percobaan mikro p1

25

Click here to load reader

Upload: ttyas

Post on 26-Jun-2015

569 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

Page 1: PERCOBAAN mikro p1

PERCOBAAN

TEKNIK ASEPTIS DAN PENGECATAN GRAM

I. TUJUAN

Setelah mengikuti praktikum ini mahasiswa diharapkan :

1. Mampu memahami pentingnya teknik aseptis dalam bekerja di

laboratorium mikrobiologi farmasi.

2. Mahasiswa mampu memahami teknik pengecatan Gram

Mahasiswa mampu melakukan pengamatan bakteri secara mikroskopis dengan melihat warna, bentuk, dan susunan bakteri

II. DASAR TEORI

Sterilisasi merupakan Metode praktis yang dirancang untuk membersihkan

dari mikroorganisme, atau sengaja untuk menghambat pertumbuhannya, yang nyata

dari kepentingan dasar di banyak keadaan. Jenis dari mikroorganisme sangat berbeda

dalam kelemahannya terdapat berbagai macam agen antimikroba, dan lebih banyak

lagi, afek yang praktis dari agen ini pada adanya keadaan nyatayang sangat besar

dipengaruhi oleh keadaan sekitar. Banyak yang akan bertahan, contohnya, pada

cuaca tertentu organisme memiliki kulit, pada beberapa tubuh zat cair atau pada

udara, Air, makanan, kotoran, atau ruangan berdebu. Caranya harus dirubah, oleh

karena itu, dengan masalah nyata. Hal ini tidak mungkin, bagaimanapun pada garis

besarnya tentunya prinsip dasar digaris bawahi pada umumnya digunakan cara untuk

memusnahkan dan mengontrol kehidupan mikroba (1). Dan untuk aseptis adalah bebas

atau menggunakan metode untuk tetap bebas dari mikroorganisme patologis (3).

Cara kerja sterilisasi adalah cara kerja agar terhindar dari kontaminasi, cara

kerja steril ini digunakan pada pembuatan media, pemeriksaan kultur dan pembuatan

preparat. Sterilisasi dapat dilakukan secara; (1) Fisik di bagi menjadi beberapa bagian

Page 2: PERCOBAAN mikro p1

antara lain (a) dengan ”Hot air Sterilization” oven. Bahan dari gelas dibungkus

dengan alumunium foil, suhu 170-250°C selama 2 jam. (b) panas basah dengan

tekanan, suhu 121°C selama 15 menit. Alat yang digunakan adalah autoclave,

caranya: alat-alat gelas dibungkus lagi dengan alumunium foil. (c) Pressure Cooker,

caranya: panaskan air mendidih, biarkan klep uap terbuka agar keluar uap kemudian

klep uap ditutup, lihat suhu dan tekanan, bila suhu telah 121°C dengan tekanan 1,5

atm, dijaga konstan selama 15 menit. Kemudian buka klep uap hingga tercapai

tekanan nol, dan setelah suhu mencapai suhu kamar, alat dan bahan dikeluarkan. (2)

Kimia yaitu dengan menggunakan zat-zat kimia seperti desinfektan, antiseptik. (3)

Radiasi yaitu dengan menggunakan sinar Ultraviolet, biasanya digunakan pada

ruangan dan alat-alat plastik. (4) Filter yaitu dengan menggunakan membran filter

dan Vacum Pump (2).

Zat warna pada umumnya digunakan senyawa-senyawa garam yang salah

satu ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion muatan negative dan ion muatan positif,

senyawa kimia ini digunakan untuk membedakan mikroba karena hasilnya

menunjukan warna yang berbeda untuk masing-masing mikroba (2).

Tujuan dari pewarnaan adalah memudahkan melihat mikroba dengan

mikroskop; memperjelas ukuran dan bentuk mikroba; melihat stuktur luar dan dalam

bakteri; menghasilkan sifat fisik dan kimia khas dari bakteri dengan zat warna.

Factor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan, antara lain :

1. Fiksasi

Fiksasi bertujuan untuk melekatkan mikroba pada gelas objek, membunuh

microbe secara tepat tanpa merubah bentuk dan strukturnya, mengubah

afinitas pada zat warna.

2. Peluntur zat warna (decolorizer), berfungsi untuk menghasilkan kontras

yang baik pada bayangan mikroskop. Pada umumnya sel-sel yang mudah

diwarnai akan mudah pula dilunturkan warnanya, sedangkan untuk sel-sel

yang sukar diwarnai akan sulit dilunturkan warnanya.

3. Intensifikasi zat warna

Page 3: PERCOBAAN mikro p1

Intensifikasi zat warna dilakukan dengan cara mempertinggi kadar zat

warna, mempertinggi suhu pewarnaan dan menambahkan suatu mordan.

Mordan adalah suatu zat kimia yang dapat menyebabkan sel-sel mikroba

dapat diwarnai intensif sehingga zat warna terikat lebih kuat pada jaringan

sel dibandigkan bila tidak diberi mordan.

4. Substrat

Substrat organic seperti lipid, asam nukleat, dan karbohidrat dapat

mempengaruhi pewarnaan.

5. Zat warna penutup (Counterstain)

Zat warna penutup biasanya digunakan terakhir bertujuan untuk

memberikan kontras pada sel-sel yang tidak menyerap warna utama. Hal

ini dilakukan pada pross pewarnaan gram. Zat sebagai penutup, antara

lai : metilen blue; safranin, erythosin, tergantung pada metode pengecatan (2).

Proses pewarnaan pada mikroorganisme bermacam-macam sesuai dari tujuan

pengamatan, antara lain :

1. Pengecatan Gram

Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen

dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran

sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding

sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel.

Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang

tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negatif lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm) (5).

SIFAT GRAM POSITIF GRAM NEGATIF

Komposisi dinding sel Kandungan lipid rendah Lipid tinggi

Page 4: PERCOBAAN mikro p1

Ketahanan terhadap

penisilin

Lebih sensitif Lebih tahan

Penghambatan warna basa Lebih dihambat Kurang dihambat

Kebutuhan nutrien Kompleks Relatif sederhana

Ketahanan terhadap

perlakuan fisik

Lebih tahan Kurang tahan

Genus bakteri yang termasuk gram negatif adalah Enterobactericeae,

Salmonella spp, Shigella spp, E. Coli, Yersinia enterolitica. Sedangkan bakteri gram

positif adalah Staphylococci, Streptococci, Enterococci, Clostridium, Bacillus(3).

Pada saat pemberian larutan cat kristal violet, bakteri gram positif dan negatif

sama-sama berwarna ungu. Saat ditetesi iodin, pada gram positif terbentuk kompleks

iodin kristal violet sehingga sel berwarna biru, demikian juga gram negatif. Namun

setelah pencucian dengan etanol warna ungu yang diikat oleh bakteri gram negatif

luntur, sedangkan pada bakteri gram positif tidak. Pada gram negatif lemak

terekstraksi dari dinding sel sehingga pori membesar dan kompleks violet kristal-

iodin keluar sel, sedangkan pada gram posotif dinding sel dehidrasi, pori berkerut

dan permeabilitas rendah sehingga kompleks violet kristal-iodin terperangkap antara

dinding sel dan membran sitoplasm sehingga sel tetap biru/ungu. Saat penambahan

safranin, bakteri gram negatif mengikatnya sedangkan gram positif melewatkannya(4).

2. Pewarnaan sederhana

Zat warna yang digunakan hanya satu warna, hal ini dimaksudkan untuk

meningkatkan kontras antara mikroorganisme dan sekelilingnya. Zat warna yang

digunakan lazimnya adalah kristal violet, metilen blue, karbol fuksasin basa, safranin

atau hijau malakit. Zat warna asam yang sering digunakan adalah nigrosin dan merah

kongo. Prosedur pada pewarnaan ini mudah dan cepat, sehingga pewarnaan ini

digunakan untuk melihat bentuk, ukuran dan penatalaksanaan mikroorganisme (4).

3. Pewarnaan negatif

Page 5: PERCOBAAN mikro p1

Beberapa mikroba sulit diwarnai dengan zat warna yang bersifat basa, tetapi

mudah dilihat dengan pewarnaan negatif. Bakteri yang dilakukan pengamatan tidak

diwarnai, tetapi mewarnai latar belakang dan lingkungan bakteri

Cara metode pewarnaan negative:

Ambil kaca objek beri 1 tetes tinta cina/ cat nigrosin di ambil

mikroorganisme dan dicampur dengan cat di atas objek biarkan preparat

mongering diudara (jangan dipanaskan) diperiksa dengan mikroskop.

Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang).

Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini

olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan

kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga

penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat

nigrosin atau tinta cina (4).

4. Pewarnaan Tahan Asama atau Pewarnaan Ziehl-Neelsen

Pewarnaan ini dilakukan pada bakteri tahan asam dalam proses warna akibat

Alkohol-asam, dan penggunaan pembalik warna pada tahap akhir dari proses

sehingga menghasilkan warna merah. Kandungan lipida yang sangat tinggi pada

bakteri menyebabkan sel bakteri sulit diwarnai, karena zat warna tidak dapat

menembus lapisan ini. Jika bakteri tahan asam diwarnai dengan larutan karbol-

fuksin, maka zat warna tidak mudah dilunturkan oleh larutan pemucat (alkohol) (4).

Tahapan pewarnaan Ziehl Neelsen:

Tahan Asam Tidak Tahan Asam

Fuksin Karbol Merah Merah

Larutan Pemucat Merah Tidak

Metilen Blue Merah Biru

\

Page 6: PERCOBAAN mikro p1

III. ALAT DAN BAHAN

III.1 Alat dan Bahan Teknik Aseptis

Alat :

a. Autoclave

b. Erlenmeyer

c. Gelas ukur

d. Kapas

e. Kertas payung

f. Lampu spiritus

g. LAF

Bahan:

a. Aquadestilata

b. Biakan bakteri

c. Serbuk nutrien broth

d. Serbuk nutrient agar

h. Ose bulat

i. Ose runcing

j. Pengaduk

k. Petri disk

l. Tabung reaksi

m. Timbangan

III.2 Alat dan Bahan Pengecatan Gram

Alat :

a. mikroskop

b. Kaca preparat

Bahan:

a. Bakteri yang akan diamati

Page 7: PERCOBAAN mikro p1

IV. METODE KERJA

IV.1 Teknik Aseptis

1. Pembuatan Media

Dibuat media berisi nutrient broth dan nutrien agar.

Ditimbang serbuk Nutrien Broth sebanyak 0,065 gram dam

serbuk Nutrien agar sebanyak 0,7 gram.

Kemudian dilarutkan dengan aquades. Pada nutrien broth

dilarutkan dalam 5 ml dan nutrien agar dilarutkan dalam 25

ml.

Apabila dalam pencampuran media masih terdapat gumpalan

yang belum homogen, maka larutan dipanaskan dahulu

hingga homogen.

Larutan media yang telah homogen, dimasukkan larutan

media nutrien broth ke dalam tabung reaksi. Sedangkan 5 ml

larutan media nutrien agar dimasukkan ke dalam tabung

reaksi dan sisanya dituang didalam cawan petri.

Kemudian media diatas disterilisasi dengan autoclave pada

Page 8: PERCOBAAN mikro p1

Ose dikeluarkan kemudian mulut tabung dipanasi dan ditutup kembali.

Ose dimasukkan dalam biakan dekat dinding tabung, kemudian dicelupkan dalam biakan.

Tabung berisi kultur yang akan dipindahkan dibuka, mulut tabung dipanaskan pada nyala api

Tutup petridish dibuka sebagian dan diletakkan di dekat nyala api

Ose digorekan pada media nutrient agar dekat nyala api

suhu 121ºC selama 15 menit.

Setelah steril, tabung nutrient agar dimiringkan pada sudut ±

45 º sampai membeku

1. Teknik biakan murni

Pemindahan biakan bakteri dari media cair ke media padat

Ose dipanaskan hingga membara

Page 9: PERCOBAAN mikro p1

Pemindahan biakan bakteri dari media padat ke media padat

Tabung berisi nutrient agar miring dibuka, kemudian mulut tabung dipanasi dengan

nyala api

Ose digoreskan pada media nutrient agar miring

Ose dimasukkan kedalam biakan kemudian diambil satu koloni dan ditutup kembali

Tutup tabung yang berisi biakan yang akan dipindahkan dibuka dan mulut tabung dipanasi pada nyala api

Diinkubasi pada suhu 370 C selama 24 jam

Ose dipanaskan sampai membara

Diinkubasi 37oC Selama 24 jam

Mulut tabung dipanasi kembali kemudian ditutup

Page 10: PERCOBAAN mikro p1

Pemindahan biakan bakteri dari media padat ke media cair

Mulut tabung dipanasi kembali kemudian ditutup

Ose dimasukkan pada media kaldu nutrient sambil diaduk

Ose steril dimasukkan dalam biakan, diambil satu koloni dan ditutup kembali

Tabung berisi kaldu nutrient dibuka, mulut tabung dipanasi pada nyala api

Tabung yang berisi kultur yang akan dipindahkan dibuka, mulut tabung dipanasi pada nyala api

Ose dipanaskan sampai membara

Diinkubasi 370 C selama 24 jam

Page 11: PERCOBAAN mikro p1

VI. PEMBAHASAN

6.1 Pengecatan Gram

Dilakukan pengamatan bakteri secara mikroskopis dengan pengecatan

gram. Pengecatan bakteri yang dilakukan berfungsi untuk mengetahui jenis

bakteri. Jika hasil pengecatan berwarna ungu maka bakteri digolongkan gram

positif dan jika berwarna merah maka bakteri tergolong gram negatif. Hal ini

dikarenakan pada bakteri gram negatif mengambil warna pembanding setelah

decolorized dengan alkohol. Hal ini disebabkan karena dinding sel bakteri

gram negatif yang terdiri dari lipid mengalami lisis oleh alkohol. Sedangkan

gram positif tidak mengalami lisis karena dinding selnya terdiri dari

peptidoglikan.

Perbedaan warna antara bakteri gram positif dan bakteri gram

negative disebabkan oleh adanya perbedaan struktur pada dinding selnya.

Dinding sel gram positif banyak mengandung peptidoglikan, sedangkan

dinding sel bakteri gram negative banyak mengandung lipopolisakarida.

Kompleks chrystal violet-iodin yang masuk ke dalam sel bakteri gram

positif tidak dapat tercuci oleh alcohol karena adanya lapisan peptidoglikan

yang kokoh pada dinding sel. Sedangkan pada dinding sel bakteri gam

negative, alcohol akan melarutkan lapisan lipopolisakarida. Kompleks

chrystal violet-iodin pada bakteri gram negative dapat tercuci dan

menyebabkan sel bakteri tampak transparan, yang akan berwarna merah

setelah diberikan safranin. Pengamatan bakteri ini dilakukan dengan

menggunakan mikroskop dengan perbesaran 100 kali obyektif. Pada

perbesaran 100 kali obyektif digunakan cairan imersion oil yang berfungsi

untuk memfokuskan cahaya (mencegah/menghilangkan adanya refluksi

cahaya).

Page 12: PERCOBAAN mikro p1

6.2. Teknik Aseptis

Teknik aseptic adalah teknik kerja yang bertujuan untuk menjaga dan

menghindari alat dan bahan uji dari kontaminan. Pada percobaan kali ini

bertujuan untuk dapat memindahkan biakan bakteri dari satu media ke

media lain secara aseptis dan mampu memahami pentingnya teknik aseptis

dalam bekerja di laboratorium mikrobiologi farmasi.

Pertama, dibuat media untuk menanam bakteri, yaitu media nutrien

agar dan nutrien broth. media nutrien agar yang ditempatkan pada tabung

dimiringkan sekitar 45⁰ agar terbentuk media agar miring, sedangkan yang

ditempatkan pada cawan dituang biasa dan semua media yang sudah

ditempatkan di tabung maupun di cawan segera ditutup agar terhindar dari

kontaminasi.

Bahan dasar nutrient agar dan nutrient broth yang sudah terbuat segera

dimasukan kedalam autoklaf selama 15 menit, untuk media cair dan media

agar miring dimasukkan kedalam tabung serta ditutup dengan kapas berlapis

aluminium foil, namun untuk media padat belum dimasukkan ke dalam

cawan. Pada proses sterilisasi dengan autoklaf cawan petridise dibungkus

dengan kertas payung dan diletakan pada posisi terbalik agar pada saat

sterilisasi dengan autoklaf cawan tidak basah terkena uap air dari autoklaf

tersebut. Prinsip autoklaf adalah terjadinya koagulasi yang lebih cepat dalam

keadaan basah dibandingkan dengan keadaan kering. Sterilisasi ini

menggunakan teknik pemanasan uap bertekanan tinggi pada suhu 121⁰C

selama 15 menit pada tekanan 1 atm. Hal ini bertujuan agar tidak hanya

bakteri saja yang mati tetapi bentuk vegetatifnya yaitu spora yang tahan

pemanasan.

Setelah sterilisasi dengan autoklaf, kemudian semua media dibawa ke

LAF ( Laminar Air Flow ) yaitu, tempat kerja untuk pemindahbiakan dan

pengujian mikroba. LAF termasuk jenis metode sterilisasi dengan cara

Page 13: PERCOBAAN mikro p1

mengalirkan udara bersih secara horizontal maupun vertikal. Adapun cara

penngunaan dari LAF adalah lampu UV dinyalakan terlebih dahulu,

kemudian dibiarkan selama 30 menit. Selanjutnya lampu UV dimatikan

dan dinyalakan FAN dan LAMP. Fungsi dari LAF dalam praktikum ini

adalah untuk menanam media dan memindahkan media. Pastikan pada saat

memindahkan media di dalam LAF selalu dekat dengan sumber api

( bunsen ). Hal ini bertujuan untuk menjaga media tetap steril. Sebelum

digunakan untuk memindahbiakan baktri ose disterilkan dengan

membakarnya pada nyala api sampai membara dan didiamkan sebentar

sampai dingin, karena jika masih panas dikhawatirkan apabila langsung

digunakan untuk mengambil bakteri, bakteri tersebut akan mati.

Sterilisasi adalah setiap proses yang membunuh semua bentuk hidup

terutama mikroorganisme, terdapat tiga macam, yaitu sterilisasi secara

fisik, kimia, dan mekanik. Sterilisasi fisik contohnya pemanasan kering

dan pemanasan basah, pemanasan basah ialah yang dipergunakan dalam

praktikum kali ini, yaitu dengan menggunakan autoklaf. Sterilisasi kimia

ialah menggunakan bahan – bahan kimia yang bersifat antimikroba, antara

lain fenol dan derivatnya, alkohol, halogen beserta gugusannya, logam

berat dan gugusannya, detergent, aldehid, dan gasterilisator ( etilen oksid ).

Contoh sterilisasi mekanik ialah filtrasi, digunakan untuk bahan yang tidak

tahan pemanasan. Fiksasi ialah proses sterilisasi dengan cara pembakaran,

pemanasan ini lebih rendah suhunya daripada autoklaf, yaitu pada suhu 40

⁰C. Fungsi fiksasi yaitu, membunuh bakteri dan menghilangkan lipid, serta

memudahkan pengamatan.

Setelah bakteri selesai ditanam dalam media, kemudian dimasukkan

ke dalam inkubator pada suhu 37 ⁰C selama 18 – 24 jam. Suhu 37 ⁰C

merupakan suhu tubuh, waktu 18 – 24 jam merupakan waktu optimum

bakteri untuk tumbuh dan berkembangbiak. Pada saat dimasukkan ke dalam

inkubator, cawan petri diletakkan terbalik untuk menghindari kontaminasi

Page 14: PERCOBAAN mikro p1

karena uap air akan membasahi media jika cawan petri tidak dibalik pada saat

inkubasi dan dapat mengganggu perkembangbiakan serta pertumbuhan

bakteri yang di tanam. Dilakukan pengamatan setelah di inkubasi selama 24

jam, hasil yang diperoleh pada percobaan, sebagai berikut :

a. Pada pemindahbiakan bakteri dari media cair ke media cair S.Aureus :

sebelum ditambahkan biakan kedalam media, media terlihat berwarna

jernih, namun setelah diberi biakan dan diinkubasi didalam oven (37C)

selama 24 jam, diamati terjadi perubahan warna. Pada tabung reaksi

(media cair) hasilnya sedikit keruh dan terdapat endapan, maka

dapat disimpulkan bahwa media cair ke cair tersebut terdapat

kontaminan di dalamnya.

b. Pada pemindahbiakan bakteri dari media agar miring ke media agar

miring (slant to slant), S. Aureus (Nutrient Agar) : Setelah diinkubasi

didalam oven (37C) selama 24 jam, pertumbuhan bakteri pada kedua

tabung berbeda. Tabung pertama pertumbuhan bakteri sesuai

dengan arah goresan dan terjadi pemisahan koloni, sedangkan

tabung kedua tidak sesuai dengan arah penggoresan dan terdapat

gumpalan putih pada beberapa sisi. Gumpalan tersebut merupakan

kontaminan.

c. Pada Staphylococcus aureus (Nutrient Agar) : Setelah diinkubasi

didalam oven (37C) selama 24 jam, pertumbuhan bakteri tidak

sempurna terbentuk baik pada penggoresan teknik continous

streak maupun teknik penggoresan quadrant streak karena koloni

yang terbentuk hanya terdapat dibeberapa bagian goresan, sebab

masih terlihat gumpalan putih yang merupakan kontaminan berupa

jamur di bagian goresan yang lain pada media plate baik secara

continous dan quadrant streak.

Dari hasil keseluruhan didapatkan bahwa semua media terdapat kontaminan.

Hal ini mungkin disebabkan karena kurang steril dalam pengerjaannya.

Page 15: PERCOBAAN mikro p1

VII. KESIMPULAN

1. Teknik aseptic adalah sutu teknik untuk menghindari alat dan bahan

dari adanya mikroorganisme dan kontaminan.

2. Bakteri gram-positif akan berwarna ungu sebab senyawa kompleks

violet-yodium tidak larut, sedangkan bakteri gram-negatif akan

berwarna merah sebab senyawa komplek larut dan digantikan oleh

safranin.

Page 16: PERCOBAAN mikro p1

VIII. DAFTAR PUSTAKA

1. Anonim, 2010, Teknik Aseptis , available at :

www.cht.nhs.uk/fileadmin/.../Section_G_-_Aseptic_Technique_Issue_2.pdf,

diakses: 25 september 2010.

2. Waluyo, lud., 2008, Teknik dan Metode Dasar dalam Mikrobiologi, UMM

Press, Malang.

3. Anonim, 2010, Pengertian Aseptis, available at :

http://www.thefreedictionary.com/aseptic, diakses: 25 September 2010.

4. Lay, Bibiana W., 1994, Analisis Mikroba di Laboratorium, PT Raja

Grafindo Persada, Jakarta.

5. Anonim, 2008, Pengecatan Gram, available at: http://www. pengecatan-

gram.html, diakses: 25 September 2010.

Page 17: PERCOBAAN mikro p1

LAPORAN PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI

Teknik Aseptik dan Pengecatan Bakteri

Oleh :

Ansharudin Alhaq (C-2)

Nurul Fatimah (C-2)

Tarias Rahayu (C-1)

Endah Nurrohwinta Djuwarno (C-3)

JURUSAN FARMASI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS ISLAM INDONESIA2010

Page 18: PERCOBAAN mikro p1