8/22/2019 Como Inmovilizar Celulas

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I n s i . B r e w . , J a n u a r y - F e b r u a r y 1 9 9 8 , V o l . 1 0 4 , 1 9 - 3 1

F U N D A M E N T A L S O F I M M O B I L I S E D Y E A S T C E L L S F O R C O N T I N U O U SB E E R F E R M E N T A T I O N : A R E V I E W

P i l k i n g t o n 1 - 2 , A . M a r g a r i t i s 1 * , M e n s o u r 1 - 2 , R u s s e l l 2

( l D e p a r t m e n t C h e m i c a l & B i o c h e m i c a l E n g i n e e r i n g , U n i v e r s i t y W e s t e r n O n t a r i o , L o n d o n , O n t a r i o , C a n a d a N 6 A 5 B 9 ,^ T e c h n o l o g y D e v e l o p m e n t D e p a r t m e n t , L a b a t t B r e w i n g C o m p a n y L i m i t e d , L o n d o n , O n t a r i o , C a n a d a 4 M 3 )

R e c e i v e d J u l y 1 9 9 7

R e c e n t f u n d a m e n t a l r e s e a r c h c o n d u c t e d o n i m m o b i l i s e d c e l l s w i t h f o c u s c o n t i n u o u s p r i m a r y b e e rf e r m e n t a t i o n p r e s e n t e d t h i s r e v i e w . T h e k n o w l e d g e w h o l e - c e l l i m m o b i l i s a t i o n , c o n t i n u o u sf e r m e n t a t i o n , y e a s t b i o c h e m i s t r y a s s o c i a t e d w i t h b e e r f l a v o u r p r o d u c t i o n , a n d b i o r e a c t o r e n g i n e e r i n g

d e s i g n r e q u i r e d t o a p p l y i m m o b i l i s e d y e a s t c e l l s i n d u s t r i a l s c a l e b e e r p r o d u c t i o n . U n d e r s t a n d i n gh o w i m m o b i l i s a t i o n c o n t i n u o u s b i o r e a c t o r o p e r a t i o n a f f e c t y e a s t c e l l m e t a b o l i s m v i a b i l i t y w i l l

p r o v i d e g r o u n d w o r k o p t i m i s i n g b e e r q u a l i t y . l a t e s t s t u d i e s i m m o b i l i s e d c e l l c a r r i e r s ,v i a b i l i t y , v i t a l i t y , m a s s t r a n s f e r c h a r a c t e r i s t i c s b i o r e a c t o r d e s i g n i n d i c a t e t h a t i n d u s t r i a l s c a l e

i m m o b i l i s e d c e l l s y s t e m p r i m a r y b e e r f e r m e n t a t i o n m a y s o o n b e r e a l i t y m o d e r n b r e w e r y .

W o r d s : I m m o b i l i s e d c e l l c a r r i e r s , b e e r p r o d u c t i o n ,c o n t i n u o u s f e r m e n t a t i o n , v i a b i l i t y , m a s s t r a n s f e r , b i o r e a c t o rd e s i g n , f l a v o u r p r o d u c t i o n .

I n t r o d u c t i o nT r a d i t i o n a l b e e r f e r m e n t a t i o n t e c h n o l o g y u s e s f r e e l y s u s p e n d e d

y e a s t c e l l s b a t c h b i o r e a c t o r s f e r m e n t w o r t u s i n g v a r i e t yy e a s t s t r a i n s m a k e d i f f e r e n t b e e r p r o d u c t s . s u g a r s

o t h e r n u t r i e n t s p r e s e n t l i q u i d p h a s e m u s t d i f f u s e i n t oy e a s t c e l l b e m e t a b o l i s e d d i f f e r e n t e n z y m e s i n t o c t h a n o l

o t h e r f l a v o u r c o m p o u n d s w h i c h m u s t d i f f u s e o u t o fy e a s t c e l l i n t o t h e l i q u i d p h a s e . f u n c t i o n a l i n t e g r i t yc e l l m e m b r a n e p l a y s r o l e d e t e r m i n i n g v i a b i l i t y

c h a r a c t e r i s t i c s t h e y e a s t c e l l s t h e i r m e t a b o l i c a c t i v i t y .O v e r l a s t I S y e a r s d e v e l o p m e n t f e r m e n t

a t i o n t e c h n o l o g y , u s i n g i m m o b i l i s e d y e a s t c e l l sc o n t i n u o u s p r o d u c t i o n b e e r , g r a d u a l l y e m e r g e d w o r l d

w i d e . E a r l i e r r e s e a r c h M a r g a r i t i s a l . 7 5 - 1 6 ' 1 7 - - 1 9 a n ( j o t n e rr e s e a r c h e r s 8 - 2 5 - 3 * 6 5 - 9 1 1 i w a . i 3 i . i 3 5 . i 3 8 e s t a b l i s h e d t h e s u p e r i o r

c h a r a c t e r i s t i c s a d v a n t a g e s u s i n g i m m o b i l i s e d y e a s t c e l l sc o n t i n u o u s l y p r o d u c e e t h a n o l i n f i x e d f l u i d i s e d

b i o r e a c t o r s y s t e m s . l a r g e n u m b e r p u b l i c a t i o n s y e a s tc e l l i m m o b i l i s a t i o n h i g h l i g h t s t h e i m p o r t a n c e i n t e r e s t i n

t h i s t e c h n o l o g y e n t e r t w e n t y - f i r s t c e n t u r y .C o n t i n u o u s b e e r f e r m e n t a t i o n u s i n g i m m o b i l i s e d c e l l s w i l lp e r f o r m e x i s t i n g m a i n s t r e a m b r e w i n g t e c h n o l o g y r e d u c i n g

t i m e p r o d u c e f i n i s h e d b e e r , r e d u c i n g i n v e n t o r y ,r e d u c i n g f l o o r s p a c e , r e d u c i n g p r o d u c t v a r i a t i o n .

A s y s t e m a t i c c r i t i c a l r e v i e w l i t e r a t u r e b e e rd u c t i o n u s i n g i m m o b i l i s e d y e a s t c e l l s r e v e a l e d t h e f o l l o w i n g

p r o b l e m s t h a t n e e d s o l v e d t h r o u g h m o r e r e s e a r c h :t h e r e r e l i a b l e c o l l e c t i o n d a t a m i x i n gm a s s t r a n s f e r r e a l t h r e e - p h a s e f l u i d i s e d b i o r e a c t o r s ;t h e r e n e e d d e v e l o p a c c u r a t e n o n - i n v a s i v e m e t h o d

m e a s u r e i m m o b i l i s e d c e l l v i a b i l i t y ;m u c h w o r k r e m a i n s d o n e e f f e c t s d i s s o l v e d

o x y g e n c o n c e n t r a t i o n f r e e a m i n o a c i d c o n c e n t r a t i o ni m m o b i l i s e d y e a s t c e l l m e t a b o l i s m p r o d u c t i o n

a r o m a a n d f l a v o u r c o m p o u n d s w h i c h s i g n i f i c a n t l y i n f l u e n c eq u a l i t y c o n s u m e r a c c e p t a n c e b e e r p r o d u c t .

e x a m p l e , m a i n p r o b l e m s r e p o r t e d h i g hd i a c e t y l c o n c e n t r a t i o n b e e r p r o d u c e d i m m o b i l i s e dc e l l s w h i c h d e t r i m e n t a l b e e r t a s t e ;m o r e r e s e a r c h n e e d e d m e a s u r e d i f f u s i v i t i c sn u t r i e n t c o m p o u n d s t h a t d i f f u s e i n t o t h e i m m o b i l i s a t i o n

m a t r i x f l a v o u r a r o m a c o m p o u n d s t h a t d i f f u s eo u t ;

i n t e g r a t e d a p p r o a c h n e e d e d i n c o r p o r a t ea b o v e i n f o r m a t i o n d e v e l o p b i o r e a c t o r c o n t r o l s t r a t e g i e s

p r o d u c t i o n c o n s i s t e n t q u a l i t y b e e r u s i n gm o b i l i s e d y e a s t c e l l s .

t h i s r e v i e w , f u n d a m e n t a l a s p e c t s i m m o b i l i s e d y e a s t c e l lr e s e a r c h n e e d e d e x p e d i t e c o m m e r c i a l i s a t i o n t h i s e m e r g i n g

t e c h n o l o g y c o n t i n u o u s b e e r p r o d u c t i o n s u m m a r i s e d .

P r a c t i c a l i m p o r t a n c e c e l l i m m o b i l i s a t i o nP r o d u c i n g a l c o h o l i c b e v e r a g e s u c h b e e r u s i n g

c o n t i n u o u s f e r m e n t a t i o n s y s t e m o f f e r s s e v e r a l i m p o r t a n ta d v a n t a g e s o v e r c o m m o n l y u s e d b a t c h s y s t e m s :

m o r e u n i f o r m p r o d u c tl e s s p r o c e s s s u p e r v i s i o n

C o r r e s p o n d i n g a u t h o r : M a r g a r i t i s .

v e r y h i g h b i o r e a c t o r v o l u m e t r i c p r o d u c t i v i t y ( p r o d u c tw e i g h t / u n i t t i m e / u n i t b i o r e a c t o r v o l u m e ) .

I m m o b i l i s a t i o n u s e d t o o l t o c o n f i n e i n t a c t c e l l si n e r t c a r r i e r w i t h i n b i o r e a c t o r . T h i s " t o o l " w i l l f u r t h e r

i n c r e a s e e f f i c i e n c y c o n t i n u o u s f e r m e n t a t i o n s y s t e mp r o v i d i n g 5 - 5 5 - 9 0 :

h i g h c e l l d e n s i t i e s u n i t b i o r e a c t o r v o l u m e w h i c h r e s u l tv e r y h i g h f e r m e n t a t i o n r a t e s

t h e r e u s e s a m e b i o c a t a l y s t s ( y e a s t c e l l s ) e x t e n d e dp e r i o d s t i m e c o n s t a n t c e l l r e g e n e r a t i o n

c o n t i n u o u s p r o c e s s w h i c h o p e r a t e d b e y o n dn o m i n a l w a s h o u t r a t e

d i s c r e t e p h a s e w h i c h c e l l s m a n i p u l a t e de a s y s e p a r a t i o n b i o c a t a l y s t f r o m t h e l i q u i d p h a s e w h e r e

t h e d e s i r e d p r o d u c t s p r e s e n t t h u s m i n i m i s i n g s e p a r a t i o nc o s t s

h i g h e r c e l l d e n s i t i e s c o m b i n e d w i t h o p e r a t i o n h i g hd i l u t i o n r a t e s , d e c r e a s i n g r i s k r e a c t o r s h u t d o w n

c o n t a m i n a t i o ni m p r o v e d t o l e r a n c e p r o t e c t i o n c e l l s f r o m p r o d u c ti n h i b i t i o n

s m a l l e r b i o r e a c t o r v o l u m e s w h i c h l o w e r c a p i t a l c o s t s .C o n t i n u o u s f e r m e n t a t i o n u s i n g i m m o b i l i s e d c e l l s a l s o a l l o w s

e f f i c i e n t p l a n t u t i l i s a t i o n d u r i n g p e a k s a l e s p e r i o d s .t i n u o u s s m a l l e r - s c a l e h i g h r a t e f e r m e n t a t i o n s y s t e m s

s t e p p e d m e e t p e a k o u t p u t w h e n r e q u i r e d . T h i si m p r o v e m e n t o v e r t h e c u r r e n t t e c h n o l o g y u t i l i s i n g l a r g e b a t c hf e r m e n t e r s w h i c h u s e f u l d u r i n g p e a k p r o d u c t i o n t i m e s b u t

u n d e r - u t i l i s e d d u r i n g o f f - t i m e s 8 3 . a l s o o b s e r v e d t h a ti m m o b i l i s e d c e l l s l e s s s u s c e p t i b l e t h a n f r e e c e l l s t o t h e

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F U N D A M E N T A L S I M M O B I L I S E D Y E A S T C E L L S B E E R C O N T I N U O U S F E R M E N T A T I O N I n s t . B r e w .

- ^C h a n g e s d u e

c o n t i n u o u s m o d er e a c t o r o p e r a t i o n

- - -

C o n t i n u o u sf e r m e n t a t i o n u s i n g

i m m o b i l i z e dy e a s t c e l l s

C h a n g e sc e l l u l a ra c t i v i t y

C h a n g e sc o m b i n a t i o n

i m m o b i l i z a t i o nc o n t i n u o u s m o d e

r e a c t o r o p e r a t i o n

^C h a n g e s d u e

y e a s t c e l li m m o b i l i z a t i o n

1 1 1 ,p t i m i z a t i o nr e a c t o r

d e s i g n

O p t i m i z a t i o ni m m o b i l i z a t i o n

m e t h o d

\O p t i m i z a t i o n

f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s

JB e e r

a c c e p t a b l e f l a v o u r

q u a l i t y p r o d u c e d

/S e l e c t i o n

a p p r o p r i a t eb i o c a t a l v s t s u p p o r t

F i e . C o n s i d e r a t i o n s i m p l e m e n t a t i o n o f a c o n t i n u o u s f e r m e n t a t i o n s y s t e m u s i n g i m m o b i l i s e d y e a s t c e l l s .

e f f e c t s c e r t a i n i n h i b i t o r y c o m p o u n d s , p H v a r i a t i o n s ,n u t r i e n t d e p l e t i o n 1 8 - 7 7 1 0 1 .

p r o c e s s a d v a n t a g e s o f f e r e d c o n t i n u o u s f e r m e n t a t i o nw i l l h a v e a p r o n o u n c e d i m p a c t b r e w i n g i n d u s t r y .

t r a d i t i o n a l b e e r p r o d u c t i o n p r o c e s s o p e r a t e d b a t c h m o d eu s i n g f r e e c e l l s g e n e r a l l y t a k e s d a y s c o m p l e t ep r i m a r y f e r m e n t a t i o n . I n i t i a l s t u d i e s s h o w t h a t c o n t i n u o u si m m o b i l i s e d c e l l s y s t e m r e d u c e t i m e r e q u i r e dp r i m a r y f e r m e n t a t i o n l i t t l e d a y 8 9 . M a t u r a t i o n u s i n g

i m m o b i l i s e d c e l l s c o u p l e d w i t h h e a t t r e a t m e n t p r o c e s ss h o r t e n e d f r o m 5 - 2 1 d a y s h o u r s 2 7 .

M a n y o b s t a c l e s m u s t o v e r c o m e b r i n g t h i s c o n t i n u o u sp r o c e s s t o i n d u s t r i a l f r u i t i o n . C u r r e n t l y , f l a v o u r b e e rp r o d u c e d u s i n g i m m o b i l i s e d y e a s t c e l l t e c h n o l o g y d o e s n o tm a t c h t h a t b e e r p r o d u c e d u s i n g b a t c h s y s t e m s . F l a v o u r -m a t c h i n g n o t b e c r i t i c a l c o m m e r c i a l s u c c e s s , t h e r e

n e e d i m p r o v e m e n t t h e f l a v o u r b e e r p r o d u c e du s i n g i m m o b i l i s e d y e a s t b e f o r e t h i s t e c h n o l o g y b e c o m e s v i a b l e

i n d u s t r i a l s c a l e 5 1 - 9 6 . i m p o r t a n t f a c t o r s a f f e c t i n gf o r m a t i o n o f t h e s e f l a v o u r c o m p o u n d s f u r t h e r d e s c r i b e db e l o w .

f i r s t f a c t o r i n v o l v e s r e a c t o r d e s i g n . B e e r f e r m e n t a t i o n u s i n gf r e e c e l l s n o r m a l l y c a r r i e d u s i n g b a t c h r e a c t o r , w h i c h

w o r t a d d e d b e g i n n i n g f e r m e n t a t i o n 6 7 . I m m o b i l i s e dc e l l r e a c t o r s o p e r a t e d c o n t i n u o u s l y w i t h f r e s h w o r t a d d e dm e t a b o l i s e d w o r t . T h i s i m p l i e s t h a t t h e f e r m e n t a t i o n p r o c e s s w i l l

n e e d s h i f t f r o m c o n s t a n t l y c h a n g i n g b a t c h s t e a d y s t a t ec o n t i n u o u s o p e r a t i o n . e x a m p l e , d u r i n g b a t c h f r e e c e l l

f e r m e n t a t i o n , t h e b i o r e a c t o r o p e r a t e d a e r o b i c a l l y f o r t h e f i r s ts e g m e n t a l l o w y e a s t u t i l i s e o x y g e n c e l l g r o w t h .

D i s s o l v e d o x y g e n l e v e l s s u b s e q u e n t l y d e p l e t e d r e a c t o ro p e r a t e s a n a e r o b i c a l l y r e m a i n d e r t h e f e r m e n t a t i o n . I n

c o n t i n u o u s s y s t e m , d i s s o l v e d o x y g e n w i l l r e a c h c o n s t a n t , s t e a d y -s t a t e c o n c e n t r a t i o n .

H o w , t h e n , c o n d i t i o n s f o u n d w i t h i n b a t c h r e a c t o rm i m i c k e d c o n t i n u o u s i m m o b i l i s e d c e l l r e a c t o r f o r t h e

p r o d u c t i o n a w e l l - b a l a n c e d b e e r ? A t h o r o u g h u n d e r s t a n d i n gy e a s t b a t c h g r o w t h k i n e t i c s r e q u i r e d . I t i s p o s t u l a t e d t h a t

c o n t r o l l i n g d i s s o l v e d o x y g e n o t h e r s u b s t r a t e l e v e l s ,s a m e r e l a t i v e a m o u n t y e a s t g r o w t h u n i t w o r t p r o c e s s e dc a n b e o b t a i n e d b o t h b a t c h c o n t i n u o u s s y s t e m s

s e c o n d f a c t o r i n v o l v e s e f f e c t i m m o b i l i s a t i o nm a s s t r a n s f e r y e a s t m e t a b o l i s m . I n t e r n a l m a s s t r a n s f e ri n v o l v e s t h e t r a n s f e r s u b s t r a t e s p r o d u c t s w i t h i n t h e

c a r r i e r t o t h e y e a s t c e l l , w h e r e a s e x t e r n a l m a s s t r a n s f e r r e f e r st h e t r a n s f e r n u t r i e n t s f r o m b u l k m e d i u m t o t h e c a r r i e r

s u r f a c e . A l t e r a t i o n i n t e r n a l e x t e r n a l m a s s t r a n s f e ri m m o b i l i s a t i o n a f f e c t c o n c e n t r a t i o n m e t a b o l i t e s

i m m e d i a t e v i c i n i t y i m m o b i l i s e d c e l l s t h u sc h a n g e t h e y e a s t c e l l ' s m e t a b o l i c s t a t e u l t i m a t e l y t h e f l a v o u r

b e e r p r o d u c e d .i m p l e m e n t a t i o n c o n t i n u o u s f e r m e n t a t i o n s y s t e m

i n d u s t r i a l s c a l e u s i n g i m m o b i l i s e d y e a s t w i l l r e q u i r e t e a ma p p l i e d r e s e a r c h e r s w i t h e x p e r t i s e b i o c h e m i c a l e n g i n e e r

i n g , m i c r o b i o l o g y , c h e m i s t r y , b i o c h e m i s t r y . P r o j e c tc o n s i d e r a t i o n s a r e o u t l i n e d F i g u r e

P r o p e r t i e s i m m o b i l i s e d c e l l s y s t e m sW h o l e - c e l l i m m o b i l i s a t i o n d e f i n e d l o c a l i s a t i o n

i n t a c t c e l l s d e f i n e d r e g i o n s p a c e w i t h p r e s e r v a t i o n

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8/22/2019 Como Inmovilizar Celulas

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V o l . 1 0 4 , 1 9 9 8 ] F U N D A M E N T A L S I M M O B I L I S E D Y E A S T C E L L S B E E R C O N T I N U O U S F E R M E N T A T I O N

E n t r a p m e n t w i t h i n m a t r i x A t t a c h m e n t o r a d s o r p t i o np r e f o r m e d c a r r i e r

S e l f a g g r e g a t i o nc e l l s ( f l o c c u l a t i o n )

C e l l s c o n t a i n e d b e h i n db a r r i e r

o o

o oo o

o o0 0o o

F i g . B a s i c m e t h o d s c e l l i m m o b i l i s a t i o n .

c a t a l y t i c a c t i v i t y 5 5 . i m m o b i l i s e d c e l l s y s t e m d e s c r i b e dA b b o t t 1 s y s t e m w h i c h m i c r o b i a l c e l l s c o n f i n e dw i t h i n b i o r e a c t o r , t h u s p e r m i t t i n g t h e i r r e u s e . M e t h o d si m m o b i l i s a t i o n i n c l u d e p h y s i c a l e n t r a p m e n t w i t h i n p o r o u sm a t r i x , a t t a c h m e n t o r a d s o r p t i o n p r e - f o r m e d c a r r i e r , s e l fa g g r e g a t i o n f l o c c u l a t i o n c r o s s l i n k i n g a g e n t s , c e l l sc o n t a i n e d b e h i n d b a r r i e r . t h e s e m e t h o d s h a v e s i m i l a rp u r p o s e : r e t a i n h i g h c e l l c o n c e n t r a t i o n s w i t h i n b i o -

r e a c t o r , l e a d i n g t o i n c r e a s e d v o l u m e t r i c p r o d u c t i v i t ys y s t e m l o w e r e d f e r m e n t a t i o n c o s t s . F i g u r e 2 i l l u s t r a t e s

b a s i c i m m o b i l i s a t i o n t e c h n i q u e s .A n i m m o b i l i s e d c e l l s y s t e m s h o u l d h a v e f o l l o w i n g

p r o p e r t i e s f o r l a r g e s c a l e i n d u s t r i a l a p p l i c a t i o n 9 0 :

c a r r i e r m a t e r i a l m u s t n o n t o x i c , r e a d i l y a v a i l a b l ea f f o r d a b l e ;

s y s t e m s h o u l d e f f i c i e n t , e a s y o p e r a t e g i v e g o o dy i e l d s ;

c a r r i e r m a t e r i a l s h o u l d a l l o w h i g h c e l l l o a d i n gp h y s i c a l s t r e n g t h ;

c e l l s s h o u l d h a v e p r o l o n g e d v i a b i l i t y i n s u p p o r t .

P h y s i c a l e n t r a p m e n t w i t h i n p o r o u s m a t r i xe n t r a p m e n t o f i m m o b i l i s e d c e l l s w i t h i n p o r o u s

p o l y m e r i c m a t r i x s u c h c a l c i u m a l g i n a t e 1 > . " . s 5 . 9 7 . < m u < m . i i m 3 of c a p / r a - c a r r a g e e n a n 8 9 - 9 0 1 0 1 ' 2 7 , a l o n g w i t h s o m e o t h e r s 4 4 1 0 3 ,

b e e n s t u d i e d e x t e n s i v e l y . P o l y m e r i c b e a d s a r e u s u a l l ys p h e r i c a l w i t h d i a m e t e r s r a n g i n g f r o m t o 3 . 0 I m m o

b i l i s i n g y e a s t c e l l s u s i n g e n t r a p m e n t r e l a t i v e l y s i m p l em e t h o d a n d h i g h b i o m a s s c o n c e n t r a t i o n f a c i l i t a t e d 8 4 .

T a b l e l i s t s s o m e c h a r a c t e r i s t i c s a l g i n a t e 1 1 7 c a r r a g e e n a ng e l s ' " .

S o m e b r e w e r s h a v e m o v e d a w a y f r o m e n t r a p m e n t m a t r i c e sa r e c u r r e n t l y f o c u s i n g a d s o r p t i o n t e c h n i q u e s s e v e r a l

r e a s o n s . p r e s e n t , e n t r a p m e n t m a t r i c e s a r e p r o d u c e de c o n o m i c a l l y i n d u s t r i a l s c a l e . D i f f u s i o n l i m i t a t i o n s

t o t h e m a t r i x h i g h b i o m a s s l o a d i n g s c a u s e m e t a b o l i t ec o n c e n t r a t i o n g r a d i e n t s w i t h i n t h e p o l y m e r b e a d s . T h i s

T A B L E C h a r a c t e r i s t i c s c a l c i u m a l g i n a t ek a p p a - c a r r a g t e n i x n g e l s

C a l c i u m A l g i n a t ep o l y m e r f r o m s e a w e e d sf r o m P h a e o p h y c e t i e c l a s s

a l g a e

m o d e r a t e c o n c e n t r a t i o n so f c a l c i u m d i c t a t i n g a g e n t ss u c h p h o s p h a t e s . 1 2 D T A .

M g : \ i o n s w i l ld i s r u p t a l g i n a t c g e l s

l a c k m e t h o d s i n d u s t r i a ls c a l e p r o d u c t i o n o f a l g i n a t e

b e a d s

A a / ) / o - C a r r j g e c n a np o l y m e r s f r o m s e a w e e d ss u c h C h o n d r u s c r i s p u s

E u c h e u m a c o t t o n i i

t h e r m o r c v e r s i b l e w h e r eg e l l i n g t e m p e r a t u r e d e p e n d s

p o t a s s i u mc o n c e n t r a t i o n

m e t h o d f o r p i l o t s c a l ep r o d u c t i o n o f c a r r a g e e n a nb e a d s c u r r e n t l y a v a i l a b l e 8 '

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E U N D A M E N T A L S I M M O B I L I S E D Y E A S T C E L L S B E E R C O N T I N U O U S F E R M E N T A T I O N I n s t . B r e w .

c o n c e r n b e c a u s e t h e f l a v o u r c o m p o n e n t s b e e r a f f e c t e dw h e n m a s s t r a n s f e r l i m i t a t i o n s a l t e r s u b s t r a t e a v a i l a b i l i t y

c r e a t e b u i l d u p i n h i b i t o r y p r o d u c t s s u c h e t h a n o lc a r b o n d i o x i d e i m m o b i l i s a t i o n m i c r o e n v i r o n m e n t . H o w

e v e r , u n d e r s t a n d i n g m a s s t r a n s f e r p h e n o m e n a w i t h i n e n t r a pm e n t m a t r i c e s a l l o w s i m u l t a n e o u s l y p r o v i d ed i f f e r i n g c o n d i t i o n s s u r f a c e b e a d c e n t r e .

t h e r e f o r e c o u l d p o t e n t i a l l y m i m i c t h e a e r o b i ca n a e r o b i c s t a g e s y e a s t m e t a b o l i s m d u r i n g b a t c h

m e n t a t i o n u s i n g t h i s e n t r a p p e d c e l l s y s t e m c o n t i n u o u sf e r m e n t a t i o n .

T h i s c o n c e p t o f u t i l i s i n g d i f f e r e n t m i c r o e n v i r o n m e n t sw i t h i n e n t r a p m e n t m a t r i x b e i n g s t u d i e d w a s t e w a t e r

t r e a t m e n t s y s t e m s 3 1 S a n t o s c o l l e a g u e s r e f e r" m a g i c b e a d c o n c e p t " w h i c h n i t r i f y i n g b a c t e r i u m

N i t r o s o m o n a s e u r o p a e a d e n i t r i f i e r P a r a c o c c t i s d e n i t r i -f i c a n s a r e c o - i m m o b i l i s e d d o u b l e - l a y e r b e a d s .

f o u n d t h a t o x y g e n 2 6 4 7 6 1 1 3 2 , t o l i m i t a t i o n u p t a k ed i f f u s i o n , r a r e l y p e n e t r a t e s g r e a t e r t h a n h u n d r e d m i c r om e t e r s i n t o b e a d w h e n l i m i t i n g s u b s t r a t e . T h u s ,

s i n g l e - s t a g e c o n t i n u o u s l i f t r e a c t o r , a e r o b i c n i t r if i c a t i o n s t e p c a r r i e d t h e o u t e r l a y e r w h i l ea n a e r o b i c d e n i t r i f i c a t i o n t o o k p l a c e b e a d c o r e 3 1 . T h i sr e s u l t p r o v e u s e f u l a c h i e v i n g a e r o b i c

a n a e r o b i c s t a g e s d u r i n g b e e r f e r m e n t a t i o n .A n o t h e r l i m i t a t i o n e n t r a p m e n t i n c l u d e s l o s s

m e c h a n i c a l i n t e g r i t y , d i s s o l u t i o n b r e a k d o w n d u ea b r a s i o n , c o m p r e s s i o n , o r i n t e r n a l a c c u m u l a t i o n 4 4 - 8 4 .

R e s e a r c h e r s h a v e t r e a t e d a l g i n a t e b e a d s w i t h s t a b i l i s i n ga g e n t s s u c h s o d i u m m e t a - p e r i o d a t e g l u t a r a l d e h y d e 1 3A l ' * i m p r o v e m e c h a n i c a l s t r e n g t h .A t t a c h m e n t o r a d s o r p t i o n p r e f o r m e d c a r r i e r

A d s o r p t i o n i n v o l v e s r e v e r s i b l e a t t a c h m e n t b i o m a s ss o l i d s u p p o r t m a i n l y e l e c t r o s t a t i c , i o n i c h y d r o g e n

b o n d i n g i n t e r a c t i o n s . B e c a u s e k n o w n t h a t y e a s t c e l l s h a v en e g a t i v e s u r f a c e c h a r g e , p o s i t i v e l y c h a r g e d s u p p o r t w i l lm o s t a p p r o p r i a t e i m m o b i l i z a t i o n 1 2 . T h e r e a c t u a l l y

t y p e s w h o l e - c e l l a d s o r p t i v e i m m o b i l i s a t i o n c a r r i e r s : ( a )c a r r i e r s t h a t a l l o w a d s o r p t i o n o n l y o n t o e x t e r n a l s u r f a c e s ,

b e c a u s e p o r e s i z e s t o o s m a l l a l l o w m i c r o o r g a n i s m sp e n e t r a t e i n s i d e , c a r r i e r s w i t h l a r g e e n o u g h p o r e s

a l l o w a d s o r p t i o n o n t o i n t e r n a l s u r f a c e s 1 0 2 . T a b l e l i s t s s o m ee x a m p l e s o f p r e f o r m e d c a r r i e r m a t e r i a l s t h a t h a v e b e e ns u g g e s t e d i m m o b i l i s a t i o n y e a s t .

B i o m a s s l o a d i n g g e n e r a l l y l o w e r a d s o r b e d c e l l s y s t e m st h a n t h o s e o b t a i n a b l e e n t r a p m e n t m a t r i c e s , m a s s

t r a n s f e r l e s s l i m i t i n g . A d s o r p t i v e m a t r i c e s h a v et h e a d d i t i o n a l d i f f u s i o n b a r r i e r b e t w e e n c e l l sb u l k f e r m e n t a t i o n m e d i u m . A n o t h e r a d v a n t a g e u s i n g

a d s o r p t i o n m a t r i c e s r e g e n e r a b i l i t y s u p p o r t .s t r e n g t h c e l l a t t a c h m e n t a d s o r p t i o n c a r r i e r

d e p e n d s b o t h c e l l m a t r i x t y p e . S i n c e t h e r e b a r r i e rb e t w e e n c e l l s s u r r o u n d i n g m e d i u m , t h e s e i m m o

b i l i s a t i o n m a t r i c e s h a v e s i g n i f i c a n t c e l l l e a k a g e . T h i sa p p r o p r i a t e p r o c e s s e s r e q u i r i n g a c e l l - f r e e e f f l u e n t 3 9 .C h a n g e s e n v i r o n m e n t a l i o n i c s t r e n g t h , t e m p e r a t u r e ,a l o n g w i t h p h y s i c a l s t r e s s e s s u c h a g i t a t i o n a b r a s i o n

i n d u c e c e l l d e s o r p t i o n . A n o t h e r l i m i t a t i o n o f a d s o r p t i o n c e l t

T A B L E S o m e c a r r i e r t y p e s u s e d r e c e n t l y f o r i m m o b i l i s a t i o na t t a c h m e n t a d s o r p t i o n

C a r r i e r M a t e r i a l R e f e r e n c eD E A E c e l l u l o s e

p o r o u s g l a s ss i l i c o n c a r b i d ev o l c a n i c r o c ks p o n g e

d i a t o m a c e o u s e a r t hw o o d b l o c k s

g l u t e n p e l l e t s

5 9 , 1 0 71 4 . 5 9 . 1 3 6 . 1 3 7

8 6 . 1 2 2 . 1 2 34 , 5 3

c a r r i e r s p o s s i b i l i t y n o n s p e c i f i c b i n d i n g o f c h a r g e dm a t e r i a l s w i t h i n f e r m e n t a t i o n m e d i u m 1 2 .

t h i c k n e s s t h e b i o f i l m a t t a c h e d t o t h e s u r f a c e t h e s ec a r r i e r s r a n g e s f r o m m o n o l a y e r c e l l s l a y e r c e l l s

m i l l i m e t r e t h i c k 5 5 . F l o w r a t e f e e d t h e b i g g e s t e f f e c td e p t h t h e b i o f i l m b e c a u s e a f f e c t s t u r b u l e n c e

l i q u i d f l o w i n g p a s t a d s o r b e d b i o l a y e r . k i n e t i c sb i o f i l m f o r m a t i o n c o m p l e x 6 8 t h e r e f o r e d i f f i c u l t

c o n t r o l .D E A E - c e l l u l o s e ( d i e t h y l a m i n o e t h y l ) s u p p o r t u s e s i o n i c

a t t r a c t i o n t o i m m o b i l i s e y e a s t c e l l s . i n e r t , n o n d i s s o l v i n gc e l l u l o s e m a t r i x w h i c h n o n u n i f o r m g r a n u l a r s h a p e t h a t

p r o v i d e s l a r g e b i n d i n g a r e a c e l l c o l o n i s a t i o n . S i n e b r y c h o f fB r e w e r y C u l t o r L t d . h a v e w o r k e d w i t h D E A E - c e l l u l o s e

i m m o b i l i s e y e a s t c e l l s c o n t i n u o u s m a t u r a t i o n o rs e c o n d a r y f e r m e n t a t i o n p r o c e s s e s . T h e y f o u n d t h a t t h e

c e l l u l o s e b i n d m o s t c o m m o n y e a s t c o n t a m i n a n t sw a s h a b l e , r e u s a b l e r e g e n e r a b l e w i t h l o n g s e r v i c e l i f e 7 4 .

L i n k o K r o n l o f 7 1 c o n d u c t e d s t u d y w h i c h t h e yc o m p a r e d S p e z y m e * , D E A E - c e l l u l o s e c a r r i e r o b t a i n e d f r o m

C u l t o r O y , F i n l a n d , w i t h t y p e s c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l ep o r o u s s i l i c a b e a d s u s e d i m m o b i l i s e d c e l l c a r r i e r s f o r t h e

c o n t i n u o u s p r i m a r y f e r m e n t a t i o n b e e r . T u b u l a rc o n i c a l 5 p a c k e d c o l u m n s w e r e u s e d

m e n t a t i o n s i n t h i s s t u d y . s i l i c a b e a d s c o m p a r e d w e r eB i o c e r a m i c s " f r o m K i r i n B r e w e r y J a p a n , S i r a n 8

d e v e l o p e d S c h o t t G m B H , G e r m a n y . r e s e a r c h e r so b s e r v e d t h a t w h e n D E A E - c e l l u l o s e p a r t i c l e s w e r e u s e d , y e a s ta t t a c h e d t h e s u r f a c e p a r t i c l e s o n l y , w h e r e a s g l a s s

b e a d s s h o w e d y e a s t g r o w t h p a r t i a l l y s u r f a c ep a r t i a l l y i n s i d e p o r e s . l o w e s t a m o u n t y e a s t g r o w t h

o b s e r v e d u s i n g t h e g l a s s S i r a n 8 c a r r i e r s . A b e e r f l a v o u rp r o f i l e m o s t s i m i l a r t r a d i t i o n a l l y b r e w e d b e e r s o b t a i n e d

u s i n g t h e s e i m m o b i l i s e d y e a s t p r i m a r y f e r m e n t a t i o n .o n l y d i f f e r e n c e f o u n d f r o m t r a d i t i o n a l l y b r e w e d b e e rs l i g h t l y e l e v a t e d e s t e r d i a c e t y l l e v e l s . o v e r c o m e t h e s e

l i m i t a t i o n s , g e n e t i c a l l y m o d i f i e d y e a s t w i t h g e n e e n c o d i n gc t - a c e t o l a c t a t e d e c a r b o x y l a s e c o u l d u s e d r e d u c e d i a c e t y ll e v e l s , w h i l e e s t e r l e v e l s c o u l d c o n t r o l l e d o p t i m i s i n g

o x y g e n l e v e l s i n i m m o b i l i s e d c e l l r e a c t o r . g l a s sc a r r i e r s , S i r a n * f o u n d s u p e r i o r o v e r B i o c e r a m i c s 1b e c a u s e o f h i g h e r m e c h a n i c a l s t r e n g t h d e n s i t y .

C a s h i n 1 6 r e c e n t l y c o m p a r e d f i v e d i f f e r e n t p o r o u s c a r r i e r st e r m s m i n i m u m f i u i d i s a t i o n v e l o c i t y , b i o m a s s l o a d i n g ,

d u r a b i l i t y . c a r r i e r s c o m p a r e d w e r e D E A E - c e l l u l o s ec a r r i e r S p e z y m e 8 , t h r e e s i z e s S i r a n 8 1 s i n t e r e d g l a s s b e a d s ,

H y p e r m i c s 8 , p o r o u s c e r a m i c c a r r i e r f r o m K i r i n B r e w e r i e sJ a p a n . H y p e r m i c s 8 w a s f o u n d g i v e t h e h i g h e s t b i o m a s s

l o a d i n g , b u t t e n d e d f l o a t a n d w a s m e c h a n i c a l l y w e a k .D E A E - c e l l u l o s e c a r r i e r , S p e z y m e , t h e l o w e s t m i n i m u m

f l u i d i s a t i o n v e l o c i t y , c h e m i c a l l y s t e r i l i s e d w h i c hm o r e t i m e c o n s u m i n g t h a n s t e a m s t e r i l i s a t i o n t h a t

u s e d s i l i c a - b a s e d c a r r i e r s . T h i s s t u d y f o u n d S i r a n 8 t op r e f e r r e d c a r r i e r f o r f l u i d i s e d s y s t e m b e c a u s e g a v e

s e c o n d l o w e s t m i n i m u m f l u i d i s a t i o n v e l o c i t y s e c o n dh i g h e s t b i o m a s s l o a d i n g , w h i l e e x h i b i t i n g n o n e t h e p r a c t i c a l

l i m i t a t i o n s f o u n d w i t h t h e o t h e r c a r r i e r s 1 6 .M e u r a - D e l t a , a B e l g i u m - b a s e d b r e w e r y e q u i p m e n t s u p p l y

c o m p a n y , c o l l a b o r a t i o n w i t h a r e s e a r c h t e a m C E R I A ,B e l g i a n u n i v e r s i t y , i n t e g r a t e d n o v e l i m m o b i l i s a t i o n a p p r o a c h

c o n t i n u o u s p r o d u c t i o n b e e r . T h e y d e s i g n e d a t w o -s t a g e c o n f i g u r a t i o n c o n t i n u o u s p r i m a r y f e r m e n t a t i o n u s i n g

i m m o b i l i s e d c e l l r e a c t o r f i r s t s t a g e f o l l o w e d f r e ec e l l s y s t e m . f i r s t r e a c t o r , m u l t i c h a n n e l p o r o u s s i l i c o nc a r b i d e i m m o b i l i s a t i o n r o d s w e r e a r r a n g e d l o o pf i g u r a t i o n 1 2 3 . O p e n p o r e s t h e s i n t e r e d s i l i c o n c a r b i d e r o d sr a n g e i n s i z e f r o m 4 0 - 6 0 w h i c h a l l o w r a p i d y e a s tc o l o n i s a t i o n . S i l i c o n c a r b i d e i n e r t , d u r a b l e , r e - u s a b l e , s t e a ms t e r i l i s a b l e , s u i t a b l e f o r c l e a n i n g 8 6 . R o d s w i t h i n t e r

c h a n n e l s r a t h e r t h a n b e a d s w e r e u s e d i m m o b i l i s a t i o no r d e r m a x i m i s e m a s s t r a n s f e r b e t w e e n y e a s t c e l l s

l i q u i d w o r t f l o w i n g t h r o u g h t h e c h a n n e l s .

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8/22/2019 Como Inmovilizar Celulas

5/13

V o l . 1 0 4 , 1 9 9 8 ] F U N D A M E N T A L S O F I M M O B I L I S E D Y E A S T C E L L S B E E R C O N T I N U O U S F E R M E N T A T I O N

D i a t o m a c e o u s e a r t h , t r a d e n a m e d C e l i t e " , t r a d i t i o n a l l yu s e d b r e w i n g i n d u s t r y a s f i l t e r a l s o p o s s e s s e s

d e s i r a b l e q u a l i t i e s f o r i m m o b i l i s e d c e l l c a r r i e r . C e l i t e 8u n i f o r m c o m p o s i t i o n , h i g h m e c h a n i c a l c h e m i c a l

s t a b i l i t y , d o e s s w e l l d u r i n g f e r m e n t a t i o n 3 3 . H o w e v e r ,b o t h y e a s t c e l l s C e l i t e h a v e n e g a t i v e l y c h a r g e d s u r f a c e s

u n d e r t y p i c a l f e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n s , c a u s i n g r e l a t i v e l yw e a k i n t e r a c t i o n b e t w e e n b i o m a s s i m m o b i l i s a t i o ns u p p o r t . A n d e r s o n a l . 3 r e p o r t e d t h a t r e d u c t i o n

c e l l l e a k a g e r a t e f r o m C e l i t e n e e d e d l o n g - t e r m ,l a r g e s c a l e f e r m e n t a t i o n s . g r o u p s u c c e s s f u l l y d e c r e a s e dc e l l l e a k a g e e n c a s i n g C e l i t e 8 l a y e r c a l c i u ma l g i n a t e 3 3 .

Z e t a p o t e n t i a l p l a y s i m p o r t a n t r o l e d e t e r m i n i n ge x t e n t c e l l a d h e s i o n c a r r i e r s u c h C e l i t e 8 . W h e nb r o u g h t i n t o c o n t a c t w i t h p o l a r m e d i u m ( e . g . f e r m e n t a t i o n

b r o t h ) , m o s t s u b s t a n c e s a c q u i r e s u r f a c e e l e c t r i c c h a r g e 6 3 . I o n so f o p p o s i n g c h a r g e w i l l m i g r a t e t h i s s u r f a c e . z e t ap o t e n t i a l 2 d e f i n e d e l e c t r i c a l p o t e n t i a l r e q u i r e d s h e a r

t h i s o p p o s i n g l y c h a r g e d l i q u i d l a y e r c o n t a c t w i t hc h a r g e d s o l i d s u r f a c e . F a c t o r s s u c h w o r t c o m p o s i t i o n , y e a s t

s t r a i n , f e r m e n t a t i o n s t a g e , f e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n s ,m e d i u m w i l l a f f e c t t h e z e t a p o t e n t i a l t h e C e l i t e 8y e a s t c e l l s . e x a m p l e , o n e w o u l d w a n t s e l e c t p H t h a tw o u l d m i n i m i s e f o r c e s r e p u l s i o n b e t w e e n c a r r i e r

c e l l s m a x i m i s e b i o m a s s l o a d i n g . H o w e v e r , p H a l s oa f f e c t s y e a s t v i a b i l i t y , c o m p r o m i s e b e t w e e n m a i n t a i n i n gy e a s t v i a b i l i t y p r o d u c t i v i t y w h i l e m a x i m i s i n g c e l l l o a d i n g

r e q u i r e d .M u l c h a n d a n i a l . 9 3 s t u d i e d t h e e f f e c t z e t a p o t e n t i a l

a d s o r p t i o n e f f i c i e n c y c e l l s o n t o s o l i d s u p p o r t s i n c l u d i n gC e l i t e 8 . T h e y s h o w e d t h a t w h e n y e a s t - l i k e f u n g u s A u r e o -b a s i d i u m p u l l u l a n s w a s g r o w n d i f f e r e n t p H c o n d i t i o n s ,d i f f e r e n c e s c h a r g e d i s t r i b u t i o n c e l l w a l l s w e r e

f o u n d . A . p u l l u l a n s c e l l s e x h i b i t e d n e g a t i v e c h a r g es o l u t i o n s a b o v e p H 2 . S - 3 . 0 . T h i s t h o u g h td i f f e r e n c e s i n c e l l w a l l c o m p o s i t i o n c a u s e d d i f f e r i n g

m e d i a c o n d i t i o n s . T h e y a l s o f o u n d t h a t C e l i t e 8 n e g a t i v ez e t a p o t e n t i a l w i t h m a x i m u m n e g a t i v i t y p H m i n i m u mp H S i n c e p u l l u l a n s s y n t h e s i s e p u l l u l a n p H

t h e y c u l t u r e d t h e c e l l s c o n t a c t w i t h C e l i t e 8 p Hh o u r s m a x i m i s e c e l l l o a d i n g m i n i m i s e e l e c t r o s t a t i cr e p u l s i o n , t h e n t r a n s f e r r e d i m m o b i l i s e d c e l l s p Hp r o d u c t i o n m e d i u m o p t i m a l f e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n s .

N g u y e n a n d S h i e h " u s e d C e l i t e 8 i m m o b i l i s e y e a s tc o n t i n u o u s p r o d u c t i o n e t h a n o l f l u i d i s e d r e a c t o r .T h e y o b t a i n e d o n l y 7 1 % t h e o r e t i c a l e t h a n o l y i e l d

t h i s t h o u g h t e x t e n d e d m e a n c e l l r e s i d e n c e t i m e ,i n h i b i t o r y e f f e c t h i g h d i s s o l v e d c a r b o n d i o x i d e c o n c e nt r a t i o n s , i n t e r m i t t e n t p H v a r i a t i o n s r e a c t o r .S e l f a g g r e g a t i o n c e l l s

f o r m a t i o n c e l l a g g r e g a t e s f l o c c u l a t i o n , s h o w nF i g u r e 2 ( c ) , m o s t s i m p l e l e a s t e x p e n s i v e i m m o

b i l i s a t i o n m e t h o d , l e a s t p r e d i c t a b l e . S t e w a r t 1 1 8 d e f i n e sf l o c c u l a t i o n " t h e f o r m a t i o n a n o p e n a g g l o m e r a t i o n t h a t

r e l i e s u p o n m o l e c u l e s a c t i n g a s b r i d g e s b e t w e e n s e p a r a t ep a r t i c l e s " . n a t u r a l f l o c c u l a t i n g a b i l i t y y e a s t c e l l se x p l o i t e d 1 0 6 c r o s s l i n k e r s a d d e d t o b o l s t e r p r o c e s s

a g g r e g a t i o n c e l l s t h a t n a t u r a l l y . c o n t r o lc e l l a g g r e g a t i o n i m p o r t a n t m a x i m i s e b i o r e a c t o r e f f i

c i e n c y . F a c t o r s w h i c h i n f l u e n c e t h e n a t u r a l f l o c c u l a t i o nc h a r a c t e r i s t i c s b r e w e r ' s y e a s t s t r a i n s i n c l u d e t h e g e n e t i c

m a k e - u p s t r a i n , c e l l w a l l s t r u c t u r e s u r f a c ec h a r g e , g r o w t h p h a s e , i n c u b a t i o n t e m p e r a t u r e , m e d i u mc a t i o n c o m p o s i t i o n m e d i u m , o t h e r w o r t

p o n e n t s " 8 .W e a k f l o c c u l a t i o n a c t i v i t y w i l l r e s u l t i n s l o w c e l l s e d i m e n t

a t i o n r a t e s w h i c h c a u s e c e l l s " w a s h e d o u t "b i o r e a c t o r w i t h f e r m e n t a t i o n m e d i u m . C o n s e q u e n t l y ,

c e l l c o n c e n t r a t i o n m a i n t a i n e d t h e r e a c t o r r e s u l t i n gi n s u f f i c i e n t f e r m e n t a t i o n r a t e s . O n o t h e r h a n d , l a r g e r f l o e s

w i t h v e r y h i g h f l o c c u l a t i o n a c t i v i t y r e s u l t l o w c o n c e nt r a t i o n s a c t i v e y e a s t c e l l s t o d i f f u s i o n l i m i t a t i o n

s u b s t r a t e t o c e l l s i n s i d e f l o e s 6 0 .D o m i n i o n B r e w e r i e s L i m i t e d Z e a l a n d " - 3 2 h a s b e e n

s u c c e s s f u l l y u s i n g a f l o c c u l e n t l a g e r y e a s t s t r a i nt i n u o u s f e r m e n t a t i o n o f b e e r a l m o s t y e a r s . T h i s b r e w e r yu s e s h o l d - u p v e s s e l f o l l o w e d b y t w o s t i r r e d t a n k f e r m e n t e r s

c o n t i n u o u s p r i m a r y f e r m e n t a t i o n . A f t e r p r i m a r ym e n t a t i o n , f l o c c u l e n t y e a s t s e p a r a t e d f r o m g r e e nb e e r g r a v i t y c o n i c a l s e t t l e r . Y e a s t t h e n r e c y c l e d f r o m

f i r s t s t i r r e d t a n k f e r m e n t e r t h e c o n i c a l s e t t l e r b a c k i n t oh o l d - u p v e s s e l t o a c h i e v e m o r e p r e c i s e c o n t r o l r a t e

f e r m e n t a t i o n . L a b a t t B r e w i n g C o m p a n y L i m i t e d C a n a d aa l s o a c t i v e i n e a r l i e r w o r k o n c o n t i n u o u s p r i m a r y

f e r m e n t a t i o n b e e r 3 7 .R e s e a r c h e r s V T T B i o t e c h n o l o g y F o o d R e s e a r c h

F i n l a n d 1 3 c o m p a r e d b e h a v i o u r s t r o n g l y w e a k l yf l o c c u l e n t y e a s t c e l l s i m m o b i l i s e d d i f f e r e n t c a r r i e r s ,S i r a n ( s i n t e r e d g l a s s ) a n d S p e z y m e 8 ( D E A E c e l l u l o s e ) f o r

p r i m a r y f e r m e n t a t i o n b e e r . T h e y f o u n d t h a t t h e s t r o n g l yf l o c c u l e n t y e a s t c e l l s a c c u m u l a t e d i m m o b i l i s a t i o n

c a r r i e r s f a s t e r c o n s e q u e n t l y d e s i r e d w o r t a t t e n u a t i o nr e a c h e d m o r e q u i c k l y t h a n w e a k l y f l o c c u l e n t y e a s t

s t r a i n . I n a d d i t i o n , t h e y n o t e d t h a t g e n e t i c a l l y m o d i f i e ds u p e r f l o c c u l e n t y e a s t s t r a i n t h a t d i s r e g a r d e d b e c a u s ef l o c c u l a t e d e a r l y c o n v e n t i o n a l b a t c h f e r m e n ta t i o n s , p r o v e v e r y u s e f u l c o n t i n u o u s

f e r m e n t a t i o n s .

C e l l s c o n t a i n e d b e h i n d b a r r i e rt h i s t y p e i m m o b i l i s a t i o n , c e l l s r e t a i n e d

m e m b r a n e s o l u b l e f o r m c e l l s a t t a c h e ds u r f a c e a n d / o r e n t r a p p e d w i t h i n m e m b r a n e m a t r i x 3 8 . Ab a r r i e r f o r m e d b y l i q u i d - l i q u i d i n t e r f a c e b e t w e e ni m m i s c i b l e f l u i d s a l s o b e u s e d i m m o b i l i z a t i o n 5 5 . C e l lr e t e n t i o n b e h i n d a m e m b r a n e b a r r i e r h a s n o t b e e n w i d e l y u s e d

i m m o b i l i s e y e a s t c e l l s c o n t i n u o u s p r o d u c t i o n b e e r ,t h e r e a r e s e v e r a l g r o u p s h a v e i n v e s t i g a t e d t h e i r

c o n t i n u o u s e t h a n o l p r o d u c t i o n 5 0 6 2 8 0 8 1 * 4 . K y u n gG e r h a r d t 6 2 i n v e s t i g a t e d c o n t i n u o u s e t h a n o l p r o d u c t i o n u s i n g

S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e i m m o b i l i s e d m e m b r a n e -c o n t a i n e d f e r m e n t e r . M i c r o p o r o u s d i a l y s i s m e m b r a n e s

p r o v i d e d a b a r r i e r w h i c h r e t a i n e d y e a s t c e l l sf e r m e n t e r s i m u l t a n e o u s l y a l l o w e d i n h i b i t o r y f e r m e n t a t i o np r o d u c t s s u c h e t h a n o l b e c o n t i n u o u s l y r e m o v e d o r d e r

b o o s t r e a c t o r p r o d u c t i v i t y . p r o b l e m o f m e m b r a n ep l u g g i n g m u s t o v e r c o m e t h i s i m m o b i l i s a t i o n m o d e

b e c o m e p r a c t i c a l i n d u s t r i a l - s c a l e m e t h o d c o n t i n u o u se t h a n o l p r o d u c t i o n f u t u r e .

I m m o b i l i s e d C e l l V i a b i l i t y V i t a l i t yY e a s t v i a b i l i t y d e f i n e d p e r c e n t a g e l i v e c e l l s

s a m p l e , y e a s t v i t a l i t y m e a s u r e o f y e a s t a c t i v i t yf e r m e n t a t i o n p e r f o r m a n c e 7 - 6 6 1 2 1 . L e n t i n i 6 6 , c o m p r eh e n s i v e 1 9 9 3 r e v i e w , s p e c i f i c a l l y d e s c r i b e s y e a s t v i t a l i t yf u n c t i o n t o t a l c e l l v i a b i l i t y p h y s i o l o g i c a l s t a t e

v i a b l e c e l l p o p u l a t i o n " . o r d e r e f f i c i e n t l ys i s t e n t l y p r o d u c e q u a l i t y b e e r u s i n g i m m o b i l i s e d c e l l s y s t e m ,o n e m u s t u n d e r s t a n d i m p a c t s u c h s y s t e m y e a s t

p h y s i o l o g y g r o w t h .M a n y c r i t e r i a u s e d t o a s s e s s y e a s t c e l l v i a b i l i t y

v i t a l i t y . C o n s e q u e n t l y , p e r c e i v e d v i a b i l i t y y e a s t s a m p l ev a r y d e p e n d i n g c r i t e r i a s e l e c t e d . o f t e n

b e n e f i c i a l m o n i t o r c o m b i n a t i o n o f p a r a m e t e r s g a i n am o r e c o m p l e t e u n d e r s t a n d i n g o f a y e a s t ' s p h y s i o l o g i c a l s t a t e .

s e c t i o n b e l o w n u m b e r m e t h o d s s t u d y i n g y e a s t c e l lv i a b i l i t y v i t a l i t y s u m m a r i s e d w h i l e l a t e r s e c t i o n sm e t h o d s e x a m i n i n g p a t t e r n s y e a s t c e l l g r o w t h w i t h i n

i m m o b i l i s a t i o n m a t r i c e s a r e d e s c r i b e d .

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6/13

F U N D A M E N T A L S I M M O B I L I S E D Y E A S T C E L L S B E E R C O N T I N U O U S F E R M E N T A T I O N I n s t . B r e w .

M e t h o d s m e a s u r e m e n t i m m o b i l i s e d c e l l v i a b i l i t y v i t a l i t ys p e c i f i c d y e s a s s e s s i n g c e l l v i a b i l i t y v i t a l i t y

M e t h y l e n e b l u e m o s t c o m m o n l y u s e d y e a s t c e l lv i a b i l i t y s t a i n i n g . V i a b l e c e l l s a r e a b l e r e d u c e t h i s s t a i nm a k i n g c o l o u r l e s s , w h e r e a s n o n - v i a b l e c e l l s u n a b l er e d u c e s t a i n r e n d e r i n g t h e m d e e p b l u e - p u r p l e s h a d e 6 6 . A

v i a b l e y e a s t c e l l c o u n t c o m p l e t e d u s i n g a h e m o -c y t o m e t e r l i g h t m i c r o s c o p e l e s s t h a n t e n m i n u t e s .

W h e n b u f f e r e d s u p p l e m e n t e d a d e q u a t e l y , m e t h y l e n e b l u ee f f e c t y e a s t c e l l v i a b i l i t y 6 4 . M e t h y l e n e b l u e s t a i n i n g

c o n s i d e r e d a c c u r a t e m e t h o d o n l y w h e n y e a s t c e l lv i a b i l i t y g r e a t e r t h a n 9 0 % 8 8 . S o m e e x a m p l e s o f m e t h y l e n e

b l u e s o l u t i o n s i n c l u d e F i n k - K u h l e s b u f f e r e d m e t h y l e n e b l u e( A S B C i n t e r n a t i o n a l m e t h o d ) 1 2 0 , m e t h y l e n e b l u e a q u e o u ss o l u t i o n 1 2 0 , s t a n d a r d m e t h y l e n e b l u e s o l u t i o n 6 4 . M e t h y l e n eb l u e s t a i n i n g g o o d m e t h o d a s s e s s i n g v i a b i l i t yh i g h l y c o n c e n t r a t e d y e a s t s u c h a s t h a t f o u n d i m m o b i l i s a t i o n

m a t r i c e s 6 4 . O t h e r b r i g h t n e l d s t a i n s w h i c h h a v e b e e n u s e dm o n i t o r y e a s t c e l l v i a b i l i t y i n c l u d e A n i l i n e B l u e 8 8 C r y s t a l

V i o l e t 3 5 .T h e r e a r e a l s o m a n y f l u o r e s c e n t s t a i n s d e s i g n e d a s s e s s

y e a s t c e l l v i a b i l i t y v i t a l i t y . W h e n f l u o r e s c e n t s t a i n s u s e dc o n j u n c t i o n w i t h c o n f o c a l m i c r o s c o p y 9 " 1 1 0 f l o w c y t o -m e t r y 2 8 . 2 . 4 o . 4 8 . 7 3 v a l u a b l e i n f o r m a t i o n o b t a i n e d y e a s t

c e l l g r o w t h m e t a b o l i c s t a t e . K a s t e n 5 6 g i v e s c o m p r e h e n s i v er e v i e w s t a i n s a v a i l a b l e f l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p yt e c h n i q u e s .

C a p a c i t a n c ep r i n c i p l e t h i s m e t h o d t h a t t h e a p p l i c a t i o n r a d i o

f r e q u e n c y v i a b l e c e l l r e s u l t s c h a r g e b u i l d u p w i t h i n t h em e m b r a n e , c a p a c i t a n c e g e n e r a t e d 6 6 . N o n v i a b l e c e l l s

u n a b l e g e n e r a t e t h i s c a p a c i t a n c e . A l i n e a r c o r r e l a t i o nb e e n d e m o n s t r a t e d b e t w e e n c a p a c i t a n c e v i a b l e y e a s t

b i o m a s s 6 .K r o n l o f 5 8 r e c e n t l y s h o w e d t h a t c a p a c i t a n c e p r o b e s

s u i t a b l e f o r m o n i t o r i n g v i a b l e y e a s t b i o m a s s b o t h f r e e l ys u s p e n d e d i m m o b i l i s e d c e l l s y s t e m s . Y e a s t c e l l s w e r e

i m m o b i l i s e d p o r o u s g l a s s c a r r i e r s ( S i r a n B ) D E A E -c e l l u l o s e ( S p e z y m e 8 ) . K r o n l o f p o i n t e d o u t t h a t a l t h o u g h t h i s

m e t h o d c o r r e l a t e s w e l l w i t h m e t h o d s s u c h a s s t a i n i n gd e t e c t i o n v i a b l e c e l l s , d o e s n o t p r o v i d e a d d i t i o n a l

i n f o r m a t i o n a b o u t t h e y e a s t c e l l ' s m e t a b o l i c s t a t e . T h e r e f o r et h i s m e t h o d b e s t u s e d c o n j u n c t i o n w i t h o t h e r m e t h o d s

m e a s u r i n g y e a s t v i t a l i t y s u c h n i c o t i n a m i d e a d e n i n ed i n u c l e o t i d e ( N A D H ) a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e ( A T P ) .

T h e p o w e r r e p r o d u c t i o n v i a b i l i t y i n d i c a t o rS t a n d a r d p l a t e c o u n t m e a s u r e s a b i l i t y y e a s t c e l l s

p r o l i f e r a t e f o r m c o l o n i e s n u t r i e n t a g a r . g e n e r a l l yt a k e s t h r e e d a y s v i s i b l e c o l o n i e s t o f o r m v i a b i l i t y

a s s e s s e d b y c o u n t i n g n u m b e r c o l o n y f o r m i n g u n i t s( C F U ) . C a r e m u s t t a k e n w h e n u s i n g t h i s m e t h o d v e r y

f l o c c u l e n t y e a s t 6 6 .Y e a s t v i a b i l i t y s l i d e c u l t u r e a l s o b a s e d a b i l i t y

y e a s t c e l l s p r o l i f e r a t e . A d r o p y e a s t c u l t u r e p l a c e df i l m n u t r i e n t a g a r a f t e r a p p r o x i m a t e l y h o u r si n c u b a t i o n f o r m a t i o n o f m i c r o c o l o n i e s o b s e r v e d u n d e r

m i c r o s c o p e . C e l l s w h i c h h a v e g i v e n r i s e m i c r o c o l o n i e sc o n s i d e r e d v i a b l e w h e r e a s s i n g l e c e l l s t h a t h a v e f o r m e d

m i c r o c o l o n i e s c o n s i d e r e d n o n - v i a b l e 1 2 0 . r e l a t i v e l y l e s st i m e - c o n s u m i n g t h a n s t a n d a r d p l a t e c o u n t s b u t s t i l l m u c hs l o w e r t h a n s t a i n i n g t e c h n i q u e s . a d v a n t a g e s l i d e

c u l t u r e m e t h o d t h a t a c c u r a t e a t r e l a t i v e l y y e a s t c e l lv i a b i l i t i e s .

V i a b i l i t y v i t a l i t y m e t h o d s b a s e d c e l l m e t a b o l i c s t a t eA d e n o s i n e T r i p h o s p h a t e ( A T P )

( a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e ) g o o d i n d i c a t o r c e l lv i a b i l i t y s i n c e p r e s e n t l i v i n g c e l l s d e g r a d e d

w h e n c e l l s d i e . A T P a l l o w s t h e d e t e c t i o n v i a b l e c e l l s

s h o r t a m o u n t t i m e ( 1 0 1 5 m i n u t e s ) w h e n c o m p a r e d w i t ht r a d i t i o n a l p l a t i n g t e c h n i q u e s . S i n c e q u a n t i t y A T P

c e l l d o e s n o t v a r y s i g n i f i c a n t l y f o r g i v e n s t r a i n ( b u t v a r i e sb e t w e e n s t r a i n s ) , i n f e r r e d t h a t a m o u n t A T Pp r e s e n t b i o m a s s s a m p l e p r o p o r t i o n a l n u m b e r

v i a b l e c e l l s p r e s e n t t h a t c e l l t y p e . A n o t h e r a d v a n t a g e o f u s i n gA T P v i a b i l i t y i n d i c a t o r t h a t a m o u n t A T P p r e s e n t

c e l l r o u g h l y i n d e p e n d e n t g r o w t h r a t e . T h e r e f o r e ac o r r e l a t i o n b e t w e e n A T P c o n c e n t r a t i o n a m o u n tv i a b l e c e l l m a s s m a d e 4 1 .

" f i r e f l y a s s a y " u s e d d e t e r m i n e t h e q u a n t i t y A T Pp r e s e n t b i o m a s s s a m p l e . T h i s i n v a s i v e m e t h o d i n v o l v e s

e x t r a c t i n g t h e f r o m c e l l s r e a c t i n g w i t h f i r e f l yl u c i f e r i n i n t w o - s t e p r e a c t i o n w h i c h c a t a l y s e d e n z y m ef i r e f l y l u c i f e r a s e . L i g h t p r o d u c t s t h i s r e a c t i o n

s t o i c h i o m e t r i c r e l a t i o n s h i p e x i s t s b e t w e e n a m o u n tl i g h t p r o d u c e d t h e q u a n t i t y A T P b i o m a s s s a m p l e .E x t r a c t a n t s u s e d t o r e l e a s e i n t r a c e l l u l a r A T P i n c l u d e b o i l i n gb u f f e r s s u c h t r i s - E D T A , c a t i o n i c d e t e r g e n t s , a c i d s ,

o r g a n i c c o m p o u n d s s u c h a c e t o n e e t h a n o l . r e a c t i o n st a k i n g p l a c e s u m m a r i s e d b e l o w :L u c i f e r i n + L u c i f e r a s e + A T P + M g 2 * ( L u c i f e r i n - L u c i f e r a s e -A M P ) P y r o p h o s p h a t e

( L u c i f e r i n - L u c i f e r a s e - A M P ) + O : - O x y l u c i f e r i n + L u c i f e r a s e+ C O 2 + A M P + L i g h t

c o n c e n t r a t i o n s a s 1 0 " 1 2 v o l u m ed e t e c t e d u s i n g t h e f i r e f l y m e t h o d 4 1 .

G i k a s a n d L i v i n g s t o n 4 1 u s e d i o l u m i n e s c e n c e c h a r a ct e r i s e b i o m a s s v i a b i l i t y i n f r e e l y s u s p e n d e d i m m o b i l i s e d

c e l l b i o r e a c t o r s . T h e y c o n c l u d e d t h a t k i n e t i c d a t a o b t a i n e df r e e l y s u s p e n d e d c e l l s c o u l d n o t a d e q u a t e l y d e s c r i b e

i m m o b i l i s e d b i o m a s s k i n e t i c s b e c a u s e i m m o b i l i s e d c e l l si n s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t m e t a b o l i c s t a t e s t h a n f r e e l y s u s p e n d e d

c e l l s . T h e y q u e s t i o n e d w h e t h e r d i f f e r e n c e s A T P l e v e l sb e t w e e n f r e e l y s u s p e n d e d i m m o b i l i s e d c e l l s r e f l e c t d i f f e r

e n c e s b i o m a s s v i a b l e f r a c t i o n d i f f e r e n c e s m e t a b o l i cs t a t e .

N A D H F l u o r o s e n s o rN A D H s u c c e s s f u l l y b e e n u s e d a s a n o n i n v a s i v e , o n - l i n e

m e t h o d m o n i t o r i n g f r e e l y s u s p e n d e d i m m o b i l i s e d y e a s tc e l l m e t a b o l i s m 3 0 - 6 9 . V i a b l e c e l l s c o n t a i n n i c o t i n a m i d e a d e n i n ed i n u c l e o t i d e ( N A D ) c o e n z y m e w h e r e a s n o n - v i a b l e c e l l ss p o r e s n o r m a l l y l o s e t h e i r N A D 1 7 . T h e o x i d i s e d f o r m , N A D *

u s e d d e h y d r o g e n a s e s a c c e p t e l e c t r o n s f r o m t h e i rs u b s t r a t e s . e x a m p l e , e n z y m a t i c c o n v e r s i o n m a l a t e

o x a i o a c e t a t e p r e s e n c e o x y g e n , m a l a t e d e h y d r o -g e n a s e ( M D E ) f i r s t b i n d s N A D + f o r m c o m p l e xM D E - N A D * . T h i s c o m p l e x t h e n c o m b i n e s w i t h m a l a t e

f o r m t e r n a r y c o m p l e x M D E - N A D + - m a l a t e . F r o m h e r e ,N A D H , i o n , o x a i o a c e t a t e r e l e a s e d :m a l a t e + N A D * o x a l o a c e t a t e + N A D H + H +

( o x i d i s e d ) ( r e d u c e d )

r e d u c e d f o r m , N A D H , f l u o r e s c e s w h i l e o x i d i s e df o r m , N A D * , d o e s n o t . N A D H s t r o n g l y f l u o r e s c e n t w i t h

e m i s s i o n m a x i m u m n m w a v e l e n g t h . t o t a l N A DN A D H N A D * . r e d u c i n g s t a t e d e n n e d

t h e r a t i o r e d u c e d f o r m t o t a l a m o u n t N A D :R = [ N A D H ] ( [ N A D * ] + [ N A D H ] )

C e l l m e t a b o l i c s t a t e d e t e r m i n e s r e d u c i n g s t a t e w h i c h w i l lr e m a i n c o n s t a n t u n l e s s t h e r e s h i f t m e t a b o l i s m . T h u s ,i n f l u e n c e s u b s t r a t e s s u c h o x y g e n o n r e d u c i n g s t a t e

p r e d i c t e d . W h e n o x y g e n e x c e s s , t h e r e d u c i n g s t a t ea p p r o a c h e s z e r o b e c a u s e N A D H e a s i l y o x i d i s e d f o r mN A D * a n d H ; O , a n d w h e n t h e r e l a c k o f o x y g e n a v a i l a b l e

c e l l s , R a p p r o a c h e s o n e . c o n c e n t r a t i o n [ N A D H ]a s w e l l a s i n t e n s i t y f l u o r e s c e n t s i g n a l i n f l u e n c e d

n u m b e r v i a b l e c e l l s , r e d u c i n g s t a t e c e l l se n v i r o n m e n t a l e f f e c t s . M e a s u r i n g N A D H a n a d v a n t a g e

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8/22/2019 Como Inmovilizar Celulas

7/13

V o l . 1 0 4 , 1 9 9 8 ] F U N D A M E N T A L S O F I M M O B I L I S E D Y E A S T C E L L S B E E R C O N T I N U O U S F E R M E N T A T I O N

o v e r m o n i t o r i n g d i s s o l v e d o x y g e n p H b e c a u s e d i r e c t l ym e a s u r e s , r e a l t i m e , e v e n t s o c c u r r i n g w i t h i n t h e c e l l r a t h e rt h a n c h a n g e s o u t s i d e t h e c e l l e n v i r o n m e n t .

S p e c i f i c O x y g e n U p t a k e R a t e ( B R F Y e a s t V i t a l i t y T e s t )R e s e a r c h e r s B r e w i n g R e s e a r c h I n t e r n a t i o n a l ( B R I )

d e v e l o p e d m e t h o d d e t e r m i n e v i t a l i t y p i t c h i n g y e a s tm e a s u r i n g s p e c i f i c o x y g e n u p t a k e r a t e 2 4 . V a r i o u sg r o u p s 2 4 - 5 4 - 8 2 h a v e s h o w n c o r r e l a t i o n b e t w e e n o x y g e n u p t a k e

r a t e y e a s t f e r m e n t a t i o n p e r f o r m a n c e y e a s t v i a b i l i t yl e s s t h a n 9 0 % . m e t h o d i n v o l v e s t h e p i t c h i n g y e a s t i n t oa e r a t e d m e d i a m e a s u r e m e n t o x y g e n u p t a k e r a t e

h o u rA r e d u c e d o x y g e n u p t a k e r a t e p a r a l l e l s o t h e r y e a s t c h a n g e s

s u c h a s t h e r e d u c t i o n y e a s t l i p i d s , g l y c o g e n , a c i d i f i c a t i o np o w e r t e s t v a l u e , y e a s t v i a b i l i t y 4 9 . U n d e r t h e s e c o n d i t i o n s ,o x y g e n u p t a k e r a t e c o r r e l a t e s w e l l w i t h y e a s t f e r m e n t a t i o np e r f o r m a n c e . H o w e v e r , W h e a t c r o f t e t a / . 1 2 9 f o u n d t h a t o x y g e nu p t a k e r a t e c o r r e l a t e w e l l w i t h f e r m e n t a t i o nf o r m a n c e w h e n y e a s t b e e n p r e v i o u s l y a c i d - w a s h e d . E v e n

t h o u g h a c i d - w a s h e d y e a s t s h o w e d d e c r e a s e d s p e c i f i c o x y g e nu p t a k e r a t e s , t h e y a c t u a l l y s h o w e d b e t t e r f e r m e n t a t i o n p e r

f o r m a n c e t h a n n o n - a c i d - w a s h e d y e a s t .b i o c a t a l y t i c a c t i v i t y n i t r o g e n - f i x i n g b a c t e r i u m ,

V i b r i o n a t r i e g e n s ( B a n e c k e a n a t r i e g e n s ) , i m m o b i l i s e dC e l i t e 8 , s t u d i e d b y G i k a s L i v i n g s t o n 4 2 u s i n g s p e c i f i co x y g e n u p t a k e r a t e ( O 2 ) g ~ ' ( d r y b i o m a s s ) h " 1 ] . S p e c i f i co x y g e n u p t a k e r a t e s f o r i m m o b i l i s e d f r e e c e l l s t h r e ep h a s e l i f t r e a c t o r w e r e c o m p a r e d f o u n d t h a tu p t a k e r a t e s w e r e s i g n i f i c a n t l y l o w e r i m m o b i l i s e d c e l l s ,i m p l y i n g a l o w e r b i o m a s s a c t i v i t y i n i m m o b i l i s e d c e l l

s y s t e m .

A c i d i f i c a t i o n P o w e ra c i d i f i c a t i o n p o w e r t e s t d e v e l o p e d b y O p e k a r o v a a n d

S i g l c r 1 0 4 m e a s u r e s d r o p e x t r a c e l l u l a r s u s p e n s i o ny e a s t c e l l s a f t e r a d d i t i o n g l u c o s e . T h i s m e t h o d u s e f u l

d e t e c t i n g l a r g e d i f f e r e n c e s y e a s t m e t a b o l i c a c t i v i t y .y e a s t a c i d i f i c a t i o n p o w e r t e s t r e q u i r e s e x t e n s i v e y e a s t w a s h i n g

m u l t i p l e s a m p l e p o i n t s w h i c h m a k e s i m p o s s i b l et h i s t e s t i m m o b i l i s e d c e l l s i n s i t u .

I n t r a c e l l u l a r p H ( I C P ) M e t h o dT h e I C P m e t h o d u s e s p H - s e n s i t i v e f l u o r e s c e n t r e a g e n t

m e a s u r e i n t r a c e l l u l a r p H i n d i v i d u a l c e l l s c e l l m a s s .f o u n d t h a t t h e i n t r a c e l l u l a r p H m o r e a c t i v e y e a s t c e l l s

d o e s n o t d e c r e a s e , e v e n e x t r a c e l l u l a r l o w , w h e r e a si n t r a c e l l u l a r p H l e s s a c t i v e c e l l s a c t u a l l y d e c r e a s e s u n d e r

e x t r a c e l l u l a r p H c o n d i t i o n s 4 9 . T h i s t e s t a b l e t od e t e c t m o r e s u b t l e c h a n g e s y e a s t c e l l v i t a l i t y t h a n a c i d if i c a t i o n p o w e r t e s t 4 9 .

M e a s u r e m e n t Y e a s t V i t a l i t y S t r e s s R e s p o n s es t a t e d e a r l i e r , v i t a l i t y b e c o n s i d e r e d a m e a s u r e

y e a s t a c t i v i t y o r f e r m e n t a t i o n p e r f o r m a n c e . a l s o b e e nd e f i n e d a b i l i t y c e l l s e n d u r e o r o v e r c o m e s t r e s s 7 .T h e r e f o r e c o u l d r e l a t e v i t a l i t y r e s p o n s e o f y e a s t c e l l s

s t r e s s e s s u c h a s e t h a n o l , h e a t s h o c k , h i g h s a l t c o n c e nt r a t i o n s . M e t h y l e n e b l u e , f l u o r e s c e n t d y e s 7 , s t a n d a r d p l a t e

c o u n t s 1 0 1 u s e d a s s e s s a b i l i t y c e l l s r e m a i nv i a b l e a f t e r b e i n g s u b j e c t e d g i v e n s t r e s s .

N o r t o n a l . i m a s s e s s e d t h e e t h a n o l h e a t t o l e r a n c eb r e w e r s ' y e a s t e n t r a p p e d K < a r r a g e e n a n g e l . F r e e i m m ob i l i s e d S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e c e l l s w e r e e x p o s e d e t h a n o l

c o n c e n t r a t i o n s 1 8 % , 1 9 . 4 % ( v / v ) g i v e n l e n g t ht i m e v i a b i l i t y t h e n m e a s u r e d u s i n g s t a n d a r d p l a t ec o u n t s . H e a t t o l e r a n c e m e a s u r e d i n c u b a t i n g y e a s t c e l l s

4 8 C v a r i o u s l e n g t h s t i m e w i t h p e r i o d i c s h a k i n g . C e l lv i a b l i t y f o l l o w i n g h e a t s h o c k a l s o m e a s u r e d u s i n g s t a n d a r dp l a t e c o u n t s . f o u n d t h a t t h e r e s i g n i f i c a n t i n c r e a s e

y e a s t s u r v i v a l a g a i n s t e t h a n o l i m m o b i l i s e d c e l l sp a r e d f r e e c e l l s , d i s t i n c t d i f f e r e n c e h e a t r e s i s t a n c e

n o t e d . s t u d y c o n c l u d e d t h a t t h e c a r r a g e e n a n m a t r i xp r o v i d e d p r o t e c t i o n t o t h e e n t r a p p e d y e a s t c e l l s a g a i n s t e t h a n o l .

W h e n e n t r a p p e d c e l l s w e r e r e l e a s e d f r o m c a r r a g e e n a nm a t r i x , t h e i r e t h a n o l t o l e r a n c e r e t u r n e d t o t h a t f r e e c e l l s .

M a g n e s i u m R e l e a s e T e s t ( M R T )T h e M a g n e s i u m R e l e a s e T e s t 9 2 b a s e d o b s e r v a t i o n

t h a t m o l e c u l a r w e i g h t s p e c i e s s u c h m a g n e s i u m , p o t a ss i u m , p h o s p h a t e i o n s a r e r e l e a s e d y e a s t i m m e d i a t e l yf o l l o w i n g i n o c u l a t i o n i n t o g l u c o s e c o n t a i n i n g m e d i u m . T r i a l sp e r f o r m e d S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e s h o w e d t h a t c e l l s w h i c hr e l e a s e d g r e a t e r q u a n t i t i e s m a g n e s i u m i m m e d i a t e l y a f t e ri n o c u l a t i o n i n t o h i g h g r a v i t y ( 1 6 P ) w o r t h i g h e r v i t a l i t yf e r m e n t a t i o n p e r f o r m a n c e t h a n y e a s t w h i c h r e l e a s e d l o w e ra m o u n t s m a g n e s i u m . S u b s e q u e n t f e r m e n t a t i o n s p e r f o r m e du s i n g m o r e v i t a l y e a s t s h o r t e r p h a s e s , h i g h e r c e l l

c o u n t s , h i g h e r e t h a n o l c o n c e n t r a t i o n s , l o w e r d i a c e t y ll e v e l s . T h e m a g n e s i u m r e l e a s e t e s t ( M R T ) t a k e s l e s s t h a n f i f t e e nm i n u t e s p e r f o r m u s e s c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e

m a g n e s i u m t e s t ( S i g m a ) w h i c h a l l o w s q u a n t i t a t i v ec o l o u r i m e t r i c m e a s u r e m e n t m a g n e s i u m w o r t b e f o r e

i m m e d i a t e l y a f t e r y e a s t i n o c u l a t i o n .

M e t h o d s f o r d e t e r m i n i n g c e l l d i s t r i b u t i o n g r o w t h p a t t e r n sw i t h i n i m m o b i l i s e d c e l l m a t r i c e sM e t h o d s u c c e s s i v e d i s s o l u t i o n l a y e r s f r o m b e a d s

W h e n c a l c i u m a l g i n a t e u s e d e n t r a p y e a s t c e l l s , c a l c i u mc h e l a t o r s s u c h p h o s p h a t e s c i t r a t e s u s e dd i s s o l v e " s h e l l s " a l g i n a t e b i o m a s s f r o m b e a d s 1 8 - 4 3 " 3 .

m e a s u r i n g c o n c e n t r a t i o n v i a b i l i t y c e l l s i n s i d ee a c h s h e l l , i n f o r m a t i o n b e o b t a i n e d a b o u t s p a t i a l

d i s t r i b u t i o n v i a b l e c e l l s w i t h i n t h e e n t r a p m e n t m a t r i x .U s u a l l y s h e l l s o b t a i n e d u s i n g t h i s m e t h o d h a v e t h i c k n e s s

g r e a t e r t h a n W h e n b i o m a s s p r o f i l e s s t e e p w i t h i n t h eb e a d s , g r e a t e r r e s o l u t i o n r e q u i r e d t o o b t a i n a c c u r a t ep i c t u r e y e a s t c e l l d i s t r i b u t i o n . R e l e a s e d b i o m a s s f r o m e a c hs h e l l a s s e s s e d v i a b i l i t y u s i n g m e t h y l e n e b l u es t a i n i n g , f l u o r e s c e n t d y e s o r p l a t i n g . P r o b l e m s w i t h t h i sm e t h o d i n c l u d e u n i f o r m i t y d i s s o l u t i o n m a t r i x , f i n d i n g

s u i t a b l e n o n t o x i c s o l u t i o n d i s s o l v i n g t h e e n t r a p m e n tm a t r i x , o v e r a l l a c c u r a c y l i m i t a t i o n s .

R e c e n t l y , P a r a s c a n d o l a A l t e r i i s " 0 s t u d i e d t h e s p a t i a lg r o w t h p a t t e r n s o f S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e c e l l s e n t r a p p e d

s t a r c h - h a r d e n e d g e l a t i n d i s c s . T h e y u s e d a m u l t i - s t e p d i g e s t i o nm e t h o d c o l l e c t c e l l s b e l o n g i n g f i v e d i f f e r e n t l a y e r s

d i s c s . D i l u t e d t r y p s i n u s e d r e l e a s e c e l l s f r o mg e l a t i n y e a s t v i a b i l i t y f r o m e a c h l a y e r s t h e n

m e a s u r e d s t a i n i n g c e l l s w i t h f l u o r e s c e n t s t a i nR h o d a m i n e e x a m i n i n g t h e m u n d e r a c o n f o c a l

m i c r o s c o p e .P h y s i c a l s e c t i o n i n g i m m o b i l i s e d c e l l m a t r i x

A b i o m a s s d i s t r i b u t i o n b e o b t a i n e d s l i c i n g m a t r i c e sc o n t a i n i n g y e a s t c e l l s . a v o i d m a t r i x c o m p r e s s i o n

o b t a i n a c c u r a t e d i s t r i b u t i o n , s a m p l e o f t e n d r i e de m b e d d e d i n t o r e s i n , f r o z e n . S h r i n k a g e h a s b e e n o b s e r v e d

d u r i n g t h i s p r e p a r a t i o n 1 3 4 . B e a d s t h e n b e s l i c e d u s i n gm i c r o t o m e o r r a z o r b l a d e c e l l c o n c e n t r a t i o n w i t h i n e a c h

s e c t i o n o b t a i n e d u s i n g i m a g e a n a l y s i s a p p r o p r i a t ev i a b i l i t y v i t a l i t y s t a i n s . H o w e v e r , t h i s i n v a s i v e s l i c i n g m e t h o d

c a u s e a l t e r a t i o n s c e l l d i s t r i b u t i o n o t h e r a b e rr a t i o n s 9 .

N M R i m a g i n gN u c l e a r m a g n e t i c r e s o n a n c e i m a g i n g ( N M R I ) n o n -

i n v a s i v e t e c h n i q u e s t u d y s p a t i a l l y c h e m i c a l p h y s i c a lp r o p e r t i e s s m a l l s a m p l e s 6 8 . L e w a n d o w s k i e t a / . 6 8 u s e dN M R I b e t t e r u n d e r s t a n d d y n a m i c s b i o f i l m g r o w t h

e x t e r n a l l i q u i d f i l m f l o w v e l o c i t y d i s t r i b u t i o n . T h e s e s t u d i e si m p o r t a n c e s i n c e t h e e x t e n t b i o f i l m g r o w t h

f l u e n c e d l o c a l c h e m i c a l e n v i r o n m e n t f l u i d f l o wThis document is provided compliments of the Institute of Brewing and Distilling

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8/22/2019 Como Inmovilizar Celulas

8/13

F U N D A M E N T A L S O F I M M O B I L I S E D Y E A S T C E L L S B E E R C O N T I N U O U S F E R M E N T A T I O N I n s t . B r e w .

c o n d i t i o n s . S u b s t r a t e s m u s t a l s o t r a n s f e r r e d t h r o u g hb i o f i l m - b u l k m e d i u m i n t e r f a c e t o r e a c h c e l l s . a d d i t i o n ,

r e s e a r c h e r s w e r e a b l e g a t h e r i n f o r m a t i o n v e l o c i t y d i s t r ib u t i o n u s i n g N M R I n e a r m i c r o b i a l l y c o l o n i s e d s u r f a c e s w i t h

i m a g i n g t i m e o f 8 - 1 6 m i n u t e s .

u s e o f c o n f o c a l m i c r o s c o p y d e t e r m i n a t i o n v i a b l ec e l l d i s t r i b u t i o n w i t h i n p o r o u s m i c r o c a r r i e r sC o n f o c a l m i c r o s c o p y v a l u a b l e t o o l s t u d y i n g v i a b i l i t yo f i m m o b i l i s e d c e l l s b e c a u s e u n i q u e a b i l i t y t o t a k e o p t i c a ls e c t i o n s t h r e e d i m e n s i o n a l o b j e c t s n o n i n v a s i v e m a n n e r .

T h i s d e p t h d i s c r i m i n a t i o n p r o p e r t y a l l o w s o n l y t h e r e g i o no b j e c t t h a t l i e s c l o s e t o t h e f o c a l p l a n e i m a g e d

e f f i c i e n t l y 8 7 . U s i n g c o n f o c a l m i c r o s c o p y , c o u l d p o t e n t i a l l yo b t a i n t h r e e - d i m e n s i o n a l i m a g e s o f y e a s t c e l l g r o w t hv i a b i l i t y d i s t r i b u t i o n w i t h i n p o r o u s m i c r o c a r r i e r s w i t h o u t

a c t u a l l y d i s r u p t i n g t h e c a r r i e r m a t r i x .e l e g a n t s t u d y a l . 1 0 , s p a t i a l d i s t r i b u t i o n

m a m m a l i a n c e l l s g r o w n m o d i f i e d m a c r o p o r o u s g e l a t i nm i c r o c a r r i e r s s t u d i e d u s i n g c o n f o c a l m i c r o s c o p y . O p t i c a ls e c t i o n i n g e m p l o y i n g c o n f o c a l m i c r o s c o p y e t h i d i u m

b r o m i d e c e l l s t a i n i n g a l l o w e d t h e r e s e a r c h e r s v i s u a l i s ed i s t r i b u t i o n c e l l s a t d i f f e r e n t s t a g e s g r o w t h w i t h i nm a c r o p o r o u s m i c r o c a r r i e r s . T h e y f o u n d t h a t c e l l s i n i t i a l l y o n l ya t t a c h t o t h e e x t e r n a l s u r f a c e w i t h i n t h e e x t e r n a l c a v i t i e s

m a c r o p o r o u s m i c r o c a r r i e r s . S u b s e q u e n t l y , t h e r e s l o wm i g r a t i o n c e l l s t o w a r d i n t e r i o r t h e b e a d s . C o n f o c a lm i c r o s c o p y r e v e a l e d t h a t p e n e t r a t i o n g r o w t h c e l l s

w i t h i n o u t e r h a l f t h e r a d i u s m i c r o c a r r i e r sa c c o u n t e d s u r f a c e u t i l i s a t i o n e f f i c i e n c y w h e r e a s

c e n t r a l c o r e , c o m p r i s i n g i n n e r h a l f r a d i u s s p h e r i c a lp a r t i c l e s , c o n t r i b u t e d o n l y t o t a l a v a i l a b l e v o i df r a c t i o n .

B a n c e l u s e d c o n f o c a l l a s e r s c a n n i n g m i c r o s c o p ye x a m i n e d i s t r i b u t i o n v i a b l e h y b r i d o m a c e l l s w i t h i n

m a c r o p o r o u s m i c r o c a r r i e r s . C o n f o c a l m i c r o s c o p y u s e da v o i d t h e p o t e n t i a l a r t i f a c t s t h a t b e g e n e r a t e d u s i n gp h y s i c a l s e c t i o n i n g . A c a t i o n i c f l u o r e s c e n t v i t a l s t a i n ( d i a l k y li n d o c a r b o c y a n i n e ) u s e d h y b r i d o m a c e l l s

s e c o n d s t a i n ( f l u o r e s c e i n i s o t h i o c y a n a t e ) w i t h d i f f e r e n te m i s s i o n w a v e l e n g t h u s e d r e n d e r m i c r o c a r r i e r s

u n i f o r m l y f l u o r e s c e n t . c o n f o c a l m i c r o s c o p e a l l o w e dr e s e a r c h e r s t a k e s e r i a l o p t i c a l s e c t i o n s i m m o b i l i s e dc e l l s c a r r i e r a n o n i n v a s i v e m a n n e r w i t hm a i n t e n a n c e c e l l v i a b i l i t y . T h e i r r e s u l t s s h o w e d t h a t t h ei n i t i a l s p a t i a l d i s t r i b u t i o n c e l l s w i t h i n t h e c a r r i e r a f f e c t sk i n e t i c s c e l l g r o w t h m a x i m u m b i o m a s s l o a d i n gp o s s i b l e . T h e s e f a c t o r s w i l l h a v e s i g n i f i c a n t e f f e c ti m m o b i l i s e d c e l l b i o r e a c t o r p e r f o r m a n c e .

M a s s T r a n s f e r C h a r a c t e r i s t i c s I m m o b i l i s e d C e l l sC h a n g e s k i n e t i c b e h a v i o u r y e a s t c e l l s u p o n

i m m o b i l i s a t i o n a t t r i b u t e d t o e i t h e r a l t e r a t i o np h y s i o l o g i c a l / m e t a b o l i c p r o p e r t i e s c e l l s , a l t e r a t i o n

l o c a l m i c r o e n v i r o n m e n t i m m e d i a t e v i c i n i t yi m m o b i l i s e d c e l l s . s e c o n d c a s e , m i c r o e n v i r o n m e n t

d e s c r i b e d t e r m s s o l u t e p a r t i t i o n i n g e f f e c t s b e t w e e nb u l k l i q u i d p h a s e s o l i d i m m o b i l i s a t i o n m a t r i x ,

e x t e r n a l f i l m m a s s t r a n s f e r r e s i s t a n c e i n t e r n a l m a s s t r a n s f e rr e s i s t a n c e 9 1 . T h e s e t e r m s q u a n t i f i e d s o l u t e p a r t i

t i o n i n g c o e f f i c i e n t ( K p ) , l i q u i d f i l m m a s s t r a n s f e r c o e f f i c i e n t( K l ) , e f f e c t i v e s o l u t e d i f f u s i v i t y w i t h i n t h e i m m o b i l i s a

t i o n m a t r i x ( D e ) r e s p e c t i v e l y . a b o v e p a r a m e t e r s n e e dq u a n t i f i e d o r d e r d e t e r m i n e o v e r a l l e f f e c t i v e n e s s f a c t o r s .

F i g u r e 3 s c h e m a t i c t r a n s f e r s u b s t r a t e f r o mb u l k m e d i u m e n t r a p p e d y e a s t c e l l . S u b s t r a t e m u s t t r a v e lt h r o u g h b u l k m e d i u m d i f f u s i o n c o n v e c t i o n , t h r o u g h

t h e e x t e r n a l l i q u i d f i l m s u r r o u n d i n g b e a d c o n t a i n i n gi m m o b i l i s e d c e l l s , t h r o u g h l i q u i d - s o l i d i n t e r f a c e , t h r o u g h

l i q u i d w i t h i n s o l i d g e l p h a s e d i f f u s i o n , t h r o u g hr e s i s t a n c e c a u s e d m i c r o c o l o n y f o r m a t i o n , f i n a l l y i n t o

D U L K U G U t OP H A S E

F i g . S c h e m a t i c o f t r a n s f e r s u b s t r a t e f r o m b u l k m e d i u me n t r a p p e d y e a s t c e l l .

t h e y e a s t c e l l w h e r e t h e r e a c t i o n s t a k e p l a c e . M a s s t r a n s f e ro c c u r s d i f f u s i o n o n l y w i t h i n c l o s e t o s o l i d m a t r i xp h a s e w h e r e a s , b u l k l i q u i d p h a s e , t r a n s f e r o c c u r s b y b o t h

d i f f u s i o n c o n v e c t i o n , l e a d i n g t o c o n c e n t r a t i o n g r a d i e n t sb e t w e e n p h a s e s .

" E f f e c t i v e n e s s f a c t o r " d e f i n e d a s t h e r a t i o b e t w e e no b s e r v e d r e a c t i o n r a t e r a t e r e a c t i o n a b s e n c e

m a s s t r a n s f e r r e s i s t a n c e . I f e f f e c t i v e n e s s f a c t o r l e s s t h a no n e , s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n s u r f a c e w i t h i nm a t r i x l o w e r t h a n c o n c e n t r a t i o n b u l k p h a s e .T h i e l e M o d u l u s d e f i n e d a s r a t i o b e t w e e nr e a c t i o n r a t e i n t e r n a l d i f f u s i o n r a t e r a t e t h a ts u b s t r a t e c o n s u m e d r e l a t i v e r a t e w h i c h s u p p l i e d

d i f f u s i o n p r o c e s s . o t h e r w o r d s , a h i g h T h i e l e M o d u l u si n d i c a t e s t h a t s y s t e m m a s s t r a n s f e r l i m i t e d w h e r e a sl o w e r n u m b e r i n d i c a t e s t h a t t h e s y s t e m k i n e t i c a l l y c o n t r o l l e d .

A T h i e l e M o d u l u s l e s s t h a n d e s i r a b l e m i n i m i s es u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n g r a d i e n t s . m o r e d e t a i l e d

c u s s i o n s m a s s t r a n s f e r i m m o b i l i s e d c e l l s y s t e m s ,p r e h e n s i v e r e v i e w s p r e s e n t e d K a r e l a l . i $ , m o r e

r e c e n t l y W e s t r i n A x e l s s o n 1 2 8 .s t u d y t h e t r a n s f e r o x y g e n b e e r f e r m e n t a t i o n

u s i n g i m m o b i l i s e d y e a s t c e l l s e s p e c i a l l y i m p o r t a n t , s i n c el a c k o f o x y g e n m a s s t r a n s f e r l i m i t a t i o n s f o r c e y e a s tc e l l s s w i t c h f r o m a e r o b i c a n a e r o b i c m e t a b o l i s m , s i g n if i c a n t l y a l t e r i n g p r o d u c t i o n b e e r f l a v o u r c o m p o u n d s .I n t e r n a l m a s s t r a n s f e r c h a r a c t e r i s t i c s

I n t e r n a l m a s s t r a n s f e r i n v o l v e s t r a n s f e r s u b s t r a t e sp r o d u c t s w i t h i n t h e c a r r i e r s o l i d p h a s e 1 0 0 , w h i c h e s p e c i a l l yr e l e v a n t e n t r a p p e d c e l l s y s t e m s . e f f e c t i v e s o l u t ed i f f u s i v i t y , u s e d t o q u a n t i f y i n t e r n a l m a s s t r a n s f e r r a t e s .

R e s e a r c h e r s h a v e f o u n d t h a t t h e c e l l m a s s m a i n l y c o n f i n e db i o l a y e r p e r i p h e r y o f e n t r a p m e n t m a t r i c e s

l a c k s u b s t r a t e t h e c e n t r e b e a d s . T h i s o c c u r s b e c a u s es u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n g r a d i e n t s a r e f o r m e d , w h e r e e a c h p o i n t

a c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e r e f l e c t s l o c a l e q u i l i b r i u m b e t w e e ns u p p l y c o n s u m p t i o n 6 8 . I n t e r n a l m a s s t r a n s f e ro p t i m i s e d a d j u s t i n g t h e i m m o b i l i s a t i o n m a t r i x s i z e , t e x t u r e

p o r o s i t y . D e c r e a s i n g b e a d d i a m e t e r g o o dm a x i m i s e i n t e r n a l m a s s t r a n s f e r . A b a l a n c e m u s t m a d e

t h a t b e a d s l a r g e e n o u g h e a s y s e p a r a t i o n f r o m b u l kp h a s e s m a l l e n o u g h m a x i m i s e m a s s t r a n s f e r . O x y g e n

e s s e n t i a l s u b s t r a t e y e a s t c e l l g r o w t h , o n l yr e q u i r e d i n r e l a t i v e l y s m a l l q u a n t i t i e s b r e w e r y f e r m e n t a t i o n s .

T h e r e f o r e o x y g e n a v a i l a b i l i t y o f t e n l i m i t e d m a s s t r a n s f e rr e s t r i c t i o n s c a u s e d o n l y m a t r i x i t s e l f , a l s oy e a s t c e l l s t h e m s e l v e s h i g h l y c o l o n i s e d b e a d s .

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8/22/2019 Como Inmovilizar Celulas

9/13

V o l . 1 0 4 , 1 9 9 8 ] F U N D A M E N T A L S I M M O B I L I S E D Y E A S T C E L L S B E E R C O N T I N U O U S F E R M E N T A T I O N

f ( r , t ) f ( t )

t B U L KL I Q U I DP H A S EF i g . S p h e r i c a l c o o r d i n a t e s y s t e m d i f f u s i o n r e a c t i o n

s o l u t e f o r s p h e r e i m m e r s e d f i n i t e l i q u i d v o l u m e .

A s p h e r i c a l c o o r d i n a t e s y s t e m u s e d d e s c r i b e d i f f u s i o nr e a c t i o n s p h e r i c a l s h e l l t h i c k n e s s " d r " s i n g l e

s p h e r i c a l c a r r i e r p a r t i c l e d e p i c t e d F i g u r e E f f e c t i v ed i f f u s i v i t y , d e f i n e d F i c k ' s l a w :

J = - D c a C s / d rw h e r e f l u x u n i t m a t r i x a r e a , a m o u n t

s o l u t e u n i t l i q u i d v o l u m e p h a s e , r a d i a lc o o r d i n a t e s p h e r e 1 0 5 .

M e t h o d s d e t e c t i o n i n t e r n a l m a s s t r a n s f e r c h a r a c t e r i s t i c sM i c r o e l e c t r o d e s

M i c r o e l e c t r o d e s a l l o w m e a s u r e m e n t c o n c e nt r a t i o n s d i r e c t l y i n s i d e b i o f i l m s . B e i n g a b l e t o t h i s

i m p o r t a n t b e c a u s e d i f f u s i o n g r a d i e n t s w i t h i n b i o f i l m s w i l li n f l u e n c e t h e i r i n t e r n a l s t r u c t u r e . y e a s t c e l l s e n t r a p p e dw i t h i n c a l c i u m a l g i n a t e o r c a r r a g e e n a n g e l s , m e a s u r e m e n t

s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s u s i n g m i c r o e l e c t r o d e sp r o v i d e s a d i r e c t m e t h o d c h a r a c t e r i s i n g m i c r o -

e n v i r o n m e n t c e l l s i n s i d e t h e m a t r i x . M i c r o e l e c t r o d e s h a v eb e e n d e v e l o p e d o x y g e n , c a p a c i t a n c e , a m m o n i a ,g l u c o s e a m o n g o t h e r s 2 1 - 4 5 - 5 8 - 9 5 1 2 1 1 2 5 . u s e f u l f o r t h e s t u d y

d i f f u s i o n p r o p e r t i e s c o m p o n e n t s w i t h i n i m m o b i l i s a t i o nm a t r i c e s , t h e m i c r o e l e c t r o d e s h o u l d l e s s t h a nd i a m e t e r t h a t p e n e t r a t e s t h e b i o c a t a l y s t w i t h o u t p h y s i c a l l yc h a n g i n g c o n f i g u r a t i o n 6 8 . R e s p o n s e t i m e e l e c t r o d ea l s o i m p o r t a n t , e s p e c i a l l y d y n a m i c p r o c e s s e s u s i n g

m o b i l i s e d f l o c c u l a t i n g c e l l s . A r e s p o n s e t i m e s e c o n d sd e s i r a b l e f o r t h e s e t y p e s s y s t e m s e l e c t r o d e t h i s

t y p e e x t r e m e l y f r a g i l e h a s a s h o r t u s e f u l l i f e t h e r e f o r es u i t a b l e r o u t i n e u s e 1 5 .

S o m e d i f f i c u l t i e s e n c o u n t e r e d w h e n u s i n g m i c r oe l e c t r o d e s s i n c e m e a s u r e m e n t s i n f l u e n c e d c a l i b r a t i o n

c o n d i t i o n s , o t h e r m e t a b o l i t e s , m e c h a n i c a l r e s i s t a n c ep r o p e r t i e s t h e m a t r i x , p u n c t u r e t e c h n i q u e . l a t t e rp o i n t r e f e r s t o t h e m e t h o d i n s e r t i o n t h e m i c r o e l e c t r o d e

i n t o b i o c a t a l y s t b e a d . S i g n a l a r t i f a c t s o c c u r t o t h es u d d e n b r e a k t h r o u g h o f t h e e l e c t r o d e t h r o u g h c o m p r e s s e dm a t e r i a l s u c h i m m o b i l i s a t i o n m a t r i x 9 5 . F l o w c o n d i t i o n s

r e a c t o r t h e f l o w c h a m b e r w h e r e m e a s u r e m e n t sp e r f o r m e d m u s t k e p t s a m e a c c u r a t e r e a d i n g s .a l s o d i f f i c u l t d e t e r m i n e e x a c t p o s i t i o n m i c r o -

e l e c t r o d e v i s u a l l y t h u s s p a t i a l r e s o l u t i o n i n s u f f i c i e n t ,e s p e c i a l l y s i n c e i m m o b i l i s e d c e l l m a t r i c e s t e n d h a v e l a r g e

s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n g r a d i e n t s 9 5 .

U n s t e a d y S t a t e T e c h n i q u e M e a s u r i n gS o l u t e D i f f u s i v i t i e s

M e r c h a n t a / . 9 1 d e v e l o p e d u n s t e a d y s t a t e t e c h n i q u em e a s u r i n g e f f e c t i v e s o l u t e d i f f u s i v i t i e s w i t h i n a n e n t r a p m e n t

m a t r i x u s e d w h o l e - c e l l i m m o b i l i s a t i o n . T h i s m e t h o da d v a n t a g e s o v e r o t h e r m e t h o d s t h a t d o e s r e l ym e c h a n i c a l s t a b i l i t y g e o m e t r y e n t r a p m e n t m a t r i x ,

c a r r i e d r e l a t i v e l y q u i c k l y 9 1 .f o l l o w i n g a s s u m p t i o n s w e r e m a d e o r d e r d e r i v e t h ee q u a t i o n s n e e d e d d e t e r m i n e s o l u t e d i f f u s i v i t i e s :

d i f f u s i o n s o l u t e o c c u r s r a d i a l l y o u t w a r d t h e r ec o n c e n t r a t i o n v a r i a t i o n w i t h a n g u l a r p o s i t i o n ;

t h e p h y s i c a l p r o p e r t i e s s p h e r e c o n s t a n t ;t h e r e n e g l i g i b l e e x t e r n a l f i l m m a s s t r a n s f e r r e s i s t a n c e ;

t i m e , t = 0 , t h e s o l u t e u n i f o r m l y d i s t r i b u t e d t h r o u g h o u ts p h e r e .

U s i n g t h e s p h e r i c a l c o o r d i n a t e s y s t e m s h o w n F i g u r em a s s b a l a n c e f o r u n s t e a d y - s t a t e d i f f u s i o n s o l u t e d e s c r i b e d

t h e f o l l o w i n g e q u a t i o n :d t = D e [ ( a 2 C s d r 2 ) + ( 2 3 C s r a r ) ]

s o l v e t h i s e q u a t i o n , i n i t i a l b o u n d a r y c o n d i t i o n sn e e d e d . T h e r e f o r e , s p h e r e c o n t a i n i n g s o l u t e i m m e r s e d

f i n i t e l i q u i d v o l u m e i n i t i a l l y f r e e s o l u t e , i n i t i a lb o u n d a r y c o n d i t i o n s l i s t e d b e l o w .

t = 0 ,t = o ,t > 0 ,t > 0 ,

0 < r < R ,r > R ,r = 0 ,r = R ,

C s = c o n s t a n tC L = 0

( r = 0v L ( a c L / a t ) =

K P A s D e ( a C s / a r ) | r = R

I . C . II . C .B . C .

B . C .m o n i t o r i n g c h a n g e c o n c e n t r a t i o n s o l u t e

l i q u i d p h a s e a s s o l u t e d i f f u s e s s p h e r e , s o l v i n ga b o v e e q u a t i o n u s i n g a f o r e m e n t i o n e d c o n d i t i o n s ,

e v a l u a t e D . R a d i o t r a c e r t e c h n i q u e s u s e d f o l l o wc h a n g e s o l u t e c o n c e n t r a t i o n s i n c e t h e m e t h o d r e q u i r e s

v e r y s m a l l l i q u i d v o l u m e s .O t h e r r e s e a r c h e r s 3 4 h a v e m e a s u r e d e f f e c t i v e s o l u t e d i f f u s i

v i t i e s u s i n g a s i m i l a r m e t h o d e x c e p t t h a t b e a d s p l a c e db u f f e r e d a q u e o u s s o l u t i o n w e l l - s t i r r e d t a n k .

d i f f u s i o n g i v e n s o l u t e i n t o o r o u t b e a d sm e a s u r e d b y m o n i t o r i n g c o n c e n t r a t i o n b u l k l i q u i dp h a s e . H i g h l e v e l s a g i t i t a t i o n a r e r e q u i r e d a v o i d e x t e r n a l

m a s s t r a n s f e r r e s i s t a n c e a t b e a d s u r f a c e . T h i s m e t h o dr e l a t i v e l y s i m p l e g a t h e r d a t a c a l c u l a t i o n

e f f e c t i v e s o l u t e d i f f u s i v i t i e s i m m o b i l i s e d c e l l s y s t e m s .O y a a s a l . m a l s o u s e d m u l t i p l e b e a d m e t h o d t o c a l c u

l a t e e f f e c t i v e d i f f u s i v i t i e s s e l e c t e d s i m p l e s u g a r s o r g a n i ca c i d s c a l c i u m a l g i n a t e g e l s w i t h w i t h o u t e n t r a p p e dL a c t o b a c i l l u s h e l v e t i c u s b a c t e r i a . m a t h e m a t i c a l m o d e l u s e da l l o w e d t h e c a l c u l a t i o n e f f e c t i v e d i f f u s i v i t i e sa c c o u n t e d s o l u t i o n s a m p l i n g e x t e r n a l f i l m r e s i s t a n c e .

T h e i r e x p e r i m e n t s s h o w e d t h a t l o w e r p H ( 4 . 5 6 . 5 ) ,h i g h e r a l g i