Ana Indrayati

Gambar tahapan umum kloning

Fisik Kimia Enzimatis

Lokasi protein di dalam sel

Protein intrasel-protein ekstrasel

Protein intrasel

Protein ekstrasel

Perbandingan protein yang diekspresikan di periplasma, sitoplasma atau ekstrasel

Sitoplasma Jumlah besar Bercampur dengan protein lain Agregat-badan

Periplasma Jumlah sedikit Relatif murni Ikatan disulfida terbentuk

Ekstrasel Volume besar bercampur dengan media pertumbuhan Perlu

inklusi (tidaklarut)

pemekatan

Cara isolasi protein intrasel dan ekstraselProtein Protein intrasel Protein ekstrasel Pemisahan sel

Pemecahan selPemisahan Pemekatan protein Pemekatan protein Kromatografi kolom

Protein intrasel

Protein yang terdapat dan bekerja di dalam sel

Enzimatis: lisozim (mengkatalisa pemutusan ikatan 1-4 betaglikosidik peptidoglikan bakteri. EDTA: mengikat kation divalen (menstabilkan dinding sel), zymotase, litikase

Kimia: deterjen: mengganggu permeabilitas dinding selsehingga lipoprotein membran larut

Fisis: sonikasi (gelombang suara dengan frekuensi tertentu)

Sentrifugasi dan pemekatan protein

Protein ekstrasel

Protein yang diekskresi keluar sel

Protein berada dalam media pertumbuhan sel

Sentrifugasi dan pemekatan protein

Pemekatan protein1. SALTING IN-SALTING OUT Dalam air murni protein sukar larut

Penambahan garam-kelarutan proteinmeningkat karena ion anorganik dari garam mengikat protein dan mencegah agregasi (salting in)

Konsentrasi garam tinggi-garam lebihcenderung mengikat air dan menyebabkan agregasi sehingga molekul protein mengalami presipitasi (salting out)

Gambar ultrafiltrasi

2. ULTRAFILTRASI

Kromatografi kolom

penukar ion (muatan total protein )exclusion (bentuk dan ukuran protein) afinitas (protein mengikat ligan spesifik)

Karakter asam amino penyusun protein

Contoh urutan asam amino penyusun protein MAFELPNLPYGFRALEPHIDQQTMEIHH

DKHHNTYVTKLNAAVEGTDLESKSIEEI VANLDSVPENIQTAVRNNGGGHLNHSLF WELLTPNSEEKGTVVDKIKEQWGSLDAF KEEFANQAAARFGSGWAWLVVNDGKLEI VTTPNQDNPLTEGKTPILGLDVWEHAYY LKYQNKRPDYISAFWNVVNWEKVDELYN AAK

Superoksida Dismutase (SOD) bakteri

Kromatografi exclusion/ size exclusion chromatography (SEC)

o Memisahkan protein berdasarkan ukuran (BM) o Kolom: menggunakan gel berpori dengan ukuran tertenu dan seragam o Molekul kecil akan memasuki pori dari gel o Elusi: molekul besar-molekul sedang-molekul kecil

Kromatografi penukar iono Memisahkan protein berdasarkan muatan

o Kolom kation: muatan total protein negatifo Kolom anion: muatan total protein positif

Prinsip kromatografi afinitas

PROTEIN FUSI- Pemurnian protein satu tahap

Definisi: Efektif dan efisien Sampel protein sedikit Spesifik

Protein fusi

Dikonstruksi pada tingkat DNA Fusi gen pengkode protein

target dengan gen pengkodeligan tertentu

Tersedia pada vektor ekspresi atau dikonstruksi sendiri

Contoh: Poli-His Tag (kolom nikel) Chitin Tag (kolom kitin)

Vektor ekspresi yang

membawa poli-His

Vektor ekspresi yang membawa poli-His

Pemurnian protein-kolom nikel

CBD tidak tersedia di plasmid

Pemurnian protein-kolom kitin

SDS PAGE

Sodium dodecyl sulfate polyacrilamide gel electroforesis Analisa protein kualitatif Mengetahui ukuran protein dan memonitor pemurnian protein Denaturasi protein: SDS: protein menjadi bermuatan negatif dan linier Beta merkaptoetanol: memutus ikatan disulfida Perebusan (5 menit, 100oC)

Berat molekul protein: marka protein (standar) yang sudah diketahui ukurannya

SDS: protein linier, negatif

Akrilamid-bisakrilamid: membentuk pori

Contoh hasil SDS-PAGE

Elektroforesis dua dimensi: 2D

Contoh hasil 2-D

2-D atau 2-DE

Informasi: muatan dan ukuran protein Analisa protein hasil ekspresi gen, deteksi marker penyakit,

penelitian kanker, kemurnian protein-memisahkan protein hinggaribuan secara cepat

Dimensi 1: protein dipisahkan berdasarkan muatan (titik isoelektrik)-Iso electric focusing (IEF) Protein denaturasi: urea-memutus ikatan hidrogen tetapi tidak

mengubah muatan Gel: gradien pH, medan listrik sehingga protein akan terpisah

berdasarkan muatan dan akan berhenti setelah muatan protein netral (titik isoelektrik)

Dimensi 2: protein dipisahkan berdasarkan ukuran - SDS PAGE

Pemotongan dengan enzim carboxy peptidase

Hanya terbaca sekitar 30 asam amino

Pemetaan peptida

Protein dipotong secara enzimatik atau kimiawi sehingga dihasilkan fragmen-fragmen peptida-dianalisa

Sekuensing protein

Informasi: urutan asam amino penyusun protein

ELISA (Enzyme Linked Immunosorbant assay)

Reaksi antigen-antibodi Protein yang akan diidentifikasi (antigen) direaksikan dengan antibodi spesifik (yang hanya mengenali protein target)

Latihan soal