SPEKTROFOTOMETRI SERAPAN ATOM

BADRIYATUN NIMAH1113102000075FARMASI ACKimia Farmasi Analisa IIHPLCHigh Performance Liquid ChromatographyKromatografi Cair Kinerja Tinggi

DefinisiKCKT atau HPLC merupakan suatu teknik kromatografi dengan fasa gerak cairan dan fasa diamnya berupa cairan atau padat. Ciri teknik ini adalah penggunaan tekanan tinggi untuk mengirim fase gerak ke dalam kolom.

Prinsip dasar dari HPLC adalah memisahkan setiap komponen dalam sample untuk selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung berapa konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut (kuantitatif)Aplikasi dan Kegunaan HPLCHPLC cocok digunakan untuk memisahkan minyak atsiri. Minyak atsiri terdiri atas campuran yang sangat rumit dan oleh karena itu HPLC berguna untuk memisahkan campuran rumit menjadi golongan-golongan senyawa atau memisahkan golongan senyawa menjadi komponen-komponennya.HPLC digunakan untuk memisahkan golongan minyak, misalnya terpenoid tinggi, segala senyawa jenis fenol, alkaloid, lipid dan gula.HPLC baik digunakan untuk senyawa yang dapat dideteksi di daerah spekrum UV atau spectrum sinar tampak.

Aplikasi dan Kegunaan HPLCHPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri farmasi dan pestisida.Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang dikombinasikan dengan kolom butiran berlapis zat berpori.Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin Zipax-SAX.Dapat memisahkan vitamin-vitamin yang larut dalam air.Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia.

Aplikasi dan Kegunaan HPLCBanyak digunakan pada industri farmasi dan pestisida.Dapat memisahkan dan menganalisis vitamin-vitamin yang larut dalam air.Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia.Untuk analisis anion nitrat (NO3-)HPLC menggunakan kolom dengan diameter umumnya kecil, 2-8 mm dengan ukuran partikel penunjang 50 mikrometer; sedangkan laju aliran dipertinggi dengan tekanan tinggi (Khopkar, 2010).

Keterangan:Wadah pelarutDegasser pelarutKatup gradienWadah pencampuranPompa bertekanan tinggiKatup dalam posisi injeksi6.Katup dalam posisi loadLoop injeksi sampelKolom pengamanKolom analisisDetektor (misalnya: IR, UV)Pengolahan dataWadah sisa atau fraksiPrinsip Kerja HPLCPemisahan suatu senyawa kimia dari suatu campuran atau senyawa lainnya berdasarkan perbedaan sifat fisiknya.Memisahkan setiap komponen dalam sample untuk selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung berapa konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut (kuantitatif). Prinsip Kerja HPLCDengan bantuan pompa, fasa gerak cair dialirkan melalui kolom ke detektor. Cuplikan dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan.Di dalam kolom, terjadi pemisahan komponen-komponen campuran karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam.Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih dulu. Sebaliknya, solut-solut yang kuat berinteraksi dengan fasa diam maka solut-solut tersebut akan keluar kolom dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk kromatogram.Diagram Alur HPLCDiagram Alur HPLC(Contoh kromatogram dari campuran kompleks parfum)

Instrumen HPLC

Komponen-komponen HPLC:Eluen (Pelarut atau Fase Gerak)Tempat pelarut biasanya menggunakan suatu botol yang tahan terhadap pelarut-pelarut organik dan larutan yang digunakan untuk HPLC haruslah terbebas dari partikel-partikel lain yang dapat menggangu.Sistem PemompaUntuk memompa eluen.Penginjeksi SampelProses injeksi pada awalnya menggunakansyringemelalui sebuah katup elastomer.Syringe yang digunakan memiliki kemampuan melawan tekanan 1500 psi.Instrumen HPLCKolom HPLCKolom HPLC secara umum dibuat dari bahan tabung stainless steel. Kolom untuk analisis HPLC memiliki ukuran panjang kolom berkisar dari 10 30 cm. Diameter dalam kolom 4 10 mm dengan ukuran partikel 5 10 m.DetektorMerupakan pengolah data.

Instrumen HPLCKolom HPLCKolom adalah tabung yang dikalibrasi lurus yang panjangnya antara 3 dan 15 cm dan pada dinding bagian dalam kadang-kadang dilapisi dengan material inert seperti kaca atau PEEK . Kolom bisa terbuat dari sejenis plastik disebut cartridge, atau terbuat dari stainless steel.

Kolom pada Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT/HPLC) merupakan bagian yang sangat penting, sebab pemisahan komponen-komponen sampel akan terjadi di dalam kolom.

Oleh karena itu ada beberapa hal yang harus diperhatikan, yaitu1. Pemilihan kolom yang sesuai2. Pemeliharaan kolom3. Uji terhadap spesifikasi kolom (walaupun kolom tersebut merupakan kolom yang siap dipakai).Pemilihan kolom merupakan langkah yang pertama dan utama untuk penggunaan kromatografi. Ketepatan dalam pemilihan kolom sangat berpengaruh terhadap performan kromatogram

Jenis-jenis kolom HPLCKolom HPLCKonvensionalMicroboreHigh Speed

Ditinjau dari ukurannya (panjang dan diameternya) Jenis-jenis Kolom

Jenis-jenis kolom HPLCKolom HPLCKolom Fase NormalKolom Fase TerbalikDilihat dari jenis fasa diam dan fasa geraknyaFase Diam KolomKebanyakan fase diam padaHPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen.

Dilihat dari jenis fasa diam dan fasa geraknya, maka kolom HPLC dibedakan atas Kolom Fasa Normal dan Kolom Fasa Terbalik (Reversed Phase Column).

Kolom Fasa NormalKromatografi dengan kolom konvensional mempunyai fasa diam normal yang bersifat polar, misalnya silika gel. Sedangkan fasa geraknya bersifat non polar, sehingga analit yang akan dipisahkan adalah analit yang bersifat non polar. Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yang polar dibanding degan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom.

Kolom Fase Terbalik Kolom fasa terbalik adalah kolom yang fasa diamnya bersifat non polar, sedangkan fasa geraknya bersifat polar, kebalikan dari fasa normal. Pemilihan KolomAda beberapa cara yang dapat digunakan yaitu :1. Tetapkan Tujuan Pemisahan Anda. Tentukan apakah aplikasi Anda membutuhkan resolusi tinggi, waktu analisis singkat,maksimum sensitivitas, waktu hidup kolom yang panjang, biaya operasi yang rendah, atau faktor penting lainnya.2. Menyamakan kolom yang digunakan untuk analit lain yang serupa 3. Mendapatkan informasi dari pustaka

Mekanisme Kerja di Dalam KolomDidalam kolom terjadi pemisahan kompenen-komponen campuran karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom terlebih dahulu, sebaliknya solut-solut yang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih lama Penggunaan KolomBanyak faktor harus diperhatikan di dalam menggunakan kolom, agar kolom dapat berfungsi dengan baik dalam waktu yang relatif panjang. Faktor-faktor yang harus diperhatikan tersebut seperti:1. Kualitas Pelarut2. Larutan Pencuci Kolom3. Pelarut untuk menyimpan kolom4. Penggunaan pre coloum

Hal-hal lain yang perlu diperhatikan yaitu pengeluaran gas (de-gas) dengan menarik gelembung udara dari dalam media dengan menggunakan peralatan pompa vakum.Pelarut untuk menyimpan kolomUmumnya jenis pelarut yang digunakan untuk menyimapan kolom harus disesuaikan dengan jenis kolomnya. Sebagai contoh :1.Kolom penukar ion disimpan dalam metanol atau air. Metanol lebih disukai karena dapat mencegah pertumbuhan bakteri.2.Kolom fasa terikat tak polar disimpan dalam metanol. Asetonitril tidak dianjurkan untuk dipakai di sini karena selain harganya mahal, asetonitril ini dapat terurai membentuk pengotor pada kolom.3.Kolom fasa terikat polar disimpan dalam heptana atau metanol.4.Kolom silika disimpan dalam heptana.

Di dalam penyimpanannya jangan sekali-kali kolom dibiarkan kering. Pada kolom yang kering dapat terjadi kekosongan karena paking kolom dapat mengkerut dari dinding kolom atau karena pengerutan paking kolom itu sendiri.

PrecolumnUntuk memperpanjang umur kolom, seringkali didahului oleh suatu precolumn atau penjaga kolom.

Kolom pengaman disebut juga pra-kolom karena diletakkan sebelum sistem pemasukan cuplikan. Kolom ini berukuran pendek, 5 cm dengan diameter 4,6 mm dan biasanya dipaking dengan partikel silika berukuran lebih besar dari ukuran partikel kolom utama.

Pre-colum dilengkapi dengan filter (saringan). Hal tersebut sangat penting untuk memperoleh hasil pemisahan yang sempurna serta untuk menghindari terjadinya penyumbatan (blocking) di dalam kolom sehingga self life kolom lebih panjang dan melestarikan kinerjanya..

Kelebihan dan Kekurangan HPLCKelebihan HPLC:Kerja lebih mudah dengan automasi dalam prosedur analisis dan pengolahan data.Volume sampel kecil (dapat menganalisis sampel yang kecil kuantitasnya).Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran dengan daya pisah tinggi.Merupakan metode analitis: cepat, peka, akurat, tepat, reproducible, preparatif.Dapat digunakan untuk sampel organik dan anorganik, bersifat volatile dan non volatil, stabil dan tidak stabil secara termal.Pilihan fase gerak dan fase diamnya luas.Dapat dihindari terjadinya dekomposisi atau kerusakan bahan analisis.Dapat digunakan bermacan-macam detektor dengan kepekaan yang tinggi.Kolom dapat digunakan kembali.Waktu analisa cukup singkat.HPLC dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap dan zat yang tidak stabil.Teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu kamar.Kelebihan dan Kekurangan HPLCKekurangan HPLC:Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dahulu.Hanya bisa digunakan untuk asam organik.Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit dan gradient elusi.Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas.Sering ada larutan standar yang tertinggal di injektor.Pada kolom dengan diameter rata-rata partikel fase diam dengan ukuran 3 mikrometer dan 5 mikrometer sela-sela partikel lebih mudah tertutup oleh kotoran, jadi harus seringkali dicuci dan kemurnian larutan harus dijaga.Kelebihan dan Kekurangan HPLC