PertanikaJ. Sci. & Techno!. 3(2): 233-239 (1995)ISSN:0128-7680

© Penerbit Universiti Pertanian Malaysia

Kesan Beberapa Parameter Fisikal ke atasTindak Balas Esterifikasi oleh Lipase

Miselium daripada Rhizopus oryzae

Abu Bakar Salleh', Che Nyonya Abd. Razak l, Kamaruzaman

Amponl , Wan Md Zin Wan Yunus2 dan Mahiran Basri2

ijabatan Biokimia & Mikrobiologi2jabatan Kimia

Fakulti Sains dan Pengajian Alam SekitarUniversiti Pertanian Malaysia

43400 UPM Serdang, Selangor Malaysia

Diterima 30 Julai 1993ABSTRAK

Kajian telah dibuat terhadap beberapa parameter fizikal bagi tindak balasesterifikasi asid oleik dan butanol yang dimagkinkan oleh lipase miseliumdaripada Rhizopus oryzae. Enzim boleh digunakan dalam bentuk serbuk ataukepingan kecil dan tindak balasnya berterusan tanpa memerlukan goncangan.Peningkatan amaun enzim akan menaikkan kadar tindak balas esterifikasihingga ke 80%. Penukaran maksimum ini tercapai dalam masa 24 jam. Suhuoptimum tindak balas ialah 40°C walaupun enzim stabil hingga ke 70°C. Enzimaktif dalam pelarut organik yang mempunyai nilai log P yang besar, dan stabiljika disimpan dalam pelarut heksana.

ABSTRACTSome physical parameters for the esterification of oleic acid and butanol bymycelial lipase from Rhizopus oryzae were examined. The enzyme can be usedin the powder or fragment form, and the reaction proceeds without the needfor shaking. The rate of esterification increases with the amount of enzyme upto 80% conversion, the maximum conversion achieved in 24 h. The optimumtemperature of the reaction is 40°C, but the enzyme is stable up to 70°C. Theenzyme is active in organic solvents with high log P values. The enzyme is alsostable when stored in hexane.

Kata kunci: esterefikosi, lipase, Rhizopus oryzae, paremeter lIzikaI

PENGENALAN

Lipase (gliserol ester hidrolase, EC: 3.1.13)ialah sejenis enzim yang terdapatdalam alam semulajadi dan ianya sesuai digunakan untuk tindak balastransformasi dalam industri kimia. Peranan lipase ialah sebagai pemangkintindak balas hidrolisis trigliserida. Walau bagaimanapun, tindak balashidrolisis ini boleh berbalik, dan keseimbangan di antara tindak balas kehadapan dengan tindak balas berbalik dikawal oleh kandungan aircampuran tindak balas. Air dihasilkan dalam tindak balas sintesis ester.Jika air ini dapat dikeluarkan daripada campuran tindak balas,keseimbangan tindak balas akan mengarah kepada sintesis ester.

Abu Bakar Salleh, Che Nyonya Abd. Razak, Kamaruzaman Ampon, Wan Md. Zin Wan Yunus & Mahiran Basri

Lipase intrasel daripada Rhizopus oryzae sangat aktif (Razak et ai. 1991)dan dipercayai mempunyai kestabilan yang lebih tinggi daripada enzimekstrasel. Enzim intrasel terletak dalam sekitaran semulajadi dan masihdilindungi oleh makromolekul seperti lipid dan protein lain, dengan itumembantu dalam menetapkan konformasi enzim. Sementara enzimekstrasel dirembes keluar dalam sekitar yang cair dengan ini memudahkantindakan daripada agen-agen denaturasi. Walaupun begitu, kebanyakankajian esterifikasi dijalankan menggunakn enzim ekstrasel. Ibrahim danTan (1991) dan Abu Bakar et ai. (1992) telah menggunakan lipaseekstrasel daripada Candida rugosa dalarn suatu tindak balas sintetik. Okumuraet ai. (1979) juga menggunakan enzim ekstrasel daripada Aspergillus niger,Rhizopus delemar, Geotrichum candidum dan Penicillum cyclopium untuk sintesisester asid oleik dengan pelbagai alkohol primer. Knox dan Cliffe (1984)melaporkan kegunaan enzim yang terlekat pada miselium kulat dalamsintesis ester. Cancet (1990) pula menggunakan lipase meselium daripadaRhizopus arrhizus un tuk proses-proses hidrolisis, in teresterifikasi,transesterifikasi dan sintesis gliserida.

KAEDAH

Penghasiian LipaseRhizopus oryzae (mesofilik) yang dipencilkan dalam makmal ini (Razaket ai, 1991) ditumbuhkan dalam PDA (potato dextrose agar) selama24jam pada suhu 37°C. Satu keping R. oryzae di atas PDA dipindahkan(mengguna penggerudi gabus) ke dalam 100 ml medium yangmengandungi polipepton, 5.0% Na

2N0

3, 1%, KH

2P0

4, 0.1 % MgS0

4•

7H20, minyak zaiton 2.0% dan glukosa, 0.1 %; pH medium ialah 6.0.Selepas 72 jam, miselium dikutip dengan cara penurasan dan

dicuci dengan air suling dan aseton sebanyak dua kali. Miseliumdisimpan dalam peti sejuk sebelum dikeringkan dengan pengeringsejuk beku. Miselium kering ini digunting halus-halus (= 1 mmpanjang) sebelum digunakan.

Campuran Tindak Baias dan Penentuan % EsterifikasiKeaktifan enzim untuk tindak balas esterifikasi 0.8 ml asid oleik dengan0.25 ml butanol. Berat pemangkin yang digunakan 30 mg (64 unit).Tindak balas dilakukan selama 24 jam pada suhu bilik (27°C) dengangoncangan 150 p.s.m. Tindak balas dihentikan dengan menambahlarutan 3.5 ml aseton: etanol (1:1 iii). Asid oleik yang tidak bertindakbalas denagan alkohol dititratkan dengan 0.2 M NaOH. Satu unitaktiviti ditakrifkan sebagi 1J.Lmole asid lemak yang digunakan dalamesterifikasi dalam masa satu jam.

234 Pertanika J. Sci. & Techno!. Vo!. 3 No.2, 1995

Kesan Parameter Fisikal ke atas Tindal< balas Esteriflkasi oleh Lipase Miselium daripada R. oryzae

KEPUTUSAN DAN PERBINCANGAN

Enzim yang terlekat pada membran tidak dapat diekstrak, tetapi miselium­miselium boleh digunakan secara terus sebagai sumber enzim lipase. Duabentuk miselium kering telah digunakan iaitu fragemen miselium keringdigunting kecil-kecil (1.0 mm), atau ditumbuk menjadi serbuk (100-500fLm). Didapati kedua-dua bentuk enzim tidak menunjukkan perbezaandari segi keaktifan. Selain dari kesan bentuk, kesan goncangan ke atastindak balas juga diuji. Kajian menunjukkan tiada perbezaan dapat dilihatke atas tindak balas yang dilakukan apabila dibandingkan hasil-hasil bagitindak balas tanpa goncangan atau goncangan hingga ke kadar 200 p.s.m.Pemerhatian ini mencadangkan tiada kesan pemindahan jisim yangmempengruhi proses tindak balas yang dimangkinkan oleh enzim yangterlekat pada miselium. Serbuk atau fragmen miselium yang mengandungilipid mudah larut dalam pelarut organik (butanol) dan enzim berfungsisebagai enzim bebas tanpa sebarang kekangan daripada miseliummenyebabkan kesan bauran tidak dapat dilihat apabila jangkamasa tindakbalas 24 jam digunakan.

Seperti yang dijangka, pertambahan enzim meningkatkan tindak balasesterifikasi (Rajah 1). Amaun 50 mg yang digunakan adalah kuantitimaksimum yang boleh digunakan dalam isipada penindak balas. Amaunmiselia yang lebih tinggi menyebabkan campuran tindak balas menjadipekat dan sebati dan menjejaskan kadar tindak balas. Keaktifan mulamendatar pada tahap 80% penukaran. Dalam tindak balas berbalik yangberlaku dengan pertambahan produk dalam campuran tindak balas.

100

80

z;? 60<~zg:

40~,,:

:..:U

00 10 15 20 25 30 35 40 ~5 50 55 60

A'lAUK LIPASE (mg)

Rajah 1. Kesan kandungan enzim ke atas kadar penghasilanester, Tindakbalas dilakukan seperti teknik pengasaian enzim

dengan menukar amaun lipase yang digunakan.

Pertanika J. Sci. & Techno!. Vo!. 3 No.2, 1995 235

Abu Bakar Salleh, Che Nyonya Ab<!. Razak, Kamaruzarnan Ampon, Wan Md. Zin Wan Yunus & Mahiran Basri

Aktiviti meningkat secara linear dalam jangkamasa 6 jam, ini diikutidengan kadar yang perlahan. Penukaran maksimum (anggaran 80%)tercapai dalam masa 24 jam, dan menjadi malar seterusnya (Rajah 2).Tahap penukaran maksimum (anggaran 80%) yang dicapai daripeningkatan kuantiti enzim dan masa, disebabkan tindak balas berada didalam kesimbangan. Dengau kehadiran air, ester yang terhasil daripadaesterifikasi akan dihidrolisiskan untuk membentuk asid lemak dan alkoholkembali (Knox dan Cliffe 1984; Ibrahim et at. 1988). Peratus tindak balasboleh ditingkatkan dengan mengurangkan kandungan air yang terhasil didalam campuran tindak balas. Air boleh dinyah melalui beberapa caraumpamanya menggunakan penapis molekul (Ibrahim dan Tan 1991) atauvakum (Miller et at. 1987)

100

8J

z 60;2;2:0Z

'" 40p.

'"20

00 20 40 60 80

MASA (JAM)

Rajah 2. Kesan jangkamasa tindakbalas ke atas kadarpenghasilan ester. Tindakbalas dilakukan seperti teknik

pengasaian enzim dengan menukar jangkamasa tindakbalas.

Proses esterifikasi adalah maksimum di sekitar 80% pada suhu 30 - 40°e.Pada suhu 50°C ke atas, keaktifannya adalah lebih rendah berbanding dengan40°C. Manakala, pada 70°C, kadar penukaran menjadi 50% (Rajah 3). Inimencadangkan pada 50DC ke atas, peratus tindak balas berbalik tinggimenyebabkan lebih banyak ester yang telah dihidrolisis. Kajian kestabilanmenunjukkan yang enzim adalah agak stabil walaupun didedahkan padasuhu 70D C. Keaktifannya masih dalam anggaran 80% daripada aktivitiasal selapas 24 jam pada suhu 70D C. Pada suhu 80°C dan 90D C, kestabilanmenurun dengan cepat. Dalam masa 1 jam sahaja, aktiviti mula terjejasdan menurun hingga ke paras 50% aktiviti asal dalam jangkamasa 10 jam(80 DC) dan 6 jam (90DC) (Rajah 4). Kehadiran substrat, asid oleik dapatmenstabilkan enzim, kerana substrat dapat melindungi tapak aktifsemasa penyimpanan. Mungkin semasa berlaku tindak balas substrat­substrat tidak lagi melekat pada tapak aktif pada jangkamasa yang lamauntuk mengawal tapak aktif.

236 Pertanika J. Sci. & Techno!' Vo!. 3 No.2, 1995

Kesan Parameter Fisikal ke atas Tindak balas Esteriflkasi oleh Lipase Miselium daripada R. oryzae

lOO

80

&0 -40

20

00 J(J 40 5(J (,(J 70

SOIiU ("C)

Rajah 3. Kesan suhu terhadap kadar penghasilan esterTindakbalas dilakukan seperti teknik pengasian enzim denganmengeramkan campuran tindakbalas pada suhu yang berbeza

100

z 80;2;2

60:.>zg:_,0 40

20

00 4 8 12 16 20 24

~IASA (JMI)

Rajah 4. Kestabilan enzim terhadap suhu. Enzim dierampada suhu 700 e (0), 800 e (t:,,) 900 e (.) pada jangkamasa

yang berbeza, Aktiviti residual enzim ditentukan denganmembanding keaktifan enzim selepas pendedahan pada suhu

berkenaan dengan keaktifan sebelumnya.

Pertanika J. Sci. & Techno!. Vol. 3 No.2, 1995 237

Abu Bakar Salleh, Che Nyonya Abd. Razak, Karnaruzaman Ampon, Wan Md. Zin Wan Yunus & Mahiran Basri

JADUAL 1Kesan pelarut organik ke atas tindakbalas esterifikasi oleh lipas R oryzae

Pelarut Organik

(1) N, N-dimethilformamida(2) Asetonitril(3) 1,4-Dioksan(4) Dietilamina(5) Piridin(6) Dietileter(7) Trietilamina(8) Benzina(9) Klorofom(10) Toluena(11) 2-Nonanona

5-Nonanona(12) Sikloheksana(13) n-Heksana(14) N-Hektana(15) n-Oktana(16) n-Nonana(17) n-Dekana(18) Undekana(19) Dodekana

Nilai Log P*

-0.4-0.33-0.270.640.170.851.62.02.02.52.92.93.23.54.04.55.15.66.16.6

%Pertukaran

9.1560.2168.62o

51.8689.5022.0395.3493.4892.6286.72f87.9190.9091.6690.8991.9595.6092.1293.5390.77

Keaktifan enzim ditentukan dengan mengukur % penukaran,iaitu % asid di tidak balas ke sebatian ester.* Daripada Laane et al. (1987)

Keaktifan enzim dalam pelarut organik dicatat dalam Jadual 1. Padaumumnya enzim ini aktif dalam kebanyakan pelarut organik yang diuji.Sungguhpun keaktifan enzim terdapat dengan pelarut yang nilai log Pnyakurang daripada sifar, arah aliran lebih menyerlah bagi pelarut yangmempunyai log P yang positif. Seperti kajian masakini, keaktifan bertambahdengan pelarut yang mempunyai nilai log P yang meningkat kecualidietileter (Log P = 0.85) (Valivety et at. 1991; Gorman dan Dordick 1992).Pelarut yang mempunyai log P yang negatif mungkin dapat menunjukkankeaktifan enzim di peringkat awal. Walau bagaimanapun kestabilan dalampelarut-pelarut ini dijangka rendah disebabkan keupayaan pelarut-pelarutini menarik air daripada molekul enzim, yang akan menyebabkankehilangan keaktifan.

Kestabilan enzim dalam pelarut diuji dengan heksana, pada suhu bilik.Pelarut hidrokarbon seperti heksana telah dikenalpasti sebagai pelarut

238 Pertanika J. Sci. & Techno!. Vol. 3 No.2, 1995

Kesan Parameter Fisikal ke atas Tindak balas Esterifikasi oleh Lipase Miselium daripada R. oryzae

yang sesuai bagi mendapat kadar tindak balas yang tinggi bagi lipase (Zaksdan Klibanov 1985). Didapati pendedahan enzim kepada heksana walaupunmelebihi 100 hari tidak memberi kesan ke atas aktiviti enzim. Kajiankestabilan pada suhu yang lebih tinggi tidak dilakukan kerana terdapatmasalah kemerwapan pelarut yang tidak dapat dibendung.

PENGHARGAAN

Projek ini dibiayai oleh Kementerian Sains, Teknologi dan Alam SekitarMalaysia di bawah program IRPA No. 1-07-05-086.

RUJUKANABu BAKAR SAllEH, M. BASI, S.M. SAMAR, e.N. RAzAK, K AMpON dan W.M.Z. YUNUS. 1992.

Synthesisofoleic esters by Iipase from Candida rugosa. Kertaskerja dibentang di PersidanganKe-17, Persatuan Biokimia Malaysia 23-24 September 1992, UKM, Bangi. Selangor.

GANCET, C 1990. Catalysis by Rhizopus arrhizusmyceliallipase. Ann. N. Y. Acad Sci. 613: 600-604.

GORMAN, L.A. dan ].S. DORDICK. 1992. Organic solvents strip water of enzymes. Biotechnol.Bioeng. 39: 392-297.

IBRAHIM, e.O., N. NISHIO dan S. NAGAI. 1988. The role of water on the equilibrium ofesterification byimmobilised lipase packed-bed column reactor. Biotechnol. Lett. 10: 799-804.

IBRAHtM, C.O. danH.L. TAN. 1991. Esterification by lipase of Candida cylindricae. Malays. Appl.Biol. 20(1): 11-23.

KNox, T. dan KR. CLIFFE. 1984. Synthesis of]ong chain esters in a loop reactor system usingfungal cell bound enzyme. Process Biochem. 19: 188-192.

I..,AANE, C., S. BOEREN. K Vos dan C. VEEGER. 1987. Rules for optimization ofbiocatalysis inorganic solvents. Biotechnol. Bioeng. 30: 81-87.

MILLER, e. A. HELEN, L. POSORSKE dan]. GONZALEZ. 1987. Characteristics ofan immobilisedlipase for commercial synthesis ofesters. Paper presented at the National American OilChemists' Society Meeting., New Orleans, May 19, 1987.

OKUMURA, S., M. IWAI dan Y. TSUJISAKA. 1979. Synthesis of various kinds of esters by fourmicrobiallipases. Biochem. Biophys. Acta 575: 156-165.

RAzAK, N., R.N.Z. ABD. RAHMAN A.B. SALLEH, K AMpON, W.M.Z. WAN YUNUS dan M. BASRI.Lipase in trasel daripada Rhizopus oryzaedan parameter-parameteryang mempengaruhipenghasilannya. Sains Malaysiana 20(3): 87-94.

VALIVETY, R.H., G. A. JOHNSTO , CJ. SUCKLING dan PJ. HALLING. 1991. Solvent effects onbiocatalysis in organic systems: Equilibrium position and rates of lipase catalysedesterfification. Biotechnol. Bioeng. 38: 1137-1143.

ZAKS, A. dan A.M. KLIBANOV. 1985. Enzyme-catalysed processes in organic solvents. Proc. Natl.Acad. Sci. USA 82: 3192-3196.

Pertanika J. Sci. & Techno!. Vo!. 3 No.2, 1995 239