bacilus subtilis strain

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  • 8/8/2019 Bacilus Subtilis Strain

    1/11

    V o l . 1 7 1 . N o . 7O U R N A L OF B A C T E R I O L O G Y , J U I Y 1 9 8 9 , p . 3 6 5 6 - 3 6 6 60 0 2 1 - 9 1 9 3 / 8 9 / 0 7 3 6 5 6 - 1 1 $ 0 2 . 0 0 / 0C o p y r i g h t t 1 9 8 9 , A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y

    G e n e t i c A n a l y s i s o f t h e P r o m o t e r R e g i o n o f t h e B a c i l l u s s u b t i l i so x - A m y l a s e G e n e tMICHAEL J . WEICKERT' AND GLENN H . CHAMBLISS2*

    L a b o r a t o r y o f G e n e t i c s ' and D e p a r t m e n t o f B ac t e r i o l o g y , 2 U n i v e r s i t y of W i s c o n s i n , Madison, Wisconsin 53706R e c e i v e d 5 D e c e m b e r 1 9 8 8 / A c c e p t e d 6 A p r i l 1 9 8 9

    T h e amyR2 a l l e l e o f t h e B a c i l l u s s u b t i l i s o x - a m y l a s e c i s - r e g u l a t o r y r e g i o n e n h a n c e s p r o d u c t i o n o f a m y l a s e a n dt r a n s c r i p t i o n o f a m y E , t h e s t r u c t u r a l gene, b y t w o - t o t h r e e f o l d over a m y R i . Th e a m y l a s e g e n e b e a r i n g e a c ho f t h e s e a l l e l e s was c l o n e d on p l a s m i d s o f a b o u t 1 0 t o 1 5 c o p i e s pe r c h r o m o s o m e . T r a n s c r i p t i o n o f t he c l o n e da m y l a s e g e n e b y e a c h a myR a l l e l e wa s a c t i v a t e d a t t h e e n d o f e x p o n e n t i a l g r o w t h a n d was s u b j e c t t o c a t a b o l i t er e p r e s s i o n b y g l u c o s e . T h e amount o f a m y l a s e p r o d u c e d was r o u g h l y p r o p o r t i o n a l t o t h e copy number o f t h ep l a s m i d , a n d c e l l s c on t ai n i n g t h e a m y R 2 - b e a r i n g p l a s m i d , p A R 2 , p r o d u c e d t w o - t o t h r e e f o l d more a m y l a s et h a n c e l l s w i t h t h e a m y R i p l a s m i d , pAMY10. D e l e t i o n o f DNA 5 ' t o t h e o t - a m y l a s e p r o m o t e r , i n c l u d i n g d e l e t i o no f t h e A + T - r i c h i n v e r t e d r e p e a t f o u n d i n a m y R 1 a n d a m y R 2 , h a d n o e f f e c t on e x p r e s s i o n or t r a n s c r i p t i o n o fa - a m y l a s e . D e l e t i o n o f DNA 3 ' t o t h e a m y R I p r o m o t e r d i d n o t i m p ai r t e m p or a l a c t i v a t i o n o f c h l o r a m p h e n i c o la c e t y l t r a n s f e r a s e i n a m y R l - c a t - 8 6 t r a n s c r i p t i o n a l f u s i o n s , b u t c a t a b o l i t e r e p r e s s i o n was a b o l i s h e d . When a n8 - b a s e - p a i r l i n k e r was i n s e r t e d i n pAMY10 a t t h e same s i t e f r o m w h i c h t h e 3 ' d e l e t i o n was m a d e , a m y l a s ee x p r e s s i o n d o u b l e d a n d wa s r e p r e s s e d l e s s b y g l u c o s e . B o t h t h e d e l e t i o n and t h e i n s e r t i o n d i s r u p t e d f o u r b a s e sa t t h e 3 ' e n d o f t h e p u t a t i v e a m y l a s e o p e r a t o r r e g i o n . S i t e - d i r e c t e d m u t a g e n e s i s wa s u s e d t o c h a n g e b a s e s i n t h ep r o m o t e r - o p e r a t o r r e g i o n o f a m y R l t o t h e i r amyR2 c o u n t e r p a r t s . E i t h e r c h a n g e a l o n e i n c r e a s e d a m y l a s ep r o d u c t i o n t w o f o l d , b u t o n l y t h e c h a n g e a t + 7 , n e x t t o t h e l i n k e r i n s e r t i o n o f 3 ' d e l e t i o n s i t e , y i e l d e d t h ei n c r e a s e d a m y l a s e a c t i v i t y i n t h e presence o f g l u c o s e t h a t i s c h a r a c t e r i s t i c o f t h e amyR2 s t r a i n . T h e d o u b l emutant b e h a v e d m o s t l i k e s t r a i n s c a r r y i n g t h e amyR2 a l l e l e .

    T h e e x p r e s s i o n o f B a c i l l u s s u b t i l i s o t - a m y l a s e i n v o l v e sa c t i v a t i o n o f s y n t h e s i s a t t h e e n d o f e x p o n e n t i a l g r o w t h ( 3 0 )a n d r e p r e s s i o n b y e a s i l y m e t a b o l i z e d c a r b o n s o u r c e s ( 1 1 , 3 6 ;o u r u n p u b l i s h e d r e s u l t s ) . T h i s r e s e m b l e s r e g u l a t i o n o f t h es p o r u l a t i o n p r o c e s s ( f o r a r e v i e w , s e e r e f e r e n c e 2 0 ) . T h ec a t a b o l i t e c o n t r o l m e c h a n i s m s g o v e r n i n g a - a m y l a s e s y n t h e -s i s a n d s p o r u l a t i o n d i f f e r a t l e a s t p a r t i a l l y ( 2 7 ) , b u t t h em e c h a n i s m f o r t e m p o r a l a c t i v a t i o n may b e t h e s a m e .T h e B . s u b t i l i s a - a m y l a s e g e n e , a m y E , i s r e g u l a t e d b y t h ec i s - a c t i n g r e g i o n a m y R ( 4 4 , 4 9 ) . T h e r e a r e a t l e a s t t h r e ea l l e l e s o f t h e a m yR l o c u s : a m y R i ( f r o m B . s u b t i l i s 1 6 8 ) ,amyR2 ( f r o m B . s u b t i l i s s u b s p . n a t t o ) , a n d amyR3 ( f r o m B .s u b t i l i s s u b s p . a m y l o s a c c h a r i t i c u s ) ( 4 8 ) . amyR2 a n d amyR3a r e a m y l a s e - h y p e r p r o d u c i n g a l l e l e s o f a m y R I ( 4 4 , 4 8 , 4 9 ) .amyRI a n d amyR2 h a v e b e e n c l o n e d a n d s e q u e n c e d ( 4 5 , 4 6 ) .R e g u l a t i o n o f amyRI a n d amyR2 o c c u r s a t t h e l e v e l o ft r a n s c r i p t i o n . S 1 n u c l e a s e m a p p i n g s h o w e d t h a t t r a n s c r i p -t i o n i n i t i a t e s a t a s i t e 8 b a s e p a i r s ( b p ) d o w n s t r e a m o f as e q u e n c e 50% h o m o l o g o u s t o t h e p r o m o t e r c o ns e n s u s r e c -o g n i z e d b y E u A ( U ( 4 3 ) RNA p o l y m e r a s e . T h i s p r o m o t e r w a sa l s o u s e d i n v i t r o b y p u r i f i e d B . s u b t i l i s E u A RNA p o l y m e r -a s e i n r u n o f f t r a n s c r i p t i o n e x p e r i m e n t s w i t h e i t h e r a m y R i o ramyR2 DNA ( 2 9 ) .I n s t r a i n s c o n t a i n i n g e i t h e r o f t h e s e a l l e l e s , a m yE mRNAr a p i d l y a c c u m u l a t e d a f t e r t h e o n s e t o f s t a t i o n a r y p h a s e , b u tw a s r e p r e s s e d when c e l l s w e r e g r o w n i n t h e p r e s e n c e o fg l u c o s e ( 4 , 2 9 ) . T h e s e q u e n c e s f o r amyRI a n d a m y R 2 h a v eo n l y t w o b a s e d i f f e r e n c e s i n t h e p r o m o t e r r e g i o n b u t a r es t r i k i n g l y d i f f e r e n t 5 ' t o t h e p r o m o t e r . T h e amyR2 s e q u e n c ec o n t a i n s a 4 9 - b a s e i n v e r t e d r e p e a t i n t h e A + T - r i c h u p s t r e a mr e g i o n . T h i s h a s a p o t e n t i a l f r e e e n e r g y f o r RNA s e c o n d a r y* C o r r e s p o n d i n g a u t h o r .t P a p e r n o . 3 0 3 1 f r o m t h e L a b o r a t o r y o f G e n e t i c s , U n i v e r s i t y o fW i s c o n s i n - M a d i s o n .

    s t r u c t u r e o f - 1 5 . 4 k c a l / m o l , more t h a n t w i ce t h e p o t e n t i a lf r e e e n e r g y ( - 7 . 3 k c a l / m o l ) o f t h e 2 9 - b a s e A + T - r i c h i n -v e r t e d r e p e a t s e q u e n c e f o u n d i n a m y R I . I t h a s b e e n s u g -g e s t e d t h a t t h e a m y R 2 i n v e r t e d r e p e a t i s r e s p o n s i b l e f o r t h eh y p e r p r o d u c t i o n p h e n o t y p e ( 4 5 ) . D el e t i o n o f t h i s u p s t r e a mp a l i n d r o m i c s e q u e n c e i n a n a m y R 2 - b l a f u s i o n s t r a i n wasr e p o r t e d t o c a u s e l o w e r 1 - l a c t a m a s e p r o d u c t i o n a n d r e d u c e dg l u c o s e c a t a b o l i t e r e p r e s s i o n ( 3 9 ) .T h e B . a m y l o l i q u e f a c i e n s Q - a m y l a s e r e g u l a t o r y r e g i o nc o n t a i n s a 4 3 - b a s e A + T - r i c h i n v e r t e d r e p e a t u p s t r e a m o f au A - t y p e p r o m o t e r ( 1 6 ) . D e l e t i o n o f t h e p a l i n d r o m i c s e q u e n c eh a d n o e f f e c t o n o x - a m y l a s e r e g u l a t i o n w h e n c l o n e d i n B .s u b t i l i s ( 1 6 ) . I n s t e a d , t h e i n v e r t e d r e p e a t f u n c t i o n e d a s at r a n s c r i p t i o n t e r m i n a t i o n s i g n a l f o r a 2 . 2 - k i l o b a s e ( k b ) o p -e r o n l o c a t e d u p s t r e a m o f t h e c x - a m y l a s e g e n e ( 1 7 ) .I n t h i s c o m m u n i c a t i o n , we d e m o n s t r a t e t h a t t h e i n v e r t e dr e p e a t i n b o t h a m y R I a n d amyR2 i s d i s p e n s a b l e f o r o t -a m y l a s e r e g u l a t i o n i n B . s i u b t i l i s . A d d i t i o n a l l y , d e l e t i o n o fs e q u e n c e s 3 ' t o t h e p r o m o t e r i n a m y R I - c a t - 8 6 t r a n s c r i p t i o nf u s i o n s e l i m i n a t e d c a t a b o l i t e r e p r e s s i o n o f c h l o r a m p h e n i c o la c e t y l t r a n s f e r a s e ( C A T ) b u t h a d n o e f f e c t o n t e m p o r a l a c t i -v a t i o n a t t h e o n s e t o f s t a t i o n a r y p h a s e . T h e t w o b a s ed i f f e r e n c e s b e t w e e n amyRI a n d amyR2 i m m e d i a t e l y 3 ' t o

    t h e p r o m o t e r a r e s h o w n t o c o n t r i b u t e t o t h e h y p e r p r o d u c -t i o n , a n d o n e o f t h e m , a t + 7 , i s r e s p o n s i b l e f o r t h e w e a k e rc a t a b o l i t e r e p r e s s i o n t h a t c h a r a c t e r i z e s a m y R 2 - d i r e c t e da m y l a s e p r o d u c t i o n .MATERIALS AND METHODS

    B a c t e r i a l s t r a i n s , p l a s m i d s , a n d g r o w t h c o n d i t i o n s . T h e B .s i u b t i l i s a n d E s c h e r i c h i a c o l i s t r a i n s a n d p l a s m i d s u s e d i n t h i ss t u d y a r e l i s t e d i n T a b l e 1 . B . s u b t i l i s s t r a i n s w e r e g r o w n i nNSM ( n u t r i e n t s p o r u l a t i o n medium [ 3 5 ] ) f o r s p o r u l a t i o n a n da m y l a s e a s s a y s , A3 medium ( a n t i b i o t i c medium n o . 3 ; D i f c oL a b o r a t o r i e s , D e t r o i t , M i c h . ) f o r p l a s m i d i s o l a t i o n , o r PBAB3 6 5 6

  • 8/8/2019 Bacilus Subtilis Strain

    2/11

    B . SUBTILIS AMYLASE GENE PROMOTER 3 6 5 7TABLE 1 . B a c t e r i a l s t r a i n s a n d p l as m i d s u s e d i n t h i s s t u d y

    S t r a i n o r G e n o t y p e o r S o u r c e o rp l a s m i d p h e n o t y p e r e f e r e n c eB . s u i b t i l i s

    1 6 8BREWLN-4WLN-15

    E . c o l iJM83JM109

    TG1

    P l a s m i d spAMY10pEATUlWl5pAR2pARI7pARIEpAR2EpARlOSp A R 1 0 8p A R 2 0 2p A R 2 1 1 0pGEM-3Zf(-)pGEM-3Zf(+)pGEMRIpGEMR108pGEMR11Op P L 6 0 3 Bp 5 ' c x B l Op 5 ' o t G R 1 0pPLR18pUC18pMWRlpMWR2pMWR2EpGEMRlFpGEMRlM1pGEMRlM2pGEMRlM3pARlMlpARlM2pARlM3pARED

    t r p C 2t r p C 2 r e c E 4 l v s - 3 anvRl +amnvE

    sa c A 3 2 1 a m y R IsacA321 a m l 1 y R 2ara ' \ ( l a c - p r o A B ) r p s L t h i4 8 0 l a c Z A M 1 5re c A l e n d A l g y r A 9 6 t l h ih s d R 1 7 s u p E 4 4 re l A IA ( l a c - p r o A B ) ( F t r a D 3 6proA+B+ l a c ( ql a c Z A M 1 5 )K 1 2 , A ( l a c - p r o A B ) supE t h ih s d D 5 ( F t r a D 3 6proA +B l a c l ql a c Z A N M 1 5 )Cm " a m y R l - a m v E +Em r amrvR2-amnvECm r a i n y R 2 - a i m y E 'Cmr amy E +Cm " amyE+Cm " amvE+Cm " a m y v ECmr a i n y E +Cm r a m n y E +Cm" a m y E +A p r l a c Z +A p r l a - c Z +A p r a m y R I l a c ZA p r jamyRl l a c ZA p r A a m v R J l a c 1 ZKm r p r o m o t e r l e s s c a t - 8 6Km " a m y R l - c a t - 8 6Km r g r a - 1 0 - c a t - 8 6Km r A a m y ' R J - c a t - 8 6A p r l a c Z +Ap r amyRl I l a c ZA p r a m y R 2 l a c ZA p r AamyR2 l a c ZA p r a m y R I l a c ZA p r amyRIMI l a c ZA p r amyR/M2 l a c ZA p r amvRlM3 l a c ZCm" am yRIMI amyE+Cm r amyRJM2 amyE+Cm " ainyRIM3 amyE+Cm r i A a m y R J a m y E

    L a b o r a t o r y s t o c kL a b o r a t o r y s t o c k2 92 64 74 7

    Amersham C o r p .

    D . H e n n e r ( 2 , 4 6 )( F i g . 1 )2 6 ( F i g . 1 )T h i s s t u d y ( F i g . 1 )T h i s s t u d yT h i s s t u d yT h i s s t u d y ( F i g . 4 )T h i s s t u d y ( F i g . 4 )T h i s s t u d y ( F i g . 4 )T h i s s t u d y ( F i g . 4 )T h i s s t u d y ( F i g . 4 )P r o m e g aP r o m e g a ( F i g . 9 )T h i s s t u d yT h i s s t u d yT h i s s t u d yD . R o t h s t e i n ( 4 3 )2 5 ( F i g . 7 )2 5 ( F i g . 7 )T h i s s t u d y ( F i g . 7 )4 72 9T h i s s t u d yT h i s s t u d yT h i s s t u d y ( F i g . 9 )T h i s s t u d y ( F i g . 9 )T h i s s t u d y ( F i g . 9 )T h i s s t u d y ( F i g . 9 )T h i s s t u d y ( F i g . 9 )T h i s s t u d y ( F i g . 9 )T h i s s t u d y ( F i g . 9 )T h i s s t u d y ( F i g . 9 )

    ( p e p t o n e b l o o d a g a r b a s e ; GIBCO L a b o r a t o r i e s , G r a n dI s l a n d , N . Y . ) f o r p l a t i n g t r a n s f o r m a n t s . E . c o l i c u l t u r e s weregrown i n LB medium ( L u r i a - B e r t a n i medium [ 2 2 ] ) . L i q u i dc u l t u r e s were a e r a t e d b y v i g o r o u s s h a k i n g a n d i n c u b a t e d a t3 7 C . G r o w t h i n l i q u i d c u l t u r e was m o n i t o r e d w i t h a K l e t t -Summerson c o l o r i m e t e r w i t h a no. 6 6 r e d f i l t e r .R e a g e n t s , e nzymes, a n d l i n k e r s . R e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e sa n d o t h e r D N A - m o d i f y i n g enzymes were p u r c h a s e d f r o mP r o m e g a B i o t e c h ( M a d i s o n , W i s . ) e x c e p t f o r mung b e a nn u c l e a s e , w h i c h was a g i f t f r o m E p i c e n t r e T e c h n o l o g i e s( M a d i s o n , W i s . ) . A l l enzymes a n d r e a g e n t s were u s e d ac -c o r d i n g t o t h e m a n u f a c t u r e r ' s r e c o m m e n d a t i o n s . A l l chem-i c a l s a n d a n t i b i o t i c s were r e a g e n t g r a d e a n d were p u r c h a s e df r o m S i g m a C h e m i c a l C o . ( S t . L o u i s , M o . ) . L o w - m e l t i n g -

    p o i n t a g a r o s e was e l e c t r o p h o r e s i s g r a d e a n d o b t a i n e d f r o mB e t h e s d a R e s e a r c h L ab o r at o r i es , G a i t h er s b u r g , Md. D o u -b l e - s t r a n d e d p h o s p h o r y l a t e d l i n k e r s c o n t a i n i n g a H i n d l l l( 5 ' - p d [ C A A G C T T G ] - 3 ' ) o r a n EcoRI ( 5 ' - p d [ G G A A T T C C I -3 ' ) r e s t r i c t i o n s i t e w e r e p u r c h a s e d f r o m P h a r m a c i a LKBB i o t e c h n o l o g y I n c . , P i s c a t a w a y , N . J .P l a s m i d i s o l a t i o n m e t h o d s . P l a s m i d s were i s o l a t e d f r o m 1 . 5m l o f E . c o l i b r o t h c u l t u r e s b y t h e a l k a l i n e l y s i s m e t h o d ( 2 2 ) .B . s i , b t i l i s p l a s m i d DNA was i s o l a t e d f r o m 5 - m l b r o t hc u l t u r e s b y t h e r a p i d b o i l i n g m e t h o d ( 1 4 ) . L a r g e a m o u n t s o fp u r i f i e d p l a s m i d DNA w e r e p r e p a r e d b y a l k a l i n e l y s i s o f 5 0 0 -t o 1 , 0 0 0 - m l c u l t u r e s , f o l l o w e d b y C s C l - e t h i d i u m b r o m i d ed e n s i t y g r a d i e n t u l t r a c e n t r i f u g a t i o n ( 2 2 ) .C o p y number d e t e r m i n a t i o n s . P l a s m i d c o p y n u m b e r wasd e t e r m i n e d e s s e n t i a l l y a s d e s c r i b e d b y W e i s b l u m e t a l . ( 4 2 ) .B . s u i b t i l i s p l a s m i d - c o n t a i n i n g s t r a i n s w e r e g r o w n i n NSMw i t h 5 0 , 0 0 0 cpm o f [ m e t h v l - 3 H ] t h y m i d i n e a n d v i g o r o u s a e r -a t i o n . S a m p l e s ( 1 . 5 m l ) were r e m o v e d , a n d c r u d e l y s a t e sw e r e p r e p a r e d a s d e s c r i b ed b e f or e ( 4 2 ) . E t h a n o l p r e c i p i t a t e sw e r e d r i e d , s u s p e n d e d i n TE ( 2 2 ) , a n d s u b j e c t e d t o e l e c t r o -p h o r e s i s o n l o w - m e l t i n g - p o i n t ( 1 2 b y 1 0 c m ) a g a r o s e s l a b g e l sc a s t a n d r u n i n T r i s - a c e t a t e e l e c t r o p h o r e s i s b u f f e r ( 2 2 ) .A g a r o s e g e l s l i c e s c o n t a i n i n g DNA b a n d s c o r r e s p o n d i n g t op l a s m i d a n d c h r o m o s o m a l DNA w e r e s e p a r a t e d a n d m e l t e di n 1 m l o f H 2 O ; t h e n , 9 m l o f B i o S a f e s c i n t i l l a t i o n f l u i d( R e s e a r c h P r o d u c t s I n t e r n a t i o n a l C o r p . , Mount P r o s p e c t ,I l l . ) was a d d e d t o e a c h s a m p l e , a n d t h e r a d i o a c t i v i t y a s s o -c i a t e d w i t h e a c h b a n d wa s q u a n t i t a t e d b y l i q u i d s c i n t i l l a t i o nc o u n t i n g . B a c k g r o u n d c o u n t s f r o m d e g r a d e d DNA wereq u a n t i t a t e d b y p r e p a r i n g s t r a i n BRE w i t h o u t a p l a s m i d i n a ni d e n t i c a l m a n n e r . T h e c h r o m o s o m a l b a n d wa s c u t f r o m t h eg e l , a s was a p i e c e f r o m w h e r e t h e p l a s m i d w o u l d o r d i n a r i l yb e l o c a t e d i n p l a s m i d - c o n t a i n i n g s t r a i n s . T h e r a t i o o f b a c k -g r o u n d cpm t o c h r o m o s o m e cpm wa s s u b t r a c t e d f r o m r a t i o sf o r p l a s m i d - c o n t a i n i n g s t r a i n s .E x o n u c l e a s e I I I d e l e t i o n s . P l a s m i d s pAMY10 a n d pAR2w e r e l i n e a r i z e d a t t h e i r u n i q u e X b a I s i t e a n d d i g e s t e d w i t he x o n u c l e a s e I I I b y u s i n g t h e E r a s e - a - B a s e S y s t e m p u r -c h a s e d f r o m P r o m e g a . T h e r e a c t i o n s were p e r f o r m e d a sd e s c r i b e d b y t h e m a n u f a c t u r e r e x c e p t t h a t e x o n u c l e a s e I I Id i g e s t i o n wa s c a r r i e d o u t a t 3 0 C w i t h o n l y 1 0 0 t o 2 0 0 U o fe x o n u c l e a s e I I I . S a m p l e s were w i t h d r a w n e v e r y 2 0 s f o rf u r t h e r t r e a t m e n t a s r e c o m m e n d e d .P l a s m i d t r a n s f o r m a t i o n m e t h o d s . E . c o l i c e l l s were t r a n s -f o r m e d a s d e s c r i b e d b y H a n a h a n ( 1 0 ) . B . s u b t i l i s c e l l s , madec o m p e t e n t a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 2 6 ) , were t r a n s f o r m e dw i t h p l a s m i d DNA.DNA s e q u e n c i n g . P l a s m i d s e q u e n c i n g wa s p e r f o r m e d w i t ha S e q u e n a s e k i t p u r c h a s e d f r o m U n i t e d S t a t e s B i o c h e m i c a lC o r p . ( C l e v e l a n d , O h i o ) f o l l o w i n g t h e m a n u f a c t u r e r ' s i n -s t r u c t i o n s . T h e a m y R i H p a I - E c o R I f r a g m e n t , a s w e l l a s twoa m y R I d e l e t i o n H p a I - E c o R I f r a g m e n t s , were s u b c l o n e di n t o S m a l - E c o R I - c l e a v e d p G E M - 3 Z f ( - ) . T h e s e p l a s m i d s ,pGEMR1, p G E M R 1 0 8 , a n d p G E M R 1 1 0 , were s e q u e n c e d b yu s i n g t h e v e c t o r S P 6 p r i m e r a s d e s c r i b e d b y t h e m a n u f a c -t u r e r ( P r o m e g a ) . T h e a m y R 2 r e g i o n , t h e r e m a i n i n g d e l e t i o n s ,a n d t h e m u t a n t s c a r r y i n g s i t e - d i r e c t e d m u t a t i o n s were s e -q u e n c e d f r o m t h e o r i g i n a l p l a s m i d s b y u s i n g a s e q u e n c i n gp r i m e r ( 5 ' - d [ G A C A C T C C T T A T T T G A ] - 3 ' ) s y n t h e s i z e d f o ru s b y t h e U n i v e r s i t y o f W i s c o n s i n B i o t e c h n o l o g y C e n t e r( M a d i s o n , W i s . ) .T r a n s c r i p t i o n m a p p i n g . RNA wa s i s o l a t e d a s d e s c r i b e dp r e v i o u s l y ( 2 9 ) . P s t I - S i n I r e s t r i c t i o n f r a g m e n t s c o n t a i n i n gt h e a m y R l o r a m y R 2 r e g i o n were i s o l a t e d f r o m pMWR1 a n dpMWR2, r e s p e c t i v e l y . T h e s e f r a g m e n t s were l a b e l e d a sd e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 2 9 ) a n d u s e d t o i d e n t i f y a m y E - s p e c i f i c

    V O L . 1 7 1 , 1 9 8 9

  • 8/8/2019 Bacilus Subtilis Strain

    3/11

    3 6 5 8 WEICKERT AND CHAMBLISSt r a n s c r i p t s . Mung b e a n n u c l e a s e m a p p i n g w a s p e r f o r m e d a sd e s c r i b e d f o r S i n u c l e a s e m a p p i n g ( 2 9 ) w i t h s e v e r a l m o d i f i -c a t i o n s . T e n v o l u m e s o f m ung b e a n n u c l e a s e b u f f e r ( 3 0 mMs o d i u m a c e t a t e , 5 0 mM N a C l , 1 mM z i n c a c e t a t e , 5%[ v o l / v o l ] g l y c e r o l , pH 4 . 6 ) , w i t h 4 U o f m ung b e a n n u c l e a s ep e r m l , w a s a d d e d t o t h e p r o b e - R N A h y b r i d , a n d t h e m i x t u r ew a s p l a c e d o n i c e f o r 1 0 m in . T h e s a m p l e s w e r e t h e n p l a c e da t 3 7 C f o r 3 0 t o 6 0 m i n , a n d t h e r e a c t i o n was s t o p p e d b y t h ea d d i t i o n o f 1 / 8 v o l u m e o f 1 . 5 M s o d i u m a c e t a t e ( p H 7 . 5 ) . T h ep r o b e - R N A h y b r i d s w e r e p r e c i p i t a t e d b y a d d i n g 2 v o l u m e so f c o l d a b s o l u t e e t h a n o l , d r i e d , a n d t r e a t e d a s d e s c r i b e dp r e v i o u s l y ( 2 9 ) .E n z y m e a s s a y s . A s s a y s o f e x t r a c e l l u l a r o x - a m y l a s e a n di n t r a c e l l u l a r CAT a c t i v i t i e s w e r e p e r f o r m e d a s d e s c r i b e dp r e v i o u s l y ( 2 5 , 3 7 ) .S i t e - d i r e c t e d m u t a g e n e s i s . S i n g l e - s t r a n d e d DNA was i s o -l a t e d f r o m E . c o l i J M 1 0 9 o r TG1 c o n t a i n i n g pGEMRlF o rpGEMRlM2 b y u s i n g p h a g e R 4 0 8 a n d t h e m a n u f a c t u r e r ' ss u g g e s t e d p r o c e d u r e s (pGEM s i n g l e - s t r a n d s y s t e m ; P r o -m e g a ) . T h e o l i g o n u c l e o t i d e s c o n t a i n i n g t h e d e s i r e d c h a n g e sw e r e s y n t h e s i z e d f o r u s b y t h e U n i v e r s i t y o f W i s c o n s i nB i o t e c h n o l o g y C e n t e r : f o r M l , 5'-d(GTAAGCGTGAAC A A ) - 3 ' ; f o r M 2 , 5 ' - d ( G A T A A T T T A A A A T G T A ) - 3 ' . S i t e -d i r e c t e d m u t a g e n e s i s w i t h t h e s i n g l e - s t r a n d e d DNA ( s s -DNA) a n d o l i g o n u c l e o t i d e s l i s t e d a b o v e was p e r f o r m e d w i t ht h e Amersham o l i g o n u c l e o t i d e - d i r e c t e d i n v i t r o m u t a g e n e s i ss y s t e m v e r s i o n 2 k i t ( A m e r s h a m C o r p . , A r l i n g t o n H e i g h t s ,I l l . ) a c c o r d i n g t o t h e m a n u f a c t u r e r ' s i n s t r u c t i o n s . S i n c e ap h a g e m i d ( p G E M ) was b e i n g u s e d , h o w e v e r , we i s o l a t e dt r a n s f o r m a n t c o l o n i e s i n s t e a d o f p l a q u e s a s d e s c r i b e d i n t h ek i t i n s t r u c t i o n s .

    RESULTSS u b c l o n i n g t h e a m y R 2 a l l e l e . To c o n v e n i e n t l y s t u d ya m y R 2 - d i r e c t e d a m y l a s e p r o d u c t i o n a n d t r a n s c r i p t i o n o fa m y E , amyR2 w a s s u b c l o n e d i n t o s e v e r a l p l a s m i d s u s e d i np r e v i o u s s t u d i e s o f a m y R i . G e n e c o n v e r s i o n t r a n s f o r m a t i o nw a s u s e d t o c l o n e amyR2 f r o m B . s u b t i l i s s u b s p . n a t t o 1 A 4 1 2( N A 6 4 ) o n t o a n Emr p l a s m i d t o m a k e pEATalW15 ( 2 6 ) . AnE c o R I f r a g m e n t f r o m t h i s p l a s m i d , c a r r y i n g t h e amyR2 l o c u sa n d p a r t o f t h e a m yE g e n e , w a s l i g a t e d i n t o pAMY10,r e p l a c i n g t h e a n a l o g o u s a m y R l - b e a r i n g f r a g m e n t , t o c r e a t epAR2 ( F i g . 1 ) . T h e u n i q u e H p a I s i t e i n pAMY10 i s n o tp r e s e n t i n t h e a m y R 2 - c o n t a i n i n g p l a s m i d p A R 2 , w h i c h h a di n s t e a d a n e x t r a A v a I s i t e n o t f o u n d i n pAMY10 ( F i g . 1 ) .To g e n e r a t e a h y b r i d i z a t i o n p r o b e f o r t r a n s c r i p t i o n m a p -p i n g , t h e X b a I - E c o R I r e s t r i c t i o n f r a g m e n t f r o m p A R 2 ,w h i c h c o n t a i n s amyR2 a n d p a r t o f t h e a m yE g e n e , w a ss u b c l o n e d i n t o X b a I - E c o R I - d i g e s t e d p U C 1 8 . T h e r e s u l t i n gp l a s m i d , pMWR2, was i d e n t i c a l , e x c e p t i n t h e a m y R r e g i o n ,t o pMWR1, w h i c h we u s e d i n o u r p r e v i o u s t r a n s c r i p t i o ns t u d i e s ( 2 9 ) .C o m p a r i s o n o f a m y R I - a n d a m y R 2 - d i r e c t e d a m y l a s e p r o -d u c t i o n . We c o m p a r e d a m y l a s e p r o d u c t i o n i n t w o i s o g e n i c

    s t r a i n s d i f f e r i n g o n l y i n t h e i r a m yR r e g i o n . T h e a m y R 2 -c o n t a i n i n g s t r a i n , WLN-15, c o n s i s t e n t l y p r o d u c e d a t l e a s t2 . 5 - f o l d m o r e a - a m y l a s e t h a n a m y R l - c o n t a i n i n g WLN-4( F i g . 2 A ) . A m y l a s e p r o d u c t i o n i n b o t h s t r a i n s w a s a c t i v a t e da t t h e e n d o f t h e e x p o n e n t i a l g r o w t h p h a s e ( T o ) a n d r e -p r e s s e d i n t h e p r e s e n c e o f g l u c o s e . T h e b a s a l l e v e l o fa m y l a s e p r o d u c e d d u r i n g e x p o n e n t i a l g r o w t h a n d t h e r e -p r e s s e d l e v e l s i n t h e p r e s e n c e o f g l u c o s e w e r e a l s o a t l e a s t2 . 5 - f o l d h i g h e r i n WLN-15 t h a n i n WLN-4 d u r i n g c o m p a r a -b l e g r o w t h c o n d i t i o n s a n d t i m e s ( F i g . 2 A ) .M u l t i c o p y p l a s m i d s pAMY10 a n d p A R 2 , c o n t a i n i n g t h ea m yE g e n e a n d amyRI o r a m y R 2 , r e s p e c t i v e l y , w e r e i n t r o -

    \< A ~ ~ BF I G . 1 . C o n s t r u c t i o n o f p A R 2 . An E c o R I f r a g m e n t f r o m p l a s m i dpEATalW15 ( 2 5 ) , c a r r y i n g t h e a i n y R 2 l o c u s a n d p a r t o f t h e a i n y Eg e n e , w a s l i g a t e d i n t o pAMY10 l i n e a r i z e d w i t h E c o R I . E . c o l i J M 1 0 9w a s t r a n s f o r m e d t o Cm" Amy' a s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n dM e t h o d s . P l as m i d s w e r e i s o l a t e d a n d s c r e e n e d b y r e s t r i c t i o n d i g e s t sf o r t h e r e p l a c e m e n t o f t h e pAMY10 a m y R I a l l e l e b y a m y R 2 .P l a s m i d s i z e s : pAMY10 a n d p A R 2 , 8 . 3 k b p ; p E A T o t 1 W 1 5 , 1 1 . 3 k b p .A , A v a l ; B , B a r n H I ; E , E co RI ; H , H p a I ; P , P s t I ; X , X b a I ; E m r ,e r y t h r o m y c i n r e s i s t a n c e d e t e r m i n a n t ; C m r , c h l o r a m p h e n i c o l r e s i s -t a n c e g e n e . a m y E i s t h e s t r u c t u r a l g e n e f o r a - a m y l a s e , a n d t h e b l a c kb o x i s a m n y R .

    d u c e d i n t o a B . s u b t i l i s Amy- s t r a i n , BRE, b y t r a n s f o r m a -t i o n . A m y l a s e p r o d u c t i o n was 2 . 5 - f o l d h i g h e r i n c e l l s c o n -t a i n i n g pAR2 t h a n i n c e l l s c o n t a i n i n g pAMY10 ( F i g . 2 B ) .T e m p o r a l a c t i v a t i o n o f a m y l a s e s t i l l o c c u r r e d a t T o , a n dc a t a b o l i t e r e p r e s s i o n r e d u c e d a m y l a s e s p e c i f i c a c t i v i t y l e v -e l s .E f f e c t o f g e n e d o s a g e o n a m y l a s e p r o d u c t i o n i n s t r a i n sc o n t a i n i n g p l a s m i d s . A t a l l g r o w t h s t a g e s a n d t i m e s , a m y l a s ew a s p r e s e n t a t a b o u t 1 0 - t o 1 8 - f o l d g r e a t e r a m o u n t s i n s t r a i n sw i t h a m y l a s e p l a s m i d s t h a n i n c o r r e s p o n d i n g a m y E - s i n g l e -c h r o m o s o m a l - c o p y s t r a i n s WLN-4 a n d WLN-15 ( F i g . 2Aa n d B ) . We d e t e r m i n e d t h e p l a s m i d c o p y number i n B .s u b t i l i s BRE c o n t a i n i n g pAMY10, p A R 2 , p A R 1 0 8 , p A R 1 0 5 ,p A R I 7 , p A R 2 0 2 , pAR2E, a n d p A R 2 1 1 0 . Copy number wase s t i m a t e d f o r e x p o n e n t i a l l y g r o w i n g c e l l s ( m i d - l o g p h a s e )a n d c e l l s 2 h a f t e r t h e o n s e t o f s t a t i o n a r y p h a s e ( T 2 ) .B a c k g r o u n d c o u n t s f o r b o t h s a m p l e t i m e s w e r e e s t i m a t e df r o m DNA p r e p a r a t i o n s o f t h e p l a s m i d l e s s BRE s t r a i n . Th ec o u n t s i n g e l s l i c e s f r o m t h e r e g i o n c o r r e s p o n d i n g t o t h ep l a s m i d l o c a t i o n w e r e u s e d t o d e t e r m i n e t h e p o r t i o n o fc o u n t s p e r m i n u t e d e r i v e d f r o m s h e a r e d o r d e g r a d e d c h r o -m o s o m a l DNA. T h e b a c k g r o u n d r a t i o w a s s u b s t a n t i a l l yh i g h e r a t T 2 ( 0 . 0 2 6 8 v e r s u s 0 . 0 1 0 1 a t m i d - l o g p h a s e ) , a t w h i c ht i m e n u c l e a s e e x p r e s s i o n was s u b s t a n t i a l l y h i g h e r t h a n a tm i d - l o g p h a s e . T h e b a c k g r o u n d r a t i o w a s s u b t r a c t e d f r o mt h e p l a s m i d r a t i o b e f o r e c o p y n u m b e r was c a l c u l a t e d .B e t w e e n 7 a n d 1 6 p l a s m i d s w e r e p r e s e n t p e r genome i nBRE c e l l s ( T a b l e 2 ) . O v e r a l l , t h e p l a s m i d c o p y n u m b e ra v e r a g e d 1 0 c o p i e s i n m i d - l o g p h a s e a n d 1 1 i n s t a t i o n a r yp h a s e ( T 2 ) .B e c a u s e g l u c o s e r e p r e s s e d a m y l a s e p r o d u c t i o n , we e x a m -i n e d i t s e f f e c t o n p l a s m i d c o p y n u m b e r . G l u c o s e , t o a 1 %

    J . B A C T E R I O L .

  • 8/8/2019 Bacilus Subtilis Strain

    4/11

    B . SUBTILIS AMYLASE GENE PROMOTER 3 6 5 9

    4-

    -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5

    3 0 0

    2 0 0 00

    go00C ) X- 1 0 0 0 s *9 0 ( 17 0 a n . u60 .5 04 0 t DM )C L

    b 3 0 C a. )C , )t_

    a2 0 - v EE

    1 0-3 -2 -1 0 1 2 3 4 5

    T i m e ( H o u r s B e f o r e a nd A f t e r T o )F I G . 2 . R e g u l a t i o n o f O C - a m y l a s e s y n t h e s i s ( s o l i d l i n e s ) d u r i n g g r o w t h ( d a s h e d l i n e s ) o f B . s l u b t i l i s s t r a i n s b e a r i n g a n m y R l ( c i r c l e s ) or a i n y R 2( t r i a n g l e s ) . C e l l s were grown i n NSM w i t h ( o p e n s y m b o l s ) or w i t h o u t ( s o l i d s y m b o l s ) g l u c o s e a d d e d a t m i d - l o g p h a s e ( s o l i d a r r o w h e a d ) t o a1 % f i n a l c o n c e n t r a t i o n . ( A ) A m y l a s e s y n t h e s i s i n WLN-4 ( a m i v R l ) a n d WLN-15 ( a t n v R 2 ) s t r a i n s b e a r i n g s i n g l e - c o p y chromosomal a i n y Ra l l e l e s . ( B ) A m y l a s e s y n t h e s i s i n s t r a i n BRE c o n t a i n i n g p l a s m i d pAMY10 ( a m y R I ) or pAR2 ( a m n v R 2 ) . Amylase s p e c i f i c a c t i v i t y was d e f i n e d

    a s u n i t s o f e n z y m a t i c a c t i v i t y ( 2 5 ) per m i l l i g r a m o f p r o t e i n . Th e g r o w t h s t a g e i s h o u r s b e f o r e a n d a f t e r T , .

    f i n a l c o n c e n t r a t i o n , w a s a d d e d t o h a l f o f a n e x p o n e n t i a l l yg r o w i n g c u l t u r e i m m e d i a t e l y a f t e r t h e f i r s t s a m p l e ( f o r c o p yn u m b e r d e t e r m i n a t i o n ) h a d b e e n w i t h d r a w n . BRE c o n t a i n -i n g pAMY10 h a d a n a v e r a g e o f 1 5 c o p i e s a t T , when g r o w ni n g l u c o s e a n d 1 3 c o p i e s i n t h e a b s e n c e o f g l u c o s e . p A R I 7w a s p r e s e n t a t T 2 i n 9 c o p i e s i n t h e p r e s e n c e o f g l u c o s e a n d1 2 c o p i e s i n i t s a b s e n c e ( d a t a n o t s h o w n ) .U p s t r e a m d e l e t i o n s i n pAMYIO a n d p A R 2 . DNA w a sd e l e t e d f r o m t h e 5 ' e n d o f a m y R i n p l a s m i d s pAMY10 a n dpAR2 b y d i g e s t i o n o f X b a I - c l e a v e d p l a s m i d s b y e x o n u c l e a s eI I I . D i g e s t i o n p r o c e e d e d i n b o t h d i r e c t i o n s a f t e r l i n e a r i z a t i o na t t h e u n i q u e X b a I s i t e o f e a c h p l a s m i d ( F i g . 1 ) . P l a s m i d sw e r e r e c i r c u l a r i z e d a n d t r a n s f o r m e d i n t o E . c o l i , s e l e c t i n gf o r Cmr a n d s c r e e n i n g f o r a m y l a s e p r o d u c t i o n . E i g h t y - f o u ro f t h e 2 1 1 pAMY10 d e l e t i o n Cm r t r a n s f o r m a n t s p r o d u c e d

    TABLE 2 . P l a s m i d c o p y n u m b e r a t m i d - l o g p h a s ea n d T , g r o w t h s t a g e sPlasmid G r o w t h P l a s m i d / c h r o m o s o m e E s t i m a t e d p l a s m i ds t a g e cp m r a t i o " c o p y n o . "pAMY10 M i d - l o g 0 . 0 3 2 0 1 5T , 0 . 0 2 2 4 1 0p A R 1 0 5 M i d - l o g 0 . 0 1 4 7 7T , 0 . 0 1 7 0 8p A R 1 0 8 M i d - l o g 0 . 0 2 0 3 1 0T , 0 . 0 1 5 9 8p A R I 7 M i d - l o g 0 . 0 2 6 7 1 2T 2 0 . 0 2 7 4 1 2pAR2 M i d - l o g 0 . 0 2 1 2 1 0T , 0 . 0 1 6 9 8p A R 2 0 2 M i d - l o g 0 . 0 2 0 0 1 0T , 0 . 0 3 2 6 1 6pAR2E M i d - l o g 0 . 0 2 0 2 1 0T , 0 . 0 3 1 8 1 6p A R 2 1 1 0 M i d - l o g 0 . 0 2 1 5 1 0T 2 0 . 0 1 9 7 9

    B a c k g r o u n d r a t i o was s u b t r a c t e d ( s e e R e s u l t s ) .b T h e m o l e c u l a r m a s s e s i n d a l t o n s ( D a ) u s e d t o c a l c u l a t e e s t i m a t e d p l a s m i dc o p y n u m b e r w e r e 2 . 5 x 1 0 9 Da f o r t he B . s i u b t i l i s c h r o m o s o m e ; 5 . 5 x 1 0 6 Daf o r p A M Y 1 0 , p A R I 7 , a n d p A R 2 ; 5 . 2 x 1 0 6 Da f o r p A R 1 0 5 , p A R 1 0 8 , a n dp A R 2 0 2 ; 5 . 2 x 1 0 6 Da f o r p A R 2 1 1 0 ; a n d 5 . 1 x 1 0 6 Da f o r p A R 2 E .

    a m y l a s e , as d i d 4 7 o f 1 5 9 pAR2 d e l e t i o n Cm r t r a n s f o r m a n t s .T h e s i z e s o f t h e d e l e t i o n s were d e t e r m i n e d b y r e s t r i c t i o nd i g e s t i o n a n d agarose g e l e l e c t r o p h o r e s i s f o r 3 0 o f t h epAMY10- a n d 1 1 o f t h e p A R 2 - d e r i v e d d e l e t i o n p l a s m i d s .B e t w e e n 1 0 0 a n d 7 3 0 b p were d e l e t e d f r o m t h e p l a s m i d s .S e v e n t e e n d e l e t i o n p l a s m i d s , 1 2 f r o m pAMY10 a n d 5 f r o mp A R 2 , were t r a n s f o r m e d i n t o B . s u b t i l i s BRE t o c h a r a c t e r i z et h e i r a m y l a s e p r o d u c t i o n . A l l 1 7 t r a n s f o r m e d Amy- BRE t oAm y ' . I n a l l s t r a i n s , a m y l a s e p r od u c t i o n was c a t a b o l i t er e p r e s s e d b y g l u c o s e . O n l y one d e l e t i o n p l a s m i d , p A R 2 1 1 0 ,p r o d u c e d l o w l e v e l s o f o t - a m y l a s e ( F i g . 3 B , i n s e t ) ; o t h e r w i s e ,t h e l e v e l was a p p r o x i m a t e l y e q u a l t o t h a t p r o d u c e d b ys t r a i n s b e a r i n g t h e u n d e l e t e d p a r e n t p l a s m i d pAMY10 orpAR2 ( d a t a n o t s h o w n ) . A l l p l a s m i d s , i n c l u d i n g p A R 2 1 1 0 ,i n c r e a s e d a m y l a s e p r o d u c t i o n n e a r t h e b e g i n n i n g o f s t a t i o n -a ry p h a s e . Time courses o f a m y l a s e p r o d u c t i o n b y s t r a i n sc o n t a i n i n g s e q u e n c e d d e l e t i o n p l a s m i d s a n d c o r r e s p o n d i n gu n d e l e t e d c o n t r o l s a re shown i n F i g . 3 . Two pAMY10 a n dtwo pAR2 d e r i v a t i v e s h a d d e l e t i o n s i n t o or b e y o n d t h ei n v e r t e d r e p e a t s ( F i g . 4 ) .

    S i n c e a m y l a s e p r o d u c t i o n i n s t r a i n BRE c o n t a i n i n ga m y R 2 - d e r i v e d p l a s m i d pAR2110 was r e d u c e d t o a l e v e lc o m p a r a b l e t o t h a t o f a s t r a i n w i t h a s i n g l e c h r o m o s o m a lcopy, we c u r e d t h e s t r a i n o f t h e Cm r d e t e r m i n a n t a n ds c r e e n e d f o r c o n c o m i t a n t l o s s o f a m y l a s e p r o d u c t i o n . Ab r o t h c u l t u r e o f A3 m e d i u m , w i t h o u t a n t i b i o t i c s e l e c t i o n ,was i n o c u l a t e d w i t h a 3 - w e e k - o l d , f u l l y s p o r u l a t e d c o l o n yf r o m a n NSM p l a t e . Th e c u l t u r e was grown o v e r n i g h t a t4 6 C , a n d c e l l s were p l a t e d on PBAB p l a t e s . Of t h e 9 0 6c o l o n i e s s c r e e n e d b y p i c k i n g t o PBAB s u p p l e m e n t e d w i t h1 % s t a r c h or 1 % s t a r c h a n d c h l o r a m p h e n i c o l ( 1 0 p u g / m l ) , 4 7were r e s i s t a n t t o c h l o r a m p h e n i c o l a n d p r o d u c e d a m y l a s e .Th e r e m a i n i n g 8 5 9 were Cm s a n d Amy-, i n d i c a t i n g t h a t9 4 . 8 % o f t h e c e l l s were c u r e d o f t h e p l a s m i d and t h a t genec o n v e r s i o n o f t h e a m yE mutant chromosomal a l l e l e ha d n o to c c u r r e d . T h i s i n d i c a t e d t h a t t h e low l e v e l o f a m y l a s e i nB R E ( p A R 2 1 1 0 ) was p r o d u c e d from t h e p l a s m i d .A d e l e t i o n mutant o f pAR2 a n a l o g o u s t o t h e d e l e t e da m y R 2 - f - l a c t a m a s e g e n e ( b l a ) f u s i o n o f Takano e t a l . ( 3 9 )was c o n s t r u c t e d . P l a s m i d pMWR2 was d i g e s t e d a t t h e AvaI

    00x

    0 .C/a )0- 5 %E

    A

    31-2 jf/I/

    A

    /I

    ) _( A0( 5

    C :,n1

    V O L . 1 7 1 , 1 9 8 9

    v

  • 8/8/2019 Bacilus Subtilis Strain

    5/11

    3 6 6 0 WEICKERT AND CHAMBLISS9-

    0 8-00w -*1 6% . . >

  • 8/8/2019 Bacilus Subtilis Strain

    6/11

    B . SUBTILIS AMYLASE GENE PROMOTER 3 6 6 1

    1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1213 m a r k e r s( b p )..._ 24 223 8

    2 1 7- **,-iiT 2 0 1-- 19 0

    F I G . 5 . M a p p i n g t h e 5 ' e n d o f t h e a r n y E t r a n s c r i p t . Mung b e a nn u c l e a s e - r e s i s t a n t DNA-RNA h y b r i d s w e r e a n a l y z e d o n a 6 % ,s e q u e n c i n g g e l . C e l l u l a r RNA ( 2 0 , u g ) w a s u s e d i n r e a c t i o n s 3 t o 1 0 ,a n d 1 0 0 F g w a s u s e d i n l a n e s 1 , 2 , 1 1 , a n d 1 2 . RNA w a s i s o l a t e df r o m c e l l s g r o w n i n NSM i n t h e a b s e n c e ( l a n e s 1 , 3 . 5 , 7 , 9 , a n d 1 1 )o r p r e s e n c e ( l a n e s 2 , 4 , 6 , 8 , 1 0 , a n d 1 2 ) o f 1% g l u c o s e . RNA w a si s o l a t e d f r o m s t r a i n BRE w i t h n o p l a s m i d ( l a n e s 1 a n d 2 ) , pAMY10( 3 a n d 4 ) , pAR108 ( 5 a n d 6 ) , pAR2 ( 7 a n d 8 ) , pAR202 ( 9 a n d 1 0 ) , o rpAR2110 ( 1 1 a n d 1 2 ) . L a n e 1 3 i s t h e tRNA c a r r i e r c o n t r o l . M a r k e r sw e r e e n d - l a b e l e d H p a I I f r a g m e n t s o f p l a s m i d p A T 1 5 3 , a n d s i z e s a r ei n d i c a t e d o n t h e r i g h t .t h e c o r r e s p o n d i n g pAMYIO o r pAR2 p l a s m i d o r d e l e t i o nd e r i v a t i v e . A f t e r d i g e s t i o n o f r e m a i n i n g ssDNA o r RNA b ym ung b e a n n u c l e a s e , t h e h y b r i d w a s r e s o l v e d o n 6% a c r y l -a m i d e s e q u e n c i n g g e l s ( F i g . 5 ) . We e s t i m a t e d t h e r e l a t i v ea m o u n t s o f t r a n s c r i p t p r o d u c e d . T r a n s c r i p t i o n s t a r t e d a t t h es a m e s i t e i n t h e d e l e t i o n m u t a n t s a s i t d i d i n pAMY10 a n dp A R 2 , t h e w i l d - t y p e p l a s m i d s ( F i g . 5 ) . T h e s a m e r e l a t i v emRNA l e v e l s w e r e a l s o o b s e r v e d . T h e s i z e o f t h e h y b r i dr e s o l v e d o n t h e g e l s i n d i c a t e d t h a t P 1 w a s t h e p r o m o t e ru s e d , a s i t i s i n t h e c h r o m o s o m a l s i n g l e - c o p y s t r a i n s ( 4 , 2 9 )( F i g . 6 ) . T h e r e w a s a l s o a b o u t t h r e e f o l d m o r e mRNA f r o mc e l l s c o n t a i n i n g pAR2 o r pAR202 t h a n f r o m t h o s e c o n t a i n i n gpAMY10 o r p A R 1 0 8 . G l u c o s e r e p r e s s e d t r a n s c r i p t i o n t o al e v e l p r o p o r t i o n a l t o t h e a m y l a s e a c t i v i t y s e e n i n c e l l s a t t h ea n a l o g o u s t i m e .C e l l s c o n t a i n i n g p l a s m i d p A R 2 1 1 0 , w i t h a d e l e t i o n e x t e n d -i n g t h r o u g h t h e - 3 5 r e g i o n o f t h e p r o m o t e r t o - 2 7 , s h o w e dr e d u c e d t r a n s c r i p t i o n , a s i n d i c a t e d b y t h e f a c t t h a t 5 t i m e s a smuch RNA w a s r e q u i r e d t o d e t e c t t h e t r a n s c r i p t ( F i g . 5 , l a n e

    1 1 ) . T h i s t r a n s c r i p t w a s b a r e l y d e t e c t a b l e when t h e c e l l sw e r e g r o w n i n m e d i u m c o n t a i n i n g 1% g l u c o s e ( F i g . 5 , l a n e1 2 ) . I t a p p e a r s t o h a v e a s l i g h t l y g r e a t e r m o b i l i t y , i n d i c a t i n gt h a t i t may i n i t i a t e f r o m P 2 , a p o t e n t i a l p r o m o t e r o v e r l a p p i n gP 1 ( F i g . 6 ) . A l t e r n a t i v e l y , i t w a s n o t i c e d t h a t a l l t h e f a i n td e g r a d a t i o n b a n d s w e r e a l s o s h i f t e d i n t h e g e l t o a b o u t t h es a m e e x t e n t ; t h u s , t h e s h i f t i n t h e t r a n s c r i p t b a n d m a y b e d u et o l o a d i n g f i v e f o l d m o r e RNA i n t h o s e l a n e s a n d n o t t o a newt r a n s c r i p t i o n s t a r t s i t e . I n a n y c a s e , t r a n s c r i p t i o n w a s r e -d u c e d , c o r r e s p o n d i n g t o l o w e r a m y l a s e p r o d u c t i o n , a n d w a sa l s o r e p r e s s e d b y g l u c o s e .D e l e t i o n o f DNA 3 ' t o t h e a m y R I p r o m o t e r . B e c a u s e DNA

    u p s t r e a m ( 5 ' ) o f t h e p r o m o t e r d i d n o t s e e m t o c o n t r i b u t e t ot r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t i o n o f O x - a m y l a s e , we e x a m i n e d t h ee f f e c t o n r e g u l a t i o n o f a d e l e t i o n 3 ' t o t h e p r o m o t e r . B e c a u s ea d o w n s t r e a m d e l e t i o n c o u l d a f f e c t t h e a m y l a s e s t r u c t u r a lg e n e , we c l o n e d a n a m n y R i 3 ' d e l e t i o n i n t o p P L 6 0 3 B , w h i c hc o n t a i n s a p r o m o t e r l e s s ( a t g e n e ( 4 3 ) . We h a d p r e v i o u s l ys h o w n t h a t when t h e amyRl a n d g r a - 1 0 r e g i o n s w e r e c l o n e di n t o t h i s p l a s m i d , t h e y r e g u l a t e d CAT p r o d u c t i o n i n am a n n e r a n a l o g o u s t o t h e i r r e g u l a t i o n o f o x - a m y l a s e ( 2 5 , 2 6 ) .T h e d e l e t i o n w a s c o n s t r u c t e d b y d i g e s t i n g pAMY10 w i t hH p a I , w h i c h c u t s o n c e a t t h e u n i q u e s i t e ( 5 ' - G T T A A C - 3 ' )l o c a t e d 7 b p 3 ' t o t h e t r a n s c r i p t i o n s t a r t s i t e ( F i g . 6 a n d 7 a ) .T h e l i n e a r i z e d p l a s m i d w a s d e p h o s p h o r y l a t e d a n d r e c i r c u -l a r i z e d b y l i g a t i o n w i t h p h o s p h o r y l a t e d E c o R I l i n k e r s t om a k e p l a s m i d p A R I E . T h e E c o R I f r a g m e n t c o n t a i n i n g t h ep r o m o t e r w a s r e m o v e d a n d l i g a t e d i n t o E c o R I - d i g e s t e dp P L 6 0 3 B t o make pPLR18 ( F i g . 7 a ) .T h e d e l e t i o n o f DNA 3 ' t o t h e H p a I s i t e d i d n o t a f f e c tt e m p o r a l a c t i v a t i o n o f c a t b u t e l i m i n a t e d c a t a b o l i t e r e p r e s -s i o n o f CAT s y n t h e s i s when c e l l s w e r e g r o w n i n t h e p r e s -e n c e o f g l u c o s e ( F i g . 7 b ) . T h i s r e l e a s e f r o m c a t a b o l i t er e p r e s s i o n w a s a n a l o g o u s t o t h a t o f p 5 ' o x G R 1 0 , i n w h i c h c a te x p r e s s i o n i s u n d e r t h e c o n t r o l o f t h e g r a - 1 0 m u t a t i o n , w h i c hc o n f e r s c a t a b o l i t e r e p r e s s i o n r e s i s t a n c e t o amyRI ( 2 6 ) ( F i g .7 b C ) . T h e d e l e t i o n e l i m i n a t e s t h e l a s t f o u r b a s e s o n t h e 3 'e n d o f t h e p u t a t i v e a m y l a s e o p e r a t o r i d e n t i f i e d , i n p a r t , b yt h e g r a - 1 0 m u t a t i o n ( 2 9 ) .

    - 2 7 0 - 2 6 0 - 2 5 0 - 2 4 0 - 2 3 0 - 2 2 0 - 2 1 0 - 2 0 0 - 1 9 0 - 1 8 0 - 1 7 0T C T A G A C G A C A G G G G G A T T C C C C A T A C A T T C T T C G C T T G G C T G A A A A T G A T T C T T C T T T T T A T C G T C T G C G G C G G C G T T C T G T T T C T G C T T C G G T A T G T G A T T G T G A AT C T A G A C G A C A G G G G G A T T C C C C A T A C A T T C T T C G C T T G G C T G A A A A T G A T T C T T C T T T T T A T C G T C T G C G G C G G C G T T C T G T T T C T G C T T C G G T A T G T G A T T G T G A A

    - 1 6 0 - 1 5 0 - 1 4 0 - 1 3 0 - 1 2 0 - 1 1 0 - 1 0 0 - 9 0 - 8 0G C T G G C T T A C A GA AG AG C G G T A A A A G A A G A A A T A A A A A A G A A A T C A T C T T T T T T G T T T G G A A A G C G A G G G A A G C G T T C A C A G T T T C G G G C= = = = ====*C T G G C T T AC A GA AG AG C G G T A A A A G A A G A A A T A A A A A A G A A A T C A T C T T G A A A A A T A G A T G G T T T C T T T T T T T G T T T G G A A A G C G A G G G A A A C A G T C T C G G G CA v a I+ 1 H t a I 1 1- 7 0 - 6 0 - 5 0 - 4 0 - 3 0 - 2 0 - 1 0A G C T T T T T T T A T A G G A A C A T T G A T T T G T A T T C A C T C TG C C A AG T TG T TT T G AT A G AG T G A T T G TG AT AA T T T T AA A T GT A A G C G T T A A C A

    A G T T T T T T A TA G GA AC A T T G A T T T G T AT T C A C T C T G C C A A G T T G T T T T G A T A G A G T G A T T G T G A T A A T T T A A A A T G T A A G C G T G A A C AI P 1 p r o m o t e r P 1 amyOP 2 | p r o m o t e r P 2 -

    4 1 5 1C G G T T T G A A A G G A G G A A G C G* r b s - 1C A G T T T G A A A G G A G G A A G C G

    P 3 p r o m o t e r

    6 1 7 1 8 1G A A G A A T G A A G T A A G A G G G A T T T T T G A C T Cr b s - 2G A A G A A T G A A G T A A G A G G G A T T T T T G A C T Cl w l I

    9C 1 0 1C G A A G T A A G T C T T C A A A A A AC G A A G T A A G T C T T C A A A A A A

    2 1A A A T T C T C C AA A A T T C T C T C A

    1 1 1 1 2 1 1 3 0T C A A A T A A G G A G T G T C A A G A A T G T T T G C Ar b s - 3T C A A A T A A G G A G T G T C A A G A A T G T T T G C A

    M e t P h e A l a

    3 1G T C T I C A C A TG T C T T C A C A T

    a m y R la m y R 2a m y E

    F I G . 6 . C o m p a r i s o n o f t h e a m y R i a n d a m y R 2 n u c l e o t i d e s e q u e n c e s . T h e t o p s e q u e n c e i s a m y R I a n d t h e b o t t o m i s a m y R 2 ; P 1 , P 2 , a n dP 3 a r e _ A - t y p e p r o m o t e r c o n s e n s u s s e q u e n c e s , o f w h i c h P 1 i s u t i l i z e d . r b s - 1 , - 2 , a n d - 3 a r e p u t a t i v e r i b o s o m e - b i n d i n g s i t e s ; s t a r s ( * ) i n d i c a t eb a s e m i s m a t c h e s ; t h e A i a I , H p a I , a n d X b a I r e s t r i c t i o n s i t e s a r e u n d e r l i n e d ; arrows i n d i c a t e t h e i n v e r t e d r e p e a t s e q u e n c e s ; t h e o p e r a t o r s i t e( a m y O ) i s e n c l o s e d i n a b o x ; a n d a m yE i s t h e a m y l a s e s t r u c t u r a l g e n e .

    V O L . 1 7 1 , 1 9 8 9

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    7/11

    3 6 6 2 WEICKERT AND CHAMBLISS

    ( a ) - - R e g i o n i n s e r t e di n t o pPL603 pPL603

    Se n d o fE c o R [ X b o l a H p o l a n yE B c i IE c o R I P s t I H p o l X b o l C o t - 8 6A -1 - I t

    H i n d m X b o L N m r / K m r E c o R I

    W - 2 9 7 1 | 932 120314229-4I . ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~II - - J

    E c o R t X b o l E c o R I P s i l H p o l X b a I C o 1 - 8 6. a H i n d m X b o L N m r / K m r E c o R I

    T - 2 T - 1 T o T 2 T 3Growth S t a g e

    F I G . 7 . CAT a c t i v i t y o f a m y R - c a t - 8 6 t r a n s c r i p t i o n a l f u s i o n s . ( a ) C o n s t r u c t i o n o f p P L R 1 8 i s d e s c r i b e d i n t h e t e x t . Th e p l a s m i d , l i n e a r i z e dw i t h E c o R I , i s c o m p o s e d o f t h e 5 ' e n d o f t h e a m yE g e n e ( s t i p p l e d b a r ) , a m y R r e g i o n ( c r o s s h a t c h e d b a r ) , c a t - 8 6 g e n e ( o p e n b a r ) , a n d v e c t o rDNA ( s o l i d l i n e ) . T h e f a c i n g arrows are i n v e r t e d r e p e a t s p r e c e d i n g c a t - 8 6 ; s i z e s ar e s p e c i f i e d i n b a s e p a i r s , a n d Nmr/Kmr i s t h e n e o m y c i n a n dk a n a m y c i n r e s i s t a n c e d e t e r m i n a n t . p 5 ' a B 1 0 a n d p 5 ' a G R 1 0 ar e i d e n t i c a l f u s i o n s o f t h e c a t - 8 6 gene t o a m y R I or g r a - 1 0 , r e s p e c t i v e l y , a n d wered e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 2 6 , 2 8 ) . ( b ) R e g u l a t i o n o f CAT s y n t h e s i s d u r i n g g r o w t h o f s t r a i n 1 6 8 c o n t a i n i n g ( A) p l a s m i d p ' a B O 1 0 , ( B ) p P L R 1 8 , or( C ) p 5 ' a G R 1 0 . O p e n c i r c l e s are CAT a c t i v i t y i n c e l l s grown i n NSM w i t h 1 % g l u c o s e , a n d s o l i d c i r c l e s are CAT a c t i v i t y i n c e l l s grown i n NSMw i t h o u t g l u c o s e . G r o w t h s t a g e i s e x p r e s s e d as h o u r s b e f o r e a n d a f t e r T o , a n d CAT s p e c i f i c a c t i v i t y was d e t e r m i n e d as d e s c r i b e d i n t h e t e x t .I n s e r t i o n o f 8 b p i n t o t h e o p e r a t o r r e g i o n . S i n c e t h e 3 'amyRi d e l e t i o n may h a v e e l i m i n a t e d c a t a b o l i t e r e p r e s s i o nb e c a u s e o f l o s s o f d o w n s t r e a m sequences i n s t e a d o f p a r t o ft h e o p e r a t o r , we i n s e r t e d a n 8 - b p H i n d I l l l i n k e r i n t o t h e

    same HpaI s i t e . T h i s i n s e r t i o n a t t h e H p a I s i t e , f r o m w h i c ht h e pPLR18 d e l e t i o n p l a s m i d was m a d e , i n t e r r u p t e d t h eo p e r a t o r 7 b p d o w n s t r e a m o f t h e t r a n s c r i p t i o n s t a r t s i t e ( + 7 ) ,a t t h e same s i t e a s t h e d e l e t i o n m e n t i o n e d a b o v e , a n d wasc o n f i r m e d b y s e q u e n c i n g . A m y l a s e p r o d u c t i o n i n c e l l s o f B .s u b t i l i s BRE c o n t a i n i n g t h e p l a s m i d w i t h t h i s 8 - b p i n s e r t wasf o u r - t o f i v e f o l d h i g h e r i n l o g a r i t h m i c g r o w t h p h a s e t h a n i nBRE c o n t a i n i n g t h e w i l d - t y p e amyRi p l a s m i d pAMY10( c o m p a r e F i g . 8 a n d 2 B ) . T h e a m o u n t o f a m y l a s e p r o d u c e dd u r i n g s t a t i o n a r y p h a s e was t w i c e t h e n o r m a l l e v e l . G l u c o s ep r e v e n t e d a n i n c r e a s e i n a m y l a s e p r o d u c t i o n a f t e r T o , b u tt h e amou nt p r o d u c e d r e m a i n e d q u i t e h i g h ( F i g . 8 ) .S i t e - d i r e c t e d m u t a g e n e s i s . U p s t r e a m d e l e t i o n s h a d no e f -f e c t on a m y l a s e e x p r e s s i o n , a n d a n i n s e r t i o n a t t h e HpaI s i t e+ 7 t o t h e t r a n s c r i p t i o n s t a r t s i t e i n c r e a s e d a m y l a s e promotera c t i v i t y . We m u t a g e n i z e d t h e b a s e s a t -7 a n d + 7 i n a m yRIt o t h e c o r r e s p o n d i n g d i f f e r e n t b a s e s f o u n d i n a myR2 t od e t e r m i n e w h e t h e r t h e s e c h a n g e s c o n f e r r e d t h e c h a r a c t e r i s -t i c h y p e r p r o d u ct i o n a n d w e a k e r c a t a b o l i t e r e p r e s s i o n o f t h eamyR2 m u t a t i o n .

    T h e g e n e r a l s c h e m e o f o l i g o n u c l e o t i d e s i t e - d i r e c t e d m u t a -g e n e s i s i s s h o w n i n F i g . 9 . We s u b c l o n e d amyRI a n d ap o r t i o n o f a m yE o n t o p G E M - 3 Z f ( + ) , a v e c t o r w h i c h ca np r o d u c e ssDNA or d o u b l e - s t r a n d e d DNA i n E . c o l i . M u t a n t swere r e c o v e r e d a t a h i g h e f f i c i e n c y ( 5 0 t o 1 0 0 % ) w i t h t h eAmersham k i t . M u t a t i o n s a t + 7 were s c r e e n e d b y t h e i ri n a b i l i t y t o b e d i g e s t e d w i t h H p a I , s i n c e s u c h m u t a t i o n sw o u l d e l i m i n a t e t h e H p a I r e s t r i c t i o n s i t e ( F i g . 6 ) . M u t a n t sd e t e r m i n e d b y s c r e e n i n g were c o n f i r m e d b y s e q u e n c i n g .M u t a t i o n s a t -7 were s c r e e n e d b y s e q u e n c i n g . M u t a t i o n s a t+ 7 a re c a l l e d M l ; t h o s e a t -7 are c a l l e d M2; a n d d o u b l em u t a n t s are c a l l e d M 3 . P l a s m i d s c o n t a i n i n g t h e s e m u t a t i o n se n d w i t h on e o f t h e s e d e s i g n a t i o n s (pGEMRlM1, pARlM2,e t c . ) . T h e d o u b l e m u t a t i o n was c o n s t r u c t e d b y i s o l a t i n gssDNA f r o m E . c o l i TG1 c o n t a i n i n g pGEMRlM2 a n d m u t a -g e n i z i n g i t w i t h t h e o l i g on u cl e ot i d e c a r r y i n g t he m u t a n t b a s ea t + 7 . T r a n s f o r m a n t c o l o n i e s were s c r e e n e d f o r p l a s m i d st h a t h a d l o s t t h e HpaI s i t e . S u s p e c t e d m u t a n t s were con-f i r m e d b y s e q u e n c i n g .I n o r d e r t o e x a m i n e t h e e f f e c t o f t h e s e m u t a t i o n s ona m y l a s e p r o d u c t i o n , i t was necessary t o p l a c e t h e E c o R If r a g m e n t c o n t a i n i n g a m y R a n d p a r t o f a m y E i n t o pARED, ap l a s m i d w i t h t h i s f r a g m e n t d e l e t e d ( F i g . 9 ) . C h l o r a m p h e n i -c o l - r e s i s t a n t , a m y l a s e - p r o d u c i n g c o l o n i e s were s c r e e n e d ,

    p 5 ' a B 1 0p 5 ' a G R 1 0

    pPLR 1 a

    ( b ) C2 0 0 S1 5 0

    1 0 0

    5 0A .

    i I ". a I 1 1 I p t i P ;a

    J . B A C T E R I O L .

    i Ii o f I I i

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    8/11

    B . S U B T I L I S AMYLASE GENE PROMOTER 3 6 6 39

    0080X . - 7

    * 5 60GC) or pAR1M2 ( - 7 T A > A T ) , or t h e d o u b l em u t a n t , pAR1M3 ( b o t h o f t h e a b o v e m u t a t i o n s ) , was com-p a r e d w i t h t h a t f r o m t h e w i l d - t y p e pAMY10 ( a m y R I ) a n dpAR2 ( a m y R 2 ) p l a s m i d s . A l l t h r e e mutant p l a s m i d s d i r e c t e da l e v e l o f a m y l a s e p r o d u c t i o n w e l l a b o v e t h a t o f pAMY10( F i g . 1 0 ) . T h e m u t a t i o n a t +7 y i e l d e d a l e v e l o f a m y l a s ep r o d u c t i o n i n t h e presence o f g l u c o s e a p p r o a c h i n g t h a t b ypAR2 ( F i g . 1 0 ) . A l t h o u g h t h e m u t a t i o n a t -7 d o u b l e da m y l a s e p r o d u c t i o n , t h e amou nt p r o d u c e d i n t h e presence o fg l u c o s e was s t i l l l i k e t h a t b y pAMY10,

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    9/11

    3 6 6 4 WEICKERT AND CHAMBLISS

    -2 -1 0 1 2 3 4Time ( H o u r s b e f o r e and a f t e r T o )

    F I G . 1 0 . R e g u l a t i o n o f a - a m y l a s e f o r s t r a i n BRE c o n t a i n i n gw i l d - t y p e or s i t e - d i r e c t e d m u t a t i o n - c a r r y i n g p l a s m i d s . ( A ) A m y l a s ef r o m s t r a i n s c o n t a i n i n g w i l d - t y p e amyRI (pAMY10; c i r c l e s ) oramyR2 ( p A R 2 ; t r i a n g l e s ) w i t h ( o p e n s y m b o l s ) or w i t h o u t ( s o l i ds y m b o l s ) g l u c o s e as d e s c r i b e d i n t h e l e g e n d t o F i g . 2 . ( B ) A m y l a s ef r o m s t r a i n s c o n t a i n i n g amyRi mutant p l a s m i d s pARlMl ( c i r c l e s ) ,pAR1M2 ( t r i a n g l e s ) , a n d pAR1M3 ( s q u a r e s ) grown w i t h a n d w i t h o u tg l u c o s e .

    Y a m a z a k i a n d c o - w o r k e r s ( 4 5 ) h y p o t h e s i z e d t h a t t h e i n -v e r t e d r e p e a t c o r r e s p o n d e d t o t h e amyR2 h y p e r p r o d u c t i o no f a . - a m y l a s e . L a t e r t h ey r e p o r t e d t h a t t h e presence o f t h ei n v e r t e d r e p e a t e n h a n c e d t r a n s c r i p t i o n o f t h e a m y l a s e pro-moter s i x f o l d when s t a r c h was p r e s e n t i n t h e medium a n dl e s s e n e d t h e r e p r e s s i o n i n t h e presence o f g l u c o s e ( 3 9 ) .U n d e r t h e c o n d i t i o n s o f ou r e x p e r i m e n t s , c o m p l e t e e l i m i n a -t i o n o f t h e upstream i n v e r t e d r e p e a t s f o r b o t h a m y R i a n damyR2 d o e s n o t a f f e c t t h e t e m p o r a l a c t i v a t i o n o f a m y l a s ep r o d u c t i o n , g l u c o s e c a t a b o l i t e r e p r e s s i o n , or h y p e r p r o d u c -t i o n i n amyR2 ( F i g . 3 a n d 4 ) . We a l s o d e t e r m i n e d t h a t t h et r a n s c r i p t i o n s t a r t s i t e a n d t h e amount o f a m y E mRNAp r o d u c e d were n o t a f f e c t e d b y t h e d e l e t i o n s ( F i g . 5 ) . T h u s ,we c o n c l u d e t h a t t h e i n v e r t e d r e p e a t s d o n o t c o n t r i b u t es i g n i f i c a n t l y t o a m y l a s e r e g u l a t i o n . T h e e n h a n c e d e x p r e s s i o nseen b y T a k a n o e t a l . ( 3 9 ) i n t h e presence o f s t a r c h c o u l d s t i l lb e i n f l u e n c e d b y t h e i n v e r t ed r e p e a t s . We d i d n o t e x a m i n et h e e f f e c t o f s t a r c h on a m y l a s e e x p r e s s i o n i n ou r d e l e t i o n sb e c a u s e we w c r k e d w i t h t h e i n t a c t a m y l a s e g e n e a n d cannotassay a m y l a s e a c c u r a t e l y f r o m a medium c o n t a i n i n g s t a r c h .An a l t e r n a t i v e f u n c t i o n f o r i n v e r t e d - r e p e a t s t r u c t u r e s l o -c a t e d upstream o f promoters i s a s t r a n s c r i p t i o n t e r m i n a t o r sf o r upstream operons. I n B . a m y l o l i q u e f a c i e n s , t h e a-amy-l a s e g e n e i s p r e c e d e d b y an i n v e r t e d r e p e a t much l i k e t h o s ewe s t u d i e d i n B . s u b t i l i s . T h i s A + T - r i c h ( 6 9 % ) i n v e r t e dr e p e a t i s l o c a t e d b e t w e e n 7 8 a n d 1 2 0 b p upstream o f t h et r a n s c r i p t i o n s t a r t s i t e ( 1 6 ) . T h i s i s s l i g h t l y c l o s e r t o t h ea m y l a s e t r a n s c r i p t i o n s t a r t s i t e t h a n t h a t f o r am yRi a n damyR2 a n d i s l e s s A+T r i c h . Th e i n v e r t e d r e p e a t i n a m y R ih a s 89 % A ' s a n d T ' s , a n d am yR2 i s 83 % A+T r i c h ( F i g . 6 ) .I n B . a m y l o l i q u e f a c i e n s , t h e i n v e r t e d repeat f u n c t i o n s as at r a n s c r i p t i o n t e r m i n a t o r f o r a 2 . 2 - k b operon upstream o f t h ea o - a m y l a s e g e n e ( 1 7 ) . T r a n s c r i p t i o n t e r m i n a t e s i n a s t r i n g o fT ' s n e a r t h e 3 ' e n d o f t h e i n v e r t e d r e p e a t . T h e r e i s a s e r i e s o fT ' s a t t h e 3 ' e n d o f t h e amyRi a n d a m y R 2 i n v e r t e d repeatsa l s o ( F i g . 6 ) . T h e r e f o r e , i t i s p l a u s i b l e t h a t t h e s e sequencesf u n c t i o n as t e r m i n a t o r s o f upstream t r a n s c r i p t i o n i n B .

    s u i b t i l i s a n d h a v e n o d i r e c t e f f e c t o n c x - a m y l a s e t r a n s c r i p -t i o n a l r e g u l a t i o n .C e l l s c o n t a i n i n g t h e amyR2 d e l e t i o n p l a s m i d pAR2110 s t i l la c t i v a t e d a m y l a s e p r o d u c t i o n a t t h e e n d o f e x p o n e n t i a lg r o w t h , e v e n t h o u g h t h e d e l e t i o n e x t e n d e d t h r o u g h t h e - 3 5r e g i o n o f t h e p r o m o t e r . A m y l a s e p r o d u c t i o n was a l s o c a t a b -o l i t e r e p r e s s e d b y g l u c o s e i n t h i s m u t a n t . Th e o v e r a l l l e v e l o fa m y l a s e w a s s e v e r e l y r e d u c e d , p r o b a b l y f r o m t h e l o s s o f t h e- 3 5 r e g i o n , w h i c h c h a n g e s t h e TTGTTT t o ATTTTT ( C r Ac o n s e n s u s - 3 5 i s TTGACA). T e m p o r a l a c t i v a t i o n a n d c a -t a b o l i t e r e p r e s s i o n m u s t r e l y o n s e q u e n c e s 3 ' t o t h e t e r m i n u so f t h i s d e l e t i o n .D e l e t i o n o f amyRI s e q u e n c e s d o w n s t r e a m o f +7 d i d n ota f f e c t t h e t e m p o r a l a c t i v a t i o n o f CAT p r o d u c t i o n i n t h ea m y R I - c a t - 8 6 f u s i o n p l a s m i d pPLR18 ( F i g . 7 b B ) . T h i s , i nc o n j u n c t i o n w i t h t h e 5 ' d e l e t i o n s t u d i e s a b o v e , i n d i c a t e s t h a ts e q u e n c e s r e q u i r e d f o r t e m p o r a l a c t i v a t i o n m u s t b e l o c a t e db e t w e e n - 2 7 a n d + 7 , t h e l i m i t s o f d e l e t i o n p l a s m i d sp A R 2 1 1 0 a n d p P L R 1 8 , r e s p e c t i v e l y . T h u s , t h e p r o m o t e ri t s e l f , a A _ - t y p e p r o m o t e r , h a s some c h a r a c t e r i s t i c m a k i n g i ts u b j e c t t o t e m p o r a l a c t i v a t i o n , o r s e q u e n c e s a r o u n d t h e - 1 0r e g i o n a r e i m p o r t a n t , o r b o t h .T h e d e l e t i o n o f s e q u e n c e s f r o m t h e 3 ' s i d e o f t h e a m y Rp r o m o t e r i n pPLR18 i n c l u d e d t h e l a s t f o u r b as es o f t h eo p e r a t o r r e g i o n . T h i s d e l e t i o n e l i m i n a t e d g l u c o s e c a t a b o l i t er e p r e s s i o n o f a m y R l - d i r e c t e d CAT p r o d u c t i o n ( F i g . 7 b ) . T h ei n s e r t i o n o f a H i n d l I l l i n k e r a t t h e H p a I s i t e , f r o m w h i c h t h ed e l e t i o n w a s m a d e , r e d u c e d c a t a b o l i t e r e p r e s s i o n o f a m y l a s ep r o d u c t i o n b y g l u c o s e a n d a l s o e l e v a t e d t h e l e v e l o f a m y l a s ep r o d u c e d ( F i g . 8 ) . T h e d o u b l i n g o f t h e l e v e l o f a m y l a s eh i n t e d t h a t t h e s a m e r e g i o n r e q u i r e d f o r c a t a b o l i t e r e p r e s s i o nm ay b e i n v o l v e d i n t h e h y p e r p r o d u c t i o n o f a m y l a s e i namyR2 m u t a n t s . Two o f t h e s i n g l e b a s e d i f f e r e n c e s b e t w e e namyRI a n d amyR2 a r e l o c a t e d w i t h i n t h e r e g u l a t o r y r e g i o nd e f i n e d b y t h e d e l e t i o n s . T h e a m y l a s e o p e r a t o r i s a l s ol o c a t e d p a r t i a l l y w i t h i n t h e s e l i m i t s . B o t h o f t h e s e b a s e sw e r e c h a n g e d i n amyRI t o t h e i r amyR2 c o u n t e r p a r t s . T h ef i r s t m u t a t i o n , M l , a TA=.GC c h a n g e a t + 7 , i s a d j a c e n t t ot h e 3 ' d e l e t i o n a n d i n s e r t i o n e n d p o i n t s d i s c u s s e d a b o v e . T h i sm u t a t i o n w e a k e n e d c a t a b o l i t e r e p r e s s i o n a n d d o u b l e d t h ea m o u n t o f a m y l a s e p r o d u c e d . T h i s s u g g es t e d t h a t t h e h y p e r -p r o d u c t i o n i n amyR2 m u t a n t s m a y b e r e l a t e d t o w e a k e n e dc a t a b o l i t e r e p r e s s i o n . T h e r e p r e s s o r m o l e c u l e m a y b ep r e s e n t t h r o u g h o u t g r o w t h a n d b i n d w e a k l y t o t h e o p e r a t o ru n l e s s i t i s a c t i v a t e d b y t h e p r e s e n c e o f e a s i l y m e t a b o l i z a b l ec a r b o n s o u r c e s , i n w h i c h c a s e i t w o u l d b i n d s t r o n g l y . T h i sh y p o t h e s i z e d w e a k b i n d i n g m ay a c t t o r e d u c e t r a n s c r i p t i o nf r o m t h e a m y p r o m o t e r . I t s h o u l d b e n o t e d , h o w e v e r , t h a tt h e g r a - 1 0 m u t a t i o n d o e s n o t c a u s e o v e r p r o d u c t i o n o f a m y -l a s e ( 2 5 ) . S o m e w h a t s u r p r i s i n g l y , t h o u g h , t h e s e c o n d b a s ed i f f e r e n c e , t h e TA='AT c h a n g e a t - 7 , a l s o d o u b l e d a m y l a s ep r o d u c t i o n . H o w e v e r , i t d i d n o t a l t e r t h e r e l a t i v e l e v e l o fc a t a b o l i t e r e p r e s s i o n . T h i s c h a n g e t o a n A r e s i d u e i s s i m i l a rt o a TA>AT c h a n g e a t - 5 , w h i c h i n c r e a s e d l a c U V 5 -d i r e c t e d CAT e x p r e s s i o n i n B . s u b t i l i s 3 . 5 - f o l d ( 1 2 ) . T h i sr e g i o n m a y b e i n v o l v e d i n o p e n c o m p l e x f o r m a t i o n a f t e rRNA p o l y m e r a s e i s b o u n d t o t h e p r o m o t e r ( 4 1 ) . I n g r a m -p o s i t i v e o r g a n i s m s , 62% o f t h e v e g e t a t i v e p r o m o t e r -1 0r e g i o n s a r e f o l l o w e d b y a n A a s t h e f i r s t b a s e ( 8 ) . An A a t t h i sp o s i t i o n m a y f a c i l i t a t e o p e n c o m p l e x f o r m a t i o n i n s o m e w a y .T h e e f f e c t o f t h e t w o m u t a t i o n s t o g e t h e r i s n o t s y n e r g i s t i c o re v e n a d d i t i v e ; h o w e v e r , t o g e t h er t h e y c a u s e a m y l a s e r e g u -l a t i o n t o l o o k m o s t l i k e t h a t i n amyR2 v a r i a n t s ( F i g . 1 0 ) .T h e 3 4 - b p r e g i o n s p a n n i n g t h e -1 0 r e g i o n o f t h e p r o m o t e rt h r o u g h t h e p u t a t i v e o p e r a t o r , a n d c o n t a i n i n g t h e t r a n s c r i p -t i o n s t a r t s i t e , a p p a r e n t l y i s s u f f i c i e n t t o r e g u l a t e t e m p o r a l

    9 -o -0 80x 7 -

    6 -

    .C )

    < 5 -z ; - )C ) 4 -0 )0. 3 -0 )

    c n s -E1-

    -3 -2 -1 0 1 2 3 4

    A Ba

    A A

    A0~~~~~~~A~~~~~~~~

    A/ * X/A.

    J . B A C T E R I O L .

  • 8/8/2019 Bacilus Subtilis Strain

    10/11

    B . SUBTILIS AMYLASE GENE PROMOTER 3 6 6 5a c t i v a t i o n o f t r a n s c r i p t i o n , c a t a b o l i t e r e p r e s s i o n , a n d h y p e r -p r o d u c t i o n i n a m v R 2 m u t a n t s . T h i s a n d p r e v i o u s s t u d i e s ( 2 5 )h a v e shown t h a t t e m p o r a l a c t i v a t i o n a n d c a t a b o l i t e r e p r e s -s i o n a r e g e n et i ca l l y s e p a r a b l e . H y p e r p r o d u c t i o n i n a l n y R 2s t r a i n s a l s o a p p e a r s t o b e i n d e p e n d e n t o f t e m p o r a l a c t i v a -t i o n . I t i s p l a u s i b l e t h a t a l l t h r e e r e g u l at o r y phenomena e x e r tt h e i r e f f e c t b y i n f l u e n c i n g o p e n c o m p l e x f o r m a t i o n .The r e g u l a t i o n o f a m y l a s e w a s m a i n t a i n e d e v e n when 1 0o r m o r e c op i e s o f t h e g e n e w e r e p r e s e n t . ( x - A m y l a s e r e g u -l a t i o n p r e s u m a b l y i n v o l v e s a r e g u l a t o r y phenomenon s h a r e db y o t h e r g e n e s ; t h u s , e f f e c t o r m o l e c u l e s i n v o l v e d i n a m y l a s er e g u l a t i o n m i g h t b e e x p e c t e d t o b e p r e s e n t i n r e l a t i v e a b u n -d a n c e . A c t i v a t i o n o f e x p r e s s i o n a f t e r t h e o n se t o f s t a t i o n a r yp h a s e i s s h a r e d b y m a n y g e n e s n o t d i r e c t l y c o n c e r n e d w i t hs p o r u l a t i o n . T h e s e i n c l u d e e n z y m e s s u c h a s s u c c i n a t e d e h y -d r o g e n a s e ( s d i l i [ 2 3 ] ) , a c o n i t a s e ( c i t B [ 3 3 1 ) , p r o t e a s e s , a n dRNases ( r e v i e w e d i n r e f e r e n c e 3 4 ) . G e n e s i n v o l v e d i n f l a -g e l l u m p r o d u c t i o n a n d m o t i l i t y ( 5 , 4 0 ) a n d m o s t c o m p e t e n c eg e n e s ( 1 ) a r e a l s o a c t i v a t e d a t t h e o ns e t o f s t a t i o n a r y p h a s e .Some o f t h e s e r e q u i r e m i n o r s i g m a f a c t o r s , l i k e t h e c t Up r o m o t e r t r a n s c r i b e d a f t e r T o b y E u J B ( 1 5 , 3 1 ) , o r t h ec o m p e t e n c e g e n e s , some o f w h i c h r e q u i r e E ( J H ( 1 ) .

    C at a b ol i t e r e p r e s s i o n b y g l u c o s e a n d o t h e r r e a d i l y m e t a b -o l i z e d c a r b o n s o u r c e s a f f e c t s s p o r u l a t i o n ( 2 0 ) a n d a l a r g enumber o f o t h e r g e n e s i n B . s u i b t i l i s , i n c l u d i n g s d h ( 2 3 ) , g n t( 7 ) , a n d c i t B ( 3 3 ) . S i n c e t e m p o r a l a c t i v a t i o n a n d c a t a b o l i t er e p r e s s i o n a p p e a r t o b e g l o b a l r e g u l a t o r y p h e n o m e n a , i t i sn o t s u r p r i s i n g t h a t a 1 0 - t o 1 5 - f o l d i n c r e a s e i n t h e c o p ynumber o f a s i n g l e g e n e d o e s n o t t i t r a t e o u t t h e r e g u l a t o r ym o l e c u l e s i n v o l v e d . W h e t h e r t h e s a m e r e g u l a t o r y m o l e c u l e sa r e i n v o l v e d f o r a l l t h e c a t a b o l i t e - r e p r e s s e d g e n e s i s s t i l lunknown.

    ACKNOWLEDGMENTSWe t h a n k S a v i t a P r a k a s h a n d J a e T h o r s t a d f o r t e c h n i c a l a s s i s -t a n c e , Ed P h i l l i p s f o r p h o t o g r a p h i c a s s i s t a n c e , Wayne N i c h o l s o na n d Dan G o n z a l e z f o r h e l p f u l s u g g e s t i o n s a n d d i s c u s s i o n , a n dK r i s t i n R e t z l a f f f o r a s s i s t a n c e i n p r e p a r i n g t h e m a n u s c r i p t .T h i s r e s e a r c h w a s s u p p o r t e d b y t h e C o l l e g e o f A g r i c u l t u r a l a n d

    L i f e S c i e n c e s o f t h e U ni v er s i ty o f W i s c o n s i n - M a d i s o n a n d b y P u b l i cH e a l t h S e r v i c e g r a n t GM34324 ( t o G . H . C . ) f r o m t h e N a t i o n a lI n s t i t u t e s o f H e al t h . M . J . W . w a s a N a t i o n a l I n s t i t u t e s o f H ea l t hp r e d o c t o r a l t r a i n e e ( P u b l i c H e a l t h S e r v i c e t r a i n i n g g r a n t G M 0 7 1 3 3 ) .

    LITERATURE CITED1 . A l b a n o , M . , J . H a h n , a n d D . D u b n a u . 1 9 8 7 . E x p r e s s i o n o fc o m p e t e n c e g e n e s i n B a c i l l u s s u b t i l i s . J . B a c t e r i o l . 1 6 9 : 3 1 1 0 -3 1 1 7 .2 . B a n d , L . , a n d D . J . H e n n e r . 1 9 8 4 . B a c i l l u s s i u b t i l i s r e q u i r e s a" s t r i n g e n t " S h i n e - D a l g a r n o r e g i o n f o r g e n e e x p r e s s i o n . DNA3 : 1 7 - 2 2 .3 . B a n n e r , C . D . , C . P . M o r a n , J r . , a n d R. L o s i c k . 1 9 8 3 . D e l e t i o na n a l y s i s o f a c o m p l e x p r o m o t e r f o r a d e v e l o p m e n t a l l y r e g u l a t e dg e n e f r o m B a c i l l u s s l u b t i l i s . J . M o l . B i o l . 1 6 8 : 3 5 1 - 3 6 5 .4 . C h a m b l i s s , G . H . , M . Won , M. J . W e i c k e r t , a n d W. L . N i c h o l -s o n . 1 9 8 8 . T r an s cr i p t i on o f t h e B a c i l l i t s s u i b t i l i s c x - a m y l a s e g e n e ,p . 8 5 - 8 9 . I n A . T . G a n e s a n a n d J . Hoch ( e d . ) , G e n e t i c s a n db i o t e c h n o l o g y o f b a c i l l i . A c a d e m i c P r e s s , I n c . , S a n D i e g o .5 . F e i n , J . E . 1 9 7 9 . P o s s i b l e i n v o l v e m e n t i n b a c t e r i a l a u t o l y t i ce n z y m e s i n f l a g e l l a r m o r p h o g e n e s i s . J . B a c t e r i o l . 1 3 7 : 9 3 3 - 9 4 6 .6 . F r e i e r , S . M . , R . K i e r z e k , J . A . J a e g e r , N . S u g i m o t o , M . H .C a r u t h e r s , T . N e i l s o n , a n d D . H . T u r n e r . 1 9 8 6 . I m p r o v e df r e e - e n e r g y p a r a m e t e r s f o r p r e d i c t i o n s o f RNA d u p l e x s t a b i l i t y .P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U SA 8 3 : 9 3 7 3 - 9 3 7 7 .7 . F u j i t a , Y . , a n d T . F u j i t a . 1 9 8 6 . I d e n t i f i c a t i o n a n d n u c l e o t i d es e q u e n c e o f t h e p r o m o t e r r eg io n o f t h e B a c i l l u s s u b h t i l i s g l u -c on at e o p e r o n. N u cl e i c A ci d s R e s . 1 4 : 1 2 3 7 - 1 2 5 2 .8 . G r a v e s , M. C . , a n d J . C . R a b i n o w i t z . 1 9 8 6 . I n i } i o a n d i n v i t r ot r a n s c r i p t i o n o f t h e C l o s t l ' i d i u u n p a s t e u r i a n u m f e r r e d o x i n g e n e .

    E v i d e n c e f o r " e x t e n d e d " p r o m o t e r e l e m e n t s i n G r a m - p o s i t i v eo r g a n i s m s . J . B i o l . C h e m . 2 6 1 : 1 1 4 0 9 - 1 1 4 1 5 .9 . G u s s i n , G . N . , C . W. R o n s o n , a n d F . M. A u s u b e l . 1 9 8 6 .R e g u l a t i o n o f n i t r o g e n f i x a t i o n g e n e s . A n n u . R ev . G en e t . 2 0 :5 6 7 - 5 9 1 .1 0 . H a n a h a n , D . 1 9 8 5 . T e c h n i q u e s f o r t r a n s f o r m a t i o n o f E . c o l i , p .1 0 9 - 1 3 5 . I n D. M . G l o v e r ( e d . ) , DNA c l o n i n g : a p r a c t i c a la p p r o a c h , v o l . 1 . IRL P r e s s , O x f o r d .1 1 . H e i n e k e n , F . G . , a n d R . J . O ' C o n n o r . 1 9 7 2 . C o n t i n u o u s c u l t u r es t u d i e s o n t h e b i o s y n t h e s i s o f a l k a l i n e p r o t e a s e , n e u t r a l p r o t e -a s e a n d s - a m y l a s e b y B a c i l l u s s u i b t i l i s N R R L - B 3 4 1 1 . J . G e n .M i c ro b i ol . 7 3 : 3 5- 4 4 .1 2 . H e n k i n , T . M . , a n d A . L . S o n e n s h e i n . 1 9 8 7 . M u t a t i o n s o f t h eE s c h e r i c h i a c o l i l a c U V 5 p r o m o t e r r e s u l t i n g i n i n c r e a s e d e x p r e s -s i o n i n B a c i l l u s s u i b t i l i s . M o l . G e n . G e n e t . 2 0 9 : 4 6 7 - 4 7 4 .1 3 . H e n n e r , D . J . , E . F e r r a r i , M. P e r e g o , a n d J . H o c h . 1 9 8 8 .L o c a t i o n o f t h e t a r g e t s o f t h e h p r - 9 7 , s a c U 3 2 ( H y ) , a n ds a c Q 3 6 ( H y ) m u t a t i o n s i n u p s t r e a m r e g i o n s o f t h e s u b t i l i s i np r o m o t e r . J . B a c t e r i o l . 1 7 0 : 2 9 6 - 3 0 0 .1 4 . H o l m e s , D . S . , a n d M. Q u i g l e y . 1 9 8 1 . A r a p i d b o i l i n g m e t h o d f o rt h e p r e p a r a t i o n o f b a c t e r i a l p l a s m i d s . A n a l . B i o c h e m . 1 1 4 :1 9 3 - 1 9 7 .1 5 . I g o , M. M . , a n d R . L o s i c k . 1 9 8 6 . R e g u l a t i o n o f a p r o m o t e r t h a ti s u t i l i z e d b y m i n o r f o r m s o f RNA p o l y m e r a s e h o l o e n z y m e i nB a c i l l u s s u i b t i l i s . J . M o l . B i o l . 1 9 1 : 6 1 5 - 6 2 4 .1 6 . K a l l i o , P . 1 9 8 6 . T h e e f f e c t o f t h e i n v e r t e d r e p e a t s t r u c t u r e o n t h ep r o d u c t i o n o f t h e c l o n e d B a c i l l u s a u n y l o l i q u e f a c i e n s a l p h a -a m y l a s e . E u r . J . B i o c h e m . 1 5 8 : 4 9 1 - 4 9 5 .1 7 . K a l l i o , P . , I . U l ma n e n , a n d I . P a l v a . 1 9 8 6 . I s o l a t i o n a n d c h a r a c -t e r i z a t i o n o f a 2 . 2 - k b o p e r o n p r e c e d i n g t h e c x - a m y l a s e g e n e o fB a c i l l u s a u n v l o l i q u e f a c c i e n s . E u r . J . B i o c h e m . 1 5 8 : 4 9 7 - 5 0 4 .1 8 . K u n s t , F . , M . P a s c a l , J . L e p e s a n t - K e j z l a r o v a , J . - A . L e p e s a n t , A .B i l l a u l t , a n d R . D e d o n d e r . 1 9 7 4 . P l e i o t r o p i c m u t a t i o n s a f f e c t i n gs p o r u l a t i o n c o n d i t i o n s a n d t h e s y n t h e s i s o f e x t r a c e l l u l a r e n -z y m e s i n B a c i l l u s s u b t i l i s 1 6 8 . B i o c h i m i e 5 6 : 1 4 8 1 - 1 4 8 9 .1 9 . L e p e s a n t , J . - A . , F . K u n s t , M. P a s c a l , J . K e j z l a r o v a - L e p e s a n t , M .S t e i n m e t z , a n d R . D e d o n d e r . 1 9 7 6 . S p e c i f i c a n d p l e i o t r o p i cr e g u l a t o r y m e c h a n i s m s i n t h e s u c r o s e s y s t e m o f B a c i l l u s s u i b t i l i s1 6 8 , p . 5 8 - 6 9 . I n D . S c h l e s i n g e r ( e d . ) , M i c r o b i o l o g y - 1 9 7 5 .A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y , W a s h i n g t o n , D . C .2 0 . L o s i c k , R . , P . Y o u n g m a n , a n d P . J . P i g g o t . 1 9 8 6 . G e n e t i c s o fe n d o s p o r e f o r m a t i o n i n B a c i l l u s s u i b t i l i s . A n n u . R e v . G e n e t .2 0 : 6 2 5 - 6 6 9 .

    2 1 . M a e d a , S . , Y . O z a w a , T . M i z u n o , a n d S . M i z u s h i m a . 1 9 8 8 .S t e r e o s p e c i f i c p o s i t i o n i n g o f t h e c i s - a c t i n g s e q u e n c e w i t h r e -s p e c t t o t h e c a n o n i c a l p r o m o t e r i s r e q u i r e d f o r a c t i v a t i o n o f t h eo u n p C g e n e b y a p o s i t i v e r e g u l a t o r , OmpR, i n E s c h e r i c h i a c o l i .J . M o l . B i o l . 2 0 2 : 4 3 3 - 4 4 1 .2 2 . M a n i a t i s , T . , E . F . F r i t s c h , a n d J . S a m b r o o k . 1 9 8 2 . M o l e c u l a rc l o n i n g : a l a b o r a t o r y m a n u a l . C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y ,C o l d S p r i n g H a r b o r , N . Y .2 3 . M e l i n , L . , K . M a g n u s s o n , a n d L . R u t b e r g . 1 9 8 7 . I d e n t i f i c a t i o n o ft h e p r o m o t e r o f t h e B a c i l l u s s u i b t i l i s s d h o p e r o n . J . B a c t e r i o l .1 6 9 : 3 2 3 2 - 3 2 3 6 .2 4 . M o r a n , C . P . , N . L a n g , C . D . B . B a n n e r , W. G . H a l d e n w a n g ,a n d R . L o s i c k . 1 9 8 1 . P r o m o t e r f o r a d e v e l o p m e n t a l l y r e g u l a t e dg e n e i n B a c i l l u s s u b t i l i s . C e l l 2 5 : 7 8 3 - 7 9 1 .2 5 . N i c h o l s o n , W. L . , a n d G . H . C h a m b l i s s . 1 9 8 5 . I s o l a t i o n a n dc h a r a c t e r i z a t i o n o f a c i s - a c t i n g m u t a t i o n c o n f e r r i n g c a t a b o l i t er e p r e s s i o n r e s i s t a n c e t o a - a m y l a s e s y n t h e s i s i n B a c i l l u s s u i b t i l i s .J . B a c t e r i o l . 1 6 1 : 8 7 5 - 8 8 1 .2 6 . N i c h o l s o n , W. L . , a n d G . H . C h am b l i s s . 1 9 8 6 . M o l e c u l a r c l o n i n go f c i s - a c t i n g r e g u l a t o r y a l l e l e s o f t h e B a c i l l u s s u i b t i l i s a m n y Rr e g i o n b y u s i n g g e n e c o n v e r s i o n t r a n s f o r m a t i o n . J . B a c t e r i o l .1 6 5 : 6 6 3 - 6 7 0 .2 7 . N i c h o l s o n , W. L . , a n d G . H . C h a m b l i s s . 1 9 8 7 . E f f e c t o f d e c o y -i n i n e o n t h e r e g u l a t i o n o f o x - a m y l a s e s y n t h e s i s i n B a c i l l u ss u i b t i l i s . J . B a c t e r i o l . 1 6 9 : 5 8 6 7 - 5 8 6 9 .2 8 . N i c h o l s o n , W. L . , G . H . C h a m b l i s s , L . B u c k b i n d e r , N . P .A m b u l o s , J r . , a n d P . S . L o v e t t . 1 9 8 5 . I s o l a t i o n a n d e x p r e s s i o n o fa c o n s t i t u t i v e v a r i a n t o f t h e c h l o r a m p h e n i c o l - i n d u c i b l e p l a s m i dg e n e c a t - 8 6 u n d e r c o n t r o l o f t h e B a c i l l u ( s s i b t i l i s 1 6 8 a m y l a s ep r o m o t e r . G e n e 3 5 : 1 1 3 - 1 2 0 .

    VOL. 1 7 1 , 1 9 8 9

  • 8/8/2019 Bacilus Subtilis Strain

    11/11

    3 6 6 6 WEICKERT AND CHAMBLISS2 9 . N i c h o l s o n , W. L . , Y . - K . P a r k , T . M. H e n k i n , M. Won , M. J .

    W e i c k e r t , J . A . G a s k e l l , a n d G . H . C h a m b l i s s . 1 9 8 7 . C a t a b o l i t er e p r e s s i o n r e s i s t a n t m u t a t i o n s o f t h e B a c i l l u s s i u b t i l i s a l p h a -a m y l a s e p r o m o t e r a f f e c t t r a n s c r i p t i o n l e v e l s a n d a r e i n a no p e r a t o r - l i k e s e q u e n c e . J . M o l . B i o l . 1 9 8 : 6 0 9 - 6 1 8 .3 0 . N o m u r a , M . , B . M a r u o , a n d S . A k a b o r i . 1 9 5 6 . S t u d i e s o na m y l a s e f o r m a t i o n b y B a c i l l u s s u b t i l i s . J . B i o c h e m . ( T o k y o )4 3 : 1 4 3 - 1 5 2 .3 1 . R a y , C . , M. I g o , W. S h a f e r , R . L o s i c k , a n d C . P . M o r a n , J r .1 9 8 8 . S u p p r e s s i o n o f c t c p r o m o t e r m u t a t i o n s i n B a c i l l i u s s u b t i l i s .J . B a c t e r i o l . 1 7 0 : 9 0 0 - 9 0 7 .3 2 . R i b a u d , O . , a n d M. S c h w a r t z . 1 9 8 4 . P o s i t i v e c o n t r o l o f t r a n -s c r i p t i o n i n i t i a t i o n i n b a c t e r i a . A n n u . R e v . G e n e t . 1 8 : 1 7 3 - 2 0 6 .3 3 . R o s e n k r a n t z , M. S . , D . W. D i ng m a n , a n d A . L . S o ne ns h e i n .1 9 8 5 . B a c i l l i u s s u b t i l i s c i t B g e n e i s r e g u l a t e d s y n e r g i s t i c a l l y b yg l u c o s e a n d g l u t a m i n e . J . B a c t e r i o l . 1 6 4 : 1 5 5 - 1 6 4 .3 4 . S c h a e f f e r , P . 1 9 6 9 . S p o r u l a t i o n a n d t h e p r o d u c t i o n o f a n t i b i o t -i c s , e x o e n z y m e s , a n d e x o t o x i n s . B a c t e r i o l . R e v . 3 3 : 4 8 - 7 1 .3 5 . S c h a e f f e r , P . , J . M i l l e t , a n d J . P . A u b e r t . 1 9 6 5 . C a t a b o l i t er e p r e s s i o n o f b a c t e r i a l s p o r u l a t i o n . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U SA5 4 : 7 0 4 - 7 1 1 .3 6 . S e k i g u c h i , J . , a n d H . O k a d a . 1 9 7 2 . R e g u l a t i o n o f a - am y l a s ep r o d u c t i o n i n a B a c i l l u s s u b t i l i s M a r b u r g s t r a i n . J . F e r m e n t .T e c h n o l . 5 0 : 8 0 1 - 8 0 9 .3 7 . S h a w , W. V . 1 9 7 5 . C h l o r a m p h e n i c o l a c e t y l t r a n s f e r a s e f r o mc h l o r a m p h e n i c o l - r e s i s t a n t b a c t e r i a . M e t h o d s E n z y m o l . 4 3 : 7 3 7 -7 5 5 .3 8 . S t e i n m e t z , M . , F . K u n s t , a n d R . D e d o n d e r . 1 9 7 6 . M a p p i n g o fm u t a t i o n s a f f e c t i n g s y n t h e s i s o f e x o c e l l u l a r e n z y m e s i n B a c i l l u ss u b t i l i s . M o l . G e n . G e n e t . 1 4 8 : 2 8 1 - 2 8 5 .3 9 . T a k a n o , J . - I . , T . K i n o s h i t a , a n d K . Y a m a n e . 1 9 8 7 . M o d u l a t i o no f B a c i l l u s s u b t i l i s o t - a m y l a s e p r o m o t e r a c t i v i t y b y t h e p r e s e n c eo f a p a l i n d r o m i c s e q u e n c e i n f r o n t o f t h e g e n e . B i o c h e m .B i o p h y s . R e s . Commun. 1 4 6 : 7 3 - 7 9 .

    4 0 . U m e d a , A . , a n d K . A m a k o . 1 9 8 0 . S p o r e o u t g r o w t h a n d t h ed e v e l o p m e n t o f f l a g e l l a i n B a c i l l u s s u b t i l i s . J . G e n . M i c r o b i o l .1 1 8 : 2 1 5 - 2 2 1 .4 1 . v o n H i p p e l , P . H . , D . G . B e a r , W. D . M o r g a n , a nd J . A .M c S w i g g e n . 1 9 8 4 . P r o t e i n - n u c l e i c a c i d i n t e r a c t i o n s i n t r a n s c r i p -t i o n : a m o l e c u l a r a n a l y s i s . A n n u . R e v . B i o c h e m . 5 3 : 3 8 9 - 4 4 6 .4 2 . W e i s b l u m , B . , M. Y . G r a h a m , T . G r y c z a n , a n d D . D u b n a u .1 9 7 9 . P l a s m i d c o p y n u m b e r c o n t r o l : i s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a -t i o n o f h i g h - c o p y - n u m b e r m u t a n t s o f p l a s m i d p E 1 9 4 . J . B a c t e -r i o l . 1 3 7 : 6 3 5 - 6 4 3 .4 3 . W i l l i a m s , D . M . , E . J . D u v a l l , a n d P . S . L o v e t t . 1 9 8 1 . C l o n i n gr e s t r i c t i o n f r a g m e n t s t h a t p r o m o t e e x p r e s s i o n o f a g e n e i nB a c i l l u s s u b t i l i s . J . B a c t e r i o l . 1 4 6 : 1 1 6 2 - 1 1 6 5 .4 4 . Y a m a g u c h i , K . , Y . N ag a t a , a n d B . M a r u o . 1 9 7 4 . I s o l a t i o n o fm u t a n t s d e f e c t i v e i n ( x - a m y l a s e f r o m B a c i l l u s s u b t i l i s : g e n e t i ca n a l y s i s . J . B a c t e r i o l . 1 1 9 : 4 1 6 - 4 2 4 .4 5 . Y a m a z a k i , H . , K . O h m u r a , A . N a k a y a m a , Y . T a k e i c h i , K .O t o z a i , M. Y a m a s a k i , G . T a m u r a , a n d K . Y a m a n e . 1 9 8 3 .a - A m y l a s e g e n e s ( a m y R 2 a n d a m y E + ) f r o m a n a - a m y l a s e -h y p e r p r o d u c i n g B a c i l l u . s s t u b t i l i s s t r a i n : m o l e c u l a r c l o n i n g a n dn u c l e o t i d e s e q u e n c e s . J . B a c t e r i o l . 1 5 6 : 3 2 7 - 3 3 7 .4 6 . Y a n g , M . , A . G a l i z z i , a n d D . H e n n e r . 1 9 8 3 . N u c l e o t i d e s e q u e n c eo f t h e a m y l a s e g e n e f r o m B a c i l l u s s u b t i l i s . N u c l e i c A c i d s R e s .1 1 : 2 3 7 - 2 4 8 .4 7 . Y a n i s c h - P e r r o n , C . , J . V i e i r a , a n d J . M e s s i n g . 1 9 8 5 . I m p r o v e dM13 p h a g e c l o n i n g v e c t o r s a n d h o s t s t r a i n s : n u c l e o t i d e s e -q u e n c e s o f t h e M 1 3 m p l 8 a n d p U C 1 9 v e c t o r s . G e n e 3 3 : 1 0 3 - 1 1 3 .4 8 . Y o n e d a , Y . , K . Y a m a n e , K . Y a m a g u c h i , Y . N a g a t a , a n d B .M a r u o . 1 9 7 4 . T r a n s f o r m a t i o n o f B a c i l l u s s u b t i l i s i n a o - a m y l a s ep r o d u c t i v i t y b y d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d f r o m B . s u b t i l i s v a r .a r n y l o s a c c h a r i t i c u s . J . B a c t e r i o l . 1 2 0 : 1 1 4 4 - 1 1 5 0 .4 9 . Y u k i , S . 1 9 6 8 . M a p p i n g o f a l n y H i n 1 6 8 o n t h e g e n e c o n t r o l l i n gt h e r a t e o f a m y l a s e p r o d u c t i o n i n B a c i l l u s s u b t i l i s . B i o c h e m .B i o p h y s . R e s . Commun. 3 1 : 1 8 2 - 1 8 7 .

    J . B A C T E R I O L .