgam dan Rantau Barurelatif berada di antara hulu dan hilir. Semakin ke hilir, badan sungai dan volume air semakin besarkarena adanya tambahan air dari anak sungai lainnya yang akan bermuara ke Selat Malaka.Semakin panjang dan lebar ukuran sungai maka keragaman ikannya akan semakin tinggi (Kottelat et al. 1996). Keragaman berkaitan dengan kekerabatan suatu populasi dan dapat dilihat dari jarakgenetiknya. Rata-rata jarak genetik antara populasi Langgam dengan Rantau Baru dan Waduk KutoPanjang berturut-turut adalah 0.003 dan 0.016, sedangkan antara Rantau Baru dengan Waduk KutoPanjang adalah 0.014. Rata-rata jarak genetik intrapopulasi Langgam, Rantau Baru dan Waduk KutoPanjang berturut adalah 0.004, 0.003 dan 0.023. Rata-rata keragaman seluruh populasi sampelberdasarkan dua basa pertama setiap kodon adalah 0.01.

SIMPULAN DAN SARAN

Gen cyt b mtDNA pada tujuh sampel yang berasal dari sungai Kampar, Riau berada dalamkelompok yang sama dengan gen cyt b mtDNA dari Chitala lopis. Berdasarkan rasiotransisi/transversi antar sampel dan spesies pembanding jenis mutasi substitusi transisi lebih seringterjadi daripada transversi. Kekerabatan interpopulasi yang terdekat ialah antara Langgam dengan

page 22 / 42


Rantau Baru sedangkan kekerabatan intrapopulasi yang paling erat terdapat pada populasi RantauBaru. Penelitian ini memerlukan penelitian lebih lanjut dengan menggunakan ruas gen selain cyt bpada mtDNA dan pengambilan sampel dari berbagai populasi dan lokasi yang berbeda di Indonesiauntuk membuktikan kekerabatan antara sampel dengan C.lopis

DAFTAR PUSTAKA

Anderson S et al. 1981. Sequence and Organization of the Human Mitochondrial Genome. Nature 290:457-74.

Avise JC. 1994. Moleculars Marker, Natural History and Evolution. New York: Chapman&Hall.

Inoue JG, Kumazawa Y, Miya M ,Nishida M. 2009. The Historical Biogeography of the Freshwater

Knifefishes Using Mitogenomic Approaches: A Mesozoic Origin of the Asian Notopterids(Actinopterygii: Osteoglossomorpha). Mol Phyl and Evol 51:486–499.

Kottelat M, Whitten JA, Wirjoatmodjo S, Kartikasari SN. 1996. Freshwater Fishes of WesternIndonesia and Sulawesi. Jakarta: Periplus Edition Ltd.

Kumar S, Nei M. 2000. Molecular Evolution and Phylogenetics. New York: Oxford University Press.

Kumar S, Dudley J, Nei M, Tamura K. 2008. MEGA: A Biologist-Centric Software for

Evolutionary Analysis of DNA and Protein Sequences. Brief in Bioin 9: 299-306.

page 23 / 42


Lavoue´ S, Sullivana JP. 2004. Simultaneous Analysis of Five Molecular Markers Provides aWell-Supported Phylogenetic Hypothesis for the Living Bony-Tongue Fishes (Osteoglossomorpha:Teleostei). Mol Phyl and Evol 33:171–185.

Lundberg JG. 1993. African-South American Freshwater Fish Clades and Continental Drift: Problemswith Paradigm. Di dalam: Goldblatt P, editor. Biological relationship between Africa and SouthAmerica. New Haven: Yale University Press. hlm 156-159.

Madang K. 1999. Morfologi Habitat dan Keragaman Genetik Kerabat Ikan Belida Di PerairanSumatera Selatan [disertasi].Bogor: Program Pasca Sarjana, Institut Pertanian Bogor.

Moritz C, Dowling TE, Brown WM. 1987. Evolution of Animal Mitochondrial DNA: Relevance forPopulation Biology and Systematic. Ann Rev Ecol Syst 18:269-291.

Roberts TR. 1992. Systematic Revision of the Old World Freshwater Fish Family Notopteridae. Ichthyol Explor Freshwater 2:361-383.

Sarkar UK, Negi RS, Deepak PK, LakraWS, Paul SK. 2008. Biological Parameters of the EndangeredFish Chitala chitala (Osteoglossiformes: Notopteridae) from some Indian Rivers. Fisheries Research90:170–177.

Tegelstrom H. 1986. Mitochondrial DNA in Natural Populations: an Improved Routine for the

Screening of Genetic Variation Based on Sensitive Silver Staining. Electrophoresis 7:226-229.

page 24 / 42


R Ajeng Siti Fatimah, Achmad Farajallah, Arif Wibowo. 2011. Karakterisasi Genom MitokondriaGen Cyt b pada Ikan Belida Anggota Famili Notopteridae. Diseminarkan tanggal 7 Januari2011. Departemen Biologi FMIPA IPB.


Ikan belida merupakan ikan air tawar yang tergolong dalam famili Notopteridae, genus Chitaladengan daerah persebaran meliputi India, Pakistan, Bangladesh, Srilanka, Nepal, Thailand danIndonesia (Jawa, Sumatera dan Kalimantan). Ikan belida memiliki nilai ekonomi yang tinggi karenadagingnya yang enak selain itu memiliki pola sisik yang unik sehingga dimanfaatkan untuk ikanhias, di Sumatera Selatan digunakan sebagai maskot dan pembuatan makanan khas lokal (Madang1999). Studi mengenai ikan air tawar memiliki aspek penting dalam biogeografi, karenapersebarannya di laut (saltwater areas) yang tidak mudah dan garis evolusinya yang berkaitan eratdengan sejarah geologis (Inoue et al. 2009; Lundberg 1993)

Secara umum populasi Chitala sp. di seluruh dunia terus menurun. Penurunan populasi terutamadiakibatkan kerusakan habitat dan penangkapan langsung dari alam. Oleh karena itu, ConservationAssessment and Management Plan (CAMP) mengkategorikan Chitala sp. sebagai spesies langka(Sarkar et al. 2008). Pemerintah juga mengeluarkan SK Mentan No.716/Kpts/UM/ 10/1980 dan PP7/1999 yang menyatakan bahwa semua jenis ikan dari genus Chitala merupakan ikan yangdilindungi. Salah satu upaya untuk melestarikan ikan belida ialah dengan mengumpulkan informasisebanyak-banyaknya baik informasi morfologi maupun genetik. Informasi genetik antara laindidapatkan dengan melakukan karakterisasi genom mitokondria sebagai dasar aplikasi lanjutanyang terkait dengan populasi belida.

page 25 / 42


Genom mitokondria hewan merupakan genom yang diwariskan secara maternal dan tidakmengalami rekombinasi. Dengan begitu, keragaman yang ditemukan pada genom mitokondriadisebabkan oleh kejadian mutasi. Genom mitokondria tidak memiliki intron dan terdiri dari codingregion dan non coding-region. Coding region terdiri atas 2 gen penyandi rRNA, 22 tRNA, dan 13protein, sedangkan non coding-region merupakan satu ruas yang diduga berfungsi sebagaipengontrol transkripsi yang dikenal sebagai d-loop (Anderson et al. 1981; Avise JC 1994). Genommitokondria sangat populer dijadikan sebagai penanda molekular untuk mempelajari berbagaifenomena populasi hewan, baik analisis intraspesies maupun interspesies (Moritz et al. 1987).

Tujuan

Penelitian ini bertujuan untuk mengkarakterisasi runutan nukleotida genom mitokondria gen cyt bpada ikan belida anggota famili Notopteridae yang ada di sungai Kampar sebagai dasarmempelajari populasi dan posisi filogenetiknya.


Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah 12 sampel darah ikan belida yang diambil dariSungai Kampar, Riau pada lima titik berbeda. Masing-masing titik berjarak antara 50-150 km.Sebanyak tiga sampel (WD22, WD23 dan WD24) berasal dari sungai Kampar kanan, Waduk KutoPanjang, satu sampel (ST03) dari Sungai Teso, tiga sampel (GG03, GG04 dan GG06) dari Langgam,dua sampel (KT10 dan KT20) dari Kuala Tolam tiga sampel (RB08, RB09 dan RB11) dari RantauBaru. Semua sampel yang digunakan merupakan koleksi Arif Wibowo SP. M.Si dari Balai RisetPerikanan (BRP), Palembang.


Isolasi DNA dilakukan menggunakan Genomic DNA mini kit for blood (Geneaid) yang dimodifikasi.Sel-sel darah ikan belida yang disimpan dalam alkohol 70% dicuci dengan air destilata dua kalikemudian disuspensikan dalam bufer STE (NaCl 1M, Tris-HCL 10mM, EDTA 0.1mM, pH 8) hinggavolume 350µl. Sel-sel darah dilisis dengan SDS 1% dan proteinase K 0.125 mg/ml pada suhu 55oCselama 1 jam sambil dikocok pelan. Metode ekstraksi DNA selanjutnya mengikuti petunjuk GenomicDNA mini kit for fresh blood (Geneaid).


page 26 / 42


Amplifikasi gen cyt b genom mitokondria menggunakan primer forward W8 dan reverse W7 berdasarkan (Lavoue dan Sullivana (2004) yang mengapit ruas gen cyt b. Pasangan primer inimengapit ruas gen cyt b mulai dari basa ke-14359 hingga 15594 dengan panjang 1236 nt.

Komposisi reaksi PCR dilakukan dengan volume akhir 50 µl terdiri atas sampel DNA 5 µl, DW steril16 µl, primer masing-masing 2 µl dan Taq ready mix 25 µl. Reaksi PCR dilakukan menggunakanmesin thermocycler BIOER dengan kondisi sebagai berikut: tahap pradenaturasi 95°C selama 10menit, tahap kedua yang terdiri dari 35 siklus yang masing-masing mencakup tahap denaturasi94°C selama satu menit, penempelan primer (annealing) pada suhu 42°C selama satu menit,pemanjangan (extension) pada suhu 72 °C selama 1,5 menit dan tahap terakhir yaitu pemanjanganakhir (final extension) pada suhu 72 °C selama 7 menit. Produk PCR diuji menggunakan PAGE 6%dalam bufer 1x TBE (10 Mm Tris-HCL, 1 M asam borat, dan EDTA 0.1 Mm) yang dijalankan padakondisi 200 Mv selama 30 menit. Selanjutnya DNA diwarnai dengan pewarnaan sensitif perak(Tegelstrom 1986).



No.Akses

Spesies



2 AP008922 Chitala lopis 6 AP008926

Papyrocranuscongoensis

3 AP008923 Chitala ornate 7 AP008927

Xenomystus nigri

4 AP008924 Notopterus notopterus (India)

page 27 / 42




Analisis DNA



page 28 / 42






Perunutan DNA

Keseluruhan sampel yang berhasil diamplifikasi berasal dari tiga lokasi yaitu Langgam (GG),Rantau Baru (RB) dan Waduk Kuto Panjang (WD) yang terdiri atas tujuh sampel yaitu RB08, RB09,RB11, GG04, GG06, WD23 dan WD24 menunjukkan homologi yang tinggi dengan spesiespembanding. Setelah diedit, panjang setiap sampel adalah 1047 nt dan rata-rata komposisinukleotida dari tujuh sampel tersebut ialah A= 29.2% ; T= 26.3% ; G= 13.8 % dan C= 30.7%. Dari1047 nt, sebanyak 1017 nt sama pada semua sampel. Sedangkan dari 30 nt berbeda yang terdiri

page 29 / 42


dari 1 nt mengalami insersi/delesi dan 24 nt mengalami substitusi hanya pada satu sampel.Sebanyak 5 nt berbeda minimal pada dua sampel. Laju insersi/delesi rendah pada coding region berbeda pada non-coding region yang memiliki laju insersi/delesinya lebih tinggi (Kumar S dan NeiM. 2000).

Analisis Filogeni

Analisis filogeni dilakukan menggunakan metode Kimura-2-parameter yaitu metode yangmenggunakan parameter transisi dan transversi untuk menghitung persentase besarnya perbedaanjarak genetik antar sampel. Topologi pohon filogeni menggunakan metode NJ dengan bootsrap1000x dan menggunakan data berdasarkan dua basa pertama setiap kodon (a) serta asam amino(b) dari tujuh sampel dan tujuh spesies pembanding. Substitusi sinonim seringkali terjadi di basake-1 dan ke-3 setiap kodon, sedangkan substitusi nonsinonim sering terjadi di basa ke-2 (Kumar Sdan Nei M 2000). Topografi keduanya menunjukkan bahwa ketujuh sampel dan Chitala lopis beradapada klade yang sama di kelompok 1. Jarak evolusi pada sampel WD 23 lebih besar dibandingkandengan sampel lainnya.

Gambar 2. Hasil rekonstruksi pohon filogeni pengelompokan tujuh sampel dan tujuh spesiespembanding berdasarkan dua basa pertama setiap kodon (a) dan asam amino (b) pada ruas gencyt b mtDNA menggunakan metode NJ dengan bootsrap 1000x


page 30 / 42



Waduk Kuto Panjang berada di bagian hulu Sungai Kampar sedangkan Langgam dan Rantau Barurelatif berada di antara hulu dan hilir. Semakin ke hilir, badan sungai dan volume air semakin besarkarena adanya tambahan air dari anak sungai lainnya yang akan bermuara ke Selat Malaka.Semakin panjang dan lebar ukuran sungai maka keragaman ikannya akan semakin tinggi (Kottelat et al. 1996). Keragaman berkaitan dengan kekerabatan suatu populasi dan dapat dilihat dari jarakgenetiknya. Rata-rata jarak genetik antara populasi Langgam dengan Rantau Baru dan Waduk KutoPanjang berturut-turut adalah 0.003 dan 0.016, sedangkan antara Rantau Baru dengan Waduk KutoPanjang adalah 0.014. Rata-rata jarak genetik intrapopulasi Langgam, Rantau Baru dan Waduk KutoPanjang berturut adalah 0.004, 0.003 dan 0.023. Rata-rata keragaman seluruh populasi sampelberdasarkan dua basa pertama setiap kodon adalah 0.01.

SIMPULAN DAN SARAN

Gen cyt b mtDNA pada tujuh sampel yang berasal dari sungai Kampar, Riau berada dalamkelompok yang sama dengan gen cyt b mtDNA dari Chitala lopis. Berdasarkan rasiotransisi/transversi antar sampel dan spesies pembanding jenis mutasi substitusi transisi lebih seringterjadi daripada transversi. Kekerabatan interpopulasi yang terdekat ialah antara Langgam denganRantau Baru sedangkan kekerabatan intrapopulasi yang paling erat terdapat pada populasi RantauBaru. Penelitian ini memerlukan penelitian lebih lanjut dengan menggunakan ruas gen selain cyt bpada mtDNA dan pengambilan sampel dari berbagai populasi dan lokasi yang berbeda di Indonesiauntuk membuktikan kekerabatan antara sampel dengan C.lopis

DAFTAR PUSTAKA

page 31 / 42












page 32 / 42








R Ajeng Siti Fatimah, Achmad Farajallah, Arif Wibowo. 2011. Karakterisasi Genom MitokondriaGen Cyt b pada Ikan Belida Anggota Famili Notopteridae. Diseminarkan tanggal 7 Januari2011. Departemen Biologi FMIPA IPB.

page 33 / 42



Ikan belida merupakan ikan air tawar yang tergolong dalam famili Notopteridae, genus Chitaladengan daerah persebaran meliputi India, Pakistan, Bangladesh, Srilanka, Nepal, Thailand danIndonesia (Jawa, Sumatera dan Kalimantan). Ikan belida memiliki nilai ekonomi yang tinggi karenadagingnya yang enak selain itu memiliki pola sisik yang unik sehingga dimanfaatkan untuk ikanhias, di Sumatera Selatan digunakan sebagai maskot dan pembuatan makanan khas lokal (Madang1999). Studi mengenai ikan air tawar memiliki aspek penting dalam biogeografi, karenapersebarannya di laut (saltwater areas) yang tidak mudah dan garis evolusinya yang berkaitan eratdengan sejarah geologis (Inoue et al. 2009; Lundberg 1993)

Secara umum populasi Chitala sp. di seluruh dunia terus menurun. Penurunan populasi terutamadiakibatkan kerusakan habitat dan penangkapan langsung dari alam. Oleh karena itu, ConservationAssessment and Management Plan (CAMP) mengkategorikan Chitala sp. sebagai spesies langka(Sarkar et al. 2008). Pemerintah juga mengeluarkan SK Mentan No.716/Kpts/UM/ 10/1980 dan PP7/1999 yang menyatakan bahwa semua jenis ikan dari genus Chitala merupakan ikan yangdilindungi. Salah satu upaya untuk melestarikan ikan belida ialah dengan mengumpulkan informasisebanyak-banyaknya baik informasi morfologi maupun genetik. Informasi genetik antara laindidapatkan dengan melakukan karakterisasi genom mitokondria sebagai dasar aplikasi lanjutanyang terkait dengan populasi belida.

Genom mitokondria hewan merupakan genom yang diwariskan secara maternal dan tidakmengalami rekombinasi. Dengan begitu, keragaman yang ditemukan pada genom mitokondriadisebabkan oleh kejadian mutasi. Genom mitokondria tidak memiliki intron dan terdiri dari codingregion dan non coding-region. Coding region terdiri atas 2 gen penyandi rRNA, 22 tRNA, dan 13protein, sedangkan non coding-region merupakan satu ruas yang diduga berfungsi sebagaipengontrol transkripsi yang dikenal sebagai d-loop (Anderson et al. 1981; Avise JC 1994). Genommitokondria sangat populer dijadikan sebagai penanda molekular untuk mempelajari berbagaifenomena populasi hewan, baik analisis intraspesies maupun interspesies (Moritz et al. 1987).

Tujuan

Penelitian ini bertujuan untuk mengkarakterisasi runutan nukleotida genom mitokondria gen cyt bpada ikan belida anggota famili Notopteridae yang ada di sungai Kampar sebagai dasarmempelajari populasi dan posisi filogenetiknya.

page 34 / 42



Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah 12 sampel darah ikan belida yang diambil dariSungai Kampar, Riau pada lima titik berbeda. Masing-masing titik berjarak antara 50-150 km.Sebanyak tiga sampel (WD22, WD23 dan WD24) berasal dari sungai Kampar kanan, Waduk KutoPanjang, satu sampel (ST03) dari Sungai Teso, tiga sampel (GG03, GG04 dan GG06) dari Langgam,dua sampel (KT10 dan KT20) dari Kuala Tolam tiga sampel (RB08, RB09 dan RB11) dari RantauBaru. Semua sampel yang digunakan merupakan koleksi Arif Wibowo SP. M.Si dari Balai RisetPerikanan (BRP), Palembang.


Isolasi DNA dilakukan menggunakan Genomic DNA mini kit for blood (Geneaid) yang dimodifikasi.Sel-sel darah ikan belida yang disimpan dalam alkohol 70% dicuci dengan air destilata dua kalikemudian disuspensikan dalam bufer STE (NaCl 1M, Tris-HCL 10mM, EDTA 0.1mM, pH 8) hinggavolume 350µl. Sel-sel darah dilisis dengan SDS 1% dan proteinase K 0.125 mg/ml pada suhu 55oCselama 1 jam sambil dikocok pelan. Metode ekstraksi DNA selanjutnya mengikuti petunjuk GenomicDNA mini kit for fresh blood (Geneaid).


Amplifikasi gen cyt b genom mitokondria menggunakan primer forward W8 dan reverse W7 berdasarkan (Lavoue dan Sullivana (2004) yang mengapit ruas gen cyt b. Pasangan primer inimengapit ruas gen cyt b mulai dari basa ke-14359 hingga 15594 dengan panjang 1236 nt.

Komposisi reaksi PCR dilakukan dengan volume akhir 50 µl terdiri atas sampel DNA 5 µl, DW steril16 µl, primer masing-masing 2 µl dan Taq ready mix 25 µl. Reaksi PCR dilakukan menggunakanmesin thermocycler BIOER dengan kondisi sebagai berikut: tahap pradenaturasi 95°C selama 10menit, tahap kedua yang terdiri dari 35 siklus yang masing-masing mencakup tahap denaturasi94°C selama satu menit, penempelan primer (annealing) pada suhu 42°C selama satu menit,pemanjangan (extension) pada suhu 72 °C selama 1,5 menit dan tahap terakhir yaitu pemanjanganakhir (final extension) pada suhu 72 °C selama 7 menit. Produk PCR diuji menggunakan PAGE 6%dalam bufer 1x TBE (10 Mm Tris-HCL, 1 M asam borat, dan EDTA 0.1 Mm) yang dijalankan pada

page 35 / 42


kondisi 200 Mv selama 30 menit. Selanjutnya DNA diwarnai dengan pewarnaan sensitif perak(Tegelstrom 1986).



No.Akses

Spesies



2 AP008922 Chitala lopis 6 AP008926

Papyrocranuscongoensis

3 AP008923 Chitala ornate 7 AP008927

Xenomystus nigri

4 AP008924 Notopterus notopterus (India)


page 36 / 42



Analisis DNA





page 37 / 42




Perunutan DNA

Keseluruhan sampel yang berhasil diamplifikasi berasal dari tiga lokasi yaitu Langgam (GG),Rantau Baru (RB) dan Waduk Kuto Panjang (WD) yang terdiri atas tujuh sampel yaitu RB08, RB09,RB11, GG04, GG06, WD23 dan WD24 menunjukkan homologi yang tinggi dengan spesiespembanding. Setelah diedit, panjang setiap sampel adalah 1047 nt dan rata-rata komposisinukleotida dari tujuh sampel tersebut ialah A= 29.2% ; T= 26.3% ; G= 13.8 % dan C= 30.7%. Dari1047 nt, sebanyak 1017 nt sama pada semua sampel. Sedangkan dari 30 nt berbeda yang terdiridari 1 nt mengalami insersi/delesi dan 24 nt mengalami substitusi hanya pada satu sampel.Sebanyak 5 nt berbeda minimal pada dua sampel. Laju insersi/delesi rendah pada coding region berbeda pada non-coding region yang memiliki laju insersi/delesinya lebih tinggi (Kumar S dan NeiM. 2000).

Analisis Filogeni

Analisis filogeni dilakukan menggunakan metode Kimura-2-parameter yaitu metode yangmenggunakan parameter transisi dan transversi untuk menghitung persentase besarnya perbedaanjarak genetik antar sampel. Topologi pohon filogeni menggunakan metode NJ dengan bootsrap1000x dan menggunakan data berdasarkan dua basa pertama setiap kodon (a) serta asam amino

page 38 / 42


(b) dari tujuh sampel dan tujuh spesies pembanding. Substitusi sinonim seringkali terjadi di basake-1 dan ke-3 setiap kodon, sedangkan substitusi nonsinonim sering terjadi di basa ke-2 (Kumar Sdan Nei M 2000). Topografi keduanya menunjukkan bahwa ketujuh sampel dan Chitala lopis beradapada klade yang sama di kelompok 1. Jarak evolusi pada sampel WD 23 lebih besar dibandingkandengan sampel lainnya.

Gambar 2. Hasil rekonstruksi pohon filogeni pengelompokan tujuh sampel dan tujuh spesiespembanding berdasarkan dua basa pertama setiap kodon (a) dan asam amino (b) pada ruas gencyt b mtDNA menggunakan metode NJ dengan bootsrap 1000x



Waduk Kuto Panjang berada di bagian hulu Sungai Kampar sedangkan Langgam dan Rantau Barurelatif berada di antara hulu dan hilir. Semakin ke hilir, badan sungai dan volume air semakin besar

page 39 / 42


karena adanya tambahan air dari anak sungai lainnya yang akan bermuara ke Selat Malaka.Semakin panjang dan lebar ukuran sungai maka keragaman ikannya akan semakin tinggi (Kottelat et al. 1996). Keragaman berkaitan dengan kekerabatan suatu populasi dan dapat dilihat dari jarakgenetiknya. Rata-rata jarak genetik antara populasi Langgam dengan Rantau Baru dan Waduk KutoPanjang berturut-turut adalah 0.003 dan 0.016, sedangkan antara Rantau Baru dengan Waduk KutoPanjang adalah 0.014. Rata-rata jarak genetik intrapopulasi Langgam, Rantau Baru dan Waduk KutoPanjang berturut adalah 0.004, 0.003 dan 0.023. Rata-rata keragaman seluruh populasi sampelberdasarkan dua basa pertama setiap kodon adalah 0.01.

SIMPULAN DAN SARAN

Gen cyt b mtDNA pada tujuh sampel yang berasal dari sungai Kampar, Riau berada dalamkelompok yang sama dengan gen cyt b mtDNA dari Chitala lopis. Berdasarkan rasiotransisi/transversi antar sampel dan spesies pembanding jenis mutasi substitusi transisi lebih seringterjadi daripada transversi. Kekerabatan interpopulasi yang terdekat ialah antara Langgam denganRantau Baru sedangkan kekerabatan intrapopulasi yang paling erat terdapat pada populasi RantauBaru. Penelitian ini memerlukan penelitian lebih lanjut dengan menggunakan ruas gen selain cyt bpada mtDNA dan pengambilan sampel dari berbagai populasi dan lokasi yang berbeda di Indonesiauntuk membuktikan kekerabatan antara sampel dengan C.lopis

DAFTAR PUSTAKA




page 40 / 42












page 41 / 42

seminar ajeng siti fatimah g34061228anitanet.staff.ipb.ac.id/wp-content/plugins/as-pdf/achmad...

Documents