Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

PCR,

Sekuensing

KULIAH V

Bioteknologi Tanaman

Copyright Statement:

Dengan ini dinyatakan, bahwa seluruh material (teks, gambar, grafik dan seluruh alat bantu penjelas lainnya)

bahan kuliah dalam format .ppt sebagaimana tercantum disini memiliki hak eksklusif intelektual bagi penyusun.

Penggunaan diluar untuk keperluan pembelajaran sebagaimana disepakati dalam pemberian material harus mendapatkan izin tertulis dari penyusun dan pelanggaran dalam hal ini akan dikenakan sanksi hukum sebagaimana

berlaku di Negara Kesatuan Republik Indonesia.

Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Bioteknologi Tanaman

PCR

(Polymerase Chain Reaction)

Reaksi Berantai Polymerase

Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Bioteknologi Tanaman

PCR : Reaksi amplifikasi/penggandaan molekul DNA secara in-vitro dengan menggunakan bantuan enzim DNA-Polymerase

Prinsip Kerja Mesin PCR:

menyediakan kondisi reaksi optimal untuk terjadinya denaturasi ds-DNA, pengikatan primer (annealing), dan ekstensi primer

dengan menggunakan molekul dNTPs bebas melalui bantuan enzim DNA-Polymerase.

PCR

Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Bioteknologi Tanaman

PCR

Ditemukan oleh: Kary Mullis pada tahun 1984-5 (USA)

Gambar: T-Gradient PCR produksi Biometra-Gmbh.-Jerman

Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Bioteknologi Tanaman

Prasyarat:

1. DNA Template, DNA yang akan diamplifikasi

2. Primer (Oligonukleotida), (8-35 basa nukleotid) (spesifik, arbitrary).

3. Enzim Taq-Polymerase, untuk mensintesis (memperpanjang

rantai DNA dengan kecepatan 150 nukleotid/detik.

4. dNTPs (dCTP, dGTP, dTTP, dATP), baik yang mixed atau single

5. MgCl2

Taq-Polymerase ditemukan oleh: David Gelfant dan Susanne Stoffel

Diisolasi dari bakteri Thermus aquaticus.

PCR

Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Bioteknologi Tanaman

5‘

3‘

5‘

3‘

3‘

5‘

3‘

5‘

Siklus 1

Siklus 2

Siklus 3

Templet

Primer /

Oligonukleotid

PCR

Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Bioteknologi Tanaman

PCR

Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Bioteknologi Tanaman

Tm = ((G+C) x 4°C) + ((A + T) x 2°C).

Suhu Annealing

CATAAGTCTGATACTTGCTG

Contoh:

suhu annealing sekitar 54-58°C

PCR

dimana:

jumlah basa C = 4, G = 4, A = 5, T = 7,

maka besarnya Tm adalah:

Tm = ((4+4)x4) + ((5+7)x2) = 32 + 24 = 56°C

Test of designed specific primer Cg

Gradient PCR

Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Bioteknologi Tanaman

Primer yang ideal :

1. Memiliki panjang sekitar 15-35 nukleotid2. Memiliki titik didih yang relatif tinggi3. Sekuens primer hanya hadir satu kali pada templet DNA4. Tidak berkomplementer dengan primer pasangannya5. Tidak membentuk struktur sekunder dengan primer pasangannya6. Memiliki proporsi GC dan AT yang seimbang7. Primer pasangannya memiliki titik didih yang relatif sama

PCR

Oligos V. 3.0

Universitas di Helsinki, Finlandia (Kalendar, 2002 )

Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Bioteknologi Tanaman

X = 2n

Jumlah perbanyakan molekul DNA sintetis

PCR

Dimana:

X = Jumlah molekul yang dihasilkan setelah n siklus

n = Jumlah siklus yang digunakan

Contoh :

Jika n = 30, maka jumlah molekul yang dihasilkan adalah:

1.024.000.000

Sekuensing

Diperkenalkan pada tahun 70-an oleh Maxam dan Gilbert, kemudian disusul oleh Sanger

et al (Nobel, 80-an)

Teknik identifikasi urutan nukleotida-nukleotida dari susunan DNA

Teknik Maxam dan Gilbert disamping sangat

complicated juga banyak menggunakan bahan kimia

yang toxic, karena itu teknik dari Sanger dianggap lebih

efisien dan berkembang sampai saat ini

Prinsip Sekuensing Metode Sanger

• Menggunakan ddNTPs sebagai DNA chain terminator

• Komponen yang dibutuhkan: 1. single-stranded DNA template, 2. DNA primer, 3. DNA polymerase, 4. radioactively or fluorescently labeled nucleotides5. modified nucleotides that terminate DNA strand

elongation (ddNTPs)6. dNTPs

Chain termination method

Semi Automated Sekuensing5‘ TGCATTGAATATGACGTTGACTAGCTAACGTTTAACTA 3‘

3‘ ACGTAACTTATACTGCAACTGATCGATTGCAAATTGAT 5‘

TGCATTG+

5‘ TGCATTGAATATGACGTTGACTAGCTAACGTTTAACTA 3‘

3‘ ACGTAACTTATACTGCAACTGATCGATTGCAAATTGAT 5‘TGCATTG

+ Polymerase; dA, dC, dG, dT, ddT

3‘ ACGTAACTTATACTGCAACTGATCGATTGCAAATTGAT 5‘TGCATTGAAT

3‘ ACGTAACTTATACTGCAACTGATCGATTGCAAATTGAT 5‘TGCATTGAATAT

3‘ ACGTAACTTATACTGCAACTGATCGATTGCAAATTGAT 5‘TGCATTGAATAAGACGT

… dst …

3‘ ACGTAACTTATACTGCAACTGATCGATTGCAAATTGAT 5‘TGCATTGAATATGACGTTGACTAGCTAACGTTTAACT

Full Automated Sequencing(Dye-Terminator Sequencing)

Sumber: Charoen Phokphand

Perbandingan penampilan antara sekuensing manual dengan sekuensing automatis

Sumber: Charoen Phokphand

Tampilan Elektrophoregram dari sekuenser automatis

Contoh data sekuens dan elektrophoregram utk kontrol kualitas

A

B

Megabace1000 produced byAmersham &Molecular-Dynamic.

Automated Sequencer

• ABI Prism 3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA).

• 4-Capillary Systems

Beckmann Coulter-Ge XP System

Sekuensing

Elektrophoregram hasil pembacaan Megabace yang diolah dengan software DNAstar. DNA template berasal beet gula

Sumber: Jamsari

Analisis Sekuens

Gen databank (Genbank), DNA databank

http:// www.ncbi. http:// www.embl-heidelberg.de.http:// www.ebi.ac.uk.http:// www.expasy.org.

BLAST (Basic Local Alignment Search Tool).BLASTn, BLASTp

SELESAI