Metode Analisis Kualitatif dan Kuantitatif Asam NukleatKamila Luthfia Putri (1306412193) Teknologi Bioproses

I. AbstrakAsam nukleat adalah senyawa kimia yang terdapat di dalam inti sel (Nukleus). Asam nukleat merupakan suatu polimer nukleotida yg berperanan dalam penyimpanan serta pemindahan informasi genetik yang berhubungan dengan pewarisan sifat turunan. Asam nukleat terdapat pada semua sel hidup dan betugas untuk menyimpan dan mentransfer informasi genetik, kemudian menerjemahkan informasi ini secara tepat untuk mensintesis protein yang khas bagi masing-masing sel. Terdapat dua jenis asam nukleat yaitu, DNA (deoxyribonucleid acid) dan RNA (ribonucleic acid). Saat ini sudah banyak metode-metode untuk identifikasi dan analisis asam nukleat. Analisis dan proses identifikasi/deteksi asam nukleat sendiri terdiri dari analisis kualitatif dan analisis kuantitatif. Analisis kualitatif bericara mengenai metode untuk mengetahui keberadaan atau eksistensi dari DNA atau RNA yang sedang diuji dan juga mengenai cara dalam memanipulasi/menggunakan DNA atau RNA dalam proses pengujian. Metode yang digunakan dalam hal tersebut diantaranya adalah staining, elektroforesis gel, hibridisasi, sentrifugasi. Selain iut juga terdapat analisis kualitatif yang membicarakan mengenai bagaimana proses dan mekanisme pengurutan DNA (DNA sequencing). Analisis kuantitatif membahas mengenai bagaimana menghitung kemurnian dan konsentrasi dari DNA atau RNA yang sedang diuji. Metode atau teknik yang digunakan dalam hal tersebut salah satunya adalah spektrofotometri UV-Vis. Selain itu, dibahas pula teknik RT-PCR yang mendukung analisis kuantitatif dari DNA atau RNA.

II. Analisis Kualitatif

1. StainingStaining merupakan sebuah metode yang dapat digunakan untuk memvisualisasikan atau menunjukkan keberadaan DNA maupun RNA, terutama setelah mengalami proses pemisahan (misalnnya dengan elektroforesis gel). Pemberian zat berwarna bertujuan untuk mengetahui keberadan atau letak DNA atau RNA. Hal tersebut dikarenakan DNA atau RNA tidak dapat kita lihat secara langsung dengan mata telanjang. Terdapat banyak jenis pewarna yang dapat digunakan keperluan ini, beberapa diantaranya adalah etidium bromida, SYBR Gold, SYBR Green, SYBR Safe, dan Eva Green. Etidium Bromida merupakan jenis pewarna umum untuk memvisualisasikan DNA. Pewarna ini dapat digunakan dalam gel, baik pada larutan penyangga elektroforesis ataupun pada gel. Molekul-molekul pewarna ini menempel pada rantai DNA dan bersifat fluoresens dia bawah cahaya UV. Namun etidium bromida bersifat karsinogen, karena itu penggunaannya harus ditangani dengan baik. SYBR Gold merupakan jenis pewarna yang dapat digunakan untuk mewarnai DNA rantai tunggal atau ganda, maupun RNA. Jenis pewarna ini merupakan salah satu alternatif pewarna etidium bromida dan dinilai lebih sensitif daripada pewarna etidium bromida. SYBR Green terbagi menjadi dua jenis, yaitu SYBR Green I dan II. SYBR Green I lebih sensitive terhadap pengunaan DNA rantai ganda, sedangkan SYBR Green II paling baik untuk DNA rantai tunggal SYBR Safe merupakan pewarna yang dirancang agar menjadi pewarna yang lebih aman daripada pewarna etidium bromida dan pewarna SYBR lainnya. Pewarna ni tidak bersifat beracun dan aman untuk dibuang langsung ke dalam sistem pembuangan limbah. Eva Green merupakan jenis pewarna yang dapat dimanfaatkan dalam metode PCR (Polymerase Chain Reaction). Selain itu, pewarna ini juga cocok digunakan untuk gel yang memiliki titik leleh yang rendah. Eva Green sangat stabil dalam suhu tinggi dan memiliki fluoresensi yang rendah, akan tetapi tingkat fluoresensinya menjadi sangat tinggi setelah berikatan dengan DNA. Pewarna ini juga memiliki tingkat toksisitas yang rendah seperti SYBR Safe.

2. Gel ElektroforesisElektroforesis adalah suatu proses migrasi molekul bermuatan di dalam suatu media yang bermuatan listrik, dimana kecepatan migrasinya tergantung pada muatan, ukuran dan bentuk setiap molekul yang terlibat. Pada saat arus listrik diberikan, molekul bermigrasi melalui media (biasanya berupa gel), mlekul yang kecil akan bermigrasi lebih cepat daripada yang besar, sehingga akan terjadi pemisahan. Teknik elektroforesis digunakan untuk memisahkan dan mempurifikasi makromolekul. Makromolekul yang dijadikan objek elektroforesis adalah protein dan asam nukleat yang memiliki perbedaan ukuran, kadar ion, dan molekul-molekul penyusunnya. Molekul-molekul tersebut diletakkan dalam di dalam medan listrik sehingga akan bermigrasi karena adanya perbedaan muatan. Molekul protein dan asam nukleat yang bermuatan negatif akan bergerak dari kutub negatif menuju kutub positif dari gel elektroforesis.Pergerakan/migrasi dari molekul-molekul asam nukleat tersebut bergantung pada berat molekul masing-masing molekul asam nukleat. Molekul yang memiliki berat lebih ringan (lebih panjang rantainya) akan bergerak lebih lambat daripada molekul yang memiliki berat molekul lebih besar. Dengan begitu, molekul asam nukleat dapat dibedakan atas berat molekulnya dengan cara membandingkannya dengan sampel standar (sudah diketahui berat molekulnya). Berat molekul asam nukleat sebanding dengan panjang rantainya sehingga asam nukleat juga dapat dibedakan berdasarkan banyaknya pasangan nukleotidnya. Semakin banyak pasangan nukleotid yang terkandung, maka akan semakin panjang pula rantainya.Beberapa factor yang mempengaruhi kecepatan molekul bergerak melewati gel, yaitu ukuran molekul, bentuk moleku, densitas muatan, komposisi gel, dan kuat medan listrik. Berdasarkan ukuran molekul, molekul-molekul yang berukuran kecil lebih cepat bergerak melewati gel dibandingkan dengan molekul-molekul yang berukuran besar. Bentuk molekul seperti DNA memiliki kecepatan gerak yang berbeda-beda. Molekul yang memiliki densitas muatan tingi akan bergerak lebih cepat. Komposisi gel berbanding terbalik dengan ukuran pori-porinya sehingga pada gel dengan konsentrasi tinggi, DNA berukuran besar akan sulit untuk bergerak. Kuat medan listrik yang lebih tinggi akan mempercepat pergerakan molekul.Elektroforesis memerlukan komponen utama berupa gel, antara lain gel pati, gel agarosa, gel poliakrilamida, dan gel selulosa asetat yang memilki fungsi masing-masing. Jenis-jenis gel tersebut memiliki kapasitas pemisahan yang berbeda. Gel pati dan gel selulosa asetat berfingsi untuk memisahkan protein, sel agarosa untuk memisahkan DNA yang berukuran besar dan gel poliakrilamida berfungsi untuk memisahkan DNA atau protein berukuran kecil.Gel agarosa dapat dibuat dengan cara melarutkannya dalam suatu larutan buffer. Agar proses pelarutannya dapat berlangsung dengan baik, proses pelarutan harus dibantu dengan pemanasan dalam microwave. Dalam keadaan panas, gel akan berwujud cair sehingga dapat dipindahkan ke suatu wadah (plate). Sebelum kembali menjadi padat, ujung gel diberi lubang dengan menggunakan lembaran Perspex tipis yang dibentuk menyerupai sisir. Sisir tersebut ditancapkan pada salah satu ujung gel yang masih cair. Dengan demikian ketika gel memadat dan sisir yang ditancapkan telah dicabut, akan terbentuk lubang lubang pada gel. Sampel DNA dimasukkan ke dalam lubang lubang kecil yang telah dibuat tersebut. Gel agarosa yang telah dibentuk kemudian dimasukkan ke dalam suatu tanki yang berisi larutan buffer yang sama dengan larutan yang digunakan untuk membuat gel. Setelah sampel DNA dimasukkan ke dalam lubang, arus listrik dialirkan. Kutub yang sejajar dengan lubang pada sampel merupakan kutub negatif sedangkan kutub lainnya adalah kutub positif. Karena DNA bermuatan negatif, DNA akan bergerak menuju ke kutub positif. Setelah beberapa saat, gel direndam dalam larutan yang mengandung etidium bromida. Etidium bromida akan menginterkalasi (menyisip ke dalam) DNA. Penggunaan etidium bromida bertujuan untuk membantu visualisasi karena etidium bromida akan memancarkan sinar UV. Apabila gel disinari dengan sinar UV dari bawa, akan tampak pita pita pada gel. Pita pita yang tampak merupakan molekul DNA yang bergerak sepanjang gel selama proses elektroforesis.

Gambar1. Proses Elektroforesis Gel Agarosa

3. DNA SequencingDNA Sequencing adalah suatu metode untuk menentuan urutan basa nukleotida dari molekul DNA. Pengurutan (sequencing) asam nukleat memungkinkan kita mengetahui kode genetik dari molekul DNA. Perubahan sekuens DNA dapat mengakibatkan perubahan protein atau menyebabkan terbentuknya protein non fungsional. Akibatnya dapat menimbulkan efek merugikan pada organism. Terdapat dua jenis metode dalam DNA sequencing dapat menggunakan metode Sanger, yaitu pemutusan rantai, atau metode Maxam-Gilbert, yaitu pembelahan secara kimiawi. Metode Maxam & Gilbert didasarkan pada pembelahan DNA pada lokasi tertentu dengan penggunaan zat-zat kimia daripada enzim. Namun, metode ini sudah jarang digunakan. Metode yang lebih sering digunakan saat ini adalah metode Sanger. Dalam metode Sanger, sintesis DNA secara enzimatik terjadi melalui pembentukan secara berurut ikatan fosfodiester antara gugus 5 fosfat yang bebas dari nukleotid yang masuk dan gugus 3 OH dari rantai yang tumbuh. Proses ini berlangsung di sepanjang DNA tersebut. SangerMetode Sanger merupakan metode sekuensing yang ditemukan oleh Frederick Sanger. Metode Sanger juga disebut sebagai sequencing dideoksi atau terminasi rantai, didasarkan pada penggunaan dideoksinukleotida (ddNTP) di samping normal (NTP) yang ditemukan dalam DNA. Prinsip kerja metode Sanger yaitu terminasi sintesis DNA oleh dideoksinukleotida yang ditempatkan pada empat tabung berbeda. Terminasi sintesis DNA akan menghasilkan chain terminating dideoxynucleotide sehingga terbentuk fragmen-fragmen dengan ukuran yang beragam. Dideoksinukleotida pada dasarnya sama dengan nukleotida kecuali mereka mengandung gugus hidrogen pada 3 'karbon bukan gugus hidroksil (OH). Nukleotida yang termodifikasi, ketika diintegrasikan ke dalam urutan, mencegah penambahan nukleotida lebih lanjut. Ini terjadi karena ikatan fosfodiester tidak dapat terbentuk antara dideoksinukleotida dan nukleotida masuk berikutnya sehingga rantai DNA diakhiri.

Gambar 2. Struktur Deoksinukleotida dan Dideoksinukleotida

Gambar. 1 Sanger MethodMetode sanger diawali dengan rantai ganda DNA akan mengalami denaturasi pada suhu tinggi menjaid rantai tunggal. DNA tunggal ini akan bertindak sebagai DNA template. DNA template kemudian dilekatkan dengan sebuah primer (sebuah rantai yang memiliki panjang sekitar 12-24 basa yang komplementer dengan ujung 3 dari salah satu untai template DNA). Ukuran primer yang tepat dalam proses ini harus ditentukan; primer yang terlalu pendek memiliki kemungkinan untuk menemukan rangkaian komplementernya pada banyak tempat sehingga dapat menempel (annealing : proses penggabungan sehingga terbentuk kembali DNA untai ganda / double stranded) dengan mudah, sedangkan primer yang terlalu panjang akan mengakibatkan proses penggabungan yang tidak stabil. Primer disintesis secara kimiawi dan proses annealing-nya dipengaruhi oleh pembentukan ikatan hidrogen antara primer dan untai DNA komplementer. Primer yang digunakan telah di-radiolabeled (penandaan / pemberian label dengan radioaktif) pada ujung 5 dengan 32P-fosfat. Pemberian label pada ujung rantai dilakukan oleh enzim polinukleotida kinase dan adenosine trifosfat (ATP) yang memiliki gamma-fosfat yang berlabel 32P. Ketika primer bergabung dengan DNA template, setiap produk yang terbentuk selama proses ekstensi oleh DNA polimerase akan memiliki label 32P pada ujung 5. Larutan yang terbentuk kemudian dibagi ke dalam empat tabung berbeda yang diberi label G, A, T, dan C yang mengandung reagen reagen berikut : G : keempat dNTP, ddGTP, dan DNA polimerase A : keempat dNTP, ddATP, dan DNA polimerase C : keempat dNTP, ddCTP, dan DNA polimerase T : keempat dNTP, ddTTP, dan DNA polimerase DNA polimerase dalam keempat tabung akan memperpanjang salinan komplementer dari DNA template untai tunggal. dNTP ditambahkan secara berturut turut pada rantai primer yang terus berkembang, dan basa yang komplementer dengan basa yang terdapat pada untai DNA pun dipilih. Ikatan fosfodiester akan terbentuk antara gugus 3-hidroksil pada ujung primer yang berkembang dan gugus 5-fosfat dari dNTP yang masuk. Ketika ddNTP ditambahkan, ikatan fosfodiester tidak dapat terbentuk sehingga rantai akan terputus. ddNTP yang ditambahkan tidak mengandung gugus OH pada posisi 3 dari deoksiribosanya. Ketidakhadiran gugus hidroksil tidak mengizinkan nukleotida berikutnya untuk bergabung karena 5-fosfat dari nukleotida berikutnya tidak dapat membentuk ikatan dengan 3-H. Dalam metode ini, keempat reaksi dimulai dari nukleotida yang sama tetapi berakhir pada basa yang spesifik, yang berbeda untuk masing masing tabung. Dalam larutan yang mengandung reaktan, DNA dengan rantai yang sama akan disintesis berulang kali. Akan tetapi, segera setelah ddNTP ditambahkan, rantai yang baru disintesis akan segera terpotong. Karena ddNTP ditambahkan secara acak (tidak teratur), sintesis akan terpotong pada berbagai posisi yang berbeda untuk masing masing tabung reaksi. DNA polimerase akan mengintegrasikan dNTP atau ddNTP secara acak. Setelah reaksi selesai berlangsung, produk (fragmen DNA yang baru disintesis dan diberi label) akan mengalami denaturasi oleh panas menjadi molekul DNA tunggal dan akan melalui proses elektroforesis. Hasil dari masing masing reaksi dipisahkan ke dalam empat jalur berbeda.

Gambar 3. Metode Sanger

Maxam-GilbertMetode Maxam-Gilbert merupakan metode sekuensing yang dikembangkan oleh Allan Maxam dan Walter Gilbert pada tahun 1977. Metode tersebut memiliki prinsip dasar pemotongan ujung molekul DNA berlabel dengan menggunakan agen kimiawi yang spesifik. Metode Maxam-Gilbert dapat diterapkan baik untuk DNA untai ganda maupun DNA untai tunggal dan melibatkan pemotongan basa spesifik yang dilakukan dalam dua tahap. Pada metode ini fragmen-fragmen DNA yang akan disekuens dipotong-potong terlebih dahulu secara parsial menggunakan piperidin. Kemudian DNA dilabeli pada salah satu ujungnya, biasanya menggunakan fosfat radioaktif atau suatu nukleotida pada ujung 5. Sekuens fragmen DNA yang dipelajari atas dasar laju migrasi masing-masing pita. Lajur kedua berisi fragmen-fragmen yang salah satu ujungnya adalah A atau G. Untuk memastikannya harus dilihat pita-pita pada lajur pertama. Jika pada lajur kedua terdapat pita-pita yang posisi migrasinya sama dengan posisi migrasi pada lajur pertama, maka dapat dipastikan bahwa pita-pita tersebut merupakan fragmen yang salah satu ujungnya adalah G. Sisanya adalah pita-pita yang merupakan fragmen dengan basa A pada salah satu ujungnya. Cara yang sama dapat kita gunakan untuk memastikan pita-pita pada lajur ketiga, yaitu dengan membandingkannya dengan pita-pita pada lajur keempat.Seperti halnya pada elektroforesis gel agarosa, laju migrasi pita menggambarkan ukuran fragmen. Makin kecil ukuran fragmen, makin cepat migrasinya. Dengan demikian, ukuran fragmen pada contoh tersebut di atas dapat diurutkan atas dasar laju/posisi migrasinya.

Gambar 4. Ilustrasi Metode Maxam-GilbertPerbedaan metode Sanger dengan Maxam-Gilbert, pada metode Maxam-Gilbert digunakkan DNA berantai ganda dan membutuhkan modifikasi basa pada DNA yang diikuti pembelahan kimiawi basa spesifik. Pertama, DNA berantai ganda diberi label dengan menempelkan gugus fosfor radioaktif (32P) pada ujung ke-5. Enzim polinukleotida kinase dan 32P-dATP digunakan disini. Lalu menggunakan dimetil sulfoksida dan memanaskan hingga 90OC, kedua rantai DNA akan terputus dan dimurnikan. Rantai tunggal sampel akan dipisahkan menjadi sampel terpisah dan masing-masing dihubungkan dengan salah satu pelarut pembelahan. Proses ini melibatkan modifikasi basa yang dilanjutkan oleh pemindahan basa yang telah dimodifikasi. Lalu, piperidine digunakan untuk membelah rantai dimana basa yang telah dimodifikasi tersebut berpindah. Jika reaksi diatur untuk memberi hanya satu atau beberapa pembelahan per molekul DNA, maka akan terbentuk potongan DNA yang memiliki panjang berbeda. Lalu sampel akan dilakukan proses elektroforesis dan hasilnya akan terlihat.

4. HibridisasiHibridisasi asam nukleat adalah salah satu metode analisis yang paling sering digunakan. Teknik ini digunakan untuk Southern blotting, Northern blotting dan untuk skrining library. Tujuan metode ini adalah untuk melihat (visulisasi) sekuens asam nukleat tertentu (DNA atau RNA) dalam lingkungan/latar belakang campuran sekuens lain yang kompleks. Teknik ini memanfaatkan sifat DNA yaitu dua untai asam nukleat yang komplemen akan saling mengikat (hibridisasi) dengan tingkat spesifisitas yang tinggi.Southern BlottingSouthern blotting dimulai dengan pemisahan elektroforesis gel fragmen DNA yang telah didigesti dengan enzim pemotong. DNA kemudian didenaturasi (dipisahkan menjadi 2 untai tunggal) dengan perlakuan alkali, selanjutnya untai tunggal ditransfer ke membran melalui transfer kapilaritas. DNA akan terikat pada secara kovalen pada membran dan diimobilisasi pada fase padat, menghasilkan replika fragmen pada gel. Fagmen DNA spesifik pada membran dapat diidentifikasi dengan hibridisasi menggunakan probe yang spesifik untuk fragmen gen yang dikehendaki.Northern BlottingPemisahan gel dan hibridisasi asam nukleat dapat juga untuk analisis RNA menggunakan prosedur Northern blotting. Beberapa hal yang membedakan dengan Southern blotting adalah: (1) RNA jauh lebih rentan terhadap degradasi dibanding DNA, oleh karena itu elektroforesis dilakukan dalam buffer yang mengandung zat kimia yang bersifat melindungi (biasanya formaldehid), (2) RNA sudah berupa untai tunggal dan membutuhkan kondisi denaturasi yang lebih ringan, (3) RNA biasanya berukuran tertentu sehingga tidak memerlukan digesti enzim untuk memperoleh pola pita.

Gambar 5. Southern blot. DNA genom diisolasi dan digesti dengan enzim restriksi. DNA kemudian dirun pada gel agarose dan ditransfer ke membran di mana DNA kemudian diikatkan secara kovalen. DNA selanjutnya dihibridisasi menggunakan probe yang dilabel 32P. Interaksi antara DNA dan probe yang dilabel dideteksi dengan cara memajankan DNA-membran ke film otoradiografi.Bottom of Form

5. SentrifugasiSentrifugasi merupakan salah satu metode dasar yang sangat penting dalam studi biologi sel maupun biologi molekuler. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi. Sentrifugasi tidak hanya dapat memisahkan sel atau organel subseluler, melainkan juga digunakan untuk pemisahan molecular. Prinsip sentrifugasi didasarkan atas fenomena bahwa partikel yang tersuspensi di dalam suatu wadah (tabung) akan mengendap ke dasar wadah karena pengaruh gravitasi. Laju pengendapan tersebut dapt ditingkatkan dengan cara meningkatkan pengaruh gravitasional terhadap partikel. Hal ini dapat dilakukan dengan menempatkan tabung berisi suspense partikel ke dalam ritir suatu mesin sentrifugasi kemudian diputar dengan kecapatan tinggi. Sentrifugasi merupakan proses penting dalam isolasi dan pemisahan sel. Makin besar ukuran sebuah partikel, maka makin besar gaya sentrifugal yang dialaminya. Oleh karena itu partikel yang memiliki ukuran yang lebih besar akan terendapkan lebih awal di dasar tabung.

III. Analisis Kuantitatif1. Spektrofotometri UV-Vis Spektrofotometri merupakan metode untuk mengetahui kemurnian suatu zat berdasarkan pengukuran nilai absorbansi dan nilai transmitansi. Transmitansi merupakan jumlah cahaya yang dilewatkan oleh zat, sedangkan absorbansi merupakan jumlah cahay yang diserap oleh zat. Spektrofotometri ini terdiri dari spektrofotometer dan fotometer. Spektrofotometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu, sementara fotometer adalah pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau diabsorbsi. Salah satu jenis spektrofotometri yang dapat digunakan untuk uji juantitatif DNA adalah Spektrofotometri UV-VisSpektrofotometri ini merupakan gabungan antara spektrofotometri UV dan spektrofotometri visible (cahaya tampak). Sinar UV memiliki panjang gelombang sekitar 190 380 nm. Berbeda dengan cahaya tampak, sinar UV tidak dapat dideteksi dengan mata, sehingga senyawa yang dapat menyerap sinar ini terkadang merupakan senyawa yang tidak berwarna atau bening. Salah satu keuntungan dari metode ini adalah dapat menggunakan sampel berwarna ataupun tidak berwarna. DNA dapat menyerap sinar UV karena mengandung basa nitrogen yaitu purin dan pirimidin. Pada panjang gelombang 260 nm pita ganda DNA dapat menyerap sinar UV. Kontaminan lain berupa protein maupun fenol dapat menyerap sinar UV pada panjang gelombang 280 nm. Adanya perbedaan penyerapan panjang gelombang antara DNA dan kontaminannya, memungkinkan adanya penentuan kemurnian DNA dalam sampel. Kemurnian DNA dapat dihitung dengan persamaan : =

Nilai kemurnian DNA berkisar antara 1.8 2.0. Jika nilai melebihi 2.0, hal ini menandakan bahwa larutan yang diuji masih mengandung kontaminan berupa protein / senyawa lain sehingga kadar DNA yang terdapat didalamnya belum cukup murni. Jika nilai kemurnian yang diperoleh kurang dari 1.8 hal ini menandakan bahwa ddH2O yang diambil terlalu banyak sehingga DNA yang diambil dalam sampel terlalu sedikit.

2. PCRPCR (Polymerase Chain Reaction) adalah metode replikasi DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme.Teknik ini berguna untuk menghasilkan DNA dalam jumlah besar dalam waktu singkat sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA. MEtode PCR dapat menhasilkan 100 milyar salinan DNA yang identik. PCR banyak digunakan dalam bidang biokimia dan biologi molekular karena relatif murah dan hanya memerlukan jumlah sampel yang sangat kecil. PCR juga banyak digunakan dalam bidang forensik, PCR digunakan untuk memperbanyak sampel DNA yang dimiliki untuk mempermudah penelitian. Biasanya sampel DNA yang dimiliki dalam bentuk darah, kulit, saliva(air liur) dan rambut. Metode ini bergantung pada siklus termal , yang terdiri dari siklus pemanasan dan pendinginan berulang reaksi untuk mencair DNA dan enzim replikasi DNA.Komponen yang dibutuhkan untuk metode ini adalah primer, DNA polimerasi dan nukleotida. Primer adalah sepotong DNA utas tunggal atau oligonukleotida pendek yang menginisiasi sekaligus membatasi reaksi pemanjangan rantai atau polimerisasi DNA. Urutan nukleotida dari primer bisa bermacam-macam, karena primer dibuat di labolatorium yang urutannya sesuai dengan kebutuhan DNA yang akan di replikasi. Dalam metode ini, dua primer dirancang agar sesuai dengan segmen DNA yang akan disalin. Melalui pasangan basa komplementer, satu primer menempel di atas strand salah satu ujung segmen, dan primer lainnya menempel pada untai bawah di ujung lainnya. DNA Polymerase adalah kompleks alami dari protein yang berfungsi untuk menyalin DNA. DNA polimerasi berperan seperti mesin yang membaca kode DNA lalu dipasangkan dengan nukleotida untuk membuat salinan DNA. Tahapan reaksi PCR:1. Tahap pertama berlangsung pada suhu sekitar 95C, yang memungkinkan adanya proses pemisahan rantai ganda asam nukleat. Tahap ini disebut tahap Denaturasi.2. Tahap kedua berlangsung pada suhu sekitar 50-60C, yang memungkinkan adanya proses pengikatan primer dengan DNA template (rantai yang dikodekan). 3. Tahap ketiga berlangsung pada suhu sekitar 68 - 72C, yang memungkinkan terjadinya proses polimerisasi yang dilakukan oleh DNA polimerase. 4. Pengulangan tahap-tahap sebelumnya untuk meperbanyak hasil salinan DNA

31

4

2

Gambar 6. Tahapan Metode PCRReal Time PCR (RT PCR) adalah suatu metoda analisa yang dikembangkan dari reaksi PCR. Real Time PCR memungkinkan dilakukannya deteksi dan kuantifikasi sekaligus terhadap sekuens spesifik dari sampel DNA yang dianalisa. Untuk satu atau lebih urutan tertentu dalam sampel DNA, Real Time-PCR memungkinkan deteksi dan kuantifikasi secara bersamaan. Kuantitas yang didapat berupa jumlah salinan mutlak atau jumlah relatif ketika dinormalisasi untuk DNA yang dimasukkan atau gen normalisasi tambahan.Pada analisa PCR konvensional deteksi keberadaan DNA dilakukan pada akhir reaksi dan pengamatan keberadaan DNA hasil amplifikasi dilakukan di gel agarose setelah dilakukan proses elektroforesi, sedangkan analisa menggunakan Real Time PCR memungkinkan untuk dilakukan pengamatan pada saat reaksi berlangsung, keberadaan DNA hasil amplifikasi dapat diamati pada grafik yang muncul sebagai hasil akumulasi fluoresensi dari probe (penanda). Pada metode RT PCR, detektor langsung diberikan dalam analisis. Detektor dapat berupa pewarna fluorosen. Detektor bekerja dengan mengeluarkan cahaya fluoresen (warna hijau) yang nantinya akan dianalisis untuk menghitung konsentrasi asam nukleat dalam sampel. Cahaya fluorosen yang dilepaskan akan ditangkap oleh sistem komputasi dalam instrument qPCRPada Real Time PCR pengamatan hasil tidak lagi membutuhkan tahap elektroforesis, sehingga tidak lagi dibutuhkan gel agarose dan penggunaan Ethidium Bromide (EtBr) yang merupakan senyawa karsinogenik. Cara kerja Real Time PCR mengikuti prinsip umum reaksi PCR. Keuntungan menggunakan metode RT PCR adalah kita dapat melihat reaksi yang terjadi sehingga kita akan tahu mana reaksi yang berjalan dengan baik dan man yang gagal, efisiensi dari reaksi dapat dihitung, dan RT PCR dapat menunjukkan analisis kuantitif DNA.

IV. Summary

Asam nukleat merupakan suatu polimer nukleotida yg berperanan dalam penyimpanan serta pemindahan informasi genetik yang berhubungan dengan pewarisan sifat turunan. Sekarang ini, berbagai teknologi dan metode analisis asam nukleat telah banyak berkembang, baik analisis dalam aspek kuantitatif maupun analisis dalam aspek kualitatif. Dalam aspek kualitatif metode-metode tersebut bertujuan untuk mengetahui keberadaan DNA/RNA dalam suatu sel, menentukan urutan basa nitrogen, dan berbagai tujuan lainnya. Dalam aspek kuantitatif metode analisis tersebut bertujuan untuk mengetahui jumlah banyaknya molekul DNA/RNA. Setiap metode memiliki kelebihan dan kekurangannya masing masing sehingga masing masing metode tidak dapat dibandingkan satu sama lain. lain. Metode Analisis kualitatif meliputi staining yaitu jenis metode pewarnaan karena DNA/RNA tidak dapat kita lihat dengan mata telanjanf, elektroforesis gel yaitu pemisahan menggunakan media bermutan listrik, sedangakan sentrifugasi pemisahan berdasarkan densitas dari molekul. Metode kualitatif lainnya yaitu sequencing DNA untuk mengetahui urutan basa nitrogen dan hibridisasi untuk melihat (visulisasi) sekuens asam nukleat. Untuk analisis kuantitatif kedua metode didalammnya bertujuan unutk mengetahui jumlah atau konsentrasi DNA.

V. Daftar pustakaAlberts, Bruce, 2008, Molecular Biology of The Cell,5th, Garland Science, Taylor & Francis Group, New York.

Anonim. PCR. Tersedia pada : http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/pcr/ (diakses pada Jumat, 20 Februari 2015).

Campbell, N. A., Reece, J.B. and Mitchell, L.G., 2000. Biologi. Edisi Kelima. Jakarta: Erlangga.

D.Stainsfield, William, Jaime, S. Colome, Raul, J. Cano, 2003, Schaums Easy Outlines Molecular and Cell Biology, The McGraw-Hill Companies, Inc., USA.

Phillips,T. (2014) DNA Sequencing Methods. Tersedia pada : http://biotech.about.com/od/pcr/a/sequencing.htm (diakses Sabtu, 21 Februari 2015).

Yuwono, T. (2011) Biologi Molekular. Jakarta : Penerbit Erlangga.