eksperimen 3 anis hidayah edited

19
LAPORAN AMALI 3 / JIB 321 PENGASINGAN ENZIM FOSFORILASE DARIPADA UBI KENTANG DAN PENENTUAN AKTIVITI SPESIFIK ENZIM 1. Abstrak Eksperimen ini juga menggunakan teknik fotometri bagi mengkaji aktiviti spesifik enzim fosfat di dalam ekstrak fraksi S1, S2, M1 dan M2. Jarak gelombang yang digunakan ialah 700- 725nm. Nilai bacaan kepekatan fosfat yang diperolehi daripada daya penyerapan larutan di catatkan. Kemudian, nilai kepekatan protein pula dirujuk dari graf penentuan protein yang menggunakan kaedah Folin. Aktiviti sepesifik enzim diperoleh dari aktiviti enzim dibahagikan dengan kepekatan protein. Akhir sekali, ekstrak fraksi yang mempunyai kepekatan yang tinggi akan disimpan untuk digunakan untuk eksperimen yang seterusnya. 2. Pengenalan Eksperimen ini adalah mengenai pengasingan enzim fosforilase, daripada ubi kentang dan kemudian aktiviti spesifik enzim ini ditentukan dalam ekstraknya. Aktiviti spesifik enzim = Jumlah aktiviti enzim = mol substrat µ diguna/min Jumlah protein mg protein Jika suatu ekstrak enzim menunjukkan aktiviti spesifik enzim yang tinggi, ianya hanya mempunyai enzim ini dalam quantiti yang tinggi. Ekstrak enzim ini dikatakan separa tulen kerana protein lain yang wujud dengan enzim dalam ekstrak dapat diasingkan. Jadi, dalam cara penceraiaan suatu enzim, unit aktiviti spesifik enzim boleh menunjukkan samada, suatu sampel ekstrak enzim adalah separuh tulen atau tidak. Sebelum kita boleh menentukan aktiviti spesifik enzim kita akan menentukan aktiviti enzim dan kepekatan proteinnya. Enzim fosforilase memainkan peranan yang penting dalam proses pemecahan karbohidrat dalam sel. Tindakbalas yang dimangkinkan oleh enzim ini adalah berikut: NUR HIDAYAH BT SALIM : JP/7692/11 Page 1

Upload: 861006595354

Post on 26-Jul-2015

347 views

Category:

Science


2 download

TRANSCRIPT

Page 1: Eksperimen 3 anis   hidayah edited

LAPORAN AMALI 3 / JIB 321

PENGASINGAN ENZIM FOSFORILASE DARIPADA UBI KENTANG DAN PENENTUAN AKTIVITI SPESIFIK ENZIM

1. Abstrak

Eksperimen ini juga menggunakan teknik fotometri bagi mengkaji aktiviti spesifik enzim fosfat di dalam ekstrak fraksi S1, S2, M1 dan M2. Jarak gelombang yang digunakan ialah 700-725nm. Nilai bacaan kepekatan fosfat yang diperolehi daripada daya penyerapan larutan di catatkan. Kemudian, nilai kepekatan protein pula dirujuk dari graf penentuan protein yang menggunakan kaedah Folin. Aktiviti sepesifik enzim diperoleh dari aktiviti enzim dibahagikan dengan kepekatan protein. Akhir sekali, ekstrak fraksi yang mempunyai kepekatan yang tinggi akan disimpan untuk digunakan untuk eksperimen yang seterusnya.

2. Pengenalan

Eksperimen ini adalah mengenai pengasingan enzim fosforilase, daripada ubi kentang dan kemudian aktiviti spesifik enzim ini ditentukan dalam ekstraknya.

Aktiviti spesifik enzim = Jumlah aktiviti enzim = µmol substrat diguna/minJumlah protein mg protein

Jika suatu ekstrak enzim menunjukkan aktiviti spesifik enzim yang tinggi, ianya hanya mempunyai enzim ini dalam quantiti yang tinggi. Ekstrak enzim ini dikatakan separa tulen kerana protein lain yang wujud dengan enzim dalam ekstrak dapat diasingkan. Jadi, dalam cara penceraiaan suatu enzim, unit aktiviti spesifik enzim boleh menunjukkan samada, suatu sampel ekstrak enzim adalah separuh tulen atau tidak. Sebelum kita boleh menentukan aktiviti spesifik enzim kita akan menentukan aktiviti enzim dan kepekatan proteinnya.

Enzim fosforilase memainkan peranan yang penting dalam proses pemecahan karbohidrat dalam sel. Tindakbalas yang dimangkinkan oleh enzim ini adalah berikut:

NUR HIDAYAH BT SALIM : JP/7692/11 Page 1

Page 2: Eksperimen 3 anis   hidayah edited

LAPORAN AMALI 3 / JIB 321

A. Prinsip mengenai pengasingan protein

Untuk mengasingkan suatu enzim daripada suatu tisu, anda perlu mengetahui prinsip asas mengenai pengasingan protein. Protein boleh terlarut dalam larutan berair kerana:

Terdapat kumpulan berion seperti NH3 dan COD dalam molekul protein yang boleh⁺ bertindak balas dengan molekul air.

Hasil daripada pengionan terdapat kumpulan berkutub pada permukaan molekul protein yang boleh bertindakbalas dengan molekul air.

Suatu protein (contohnya enzim) dapat dimendakkan daripada larutan berair jika keadaan perlarutnya boleh mengurangkan cas bersih pada permukaan protein atau mengurangkan saling tindakan antara kumpulan berkutub pada permukaan molekul protein dengan molekul air. Ia juga boleh dimendakkan jika protein asli (native) boleh menukarkan konformasi kumpulan dalam kepada konformasi lain supaya sifat permukaan protein tidak akan bertindakbalas dengan molekul air lagi. Oleh kerana itu, permukaan molekul protein tidak distabilkan dengan molekul air lagi, dan seterusnya ia akan mengalami pemendakan daripada larutan. Proses ini dikatakan ‘salting-out’.

Pemendakkan suatu protein pada titik isoelektrik atau dengan menggunakan kepekatan garam yang tinggi adalah cara yang sangat berguna dan ianya biasa digunakan dalam pengasingan enzim kerana kedua-dua kaedah ini selalunya tidak akan mendenaturasikan protein.

Dalam eksperimen ini, pengasingan enzim fosforilase dengan meggunakan garam ammonium sulfat sebagai bahan mendakan melalui proses salting-out dilakukan. Secara amnya, keterlarutan sesuatu protein dipengaruhi oleh kekuatan ion seperti yang berikut:

µ = 1 cizi² 2

Di mana :

µ = kekuatan ion

Ci = kepekatan ion

zi = Ca pada ion itu.

Enzim boleh dimendakkan dengan menggunakan larutan yang mempunyai kekutan ion tertentu. Setelah enzim dimendakkan dengan menggunakan garam, misalnya ammonium sulfat dalam eksperimen ini ianya boleh diceraikan dengan menggunakan teknik-teknik tertentu seperti kromatografi, elektroforesis dan lain-lain.

NUR HIDAYAH BT SALIM : JP/7692/11 Page 2

Page 3: Eksperimen 3 anis   hidayah edited

LAPORAN AMALI 3 / JIB 321

B. Penentuan aktiviti fosforilase

Fosforilase memangkinkan tindakbalas berikut:

(kanji)n + pi ******* (kanji)n-1 + glukosa-1-fostat

3. Bahan-bahan

Ubi kentangAlat pengemparan mejaTabung emparanBikar Tabung uji(1ml,2ml, 5ml, 10ml)KelalangKain muslinNatrium ditionit(0.7%)Ammonium sulfat(1 botol)25% larutan asid trikloroasetik(TCA)

0.025M glukosa 1-fosfatLarutan tampan tris malat pH 7.4Reagen fosfatSpektrofotometerKuvetRendaman air, 37%JamPenurus BuchnerAis

4. Tatacara

Pengasingan fosforilase daripada ubi kentang

i. Ubi kentang dikupaskan kemudian dipotongkan menjadi keping-keping sebesar ½ inci besar. Ditimbangkan 200g keeping ubi kentang itu dan direndamkannya selama 5 minit dalam larutan natrium dilionit (7g/liter). Kemudian ia dibasuhkan dengan air suling, dan dimasukkan ke dalam alat pengisar dengan 50 ml air suling dan dikisar hingga lumat. Kemudian, perahan ubi kentang itu didapatkan dengan menggunakan kain muslin atau turasan vakum penuras Buchner yang dilapik dengan kain muslin. Penurasan harus dilakukan dengan cepat untuk mengelakkan kehilangan aktiviti enzim. Emparkan perahan ini selama 3 minit pada kelajuan putaran 5,000 rpm. Supernatant ddiambil dan ditentukan isipadunya. Diasingkan 10ml supernatant itu dan dilabelkannya sebagai S1. Disimpankannya dalam ais.

ii. Supernatan yang selebihnya ditambahkan ammonium sulfat (3g ammonium sulfat/10 ml supernatant) dengan beransur-ansur dan dibancuhkan hingga semua hablur (NH₄)₂ SO₄ telah terlarut. Diemparkan campuran ini pada 5,000 rpm selama 10 minit. Dipisahkan mendapan dan supernatan yang diperolehi. Ditambahkan air suling kepada mendapan ini dengan nisbah 1 ml mendapan; 2 ml air suling. Dilabelkan bahagian ini sebagai M1 dan letakkan kedalam ais.

NUR HIDAYAH BT SALIM : JP/7692/11 Page 3

Page 4: Eksperimen 3 anis   hidayah edited

LAPORAN AMALI 3 / JIB 321

iii. Kepada supernatant yang diperolehi dari emparan kedua, tambahkan 2gm ((NH₄)₂ SO₄ /10 ml supernatant beransur-ansur sambil membancuh dengan sempurna. Diemparkan campuran selama 10 minit pada 5,000 rpm. Dipisahkan mendapan dan supernatant yang diperolehi. Ditambahkan mendapan yang kedua ini dengan air suling dengan nisbah 1 ml mendapan; 4 ml air suling. Dilabelkan bahagian mendapan ini sebagai M2 dan supernatan tadi sebagai S2 dan letakkan kedalam ais.

Langkah-langkah untuk pengasingan bahagian yang akan mengandungi fosforilase ditunjukkan dalam carta aliran berikut:

Carta aliran

Homogenant ubi kentang5000 rpm selama 3 minit

Supernatan (SI) MendapanAmbil 10 ml Sl+ 3 g (NH₄)₂ SO₄ Emparkan

Mendapan supernatant (S2)

Tambah air + 2g (NH₄)₂ SO₄ 10 mlSuling (v/v1:4) supernatant 5,000 rpm, 10 minitM1

Mendapan Supernatan (S2)

Air suling Suling (v/v1:4) M2

iv. Digunakan semua bahagian ekstrak (S1, S2, M1, M2) untuk menentukan aktiviti fosforilase.

NUR HIDAYAH BT SALIM : JP/7692/11 Page 4

Page 5: Eksperimen 3 anis   hidayah edited

LAPORAN AMALI 3 / JIB 321

Penentuan aktiviti fosforilase

i. Sediakan 4 tabung uji bagi setiap bahagian ekstrak ubi kentang (S1, S2 dan M1, M2) seperti berikut:

Tabung uji 3 dan 4 digunakan sebagai tabung kawalan untuk tabung uji 1 dan 2 masing-masing yang mengandungi larutan ekstrak enzim tertentu. Diulangkan prosedur ini untuk ekstrak lain. Jumlah tabung uji yang digunakan ialah 16.

ii. Dieramkan semua tabung uji ini dalam sebuah rendaman air pada 37°C selama 2 minit.

iii. Ditambahkan 1 ml 25% TCA ke dalam tabung uji 3 dan 4 bagi setiap larutan ekstrak. Dibancuhkannya

iv. Ditambahkan 1 ml larutan glukosa-1-fostat ke dalam semua tabung uji termasuk tabung uji kawalan. Dibancuhkan dan dieramkan semua tabung uji bagi setiap ekstrak pada 37°C selama 15 minit.

v. Selepas eraman, ditambahkan 1 ml 25% TCA kedalam tabung uji 1 dan 2 bagi setiap bahagian ekstrak.

vi. Diemparkan semua tabung uji dan digunakan 1 ml supernatant daripada setiap tabung uji untuk penentuan kepekatan Pi. Pi ini terhasil dalam setiap tabung uji.

Penentuan kepekatan Pi

i. Diambil 1 ml supernatant (dari langkah 6) bagi setiap bahagian ekstrak dan dimasukkan ke dalam sebuah tabung uji bersih. 17 tabung uji digunakan ; satu tabung uji digunakan sebagai blank. Tabung uji blank ini hanya mengandungi 1 ml air suling.

ii. Ditambahkan 2 ml reagen fostat kepada setiap tabung uji. Diancuhkan dan kemudian ditinggalkan tabung uji ini pada suhu bilik selama 10 minit.

NUR HIDAYAH BT SALIM : JP/7692/11 Page 5

Page 6: Eksperimen 3 anis   hidayah edited

LAPORAN AMALI 3 / JIB 321

iii. Ditentukan daya penyerapan untuk semua tabung uji ini pada 72 nm dengan menggunakan air suling sebagai blank.

iv. Digunakan lengkok piawai daya penyerapan lawan kepekatan fostat takorganik yang telah didapati daripada eksperimen 1 untuk pengiraan kepekatan fostat terhasil bagi setiap ekstrak S1, S2 dan M1, M2.

v. Aktiviti enzim fosforilase diberikan dalam sebutan µ mole Pᵢ yang dihasilkan/min/ml bagi setiap bahagian ekstrak.

vi. Ditentukan bahagian ekstrak yang mempunyai aktiviti enzim tertinggi. Keputusan dibincangkan.

vii. Bahagian ekstrak yang mempunyai aktiviti enzim tertinggi disimpankan kedalan peti sejuk untuk eksperimen 3.

Penentuan Kepekatan Protein

i. Tabung uji bersih djsediakan untuk menentukan kepekatan protein dalam ekstrak S1, S2 dan M1, M2 dengan menggunakan reagen Folin-Clocalteau. Rujukan kepada Jadual 1.1 eksperimen 1 untuk menjalankan penentuan kepekatan protein ini.

ii. Digunakan 0.5 ml daripada setiap ekstrak untuk ujian ini.

iii. Ditentukan kepekatan protein dalam larutan ekstrak dengan mengikuti kaedah Folin yang diberi dalam eksperimen 1.

iv. Dikirakan kepekatan protein dalam ekstrak S1, S2 dan M1, M2 dan kemudian dikirakan aktiviti spesifik enzim fosforilase dalam ekstrak ini.

NUR HIDAYAH BT SALIM : JP/7692/11 Page 6

Page 7: Eksperimen 3 anis   hidayah edited

LAPORAN AMALI 3 / JIB 321

5. Keputusan

NUR HIDAYAH BT SALIM : JP/7692/11 Page 7

Page 8: Eksperimen 3 anis   hidayah edited

LAPORAN AMALI 3 / JIB 321

NUR HIDAYAH BT SALIM : JP/7692/11 Page 8

Page 9: Eksperimen 3 anis   hidayah edited

LAPORAN AMALI 3 / JIB 321

NUR HIDAYAH BT SALIM : JP/7692/11 Page 9

Page 10: Eksperimen 3 anis   hidayah edited

LAPORAN AMALI 3 / JIB 321

NUR HIDAYAH BT SALIM : JP/7692/11 Page 10

Page 11: Eksperimen 3 anis   hidayah edited

LAPORAN AMALI 3 / JIB 321

NUR HIDAYAH BT SALIM : JP/7692/11 Page 11

Page 12: Eksperimen 3 anis   hidayah edited

LAPORAN AMALI 3 / JIB 321

NUR HIDAYAH BT SALIM : JP/7692/11 Page 12

Page 13: Eksperimen 3 anis   hidayah edited

LAPORAN AMALI 3 / JIB 321

6. Perbincangan

Eksperimen yang dijalankan menunjukkan ekstrak enzim S2 mempunyai aktiviti enzim fosforilase yang paling tinggi dengan menggunakan tindak balas terbalikan melalui penentuan kadar pembentukan fosfa takorganik Pi. Ini bermakna ekstrak enzim S2 mempunyai kuantiti yang tinggi. Setelah di bahagikan dengan kepekatan protein, didapati ekstrak enzim S2 juga mempunyai aktiviti spesifik enzim yang paling tinggi. Berdasarkan teori, ekstrak enzim ini dikatakan separa tulen kerana protein lain yang wujud dengan enzim dalam ekstrak dapat diasingkan. Pada awalnya kami telah mendapat bacaan yang negatif, kemudian setelah mengulangi semula eksperimen, kami berjaya melakukan eksperimen dengan baik kerana sentiasa berhati-hati ketika melakukan prosedur dan menggunakan peralatan yang digunakan dengan baik. Setelah berbincang, kami dapati keputusan yang negatif yang kami peroleh di awal eksperimen berkemungkinan disebabkan kuantiti reagen yang kami ambil menggunakan pipet kurang dari kuantiti yang telah ditetentukan.

7. Kesimpulan

Kami telah berjaya menjalankan eksperimen dengan baik. Eksperimen ini perlu mengambil kira aktiviti enzim fosfat dan kepekatan protein bagi menentukan aktiviti spesifik enzim bagi ekstrak tertentu. Ekstrak enzim S2 menunjukkan aktiviti spesifik enzim yang paling tinggi. Oleh itu, ekstrak enzim S2 akan disimpan untuk digunakan di dalam eksperimen seterusnya.

NUR HIDAYAH BT SALIM : JP/7692/11 Page 13

Page 14: Eksperimen 3 anis   hidayah edited

LAPORAN AMALI 3 / JIB 321

8. Soalan perbincangan

i. Apakah maksudnya aktiviti dan aktiviti spesifik bagi suatu enzim?

Aktiviti enzim adalah kerja yang dilakukan oleh enzim untuk menghasilkan produk sebanyak 1 umol per minit. Manakala, aktiviti spesifik enzim ialah magnitud aktiviti enzim per jumlah protein yang terkandung dalam campuran enzim yang diuji. Semakin besar suatu aktiviti tertentu enzim, maka makin besar tingkat penulenan suatu enzim.

ii. Huraikan prinsip fotometri untuk penentuan kepekatan suatu sebatian dalam suatu larutan.

Prinsip fotometri berdasarkan dari perbezaan jarak dari dua sumber cahaya dari titik pengukuran bagi menghasilkan intensiti yang sama pada titik pencahayaan. Erti kata lain, cahaya pada jarak gelombang tertentu akan diserap apabila suatu cahaya putih melalui suatu larutan yang mengandungi sebatian berwarna. Warna yang terhasil adalah disebabkan oleh cahaya yang tidak dapat diserap oleh sampel itu. Ini boleh dibuktikan oleh spektrum penyerapan riboflavin, iaitu graf yang menunjukkan kuantiti cahaya yang diserap melawan jarak gelombang. Prinsip fotometri ditunjukan dengan penggunaan spektrofotometer bagi menentukan kepekatan sesuatu bahan. Prinsip fotometri merujuk kepada Hukum Lambert dan Hukum Beer. Spektrofotometer adalah alat yang pentingbagi ahli biologi dan biokimia kerana banyak sebatian biologi dan biokimia boleh menyerap cahaya dalam julat ultra-lembayung (200-400nm), sinaran ternampakkan (400-700nm) dan sinaran inframerah dekat (700-900nm).

iii. Mengapakah anda menentukan kepekatan fostat takorganik tetapi bukan kepekatan glukosa-1-fostat dalam tindakbalas enzim fosforilase dalam eksperimen ini?

Ini kerana aktiviti fosforilase boleh ditentukan dengan menggunakan tindakbalas terbalikan melalui kadar penentuan kadar pembentukan fosfa takorganik Pi

iv. Bagaimanakah protein dapat dimendakkan daripada larutan?

NUR HIDAYAH BT SALIM : JP/7692/11 Page 14

Page 15: Eksperimen 3 anis   hidayah edited

LAPORAN AMALI 3 / JIB 321

Protein (contohnya enzim) dapat dimendakkan daripada larutan berair jika keadaan perlarutnya boleh mengurangkan cas bersih pada permukaan protein atau mengurangkan saling tindakan antara kumpulan berkutub pada permukaan molekul protein dengan molekul air. Ia juga boleh dimendakkan jika protein asli (native) boleh menukarkan konformasi kumpulan dalam kepada konformasi lain supaya sifat permukaan protein tidak akan bertindakbalas dengan molekul air lagi. Oleh kerana itu, permukaan molekul protein tidak distabilkan dengan molekul air lagi, dan seterusnya ia akan mengalami pemendakan daripada larutan. Proses ini dikatakan ‘salting-out’. Pemendakkan suatu protein pada titik isoelektrik atau dengan menggunakan kepekatan garam yang tinggi adalah cara yang sangat berguna dan ianya biasa digunakan dalam pengasingan enzim kerana kedua-dua kaedah ini selalunya tidak akan mendenaturasikan protein. Eksperimen ini, mengasingkan enzim fosforilase dengan meggunakan garam ammonium sulfat sebagai bahan mendakan melalui proses salting-out.

v. Mengapakah telur membeku jika ianya dipanaskan?

Putih telur merupakan protein yang dipanggil albumin. Protein terdiri dari molekul asid amino yang membentuk rantaian panjang. Rantaian yang panjang ini akan bergabung dan akhirnya bergumpal membentuk globul. Apabila dipanaskan, rantaian globul terurai sebab adanya haba.kemudian, molekul-molekul bergabung antara satu sama lain lalu membentuk ikatan yang kuat.

Rujukan

A microcolometric method for the determination of inorganic phosphorus,H Taussky, E. Shorr and Gloria Kurman, J. Biochem 202, 675-685, 1953.

Practical modules 1-6 / Biochemistry / Nik Norulaini Nik Ab Rahman

Campbell, Farrell. (2012). Biochemistry . Brooks / Cole.

Chang, R. (2010). Chemistry . Singapora: Mc Graw Hill.

NUR HIDAYAH BT SALIM : JP/7692/11 Page 15