LAPORAN AKHIR

INSENTIF RISET SINAS

IDENTIFIKASI PENYEBAB PENYAKIT BUSUK UMBI PORANG

(Amorphophallus mueleri Blume) DAN ISOLASI SERTA SKREENING AGENS HAYATI

UNTUK PENGENDALIAN RAMAH LINGKUNGAN

RD-2015-0019

Bidang Prioritas Iptek:

10. Teknologi Pangan

10.03 Riset Pengembangan Perkebunan

Jenis Insentif Riset:

Riset Dasar

NON KONSORSIUM

Lembaga Penelitian Dan Pengabdian Masyarakat

Universitas Merdeka Madiun

Jln. Serayu No 79 Madiun 63133

Phone (0351) 495551/Fax (0351) 495551/E-mail: lppm@unmer-madiun.ac.id

Tahun 2015

mailto:lppm@unmer-madiun.ac.id

ii

iii

RINGKASAN/ABSTRAK

Identifikasi penyebab penyakit busuk umbi porang (Amorphophallus mueleri

Blume) dan isolasi serta skreening agens hayati untuk pengendalian ramah

lingkungan. Indonesia mengexport porang ke Jepang dan China. Salah satu faktor

pembatas produksi porang disebabkan serangan penyakit busuk di pertanaman dan pasca

panen. Identifikasi yang akurat dari penyebab penyakit dan isolasi serta skreening agens

hayati sangat diperlukan untuk keberhasilan pengendalian terhadap penyakit tersebut.

Penelitian bertujuan: 1) mendeteksi dan mengidentifikasi patogen busuk umbi porang; 2)

memperoleh dan menguji daya antagonisme agens hayati terhadap patogen busuk umbi

porang. Penelitian dilakukan dengan cara: 1) pendekatan Postulat Koch yaitu isolasi,

inokulasi, dan reisolasi yang dilanjutkan dengan analisis molekular untuk menentukan

spesies dari penyebab penyakit; 2) isolasi dan skreening agens hayati serta uji kemampuan

daya hambat bakteri antagonis terhadap penyakit busuk umbi porang secara in vitro. Hasil

penelitian menunjukkan penyebab busuk umbi porang terdiri atas dua isolat jamur yaitu:

Sclerotium delphinii isolate CBS221 dengan patogenisitas tertinggi yaitu 88,23%, diikuti :

Fusarium oxysporum strain Ppf15 sebesar 30,65 % dan dua isolat bakteri yaitu Serratia

nematodiphila strain DZ0503SBS1 sebesar 14,01 % dan Cedecea neteri NBRC 105707

sebesar 10,46 %. Aplikasi Pseudomonas fluorescens (Pf 11, Pf 15, dan Pf 25) mampu

menghambat patogen busuk umbi porang secara in vitro. Pseudomonas fluorescens Pf 11

mempunyai daya hambat yang lebih efektif dibandingkan Pseudomonas fluorescens Pf 15,

dan Pf 25. P. fluorescens Pf 11 memiliki prospek untuk dikembangkan sebagai alternative

pengendalian ramah lingkungan terhadap umbi katak di tempat penyimpanan.

Kata kunci: porang (Amorphophallus mueleri Blume), busuk umbi,Pseudomonas fluorescens

iv

DAFTAR ISI Halaman

Lembar Identitas dan Pengesahan .................................................................... ii

Ringkasan/Abstrak ........................................................................................... iii

Daftar Isi ........................................................................................................... iv

Daftar Tabel ...................................................................................................... v

Daftar Gambar .................................................................................................. vi

BAB 1. PENDAHULUAN .................................................................................. 1

1.1. Latar Belakang ......................................................................................... 1

1.2. Tujuan dan Sasaran .................................................................................. 2

BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA ......................................................................... 4

1.1. Tanaman Porang (Amorphophallus muelleri Blume) ................................. 4

1.2. Penyakit Busuk Umbi Porang ................................................................... 5

BAB 3 TUJUAN DAN MANFAAT ..................................................................... 7

BAB 4. METODE ............................................................................................... 8

1.1. Laporan Tahap I ....................................................................................... 7

1.2. Laporan Tahap II ....................................................................................... 13

1.3. Laporan Tahap III ...................................................................................... 18

BAB 5. RENCANA CAPAIAN, HASIL DAN PEMBAHASAN ............................ 19

1.1. Rencana Capaian ...................................................................................... 19

1.2. Hasil .......................................................................................................... 21

1.3. Hambatan ................................................................................................... 30

1.4. Pembahasan ............................................................................................. 30

BAB 6. KESIMPULAN DAN SARAN ................................................................. 36

1.1. Kesimpulan ................................................................................................ 36

1.2. Saran ......................................................................................................... 36

DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................... 37

v

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 1. Persentase penyakit busuk umbi di permukaan kulit dan

daging umbi porang berdasarkan periode tumbuh ketiga ................... 21

Tabel 2. Jenis isolat jamur penyebab busuk umbi porang hasil inokulasi ......... 24

Tabel 3. Jenis isolat bakteri penyebab busuk umbi porang hasil inokulasi ....... 27

Tabel 4. Sifat fenotipik Pseudomonas fluorescens isolate Saradan ................. 29

Tabel 5. Hasil pengujian Pseudomonas fluorescens isolat Saradan terhadap

pertumbuhan koloni penyebab penyakit busuk umbi porang ............. 29

Tabel 6. Pengaruh P.fluorescens PF 11 terhadap penekanan jumlah organ

sklerosia dari S. delphinii dan persentase perkecambahan sklerosia

pada umbi katak di penyimpanan ...................................................... 30

vi

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Tanaman porang (Amorphophallus muelleri Blume) ..................... 4

Gambar 2. Pembusukan pada umbi porang .................................................. 8

Gambar 3. Pengambilan sampel umbi dari tanaman porang ......................... 9

Gambar 4. Cara peletakan inokulum bakteri antagonis dan penyebab penyakit 17

Gambar 5. Penyebab penyakit busuk umbi porang pada 4 hari setelah inokulasi 20

Gambar 6. Gejala busuk pada umbi porang yang muncul setelah diinokulasi

dengan isolat jamur ...................................................................... 22

Gambar 7. Biakan murni dari bagian jaringan umbi porang ............................. 22

Gambar 8. Morfologi koloni jamur penyebab busuk umbi porang (200 X) ....... 23

Gambar 9. Hasil amplifikasi DNA pada isolat jamur penyebab penyakit busuk

umbi porang dalam PAGE 6% ...................................................... 23

Gambar 10. Pohon filogenetik dari isolat penyebab penyakit busuk

umbi porang .................................................................................. 24

Gambar 11. Gejala pada umbi porang dari hasil reisolasi isolat bakteri .......... 25

Gambar 12. Koloni bakteri penyebab penyakit busuk umbi porang

di bawah sinar UV ......................................................................... 25

Gambar 13. Reaksi hipersensitif pada daun tembakau ..................................... 26

Gambar 14. Hasil uji degradasi pektat isolat bakteri pendarfluor pada

umbi kentang ................................................................................ 26

Gambar 15. Pohon filogenetik yang memperlihatkan posisi isolat bakteri

nomor 5 dan 7 berdasarkan sekuen gen 6 S rRNA ....................... 27

Gambar 16. Pengamatan koloni bakteri pada medium King B di bawah

Sinar UV (λ = 366 nm) .................................................................. 28

Gambar 17. Bentuk bakteri pada pengamatan di bawah mikroskop

cahaya dengan perbesaran 1000 x ............................................... 28

Gambar 18. Pengujian reaksi hipersensitif dari Pseudomonas fluorescens

pada daun tembakau .................................................................... 29

Gambar 19. Gejala penyakit busuk umbi porang .............................................. 31

Gambar 20. Daya hambat Pseudomonas fluorescens Pf 11 terhadap

Sclerotium delphinii pada 7 hari setelah inokulasi di media

King B agar ................................................................................... 34

Gambar 21. Penyimpanan umbi katak selama dua bulan yang ditumbuhi oleh

miselium dan sklerosia ................................................................... 35

1

BAB 1.

PENDAHULUAN

1.1. LATAR BELAKANG

Indonesia mengexport porang (Amorphophallus mueleri Blume) ke Jepang dan

Tiongkok. Bahan makanan yang berasal dari porang atau iles-iles ini mengandung

glukomanan dan disukai oleh masyarakat Jepang sebagai bahan baku mie atau

konyaku dan industri lain, seperti obat-obatan. Tanaman porang dapat dipanen setelah

berumur 3 tahun (3 kali pertumbuhan). Harga umbi saat ini diperkirakan sekitar

Rp. 4.000,-/Kg dalam keadaan basah. Umbi dalam bentuk irisan keripik yang kering

dijual sekitar Rp. 9.000,-/Kg. Apabila menjualnya langsung ke pihak investor dari

Jepang harga sekitar USD 18/Kg. Oleh karena itu budidaya tanaman porang

mempunyai prospek yang baik dan bernilai ekonomis tinggi bagi masyarakat. Sehingga

dapat membantu masyarakat dalam membuka lapangan kerja dan usaha serta

memberikan nilai tambah bagi masyarakat itu sendiri.

Salah satu faktor pembatas produksi porang disebabkan serangan penyakit

busuk umbi porang di pertanaman dan pasca panen. Jamur Sclerotium rolfsii Sacc,

Fusarium oxysporum, Pseudomonas sp, Rhizoctonia, Cercospora menyebabkan

penyakit busuk pada pangkal batang dan umbi busuk lunak (foot root). Selain itu

Batryodiplodia theobromae terjadi pada kondisi panas dan lembab. Penyebab

penyakit yang disebabkan oleh jamur terutama berkembang pada musim hujan dan

kondisi lingkungan yang lembab dengan intensitas sinar matahari rendah. Agihan

penyakit busuk pangkal batang di lahan mengelompok dengan batas tegas. Hal ini

menunjukkan penyebab penyakit terbawa melalui tanah (Setiasih, 2008; Andayanie,

2014). Pengamatan berdasarkan gejala secara visual terhadap penyakit tersebut

sebagai langkah awal identifikasi, namun tidak dapat dijadikan jaminan. Penyakit

busuk pada pangkal batang yang menyerang melalui akar menimbulkan tantangan

dalam pengelolaan penyakit yang efektif. Oleh karena sumber inokulum awal sudah

ada di dalam tanah sebelum awal pertumbuhan atau diintroduksi oleh tanaman

inang. Identifikasi yang akurat dari penyebab penyakit sangat diperlukan untuk

keberhasilan pengendalian terhadap penyakit tersebut.

Pengendalian hayati menggunakan mikroorganisme yang berasosiasi dengan

rizosfer perakaran tanaman yang sehat lebih aman,ramah lingkungan dan

berkesinambungan serta dapat diintegrasikan dengan pengendalian hama terpadu.

Saat ini bakteri Pseudomonas fluorescens banyak dimanfaatkan sebagai agens hayati.

2

Rizobakteri dari genus Pseudomonas, Bacillus dapat meningkatkan pertumbuhan

tanaman, menguraikan dinding sel patogen dan menghambat pertumbuhan patogen

dengan menghasilkan senyawa antimikroba seperti siderofor ( Weller et al., 2002;

Joseph et al., 2007; Chandrashekhara, 2007; Diniyah, 2010). Tahapan pengembangan

agens hayati dilakukan melalui isolasi, skreening in vitro, uji kemampuan antagonisme,

skreening in vivo, dan pengembangan formulasi (Ahmed et al., 2007).

Eksplorasi keragaman bakteri rizozfer di perakaran tanaman porang yang

sehat diperlukan untuk mengetahui potensi ketersediaan agens hayati pada

pengendalian penyakit busuk umbi porang.

Pengendalian penyakit busuk umbi pada tanaman porang akan meningkatkan

kandungan glukomanan. Kemampuan agens hayati dalam meningkatkan pertumbuhan

dan pengendalian penyakit pada berbagai komoditas telah banyak dilaporkan peneliti,

tetapi informasi tentang penggunaan agens hayati untuk pengendalian busuk umbi

porang di sentra penanaman porang belum pernah dilaporkan, khususnya di

Indonesia. Upaya identifikasi penyebab penyakit busuk umbi dan isolasi serta

skreening agens hayati yang akurat akan digunakan sebagai strategi pengendalian

busuk umbi porang. Selain itu membantu penyelamatan umbi porang dan

pengembangan sumber pangan alternatif serta meningkatkan devisa negara melalui

export porang dalam bentuk chip melalui program pengelolaan hutan bersama

masyarakat, sehingga dapat memperkuat Sistim Inovasi Nasional (SINas).

1.2. TUJUAN DAN SASARAN

a. Tujuan

Tujuan Umum: Tujuan umum penelitian sebagai upaya untuk peningkatan

produksi porang dan ketahanan pangan nasional yang akan teragregasi ke dalam

SINas melalui:

i) Isolasi dan identifikasi penyebab penyakit busuk umbi yang akurat sebagai langkah

awal pengendalian penyakit busuk umbi porang (laporan kemajuan I).

ii) Isolasi dan potensi bakteri rizozfer pada tanaman porang sehat sebagai agens

hayati penyakit busuk umbi porang (laporan kemajuan II).

iii) Mendapatkan umbi katak yang sehat di penyimpanan (laporan kemajuan III).

Tujuan Khusus: Tujuan khusus penelitian terdiri atas:

i) Mengetahui dan mengkaji intensitas penyakit busuk umbi porang yang disebabkan

oleh organisme patogenik di sentra penanaman porang di Kabupaten Madiun

(laporan kemajuan I).

3

ii) Mengkaji dan mempelajari derajad (tingkat) virulensi isolat organisme patogenik

dominan yang berasal dari daerah sentra penanaman porang di Kabupaten Madiun

(laporan kemajuan I).

iii) Melakukan karakterisasi dan identifikasi isolat dari organisme patogenik yang

berasosiasi dengan umbi porang berdasarkan analisis fenotipik (konvensional) dan

genotipik (molekular) (laporan kemajuan I).

iv) Mendapatkan dan melakukan identifikasi isolat rizobakteri dari rizosfer tanaman

porang sehat di daerah endemis penyakit busuk umbi porang (laporan kemajuan II).

v) Mengevaluasi daya hambat dan efektivitas isolat-isolat rizobakteri untuk menekan

penyakit busuk umbi porang (laporan kemajuan II).

vi) Memperoleh bulbil atau umbi katak yang sehat dengan penggunaan isolat yang

tertinggi daya hambatnya terhadap penyebab penyakit busuk umbi (laporan

kemajuan III).

b. Sasaran

Diperoleh identifikasi penyebab penyakit busuk umbi porang (laporan

kemajuan I) dan identifikasi bakteri rizozfer serta potensi bakteri tersebut sebagai

agens hayati (laporan kemajuan II) untuk strategi pengendalian penyebab penyakit

busuk umbi porang yang ramah lingkungan melalui penggunaan umbi katak yang

sehat, sehingga kualitas dan kuantitas umbi porang dapat ditingkatkan (laporan

kemajuan III).

4

BAB 2.

TINJAUAN PUSTAKA

1.1. TANAMAN PORANG (Amorphophallus muelleri Blume)

Amorphophallus muelleri dikenal dengan nama lokal porang. Tanaman porang

menyebar dari Kepulauan Andaman melewati Myanmar, Thailand bagian utara sampai

ke Sumatera, Jawa terus ke Flores dan Timor (Yuzammi, 2000). Tanaman ini memiliki

bulbil atau umbi katak yang terdapat pada tengah dan pada percabangan rakhisnya,

sehingga berbeda dengan jenis Amorphophallus lainnya yang ada di Pulau Jawa.

Umbi katak dapat digunakan untuk bahan perbanyakan tanaman secara generative.

Umbi katak yang dipilih harus sehat, sehingga persentase tumbuh dapat mencapai di

atas 90 %. Daun biasanya hanya satu per umbi akan tetapi terkadang dijumpai juga

adanya daun tumbuh lebih dari satu. Tangkai daun halus, hijau atau hijau kecoklatan

atau hampir hitam pada bagian latar dengan totol-totol kecil atau berbentuk jajaran

genjang (rhomboid) atau berbentuk seperti garis-garis, berjumlah banyak, berwarna

hijau pucat atau hijau muda (Gambar 1). Tanaman porang yang cukup besar dapat

menghasilkan umbi katak ± 40 /pohon. Umbinya berwarna coklat tua pada bagian luar,

kuning atau orange pada bagian dalam dan tidak mempunyai umbi samping.

Gambar 1. Tanaman porang (Amorphophallus muelleri Blume)

Pangsa pasar umbi porang mencakup pasar dalam negeri dan luar negeri.

budidaya tanaman porang mempunyai prospek yang baik dan bernilai ekonomis tinggi

bagi masyarakat ( Rachmawati dan Daroini, 2014). Satu gelondong porang memiliki

berat sekitar 1 – 3 kg. Harga chips mencapai Rp 28.000/kg. Lahan seluas kurang lebih

1 hektar dapat menghasilkan 12 ton porang gelondongan dan 4 kuintal katak. Harga

katak pada tahun 2014 mencapai Rp 50.000/kg.

5

1.2. PENYAKIT BUSUK UMBI PORANG

Salah satu faktor pembatas produksi porang disebabkan serangan penyakit

busuk umbi di pertanaman dan pasca panen. Pengamatan berdasarkan gejala secara

visual terhadap penyakit tersebut sebagai langkah awal identifikasi, namun tidak dapat

dijadikan jaminan. Identifikasi yang akurat secara biologi, dan fisiologi serta molekular

dari penyebab penyakit sangat diperlukan untuk keberhasilan pengendalian terhadap

penyakit tersebut. Agihan penyakit busuk pangkal batang di lahan mengelompok

dengan batas tegas. Hal ini menunjukkan penyebab penyakit terbawa melalui tanah

dan sulit dikendalikan secara kimiawi karena penyebarannya sangat cepat (Setiasih,

2008; Andayanie, 2014). Kondisi tersebut memberikan gagasan untuk melakukan

pengendalian penyakit busuk umbi porang yang ramah lingkungan dan berkelanjutan

dengan pemanfaatan agens hayati.

1.3. PENGENDALIAN PENYAKIT BUSUK UMBI PORANG

Rizobakteri dapat digunakan untuk mengendalikan penyakit melalui beberapa

cara yaitu produksi senyawa antibiosis, persaingan ruang dan nutrisi, penguraian

faktor kepatogenan seperti enzim kitinase (1-3 glukanase) sebagai pendegradasi

dinding sel serta menghasilkan fitohormon (Van Loon, 2007; Wiyono et al., 2008).

Salah satu rizobakteri yang mempunyai potensi sebagai agens hayati yaitu

Pseudomonas fluorescens. Bakteri ini diisolasi dari perakaran tanaman gandum

bersifat sebagai antifungi dan antibakteri dari penyebab penyakit. Kemampuan

rizobakteri dalam menginduksi ketahanan tanaman bervariasi. Isolat yang efektif

mengendalikan penyakit tanaman adalah yang berasal dari rizoplan tanaman yang

bersangkutan (indigenus). Bakteri kelompok ini menghasilkan pigmen berwarna hijau

kuning yang dapat digunakan untuk identifikasi serta klasifikasi dari senyawa

fluorescence atau pyoverdin yang berpendar di bawah cahaya ultraviolet (panjang

gelombang 266 nm (Nawangsih et.al., 2014). Pengendalian penyakit dengan

menggunakan P. fluorescens merupakan salah satu alternatif pengendalian yang

ramah lingkungan, berkesinambungan dan dapat diintegrasikan dalam program

pengendalian hama terpadu ( Soesanto et al., 2011; Yanti et al., 2013).

Kemampuan Rizobakteria mengendalikan penyakit pada berbagai komoditas

telah banyak dilaporkan, tetapi penggunaan rizobakteria dari lingkungan habitat

tanaman porang belum pernah dilaporkan. Oleh karena itu identifikasi dan potensi

6

rizobakteri tersebut perlu dievaluasi dan dipertimbangkan untuk pengendalian penyakit

busuk umbi porang di pertanaman dan pasca panen.

Keberhasilan pengendalian hayati sangat dipengaruhi oleh daya antagonis atau

daya hambat yang dimiliki isolat atau jumlah inokulum yang digunakan dan cara

aplikasinya (Cook & Baker, 1996). Leeman et al. (l995) mengatakan bahwa aplikasi

Pseudomonas fluorescens melalui penyelaputan benih (seed coating) sangat sesuai

dan praktis untuk pengendalian patogen tular tanah. Oleh karena umbi katak yang

terinfeksi penyakit busuk umbi akan menjadi sumber inokulum di lapangan. Masalah

yang perlu mendapat perhatian dalam penggunaan Pseudomonas fluorescens yaitu

daya hambat harus tinggi dan konsentrasinya aplikasi efektif, terutama pada benih

umbi katak saat penyimpanan.

7

BAB 3.

TUJUAN DAN MANFAAT

Tujuan dan manfaat penelitian ini adalah:

1. Diharapkan dapat berguna sebagai bahan informasi dasar tentang keberadaan

mikroorganisme patogenik pada umbi porang terutama tentang intensitas penyakit,

virulensi patogen, karakteristik mikroorganisme patogenik berdasarkan fenotipik dan

genotipik. Informasi ini dipergunakan sebagai salah satu dasar untuk membantu

pengendalian busuk umbi porang yang tepat Selain itu hasilnya dapat berguna

sebagai data base penelitian porang di Indonesia (laporan kemajuan I).

2. Mendapatkan dan melakukan identifikasi isolat rizobakteri dari rizoplan

tanaman porang (indigenus). Manfaat penelitian untuk mengetahui senyawa yang

berpendar dari kelompok Pseudomonas spp dan morfologi serta sifat fenotipik dari

sel bakteri tersebut (laporan kemajuan II).

3. Mendapatkan daya hambat isolat Pseudomonas fluorescens terhadap patogen

penyebab busuk umbi porang secara in vitro. Manfaat penelitian ini untuk melihat

keefektifan daya hambat rizobakteri terhadap penyebab penyakit busuk umbi

porang (laporan kemajuan II).

4. Mempelajari konsentrasi yang efektif Pseudomonas fluorescens terhadap penularan

penyebab penyakit busuk umbi porang melalui umbi katak saat penyimpanan

(laporan kemajuan III).

8

BAB 4.

METODE

1.1. Laporan Tahap I

Sampel umbi diperoleh dari pertanaman porang yang bergejala busuk umbi di

bawah tegakan hutan jati Kecamatan Saradan Kabupaten Madiun. Analisis sampel

dilakukan di laboratorium Agroteknologi Universitas Merdeka Madiun dan di

laboratorium LPPT Universitas Gadjah Mada Yogyakarta. Penelitian isolasi dan

identifikasi penyebab penyakit busuk umbi porang dilakukan mulai bulan April 2015

sampai bulan Agustus 2015. Metode penelitian dilakukan dengan pengamatan

intensitas penyakit, pendekatan Posulath Koch yaitu: isolasi, inokulasi, reisolasi,dan

pengamatan secara visual di bawah mikroskop serta analisis molekular.

a. Pengamatan Intensitas Penyakit

Gejala busuk umbi porang diamati pada periode tumbuh ketiga yaitu 2 minggu

sebelum tanaman rebah (MSBTR), saat tanaman rebah (TR), dua minggu setelah

tanaman rebah (MSTR). Pengambilan umbi dilakukan, masing-masing sebanyak 10

tanaman. Masa pengamatan ini merupakan panen ketiga dari umbi porang dengan

kandungan glukomanan yang tinggi, jika umbi tersebut sehat (Chairiyah, 2014).

Persentase umbi yang terserang dibedakan menjadi persentase umbi bergejala busuk

di bagian luar dan persentase umbi bergejala busuk di bagian dalam (Gambar 2).

Gambar 2. Pembusukan pada umbi porang: A) miselium jamur nampak di bagian luar umbi; B) pembusukan nampak di bagian dalam umbi

Intensitas busuk umbi di bagian kulit umbi dihitung menggunakan rumus:

∑ (n x v) I = x 100% N x Z I = intensitas serangan

n = jumlah umbi yang terserang dengan nilai skor tertentu

v = harga numerik tiap tingkat kerusakan (skor)

A B

9

N = jumlah semua sampel yang diamati

Z = nilai tingkat kerusakan (skor) tertinggi

Skor tingkat kerusakan yang digunakan yaitu:

1 = umbi porang nampak sehat, kulit umbi mulus tanpa ada cacat

2 = bagian kulit umbi porang sedikit sekali membusuk

3 = bagian batang dan kulit umbi porang sedikit membusuk dan tidak lepas secara

alami

4 = bagian batang dan kulit umbi porang membusuk dan tidak lepas secara alami

5 = bagian batang dan kulit umbi porang membusuk dengan miselium nampak di

bagian batang dan kulit luar umbi porang

Persentase busuk umbi porang di bagian dalam dihitung dengan rumus:

P = A/B x 100%

P = persentase serangan

A = jumlah contoh umbi porang yang daging buahnya mengalami pembusukan

B = jumlah contoh umbiporang yang diamati

b. Pengambilan Sampel Umbi Porang Bergejala Busuk dan Isolasi Penyebab

Penyakit

Umbi porang diambil dari tanaman yang menunjukkan gejala pangkal batang

dan umbi yang mengalami pembusukan sebanyak 10 tanaman porang (Gambar 2).

Gambar 3. Pengambilan sampel umbi dari tanaman porang: A) pembusukan dan miselium

nampak pada pangkal batang; B) pembusukan pada umbi

Sampel umbi yang mengalami pembusukan di pertanaman diamati di

laboratorium. Tanah pada bagian umbi dibersihkan dengan air mengalir dan

dikeringanginkan. Umbi diseka dengan alkohol 70% sebanyak tiga kali. Bagian

jaringan umbi diambil secara aseptik dan direndam di dalam larutan natrium hipoklorit

2% selama 3 menit. Selanjutnya dibilas sebanyak tiga kali dengan aquadest steril

serta dikeringkan dengan tissue steril. Jaringan ditumbuhkan dalam media PDA

A B

10

(Potato Dextrose Agar) kloramfenikol untuk mendapatkan isolat jamur. Isolat bakteri

diperoleh dengan cara perendaman bagian jaringan bergejala di dalam 5 ml air steril.

Setelah jaringan mengeluarkan oose bakteri, kemudian diambil satu oose serta

ditumbuhkan pada media CPG (Cassamino Pepton Glucose Agar). Jaringan dan

oose pada masing-masing media tersebut diinkubasikan selama tiga hari. Isolat

jamur dan atau bakteri yang tumbuh di subkultur pada media yang baru sampai

didapatkan biakan murni.

c. Inokulasi Isolat Jamur Penyebab Penyakit Busuk Umbi Porang

Umbi porang sehat dan telah steril umur satu bulan disiapkan untuk inokulasi

isolat patogen. Biakan murni dari isolat jamur diinokulasikan satu persatu pada umbi

porang yang sehat di laboratorium. Umbi porang dibelah dan dilubangi bagian

tengahnya. Bagian yang lubang pada umbi disentuhkan masing-masing isolat dengan

jarum ose. Sedangkan perlakuan kontrol tidak disentuhkan dengan isolat. Masing-

masing isolat jamur dilakukan dengan 10 kali ulangan dan diletakkan pada gelas

plastik transparan yang telah disterilkan dengan alkohol. Gejala busuk umbi yang

muncul di laboratorium diamati secara visual.

d. Reisolasi Isolat Jamur Penyebab Penyakit Busuk Umbi Porang

Umbi hasil inokulasi dengan isolat jamur penyebab penyakit yang

menunjukkan gejala pada hari ketiga diisolasi mikroorganismenya. Isolasi dilakukan

dengan pengambilan jaringan (± 2 mm2) antara yang sakit dan sehat. Jaringan

diambil secara aseptik kemudian direndam dalam larutan hipoklorit selama 3 menit.

Selanjutnya dibilas sebanyak tiga kali dengan aquadest steril serta dikeringkan

dengan tissue steril. Bagian jaringan tersebut diinkubasikan selama 3 hari. Selanjutnya

dibilas sebanyak tiga kali dengan aquadest steril serta dikeringkan dengan tissue

steril. Jaringan ditumbuhkan dalam media PDA (Potato Dextrose Agar) kloramfenikol

untuk memastikan jamur yang sama dengan yang diinokulasi sebelumnya.

e. Identifikasi Isolat Jamur Penyebab Penyakit Busuk Umbi Porang

Isolat jamur hasil reisolasi yang menimbulkan gejala busuk umbi diidentifikasi di

bawah mikroskop dengan mencocokkan ciri-ciri jamur yang teramati ( Barnet & Hunter,

1998; CMI, 1981). Analisis secara molekular dilakukan sebagai berikut:

1) Ekstraksi DNA

Isolat jamur ditumbuhkan pada medium PDA. Jamur yang tumbuh disubkultur

ke dalam 50 ml medium Potato Dextrose Broth, digoyang di atas shaker dengan

11

kecepatan 125 rpm selama 7-10 hari pada suhu ruang. Ekstraksi DNA jamur dilakukan

dengan menggunakan bahan-bahan ekstraksi. Kultur jamur disaring dan miselium

ditimbang 0,5 gram dan dihaluskan dengan mortar dengan cara menambah 700 µl

CTAB 2% dan 500-700 µg pasir kwarsa. Sebanyak miselium dimasukkan dalam tube

1,5 ml diinkubasikan pada suhu 60°C selama 30 menit dalam waterbath, selanjutnya

disentrifuse 5.000 rpm selama 5 menit. Supernatan diambil dan dimasukkan dalam

tube baru dan ditambahkan dengan CIAA dengan volume yang sama dan divortex

selama 1-3 menit. Selanjutnya disentrifuse 12.000 rpm selama 10 menit. Supernatan

dipindahkan lagi dalam tube baru dan ditambahkan ethanol 96 % (1 M) sebanyak 1-2

kali volume supernatan yang didapatkan. Selanjutnya disimpan semalam pada suhu -

20 °C dan disentrifuse 12.000 rpm selama 10 menit. Supernatan dipindah kedalam

tube baru dan ditambah ethanol 70% sampai penuh dan digojog selama1-3 menit,

kemudian disentrifuse 12.000 rpm selama 10 menit dan ethanol dibuang. Pelet yang

didapatkan dikeringanginkan dan ditambah TE buffer 20 µL dan disimpan pada suhu -

20 °C.

2) Amplifikasi gen 16S rRNA DNA genom hasil ekstraksi digunakan untuk amplifikasi gen 18S-rRNA.

Selanjutnya, sampel DNA tersebut diamplifikasi dengan menggunakan pasangan

primer universal untuk berbagai spesies jamur yaitu 18S FWEU (5’-AGG ATC CAT

TGG AGG GCA AGT -3’) dan 18SRVEU (5’-TCC ACC TAC GAG CTT TTT ACC TGC

A -39). Komponen reaksi PCR (25 µl) mengandung PCR kit KAPA (10 µl), primer 27F

dan 1509R (masing-masing 2 µl), DNA cetakan (2 µl) dan dH2O (9 µl). Tahapan PCR

terdiri atas pre-denaturasi pada suhu 94 ºC selama 1 menit, denaturasi pada suhu

94 OC selama 30 detik, annealing (pelekatan primer) pada suhu 55 OC selama 30 detik,

extension pada suhu 72 OC selama 45 detik dan final extension pada suhu 72 OC

selama 5 menit dan PCR dijalankan selama 30 siklus. Tahap akhir suhu diturunkan

dan dipertahankan pada 4OC, kemudian siap untuk divisualisasi. Hasil amplifikasi DNA

kemudian divisualisasi menggunakan elektroforesis gel agarose dengan konsentrasi

1%. Setelah amplifikasi, DNA marker dan larutan DNA produk amplifikasi gen 18S

rRNA, masing-masing sebanyak 5 µl dimasukkan ke dalam sumur gel agarose dalam

1 x TBE dan alat elektroforesis di running dengan 110 V selama 30 menit .

Pita DNA hasil elektroforesis dideteksi dengan pengecatan ethidium bromida

selama 15 menit dan gel diletakkan di atas permukaan UV transilluminator, kemudian

divisualisasi dengan fotografi cahaya UV. Selanjutnya didokumentasikan dengan

kamera digital.

12

3) Analisis filogenetik

Hasil amplifikasi DNA dengan teknik PCR, selanjutnya disekuensing pada

perusahaan jasa sekuensing PT Genetika Science Indonesia (1st BASE Pte Ltd

Malaysia). Hasil sekuen berupa data perunutan DNA kemudian dianalisis tingkat

kesamaan atau kekerabatan genetik dari isolat yang diperoleh dengan data sekuen

GenBank menggunakan program BLAST-N (Basic Local Alignment Search Tool) .

Dengan program BLAST metode neighbour joining dibuat pohon filogenetik.

f. Identifikasi Isolat Bakteri Penyebab Penyakit Busuk Umbi Porang

Identifikasi isolat bakteri dilakukan setelah reisolasi biakan murni dari isolat

bakteri ke umbi porang dengan cara sebagai berikut:

1) Karakterisasi koloni bakteri

Karakterisasi bakteri yang diamati berdasarkan fisiologi bakteri yaitu: produksi

pigmen fluorescens, uji busuk lunak, reaksi gram, dan reaksi hipersensitif.

i. Produksi pigmen fluorescens dan warna koloni bakteri

Biakan murni isolat bakteri ditumbuhkan pada media King agar pada satu

cawan. Isolat bakteri yang tumbuh diamati di bawah sinar UV dengan panjang

gelombang 365 nm untuk pengamatan koloni bakteri dan pendarfluor yang dihasilkan.

Koloni bakteri yang tumbuh dan berpendar digoreskan kembali pada media King B

hingga diperoleh koloni tunggal. Koloni bakteri diamati di bawah sinar UV untuk melihat

koloni yang berpendar.

ii. Uji degradasi pektat

Uji degradasi pektat menggunakan umbi kentang sehat berbobot 30 g. Umbi

dicuci dengan air mengalir selanjutnya diusap dengan alkohol 96% dan dibilas dengan

air steril. Umbi kentang dibelah dan dibuat lubang (sumuran) ditengahnya. Isolat

bakteri umur 48 jam dituangkan pada sumuran tersebut. Umbi kentang diinkubasikan

pada suhu kamar selama 48 jam dengan kondisi anaerob. Pengamatan dilakukan

pada 24 jam dan dilanjutkan pada 48 jam. Untuk kontrol air steril dituangkan pada

sumuran umbi kentang.

iii. Reaksi gram

Uji reaksi gram menggunakan KOH 3%. Apabila saat pengujian dijumpai

benang hifa berarti gram negatif. Bakteri gram negatif mempunyai sifat patogenik.

iv. Uji hipersensitif

Pengujian hipersensitif dilakukan pada bakteri yang telah dipastikan berpendar

di bawah sinar UV. Pengujian ini menggunakan kerapatan bakteri 106 cfu/ml dan

13

diinfiltrasi pada daun tembakau. Hasil infiltrasi pada daun tersebut diiinkubasikan

selama 24 jam. Gejala nekrosis yang berwarna coklat muda hingga coklat tua dan

daun nampak tipis akan dihasilkan pada permukaan daun bagian atas, jika bakteri

yang diinfiltrasikan patogenik.

2) Analisis molekular

i. Ekstraksi DNA

Isolat bakteri yang berasal dari koloni tunggal ditumbuhkan pada medium NA

miring dalam tabung reaksi dan diinkubasikan dalam inkubator pada suhu 30OC

selama 48 jam. Isolat bakteri dipindahkan dan ditumbuhkan kembali ke dalam 5 ml

medium Nutrien Broth, digoyang di atas shaker dengan kecepatan 125 rpm selama 16

– 24 jam pada suhu ruang. Ekstraksi DNA bakteri dilakukan dengan menggunakan

bahan-bahan ekstraksi. Kultur bakteri dimasukkan dalam tube 1,5 ml disentrifuse

dengan kecepatan 12.000 rpm untuk mendapatkan sel bakteri dan selanjutnya

ditambah dengan 540 µL buffer TE dan 30 µL SDS 10% dan diinkubasikan selama

1 jam pada suhu 37°C dalam oven. Suspensi tersebut ditambah dengan 100 µL NaCl

5 M dan 80 µL CTAB/NaCl dan digojog, selanjutnya diinkubasikan pada suhu 65 °C

selama 10 menit dalam waterbath. Kemudian sebanyak 750 µL CIAA ditambahkan dan

digojog, selanjutnya disentrifuse 12.000 rpm selama 5 menit. Supernatan dipindahkan

kedalam tube baru dan ditambahkan dengan PCIAA sebanyak 600 µL untuk kemudian

disentrifuse 12.000 rpm selama 5 menit. Supernatan dipindahkan lagi dalam tube baru

dan ditambahkan ethanol 96 % (1 M). Selanjutnya disentrifuse 12.000 rpm selama

5 menit dan pelet dicuci dengan ethanol 70% dingin sebanyak 300 µL, kemudian

disentrifuse 12.000 rpm selama 5 menit. Pelet yang didapatkan dikeringanginkan dan

ditambah TE buffer 20 µL dan disimpan pada suhu -20 °C.

ii. Amplifikasi gen 16S rRNA

DNA genom hasil ekstraksi digunakan untuk amplifikasi gen 16S-rRNA.

Selanjutnya, sampel DNA tersebut diamplifikasi dengan menggunakan pasangan

primer universal untuk berbagai spesies bakteri yaitu 27F (5’-

AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) dan 1509R (5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’).

Komponen reaksi PCR (25 µl) mengandung PCR kit KAPA (10 µl), primer 27F dan

1509R (masing-masing 2 µl), DNA cetakan (2 µl) dan dH2O (9 µl). Tahapan PCR

terdiri atas pre-denaturasi pada suhu 94 ºC selama 2 menit, denaturasi pada suhu 95

OC selama 15 detik, annealing (pelekatan primer) pada suhu 57 OC selama 30 detik,

extension pada suhu 68 OC selama 30 detik dan final extension pada suhu 72 OC

selama 5 menit dan PCR dijalankan selama 30 siklus. Tahap akhir suhu diturunkan

14

dan dipertahankan pada 4OC, kemudian divisualisasi dengan elektroforesis gel

agarose konsentrasi 1%. Setelah amplifikasi, DNA marker dan larutan DNA dari produk

amplifikasi gen 16S rRNA, masing-masing sebanyak 5 µl dimasukkan kedalam sumur

gel agarose dalam 1 x TBE dan alat elektroforesis di running dengan 90 V/80 menit .

Pita DNA hasil elektroforesis dideteksi dengan pengecatan ethidium bromida

selama 15 menit dan gel diletakkan di atas permukaan UV transilluminator, kemudian

divisualisasi dengan fotografi cahaya UV. Selanjutnya didokumentasikan dengan

kamera digital.

iii. Sekuensing gen 16S rRNA dan Analisis filogenetik

Hasil amplifikasi DNA dengan teknik PCR, selanjutnya disekuensing pada

perusahaan jasa sekuensing PT Genetika Science Indonesia (1st BASE Pte Ltd

Malaysia). Hasil sekuen berupa data perunutan DNA kemudian dianalisis tingkat

kesamaan atau kekerabatan genetik dari isolat yang diperoleh dengan data sekuen

GenBank menggunakan program BLAST-N (Basic Local Alignment Search Tool) .

Pohon filogenetik sibuat dengan program BLAST metode neighbour joining .

1.2. Laporan Tahap II

Sampel tanah diperoleh dari tanaman porang yang sehat di sekitar

pertanaman yang terserang penyakit busuk umbi (bulbs rot) dan busuk pangkal

batang (collar rot) di bawah tegakan hutan jati Kecamatan Saradan Kabupaten

Madiun. Analisis sampel tanah dilakukan di laboratorium Agroteknologi Universitas

Merdeka Madiun dan LPPT Universitas Gadjah Mada Yogyakarta. Penelitian

dilakukan mulai bulan September 2015 sampai bulan November 2015.

Pemahaman sifat-sifat dari agens hayati, seperti sifat fenotipik bakteriologis

dan sifat patogenisitas terhadap tanaman porang diperlukan untuk keefektifan

pengendalian hayati. Metode penelitian dilakukan dengan cara: isolasi, skreening in

vitro, uji kemampuan antagonisme.

a. Isolasi dan Identifikasi Agens Hayati

Isolasi agens hayati dilakukan dengan cara pengambilan tanah yang melekat

disekitar perakaran tanaman porang sehat. Selanjutnya tanah dimasukkan dan

disimpan dalam kantung plastik untuk dianalisa. Sampel tanah dengan berat 1 g

dimasukkan dalam erlenmeyer yang berisi 10 ml larutan bufer fosfat 0,1 M dengan pH

7,0. Larutan divortex dan supernatan dibuat pengenceran 6 kali (10-6). Supernatan

sebanyak 1 ml dibiakkan dalam media King B agar dan diinkubasikan pada suhu kamar

15

selama 48 jam. Selanjutnya dilakukan isolasi kembali bakteri pada media King B

hingga diperoleh isolat murni.

Identifikasi bakteri antagonis diamati berdasarkan:1) pengamatan morfologi

koloni dan sel; 2) sifat fisiologi dan biokimia.

1) Pengamatan morfologi koloni dan sel bakteri antagonis

Bentuk dan warna koloni bakteri diamati di bawah mikroskop dengan sinar ultra

violet panjang gelombang 365 nm (UV tipe Gamac). Pengecatan negatif dilakukan

untuk melihat morfologi individu sel dengan metode Yutono et al., 1973.

2) Sifat fisiologi dan biokimia bakteri antagonis

Pengujian sifat fisiologi dan biokimia bakteri dilakukan dengan cara sebagai

berikut:

a) Pengujian gram

Isolat murni dari bakteri yang berumur 24 jam diambil sebanyak satu ose dan

diletakkan pada gelas obyek steril yang telah ditetesi dengan KOH 3% serta diaduk,

sehingga tercampur rata. Selanjutnya jarum ose diangkat perlahan-lahan, jika lengket

di jarum ose digolongkan gram negatif dan tidak lengket digolongkan gram positif

(Lelliot & Stead, 1987).

b) Reduksi Hidrogen Peroksidase (H2O2)

Isolat murni dari bakteri yang berumur 24 jam diambil sebanyak satu ose dan

digoreskan pada gelas obyek steril yang telah ditetesi dengan H2O2 3%, jika terjadi

gelembung udara menunjukkan bakteri tersebut mereduksi H2O2 (Lelliot & Stead,

1987).

c) Hidrolisis pati

Isolat murni dari bakteri yang berumur 24 jam ditumbuhkan pada medium pati

dan diinkubasikan selama 5 hari. Selanjutnya isolat ditetesi dengan reagen Iodium

pati, jika disekitar koloni menjadi bening menunjukkan reaksi positif. Reaksi negatif

akan nampak di sekitar koloni berwarna biru tua atau gelap (Lelliot & Stead, 1987).

d) Enzim gelatin

Isolat murni dari bakteri yang berumur 24 jam diinokulasikan pada medium

gelatin di dalam tabung reaksi dan diinkubasikan pada temperatur ruang selama 3 hari.

Selanjutnya diinkubasikan di dalam kulkas (suhu 4oC) selama 2 jam. Jika medium

tetap cair menunjukkan reaksi positif atau bakteri dapat menghidrolisis gelatin

(Klement, 1990).

16

e) Produksi Indol

Isolat murni dari bakteri yang berumur 24 jam ditumbuhkan pada medium

Indol dan diinkubasikan selama 3 −5 hari. Pengamatan dilakukan dengan meneteskan

larutan Iodin. Jika pada permukaan medium tersebut terdapat cincin merah

menunjukkan reaksi positif (Klement, 1990).

f) Reduksi nitrat

Isolat murni dari bakteri yang berumur 24 jam ditumbuhkan pada medium

Nitrat dalam tabung reaksi dan diinkubasikan selama 4 hari. Selanjutnya ditambahkan

1 ml reagen Nitrat dan diinkubasikan selama 24 jam pada temperatur ruangan. Jika

pada permukaan medium tersebut berwarna merah menunjukkan bakteri tersebut

mereduksi Nitrat (Klement, 1990).

g) Hidrolisis arginin

Isolat murni dari bakteri yang berumur 24 jam ditumbuhkan pada medium

dengan kandungan L-arginin di dalam dua tabung reaksi, masing-masing ditutup

dengan minyak parafilm dan tanpa ditutup minyak parafilm. Selanjutnya diinkubasikan

pada suhu 27oC selama 5 hari. Reaksi positif ditunjukkan dengan perubahan media

berwana merah pada tabung yang ditutup parafilm dan berwarna merah jambu pada

tabung yang tanpa ditutup parafilm (Lelliot & Stead, 1987).

h) Pembentukan Levan

Bakteri ditumbuhkan pada medium Nutrien Agar dengan penambahan sukrosa

5%. Selanjutnya diinkubasikan pada temperatur ruangan selama 2 hari. Pembentukan

levan sukrosa ditunjukkan dengan koloni bakteri yang transparan sampai gelap,

berlendir (mukoid) dan berbentuk cembung (Fahy & Hayward, 1983).

3) Pengujian koloni bakteri antagonis menghambat pertumbuhan koloni patogen

busuk umbi porang

Sclerotium delpinii isolate CBS221 dan Fusarium oxysporum strain Ppf15

sebagai kelompok jamur penyebab penyakit busuk umbi porang dan Cedecea lapagei

strain DSM 4597 dan Serratia marcecens subsp. Sakuensis strain KRED (laporan

kemajuan I) akan digunakan untuk uji daya hambat dari bakteri antagonis. Pengujian

dilaksanakan pada media King B agar dalam cawan petri.

Pengujian pada kelompok patogen jamur, bagian bawah cawan petri masing-

masing diberi garis tengah dengan spidol marker. Inokulum koloni bakteri antagonis

berumur 48 jam dengan cork borer ukuran diameter 5 mm diletakkan dengan jarak 3

cm dari tepi cawan petri. Sedangkan inokulum koloni penyebab penyakit busuk umbi

porang dengan cara yang sama, tetapi arahnya berlawanan dengan koloni bakteri

17

antagonis. Masing-masing inokulum koloni penyebab penyakit tersebut diletakan pada

cawan petri yang berbeda (Gambar 5). Selanjutnya inokulum tersebut diinkubasikan

selama 7 hari. Pengamatan dilakukan setiap hari dengan mengukur jari-jari koloni

Sclerotium delpinii isolate CBS221 dan Fusarium oxysporum strain Ppf15.

Gambar 4. Cara peletakan inokulum bakteri antagonis dan penyebab penyakit Keterangan : Pf = Pseudomonas fluorescens; P = Sclerotium delpinii;

Fusarium oxysporum

Daerah penghambatan diukur dengan rumus:

r1 – r2 I = x 100% r1

I = daya hambat (%).

r1 = jari-jari koloni Sclerotium delpinii isolate CBS221 dan Fusarium oxysporum strain

Ppf15 yang arahnya berlawanan dengan koloni bakteri antagonis.

r2 = jari-jari koloni Sclerotium delpinii isolate CBS221 dan Fusarium oxysporum strain

Ppf15 yang arahnya menuju koloni bakteri antagonis.

Pengujian pada kelompok patogen bakteri Cedecea lapagei strain DSM 4597

dan Serratia marcecens subsp. Sakuensis strain KRED dilakukan dengan

penambahan 6 ml air steril pada biakan patogen bakteri. Selanjutnya suspensi bakteri

diambil sebanyak 100 µl (107cfu/ml), dituangkan dalam cawan petri yang berisi media

King B agar, kemudian kertas saring steril diletakkan ditengah petri dan ditetesi bakteri

antagonis sebanyak 20 µl ( Navitasari et al., 2013).

Masing-masing isolat agens hayati dilakukan pengujian dengan tiga kali

ulangan. Nilai diameter daya hambat yang diperoleh dianalisis ragamnya dan diuji

dengan Jarak Berganda Duncan.

Pf P

18

1.3. Laporan Tahap III

Umbi katak diperoleh dari lahan endemis penyakit busuk umbi porang. umbi

katak tersebut berasal dari tanaman yang terinfeksi penyakit busuk umbi porang dan

jika jatuh ke tanah akan banyak sklerosia berlimpah di tanah, sehingga umbi katak

akan berfungsi sebagai agen penyebab penyakit saat disimpan dan di tanam di

lapangan.

Umbi katak dimasukkan dalam plastik diameter 30 cm dengan jumlah 1 kg umbi

katak/plastik untuk setiap perlakuan. Isolat yang tertinggi daya hambatnya

(P. fluorescens Pf 11) terhadap penyebab penyakit busuk umbi porang diuji pada umbi

katak saat penyimpanan. Isolat P. fluorescens hasil seleksi sebelumnya dikultur pada

media cair King B 5% dengan konsentrasi sesuai yang ditentukan dalam perlakuan.

Inokulum tersebut diinkubasikan selama 2 x 2 jam, selanjutnya diaplikasikan pada

umbi katak dengan dua cara aplikasi. Perlakuan terdiri atas dua faktor:

1) Cara aplikasi P. fluorescens: (A) umbi katak saat penyimpanan diperlakukan

dengan penyelaputan P. fluorescens. Umbi katak sebanyak 1 kg dicampurkan

dengan 10 ml suspensi P. fluorescens dan ditambah talk serta diaduk supaya

merekat, selanjutnya dimasukkan plastik; (B) penyemprotan umbi katak sebanyak

1 kg disemprot secara merata dengan 10 ml suspensi Pseudomonas fluorescens,

selanjutnya dimasukkan plastik; (C) sebagai kontrol tanpa upaya pengendalian.

2) Konsentrasi P. fluorescens: 105 cfu/ml; (B) 107 cfu/ml; (C) 109 cfu/ml. Hasil akhir

adalah benih umbi katak yang dilapisi pasta dan cairan bakteri antagonis

P fluorescens.

Percobaan ini disusun dalam Rancangan Acak Lengkap (RAL) terdiri dari 7

perlakuan dengan masing-masing perlakuan lima kali ulangan. Data diolah dengan

analisis ragam (ANOVA) dan dilanjutkan denganuji selang berganda Duncan (DMRT)

pada taraf nyata α = 5% menggunakan SAS versi 6.12

19

BAB 5.

RENCANA CAPAIAN, HASIL DAN PEMBAHASAN

1.1. Rencana Capaian

a. Laporan Tahap I

1) Pengamatan intensitas penyakit

Rencana capaian pada laporan kemajuan tahap pertama ini adalah mengetahui

persentase pembusukan di bagian luar dan bagian dalam umbi porang

berdasarkan periode tumbuh ketiga yaitu 2 minggu sebelum tanaman rebah

(MSBTR), saat tanaman rebah (TR), dua minggu setelah tanaman rebah (MSTR).

2) Pengambilan sampel umbi porang bergejala busuk dan isolasi penyebab

penyakit

Rencana capaian pada laporan kemajuan tahap pertama ini adalah menentukan

persentase busuk umbi di bagian kulit dan daging umbi porang serta

mendapatkan biakan murni dari isolat jamur dan bakteri. Biakan murni digunakan

untuk inokulasi penyebab penyakit.

3) Inokulasi isolat penyebab penyakit

Inokulasi isolat penyebab penyakit dilakukan pada umbi porang sehat di

laboratorium. Kegiatan inokulasi direncanakan akan mendapatkan gejala busuk di

laboratorium dan isolat murni yang akan diidentifikasi secara akurat. Sampai

dengan laporan kemajuan tahap pertama, direncanakan sudah terkumpul data hasil

skoring gejala busuk umbi di laboratorium.

4) Reinokulasi isolat jamur penyebab penyakit

Pada kegiatan reinokulasi penyebab penyakit direncanakan akan mendapatkan

mikroba yang tumbuh pada masing-masing media sampai diperoleh biakan murni

yang siap diidentifikasi.

5) Identifikasi isolat jamur penyebab penyakit

Pada kegiatan identifikasi isolat penyebab penyakit akan teramati ciri-ciri penyebab

penyakit dari isolat jamur berdasarkan pengamatan di bawah mikroskop, dan hasil

amplifikasi DNA isolat jamur serta analisis filogenetik.

20

6) Identifikasi isolat bakteri penyebab penyakit

Pada kegiatan identifikasi isolat penyebab penyakit akan teramati ciri-ciri penyebab

penyakit dari isolat bakteri berdasarkan pengamatan uji gram, pengujian

hipersensitif, sekuensing gen 16S rRNA serta analisis filogenetik.

b. Laporan Tahap II

1) Pengamatan morfologi koloni dan sel bakteri antagonis

Kegiatan ini dilakukan untuk mengetahui pigmen yang dikeluarkan oleh bakteri

tersebut pada medium King B di bawah sinar UV, sehingga dapat dibedakan dengan

kelompok bakteri lain. Selain itu pengecatan negatif terhadap bakteri untuk

mengetahui bentuk dan ukuran bakteri dengan pengamatan di bawah mikroskop.

2) Pengamatan sifat fisiologi dan biokimia bakteri antagonis

Pengujian berbagai sifat fisiologi dan biokimia bakteri dilakukan untuk

mengetahui sifat fenotipik bakteriologis agar efektif sebagai agens hayati. Pengujian ini

dilakukan dengan cara: pengujian gram, reduksi hidrogen peroksida, hidrolisis pati,

enzim gelatin, produksi indol, reduksi nitrat, hidrolisis arginin, pembentukan levans.

3) Pengujian koloni bakteri antagonis menghambat pertumbuhan koloni patogen

busuk umbi porang

Uji daya hambat terhadap patogen penyebab busuk umbi porang (S. delpinii

CBS221 dan F. oxysporum strain Ppf 15 , Cedecea lapagei strain DSM 4597, dan

Serratia marcecens subsp. Sakuensis strain KRED.) secara in vitro akan dilakukan

untuk memilih bakteri antagonis yang berpotensi sebagai agens hayati. Koloni patogen

penyebab penyakit busuk umbi porang disajikan pada Gambar 5.

Gambar 5. Penyebab penyakit busuk umbi porang pada 4 hari setelah inokulasi: A) Fusarium oxysporum strain Ppf 15; B) Sclerotium delpinii CBS221; C) Cedecea lapagei strain DSM 4597;D) Serratia marcecens subsp. Sakuensis strain KRED.

A B C D

21

c. Laporan tahap III

Jumlah sklerosia dan perkecambahan sklerosia dilakukan pengamatan

setelah umbi katak disimpan selama dua bulan. Jumlah sklerosia dihitung

menggunakan Wt Sieving Technique (Punja, 1988) yang telah dimodifikasi.

Skerosia setiap perlakuan diambil dengan pinset dan dimasukkan ke dalam

cawan petri. Selanjutnya organ pembiakan tersebut dikecambahkan. Setiap perlakuan

diambil 25 butir untuk diisolasikan pada media PDA dalam cawan. Perkecambahan

ditandai oleh munculnya hifa berwarna putih. Perkecambahan dihitung dengan rumus:

a P = x 100% a + b

P : persentase perkecambahan

a : sklerosia yang berkecambah

b : sklerosia yang tidak berkecambah

1.2. Hasil

a. Laporan Tahap I

1) Persentase penyakit busuk umbi porang

Gejala penyakit busuk umbi porang di batang nampak kumpulan miselium

seperti bulu. Miselium tersebut akan berubah menjadi butir-butir bulat dan lonjong yang

nampak disekitar tanah dari tanaman yang terinfeksi. Infeksi penyebab penyakit

tersebut menyebabkan permukaan kulit umbi terlapisi oleh miselium, jika ditekan umbi

menjadi lunak. Infeksi pada bagian daging umbi menampakkan gejala nekrose yang

berwarna coklat sampai hitam. Persentase penyakit busuk umbi porang tergolong

cukup rendah seperti yang ditunjukkan pada Tabel 1.

Tabel 1. Persentase penyakit busuk umbi di permukaan kulit dan daging umbi porang

berdasarkan periode tumbuh ketiga

Masa periode tumbuh ketiga Gejala pada bagian umbi porang

Permukaan kulit umbi (X ± SE%) Daging umbi (X±SE%)

2 MSBTR 7.25± 2.01 9.48 ± 2,39 TR 11.61± 1.84 14.01± 3.12 2 MSTR 13.83 ± 0.97 16.25 ± 1.70

Keterangan: MSBTR = minggu sebelum tanaman rebah; TR = tanaman rebah; MSTR = minggu setelah tanaman rebah; SE = Standard Error pengukuran

Penyakit busuk umbi porang terbanyak terjadi pada daging umbi saat 2 MSTR.

Daging umbi menampakan gejala nekrosa yang berwarna coklat muda sampai coklat

22

tua. Tingginya persentase busuk umbi ini disebabkan infeksi organisme lain saat

tanaman.

2) Inokulasi isolat jamur penyebab penyakit

Hasil inokulasi isolat patogen pada umbi porang menghasilkan gejala yang

terdiri atas: 1) umbi mengalami nekrose dengan miselium berwarna putih seperti

kapas dan berbulu dengan pertumbuhannya sangat cepat. Hari kelima setelah

inokulasi menampakan gumpalan berwarna putih, selanjutnya gumpalan tersebut

berwarna coklat ;2) umbi mengalami nekrose dengan miselium seperti kapas dengan

pertumbuhannya lambat. Sampai hari kelima tidak nampak terbentuknya gumpalan.

Hasil inokulasi isolat penyebab penyakit disajikan pada Gambar 6.

Gambar 6. Gejala busuk pada umbi porang yang muncul setelah diinokulasi dengan isolat jamur (A,B,C,D) pemacu pembusukan pada umbi porang di laboratorium, K: kontrol

3) Identifikasi isolat jamur penyebab penyakit

Potongan jaringan dari umbi bergejala busuk dengan miselium yang tumbuh di

daging umbi disubkultur hingga diperoleh biakan murni jamur. Morfologi jamur

penyebab busuk umbi porang pada media PDA disajikan pada Gambar 7.

Gambar 7. Biakan murni dari bagian jaringan umbi porang: A) koloni penyebab penyakit; B) koloni penyebab penyakit dengan sklerotia berwarna coklat

A B

23

a) Pengamatan mikroskopi

Hasil pengamatan di bawah mikroskop menampakan hasil sebagai berikut:

1) miselium dengan sklerotia; 2) miselium dengan spora yang terdiri atas mikrokonidia

dan makrokonidia yang berbentuk bulan sabit dan bersekat. Morfologi koloni jamur

penyebab busuk umbi porang disajikan pada Gambar 8.

Gambar 8. Morfologi koloni jamur penyebab busuk umbi porang (200 X):A) miselium dengan klamidospora (terminal); B,C,D) miselium dengan mikro dan makrokonidia

b) Analisis secara molekular

Masing-masing DNA isolat jamur seperti pada Gambar 4 diisolasi, kemudian di

PCR. Hasil amplifikasi DNA dengan teknik PCR disajikan pada Gambar 9.

M 1 2 3

Gambar 9. Hasil amplifikasi DNA pada isolat jamur penyebab penyakit busuk umbi porang dalam

PAGE 6%. Lajur (1) DNA miselium jamur dengan spora (makrokonidia dan mikrokonidia); Lajur (2) DNA miselium jamur dengan sklerotia; Lajur (3) DNA miselium jamur dengan spora (makrokonidia dan mikrokonidia); Lajur (M) marker DNA 1 kb

3000 bp

1000 bp

A B

C D

24

Isolat nomor 1 dan 3 berhasil teramplifikasi pada daerah sekitar 600 bp. Isolat

nomor 2 teramplifikasi pada daerahsekitar 700 bp. Hasil amplifikasi DNA isolat jamur

disekuensing. Hasil sekuen berupa data perunutan DNA kemudian dianalisis tingkat

kesamaan atau kekerabatan genetik dari isolat yang diperoleh dengan data sekuen

GenBank menggunakan program BLAST-N (Basic Local Alignment Search Tool) .

Program BLAST metode neighbour joining digunakan untuk membuat pohon filogenetik,

sehingga diperoleh nama spesies jamur dengan kecocokan tertinggi (Gambar 10).

Isolat1

Isolat3

Fusarium oxysporum strain Ppf15

Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici strain ATCC 52429

Fusarium oxysporum isolate 2-X

Sclerotium delphinii isolate CBS221

Isolat2

Athelia rolfsii strain bai269

100

64

87

42

0.05

Gambar 10. Pohon filogenetik dari isolat penyebab penyakit busuk umbi porang

4) Jenis isolat jamur penyebab busuk umbi porang hasil inokulasi

Jenis isolat jamur penyebab busuk umbi porang hasil inokulasi disajikan pada

Tabel 2.

Tabel 2. Jenis isolat jamur penyebab busuk umbi porang hasil inokulasi

Nomor isolat

Jenis mikroba Hasil inokulasi pada umbi

Rerata kemunculan gejala

Karakteristik pertumbuhan koloni di media PDA

1 dan 3 Fusarium oxysporum Strain Ppf15

Menghasilkan gejala pada 5 hsi

30,65% Koloni tumbuh agak lama; pada biakan umur 3 hari mencapai 0.8 cm

2 Sclerotium delphinii isolate CBS221

Menghasilkan gejala pada 3 hsi

88,23% Koloni tumbuh sangat cepat; pada biakan Umur 3 hari mencapai 3,6 cm

5) Reisolasi dan karakterisasi isolat bakteri penyebab penyakit busuk umbi porang

a) Reisolasi isolat bakteri penyebab penyakit

Reisolasi isolat bakteri penyebab penyakit dilakukan pada umbi porang yang

berumur satu bulan. Isolat bakteri yang tumbuh pada jaringan disubkultur beberapa

kali sampai diperoleh biakan murni. Reisolasi isolat bakteri disajikan pada Gambar 11.

25

Gambar 11. Gejala pada umbi porang dari hasil reisolasi isolat bakteri

b) Pengamatan koloni bakteri penyebab penyakit

Hasil isolasi pada media King B penyebab penyakit ditemukan 10 jenis bakteri

berpendar dan isolat nomor 3 berwarna merah. Hasil pengamatan koloni bakteri

tersebut pada media King B disajikan pada Gambar 12.

Gambar 12. Koloni bakteri penyebab penyakit busuk umbi porang

c) Pengujian gram

Hasil uji gram menunjukkan bahwa isolat bakteri nomor 1, 2, 3, 5, 7, 8 bersifat

gram negatif dan nomor 4, 6 dan 10 bersifat gram positif.

d) Pengujian hipersensitif

Pengujian hipersensitif menggunakan 10 isolat bakteri yang berpendar. Isolat

bakteri nomor 7 dan 5 masing-masing setelah masa inkubasi 2 hari, dan 3 hari

menunjukkan gejala nekrosis dan daun nampak tipis transparan (Gambar 13).

26

Gambar 13. Reaksi hipersensitif pada daun tembakau: A) gejala nekrosis pada isolat bakteri nomor 7; B) gejala nekrosis pada isolat bakteri nomor 5

e) Pengujian degradasi pektat pada umbi kentang

Uji degradasi pektat pada isolat bakteri pendar fluor nomor 5 dan 7

menunjukkan gejala yang berbeda. Isolat bakteri pendarfluor nomor 5 jaringan umbi

yang rusak dan mati berwarna hitam pekat dan tidak meluas dibandingkan isolat nomor

9. Hasil pengujian degradasi pektat pada umbi kentang disajikan pada Gambar 14.

Gambar 14. Hasil uji degradasi pektat isolat bakteri pendar fluor pada umbi kentang: Konrrol

dengan penuangan air steril; isolat 5 dan 7 dengan penuangan masing-masing isolat bakteri pendar fluor

f) Analisis secara molekular

Pohon filogenetik menunjukkan bahwa isolat bakteri nomor 5 termasuk dalam

kelompok Cedecea lapagei strain DSM 4597. Berdasarkan hasil BLAST diketahui

isolat mempunyai kemiripan 99% dengan Cedecea neteri NBRC 105707. Isolat

nomor 7 termasuk dalam kelompok Serratia marcecens subsp. Sakuensis strain

KRED. Isolat mempunyai kemiripan 100% dengan Serratia nematodiphila strain

DZ0503SBS1. Pohon filogenetik yang memperlihatkan posisi isolat bakteri nomor 5

dan 7 berdasarkan sekuen gen 16S rRNA (Gambar 15).

A B

27

P5

Cedecea lapagei strain DSM 4587

Cedecea neteri NBRC 105707

Serratia nematodiphila strain DZ0503SBS1

P7

Serratia marcescens subsp. sakuensis strain KRED

Leclercia adecarboxylata strain NBRC 102595

Pantoea agglomerans strain JCM1236

P4

Enterobacter cancerogenus strain LMG 2693

Enterobacter asburiae strain JCM6051

Pantoea ananatis strain 1846

P1

Pantoea anthophila strain LMG 255852

100

78

100

88

64

99

52

72

85

41

0.005

Gambar 15. Pohon filogenetik yang memperlihatkan posisi isolat bakteri nomor 5 dan 7 berdasarkan sekuen gen 16 S rRNA

6) Jenis isolat bakteri penyebab busuk umbi porang hasil inokulasi

Jenis isolat bakteri penyebab busuk umbi porang hasil inokulasi disajikan pada

Tabel 3.

Tabel 3. Jenis isolat bakteri penyebab busuk umbi porang hasil inokulasi

Nomor isolat

Jenis mikroba Hasil inokulasi pada umbi

Rerata kemunculan gejala

Karakteristik Uji hipersensitif, gram, dan degradasi pektat

5 Cedecea neteri NBRC 105707

Menghsilkan gejala pada 8 hsi

10,46% Gejala nekrosis, gram negatif, mendegradasi pektat pada hari 4, tetapi tidak menyebar

7 Serratia namatodiphila strain DZ0503SBS1

Menghasilkan gejala pada 4 hsi

14,01% Gejala nekrosis, gram negatif, mendegradasi pektat pada hari 4, tetapi menyebar

28

b. Laporan Tahap II

1) Morfologi koloni bakteri

Berdasarkan pengamatan di bawah sinar UV ( λ = 366 nm) menunjukkan tiga

dari 37 koloni bakteri pada medium King B agar berpendar dengan warna hijau

kebiruan. Koloni bakter tersebut dengan kode 11,15,25. Pendaran dan warna dari

koloni bakteri tersebut disajikan pada Gambar 16

Gambar 16. Pengamatan koloni bakteri pada medium King B di bawah sinar UV (λ = 366 nm) A) koloni bakteri yang berpendar; B) koloni bakteri yang berpendar dan yang tidak berpendar.

Individu bakteri dengan pengecatan negatif mempunyai bentuk batang dengan

ukuran 0,5−0,9 x 1,6−3,7 µm. Bakteri dapat ditemukan dalam keadaan tunggal dan

bergerombol (Gambar 17).

Gambar 17. Bentuk bakteri pada pengamatan di bawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 1000x

2) Pengujian reaksi hipersensitif pada daun tembakau

Pengujian hipersensitif menggunakan tiga koloni bakteri (Pf 11, Pf 15, Pf 25)

yang berpendar di bawah sinar UV masing-masing setelah masa inkubasi sampai

hari ke 7 tidak menunjukkan gejala nekrosis (Gambar 18).

A B

29

Gambar 18. Pengujian reaksi hipersensitif dari Pseudomonas fluorescens pada daun tembakau

3) Pengamatan sifat fisiologi dan biokimia bakteri

Tabel 4. Sifat fenotipik Pseudomonas fluorescens isolat Saradan

Sifat fenotip Pf 11 Pf 15 Pf 25

Gram − − − Reduksi Hidrogen Peroksidase + + + Hidrolisis Pati − + − Enzim Gelatin + + − Reduksi Nitrat + + + Produki Indol 2 hari 5 hari

− +

+ −

+ −

Hidrolisis Arginin + + + Pembentuk Levan + − −

4) Pengujian daya hambat

Tabel 5. Hasil pengujian Pseudomonas fluorescens isolat Saradan terhadap

pertumbuhan koloni penyebab penyakit busuk umbi porang

Kode isolat P. fluorescens

Daya hambat terhadap jamur penyebab busuk umbi porang (%)

Diameter hambatan terhadap bakteri penyebab busuk umbi porang (mm)

F.oxysporum S. delpinii C. neteri S. namatodiphila

Pf 11 85,12 a 78,84 a 11,25 a 14.09 a Pf 15 54,93 c 51.06 b 9.37 b 12,14 b Pf 25 61,40 b 49,93 b 9,29 b 8,70 b Kontrol 1,37 d 1,80 c 2,01 c 2,28 d

Keterangan: Angka yang diikuti huruf yang sama dalam kolom yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata pada P= 0.05

Kontrol = tanpa menggunakan isolat P. fluorescens

c. Laporan Tahap III

Perlakuan yang paling menekan jumlah dan perkecambahan sklerosia

adalah aplikasi dengan penyelaputan umbi katak P. fluorescens dengan konsentrasi

tinggi 107 -109cfu/ml. Viabilitas organ pembiakan Sclerotium delphinii pada umbi katak

yang disimpan selama dua bulan dari peubah jumlah dan perkecambahan sklerosia

hanya dipengaruhi oleh cara aplikasi P. fluorescens Pf 11. P fluorescens yang

diaplikasikan dengan penyelaputan benih dan penyemprotan umbi katak dengan

agens hayati tersebut, masing-masing mampu menekan jumlah sklerosia yang

30

terbentuk pada umbi katak rata-rata 22,50 butir (90 %) dan 12,34 butir (49,36 %)

sklerosia dari 25 sklerosia yang dikembangkan pada media PDA (Tabel 6).

Tabel 6. Pengaruh P.fluorescens PF 11 terhadap penekanan jumlah organ sklerosia

dari S. delphinii dan persentase perkecambahan sklerosia pada umbi katak di

penyimpanan

Cara aplikasi P.fluorescens Pf 11

Konsentrasi P.fluorescens Pf 11

(cfu/ml).

Organ sklerosia (butir/1 kg umbi katak)

Perkecambahan (%)

A1 105 20,45 b 18,20 e

107 23,26 ab 6,96 g

109 23,79 a 4,84 fg

A2 105 10,46 d 58,80 b

107 11,80 d 52,81 c

109 14,75 c 41,00 d

Kontrol 3,89 e 84,44 a

Keterangan: A1 : Aplikasi melalui penyelaputan umbi katak A2 : Aplikasi melalui penyemprotan Angka selajur yang diikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda nyata pada P= 0,05

1.3. HAMBATAN

Kendala dan hambatan pada kegiatan penelitian “Identifikasi Penyebab

Penyakit Busuk Umbi Porang (Amorphophallus mueleri Blume) “ yaitu ketersediaan

tanaman porang di lapangan. Ketersediaan tanaman porang di lapangan yang

digunakan untuk isolasi penyebab penyakit busuk umbi porang merupakan hambatan

yang paling utama. Tanaman porang pada musim kemarau yaitu bulan Juni sampai

bulan September dalam kondisi dorman. Oleh karena itu peneliti melakukan penelitian

sebelum bulan Juni untuk mendapatkan isolat penyebab penyakit busuk umbi porang di

pertanaman,sehingga tidak berpengaruh terhadap target-target penelitian. Meskipun

masalah keterlambatan pendanaan merupakan masalah klasik yang selalu terjadi untuk

peneliti di Indonesia.

Tahap ke II dan III secara teknis tidak mengalami hambatan dalam

penelitian. Hal ini karena penelitian dilakukan lebih awal dan penelitian di laboratorium

serta umbi katak di lapangan tersedia pada akhir musim kemarau. Meskipun tenggang

waktu pelaporan kemajuan II dan III sangat dekat.

1.4. PEMBAHASAN

a. Laporan Kemajuan I

Gejala penyakit busuk umbi menampakan tumbuhnya miselium pada pangkal

batang dan kulit serta bagian daging umbi porang. Kumpulan miselium berwarna

31

putih seperti kapas dan sklerotia berwarna coklat yang tumbuh pada kulit umbi porang

mengotori tanah dan melekat pada umbi tersebut serta menjadi sumber inokulum. Jika

tanah di permukaan umbi dibersihkan nampak permukaan umbi berwarna coklat

terang dan ditekan nampak lunak. Gejala pada pangkal batang ini menyebabkan

tanaman porang rebah sebelum saatnya (Gambar 19). Kondisi ini akan memudahkan

infeksi jasad pengganggu lain yang memperparah gejala pada umbi tersebut.

Gambar 19. Gejala penyakit busuk umbi porang: A) gejala pada pangkal batang; B) gejala pada permukaan tanah ; C) gejala pada permukaan kulit umbi porang

Jamur tular tanah dengan struktur berupa skletotia dapat bertahan hingga 10

tahun. Jika terdapat tanaman inang akan berkembang kembali. Permukaan sklerotium

dapat mengeluarkan exudat antara lain asam oksalat yang bersifat racun pada

tanaman. Asam oksalat meningkat karena senyawa dari akar yang menguap (Yaqub

dan Shahzad, 2005; Okereke dan Wokocha,2007; Sumartini,2011).

Hasil identifikasi berdasarkan pengamatan di bawah mikroskop miselium

dengan skerotia dan miselium dengan spora yang terdiri atas: makrokonidia dan

mikrokonidia, masing-masing adalah kelompok jamur Sklerotium sp dan Fusarium sp.

Amplifikasi DNA menunjukkan isolat 1 mempunyai ukuran pita yang sama

Berdasarkan diagram filogenetik, miselium jamur dengan sklerotia 100 % dianggap

teridentifikasi pada tingkat spesies dan memiliki kemiripan basa dengan Sclerotium

delphinii isolate CBS221. Miselium jamur dengan spora yang terdiri atas makrokonidia

dan mikrokonidia 87% dianggap teridentifikasi pada tingkat genus atau famili dan

memiliki kemiripan basa dengan Fusarium oxysporum strain Ppf15.

Karakter isolat bakteri nomor 1, 2, 3 ,5 , 7 dan 8 menunjukkan bersifat gram

negatif dan produksi pigmen pendarfluor. Meskipun pada uji hipersensitif menunjukkan

isolat bakteri nomer 5 dan 7 bergejala nekrosis, yang berarti penyebab penyakit pada

umbi porang. Hasil pengujian ini didukung dengan uji pektat. Isolat nomor 5 dan 7

mampu menghasilkan dan mensekresikan ensim pektinase atau isoensim serta

mendegradasikan dinding sel untuk merombak pektat. Hal ini menyebabkan umbi

porang membusuk dan berwarna hitam. Menurut Barras et al. (l994) menyatakan

A B C

32

enzim pektinase dari bakteri pendar fluor mampu memecah pektin didalam lamela

tengah dan dinding sel tanaman, sehingga jaringan mati, rusak dan sel pecah.

Berdasarkan hasil isolasi dan uji busuk umbi serta produksi pigmen

pendarfluor didapatkan 10 koloni bakteri. Koloni bakteri dari isolat nomor 5 dan 7

setelah uji gram menunjukan kelompok bakteri gram negatif dan uji hipersensitif

menghasilkan gejala nekrosis pada daun tembakau.Isolat nomor 5 dan 7

mengindikasikan patogenik terhadap umbi porang. Ignjatov et al., (2007) uji

patogenisitas positif, jika daun tembakau menunjukkan gejala nekrosis pada bagian

daun 24 jam setelah terinfiltrasi dengan isolat bakteri.

Berdasarkan uji gram isolat bakteri nomor 1 bersifat gram negatif, tetapi

bereaksi negatif pada uji hipersensitif, reisolasi pada umbi porang, dan degradasi

pektat, sehingga tbakteri tersebut tidak patogenik. Meskipun analisis pohon filogenetik

teridentifikasi Pantoea ananatis strain 1846. Bakteri patogenik yang menyebabkan

busuk umbi porang adalah dari kelompok Cedecea neteri NBRC 105707 dan Serratia

namatodiphila strain DZ0503SBS1 termasuk famili Enterobacteriaceae. Menurut

Kowalska et al. (2011) Serratia plymuthica menyebabkan busuk umbi pada bawang.

Sedangkan Serratia marcecens strain PPM4 16 S termasuk bakteri endofit yang

mampu menekan serangan penyakit hawar daun bakteri.

b. Laporan Kemajuan II

1) Morfologi koloni bakteri dan uji reaksi hipersensitif

Tiga koloni bakteri tersebut (Pf 11, Pf 15, Pf 25) merupakan kelompok

Pseudomonas fluorescens. Hal ini karena memancarkan sinar hijau kebiruan, jika

diamati di bawah sinar UV dengan panjang gelombang 365 nm. Menurut Sands (2001)

dan Schaad (l988) pendaran sinar tersebut mencirikan keberadaan dari siderofor

karena medium King B mengandung ion Fe. Terbentuknya pigmen fluorescens pada

bakteri di media King B menunjukkan bakteri termasuk golongan Pseudomonas

fluorescens.

Sampel dari tiga koloni bakteri Pseudomonas fluorescens tersebut mempunyai

bentuk batang dengan ukuran 0,5−0,9 x 1,6−3,7 µm. Menurut Palleroni (l993) koloni

bakteri tersebut merupakan famili dari Pseudomonasaceae.

Gejala nekrotik sampai hari ke 7 tidak dihasilkan oleh tiga koloni bakteri

Pseudomonas fluorescens pada uji HR. Reaksi ini menunjukkan koloni bakteri tersebut

bukan patogen tanaman.

33

2) Pengamatan sifat fisiologi dan biokimia bakteri

Koloni bakteri Pseudomonas fluorescens (Pf 11, PF 15, Pf 25) memberikan

reaksi negatif pada pengujian gram. Hal ini karena campuran koloni tersebut dengan

KOH 3% melekat pada jarum ose dan dapat diangkat. Hal ini nampak pada koloni

tersebut tidak melekat pada jarum ose. Menurut Lelliot & Stead (l987) kebanyakan

bakteri yang virulen bersifat gram negatif.

Reduksi Hidrogen Peroksidase (H2O2) dilakukan dengan uji katalase. Uji

katalase menunjukkan semua koloni bakteri Pseudomonas fluorescens (Pf 11, Pf 15,

Pf 25) bereaksi positif. Hal ini dibuktikan dengan gelembung-gelembung udara dari

campuran masing-masing koloni tersebut dengan H2O2. Menurut Lay (l994 ) koloni

bakteri tersebut menghasilkan enzim katalase. Enzim ini mampu merubah H2O2

menjadi air dan oksigen.

Uji hidrolisis pati menunjukkan dua koloni bakteri Pseudomonas fluorescens

(Pf 11 dan Pf 25) bereaksi negatif. Hal ini ditunjukkan dengan warna hitam di

permukaan media. Sedang koloni bakteri yang lain menunjukkan reaksi positif.

Menurut Lay (l994) koloni bakteri tersebut tidak dapat menghidrolisa pati menjadi

maltosa dan glukosa, sehingga tidak mampu menghasilkan enzim amylase.

Koloni bakteri Pf 11 , Pf 15 menunjukkan reaksi positif pada uji enzim gelatin.

Sedangkan koloni bakteri yang lain menunjukkan reaksi negatif. Reaksi positif

menghasilkan media cair setelah diinkubasikan di dalam kulkas. Menurut Lay (l994)

reaksi positif terjadi karena bakteri mendekomposisi medium gelatin.

Uji produksi indol menunjukkan isolat bakteri Pseudomas fluorescens (Pf 15,

Pf 25) bereaksi positif pada hari ke dua. Sedang pada hari ke lima menunjukkan reaksi

positif pada Pf 11. Hal ini ditunjukkan dengan lapisan berwarna merah pada

permukaan media setelah ditetesi iodin. Menurut Lay (l994) koloni bakteri (Pf 11)

tersebut mampu menghasilkan triptophan untuk memecah asam amino triptophan

menjadi indol dan asam piruvat serta NH4+.

Uji reduksi nitrat menunjukkan semua koloni bakteri Pseudomonas fluorescens

(Pf 11, Pf 15, Pf 25) bereaksi positif. Koloni bakteri tersebut setelah ditambahkan nitrat

mampu menghasilkan nitrit, sehingga terjadi perubahan warna merah dari bakteri

tersebut.

Uji hidrolisis arginin menunjukkan reaksi positif pada semua koloni bakteri

Pseudomonas fluorescens (Pf 11, Pf 15, Pf 25). Reaksi positif dicirikan dengan

perubahan warna merah pada tiga koloni yang ditutup dengan minyak parafin.

34

Koloni bakteri Pf 11 menunjukkan reaksi positif, sedangkan koloni bakteri yang

lain bereaksi negatif pada pembentukan Levan. Koloni bakteri Pf 11 nampak berlendir

dan bercahaya. Hal ini sesuai dengan yang dikemukakan oleh Fahy & Hayward (l983).

3) Daya hambat Pseudomonas fluorescens terhadap pertumbuhan koloni

penyebab penyakit busuk umbi porang secara in vitro

Berdasarkan hasil pengujian isolat Pseudomonas fluorescens menunjukkan

ketiga isolat (Pf 11, Pf 15, Pf 25) mampu menghambat pertumbuhan dan mempunyai

penghambatan bersifat bakteriostatik terhadap isolat penyebab penyakit busuk umbi

porang. Hal ini dilihat dari zona bening yang dihasilkan di sekitar isolat. Pengujian

Pseudomonas fluorescens menunjukkan senyawa siderofor. Hal ini ditunjukkan

dengan pendaran warna di bawah sinar UV.

Pengujian Pseudomonas fluorescens Pf 11 lebih effektif menghambat

penyebab penyakit penyakit busuk umbi porang secara in vitro (Gambar 20).

Gambar 20. Daya hambat Pseudomonas fluorescens Pf 11 terhadap Sclerotium delphinii pada 7 hari setelah inokulasi di media King B agar: A) koloni Sclerotium delphinii; B) daya hambat Pseudomonas fluorescens Pf 11 terhadap Sclerotium delphinii.

Secara umum daya hambat maupun zona hambat berbeda nyata dengan

daya hambat Pseudomonas fluorescens Pf 15 dan Pseudomonas fluorescens Pf 25.

Menurut Mulya et al. (l996) dan Kazempour (2004) rizobakteri yang menghasilkan

siderofor dan antibiotika lebih efektif untuk menekan penyakit dibandingkan dengan

agens hayati penghasil siderofor atau antibiotik saja.

Kemampuan Pseudomonas fluorescens Pf 11 menghasilkan siderofor yang

semakin tinggi dan senyawa toksik yang lebih banyak berhubungan dengan

peningkatan kemampuan penekanan penyakit. Selain itu mekanisme antagonisme

dilakukan dengan kompetisi pemanfaatan unsur hara Fe oleh bakteri antagonis. Oleh

karena media King B yang mengandung ion Fe juga digunakan untuk organisme lain.

c. Laporan Kemajuan III

Umbi katak selalu disimpan oleh petani untuk dijual dan ditanam pada saat

yang tepat harga dan waktu. Penyimpanan umbi katak yang tidak sehat akan menjadi

sumber inokulum di tempat penyimpanan (Gambar 21).

A B

35

Gambar 21. Penyimpanan umbi katak selama dua bulan yang ditumbuhi oleh miselium dan sklerosia

Pemanfaatan isolat P.fluorescens pf 11 asal rizosfer porang dari penelitian ini

memberi harapan baik dalam upaya pengendalian hayati penyakit tular tanah

S. delphinii (laporan kemajuan II) yang merupakan salah satu penyebab penyakit

busuk umbi porang. Aplikasi isolat P. fluorescens pf 11 (yang paling antagonis secara

in vitro) pada konsentrasi 107-109 cfu/ml dengan cara aplikasi melalui penyelaputan

umbi katak mempunyai pengaruh yang sangat nyata untuk menekan penyebab

penyakit terbawa umbi katak hingga tingkat 93,03%. Aplikasi dengan konsentrasi

tinggi dan merata akan meningkatkan populasi bakteri antagonis tersebut serta efisien

di tempat penyimpanan. Rahayu (2008) menyatakan bahwa konsentrasi suspensi

P. fluorescens pada 109 cfu/g, dapat mencegah penularan jamur tanah S. rolfsii pada

persemaian kedelai.

36

BAB 6.

KESIMPULAN DAN SARAN

1.1. Kesimpulan

1. Berdasarkan hasil identifikasi sekuensing 16 S rRNA, isolat penyebab busuk umbi

porang terdiri atas dua isolat jamur yaitu: Fusarium oxysporum strain Ppf15 ;

Sclerotium delphinii isolate CBS221 dan dua isolat bakteri yaitu Cedecea neteri

NBRC 105707 dan Serratia namatodiphila strain DZ0503SBS1.

2. Semua isolat Pseudomonas fluorescens yang diuji tidak merupakan patogen

tanaman dan bersifat bakteriostatik serta toksik, sehingga bisa digunakan sebagai

calon agens hayati penyebab penyakit busuk umbi porang. P. fluorescens Pf 11

yang paling antagonis secara in vitro.

3. P. fluorecens Pf 11 yang diaplikasikan melalui penyelaputan umbi katak dengan

konsentrasi tinggi (109 cfu/ml) berpengaruh positif dalam menekan S. delphinii .

4. P. fluorescens Pf 11 memiliki prospek untuk dikembangkan sebagai alternatif

pengendalian ramah lingkungan terhadap umbi katak di tempat penyimpanan.

1.2. Saran

Kegiatan identifikasi penyebab penyakit busuk umbi porang dilakukan dalam

upaya pengendalian terhadap penebab penyakit tersebut. Oleh karena itu penelitian ini

diharapkan untuk mendapatkan agens hayati dari tanaman porang sehat dengan cara

isolasi dan skreening di daerah endemis penyakit busuk umbi porang.

Sifat-sifat fenotipik dari Pseudomonas fluorescens dilakukan sebagai upaya

untuk dapat menggunakan efektifitas dari agens hayati tersebut. Meskipun masih

perlu diteliti secara molekular untuk memastikan hubungan kekerabatan dengan

kelompok Pseudomonas spp yang lain.

Pemanfaatan mikroba tanah sebagai biopestisida untuk mengendalikan

penyakit busuk umbi porang secara in Planta akan dijumpai kesulitan. Oleh karena itu

perlu diteliti lebih lanjut formulator yang tepat, sehingga isolat P. fluorescens Pf 11

mempunyai efikasi.

37

DAFTAR PUSTAKA

Ahmed IH, N Labuschagne, & L. Korsten.2007. Screening rhizobacteria for biological

control of Fusarium root and crown rot of sorghum in Ethiopia. Biol Control. 40 (1): 97−106. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.biocontrol .2006.07.017.

Andayanie WR. 2014. Kajian penyakit busuk umbi dan pangkal batang pada tanaman

porang. Laporan penelitian hibah internal. Universitas Merdeka Madiun. Barnet HL & BB Hunter. 1998. Illustrated Genera of Imperfect Fungi. 4 th Ed.APS

Press, Minnesota.

Barras F, F Van Gijsegem, & AK Chatterjee. 1994. Extracellular enzymes and

pathogenesis of soft rot Erwinia. Annu Rev. Phytopathol. 32: 201-234.

Chandrashekhara. 2007. Endophytic bacteria from different plant origin enhance

growth and induce Downy mildew resistence in pearl millet. J. Plant Pathology.

1 (1): 1-11.

CMI.1981. Description of pathogenic fungi and bacteria. Commonwealth Mycology

Institute, England.

Cool RJ & KF Baker. 1996. The nature and practice of biological control of plant

pathogens. APS Press. The American Phytopatological Society. St. Paul.

Minnesota, USA. 539 p.

Diniyah S. 2010. Potensi isolat bakteri Endofit sebagai penghambat pertumbuhan

bakteri (Ralstonia solanacearum) dan jamur (Fusarium sp. dan Phytopthora

infestans) penyebab penyakit layu pada tanaman. Skripsi Fak. Sains dan

Teknologi UIN Maulana Ibrahim Malang.

Fahy PC & AC Hayward. 1983. Media and methods for isolation and diagnostics test.

In Fahy PC & GJ Persley (Eds) Plant bacterial diseases a diagnostics guide:

337−378. Australia Academic Press.

Habazar T, Nasrun, Jamsari, & I N Rusli. 2007. Pola penyebaran penyakit hawar

daun bakteri (Xanthomonas axonopodis pv. allii) pada bawang merah dan

upaya pengendaliannya melalui imunisasi menggunakan rizobakteria. Laporan

hasil penelitian Universitas Andalas Padang dengan Litbang Pertanian Proyek

KKP3T.

Ignjatov M, M Milosevic, M Nikolic, Z Vujakovic, & D Petrovic. 2007. Characterization of

Pseudomonas savastanoi pv. glycinea isolates from Vojvodina.

Phytopathol.45:43-54.

Joseph B, Ranjan PR, & R Lawrence. 2007. Characterization of plant growth promoting

rhizobacteria associated with chickpea (Cicerarietinum L.). J. Plant Production

1(2): 141-151.

38

Jutono J, Soedarsono, S Hartadi, S Kabirun, Soehadi, Susanto. 1973. Pedoman

praktikum mikrobiologi umum untuk perguruan tinggi. Departemen Mikrobiologi

Fakultas Pertanian Universitas Gadjah Mada , Yogyakarta. 227 hal.

Kazempour MN. 2004. Biological control of Rhizoctonia solani, the causal agent of rice sheath blight by antagonis bacteria in green house and field conditions. J. Plant Pathol. 3: 88−96.

Klement Z, K Rudolph, DC Sand. L990. Methods in Phytobacteriology. Budapest

Academia Kiado. Kowalska B, U Smolinska, M Oskiera. 2011. Serratia plymuthica causing bulb rot in

Poland. Pol. J. Microbiol.60(1): 85-87. Lay Wb. 1994. Analisis mikrobia di laboratorium. Jakarta. Raja Grafindo Persada.

Lelliot & Stead. 1987. Mehods for the diagnosis of bacterial diseases of plant. Oxford:

Blackwell. Sci. Publ.

Leeman M, JA Van Velt, MJ Hendrick, RJ Schiffer, PAHM Baker, & B Schippers. L995.

Biocontol of Fusarium wilt of radish in commercial green house trials by seed

treatment with Pseudomonas fluoresens 374. Phytopath.85: 1301-1305.

Mulya K, M Watanabe, M Goto, y Takikawa, & S Tsuyusumu. 1996. Suprpression of

bacterial wilt disease in tomato by root dipping with Pseudomonas fluorescens

PfG 32: The role of antibiotic substances and siderophore production. Ann.

Phytopathol. Soc. Jap. 62; 132−140.

Navitasari L, L Soesanto, AY Rahayu. 2013. Pengaruh aplikasi Pseudomonas

fluorescens P60 terhadap mutu patologis, mutu fisiologis dan pertumbuhan bibit

padi IR 64. J. Hama Penyakit Tumbuhan Tropika 13 (2): 179−190.

Nawangsih AA, T Widjayanti, & Y.Anisa. 2014. Kelimpahan bakteri rizosfer pada

sistem PHT biointensif serta kemampuan antagonismenya terhadap

Sclerotium rolfsii pada kedelai. J. HPT Tropika 14(2): 110-120.

Okereke V, & RC Wokocha. 2007. In vitro growth of four isolates of Sclerotium

rolfsii Sacc in the humid tropics. African Journal of Biotechnologi 6(16): 1879-

1881.

Palleroni NJ. 1993. Introduction to the family Pseudomonasaceae. In: MP Starr, HG Troper, A Balows, and HG Schiegel (Eds.). The prokaryotes A Handbook on Habitat, Isolation and identification of bacteria. Springer-Verlag. New York.

Punja ZK. 1988. Sclerotium (Athelia) rolfsii, a pathogen of many plant species.

Advances in plant pathology, 6: 523-535.

39

Racmawati NY, & A Daroini. 2014. Strategi pengembangan komoditi tanaman porang (Amorphophallus oncophyllus) di Kabupaten Nganjuk. J. Manajemen Agribisnis. 14(1): 51-56.

Rahayu M. 2008. Efikasi isolat Pseudomonas fluorescens terhadap penyakit rebah

semai pada kedelai. Penelitian Pertanian Tanaman Pangan 27(3): 179-184. Sands, DS.1990. Physiological criteria- determinative test. In: Klement, Z., K Rudolph,

and DC Sands. Methods in phytobacteriology. Academical Kado, Budapest: 133−143.

Schaad NW. 1988. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria. 2 nd

Edition Minnesota: The American Phytopathological Society. Schaad NW, JB Jones & W Chun, 2001. Laboratory guide for identification of plant

pathogenic bacteria (third Edition), APS Press, The American Phytopathological Society. St. Paul Minnesota.

Setiasih I. 2008. Produktivitas tanaman iles-iles (Amorphophallus muelleri Blume) pada

berbagai perlakuan dosis N dan K . Skripsi. Institut Pertaian Bogor. Sumartini. 2011. Penyakit tular tanah (Sklerotium rolfsii dan Rhizoctonia solani) pada

tanaman kacang-kacangan dan umbi-umbian serta cara pengendaliannya. J Litbang Pertanian 3(1):27-34.

Yanti Y & Z Resti. 2010. Indu