KULIAH ANALISIS PANGAN TEKNOLOGI INDUSTRI PANGAN UNIVERSITAS PADJADJARAN

PENDAHULUAN Protein : senyawa berlimpah dlm sel

BM 5000 Dalton - > 1 juta Dalton Senyawa N membendakan protein dg makromolekul lain Total N 13,4 19,1 Protein yg kaya AA basa, N >

Dpt didenaturasikan oleh : panas, alkali, asam, 8M urea, pelarut organik dan detergent serta 6 M guanidin - HCl

Analisis Protein cukup kompleks krn : Bbrp komponen pangan sifat fisikokimia nya mirip protein Nitrogen non protein : AA bebas, peptida kecil, asam nukleat, fosfolipid, gula amino, porfirin, beberapa vitamin, alkaloid, asam urat, ion amonium Total N : >> dr protein

MANFAAT ANALISIS PROTEIN1. Penentuan aktivitas biologis Protein : enzim dan inhibitor enzim (enzim proteolitik, pektinase, tripsin inhibitor)2. Penelitian ttg sifat fungsional Memiliki sifat fungsional unik (gliadin dan glutenin utk roti, casein pd susu utk keju, albumen telur utk busa ) 3. Label Nutrisi

KANDUNGAN PROTEIN PADA PANGANSumber utama : pangan hewani dan legumJenis Pangan Susu penuh Keju cheddar Daging sapi Dada ayam Persen Protein (wb) 3,5 25,0 28,6 27,3

Telur mentahIkan tuna Beras pecah kulit Kedelai (kering) Terigu ( hard wheat) Polong-polongan (semua var.)

12,924,2 7,5 34,1 13,3 22,3

METODE ANALISISKJELDAHL Prinsip : Protein dan komp. Organik pangan dicerna oleh asam sulfat + katalis (total N organik amonium sulfat )1.

distilasi dlm asam borat titrasi dg asam standar

penetralan dg alkali kadar protein kasar

TAHAPAN UMUM ANALISIS1. Digestion / Destruksi

Ditambahkan asam sulfat : konversi Nitrogen mjd amonium sulfat 2. Netralisasi Diikuti dengan distilasi 3. Titrasi

Modifikasi Kjeldahl Ditambahkan katalis logam : Hg, Cu, Se pd H2SO4 utk

menyempurnakan digestion. Hg paling bagus K2SO4 di+kan utk meningkatkan titik didih H2SO4 shg mempercepat digestion Amonia didistilasi secara langsung dlm larutan asam borat diikuti dg titrasi dg asam standar

PROSEDUR ANALISIS Bhn padat dihaluskan ( dpt melewati saringan 20 mesh)1. Digestion

Sampel ditimbang dg akurat dlm labu kjeldahl. Tambahkan asam dan katalis Digest sampai jernih utk menghancurkan semua bhn organik. Reaksi N + H2SO4 = amonium sulfat

Protein

H2SO4 (NH4)2SO4

panas, katalis C, O mjd CO2 H, O mjd H2O 2. Netralisasi dan Distilasi Hasil digest diencerkan dg air. Alkali yg mgd Na tiosulfat di+ kan utk menetralkan H2SO4 Amonia yg terbentuk didistilasi dalam larutan asam borat yg mgd indikator metilen blue dan metil merah

(NH4)2SO4 + 2 NaOH NH3 + H3BO3 (asam borat)

2 NH3 + Na2SO4 + 2 H2O NH4 + H2BO3- ( (ion borat)

3. Titrasi Ion borat (proporsional dg jml N) ditirasi dg HCl standar H2BO3- + H+ H3BO3 4. Perhitungan Mol HCl = Mol NH3 = Mol N (dlm sampel) Blanko reagent juga hrs dibuat dan dititrasi % N = N HCl x vol. asam koreksi x 14 g N/mol x 100 g sampel

Dimana : N HCl = normalitas HCl ( mol / 1000ml) Vol. Asam koreksi = ml asam std utk sampel ml asam std untuk blanko 14 = Berat Atom N

% protein = % N atau 16

% protein = % N x 6,25

Umumnya protein mgd 16 % N shg faktor konversi = 100/16 = 6,25

Faktor konversi berbeda2 untuk setiap jenis panganJenis Pangan Telur & daging Susu Terigu % N dlm protein 16,0 15,7 18,0 Faktor konversi 6,25 6,38 5,70

JagungOat Kedelai

16,017,15 17,51

6,255,83 5,71

AplikasiKeuntungan : Dpt diaplikasikan untuk semua jenis pangan Metode relatif sederhana Murah Akurat untuk kadar protein kasar Kelemahan : Mengukur semua /total N organik ( bukan hanya dr protein) Butuh waktu relatif lama ( minimal 2 jam) Ketelitian lebih rendah dr metode Biuret Reagent korosif

2. Metode Biuret Prinsip : Terbentuknya warna ungu (violet-purpulish) yg dihasilkan ketika ion Cu membentuk kompleks dg rantai peptida ( senyawa mgd minimal 2 ikatan peptida, peptida panjang dan semua protein) pd kondisi alkali.

Intensitas warna diukur pd pj gel 540 nm Abs proporsional dg kadar protein pd contoh/sampel

Prosedur Reagent biuret sebanyak 5 mL dicampur dg 1 mL larutan

protein ( 1 10 mg protein /mL). Dalam reagent termasuk CuSO4, NaOH, KNa tartarat (digunakan utk menstabilkan ion Cu dlm larutan alkali). Dibiarkan pd suhu ruang selama 15 30 menit. Jika campuran tdk jernih, dilakukan sentrifugasi atau penyaringan. Selanjutnya absorbansi diukur pd 540 nm, dan koreksi dg blanko. Suatu kurva stndar juga dibuat yaitu konsentrasi vs absorbansi dg menggunakan bovin serum albumin (BSA)

Aplikasi : Digunakan utk menentukan kadar protein pada serealia, daging, kedelai, dan isolat protein.Keuntungan : Lebih murah daripada metode Kjeldahl Cepat ( dapat selesai < 30 menit) Metode paling sederhana utk analisis protein Sangat sedikit senyawa pengganggu yg dpt bereaksi dg biuret Tidak mendeteksi nitrogen dr senyawa non peptida atau non protein

Kelemahan : Tidak sangat sensitif dibandingkan metode Lowry ( Kandungan protein minimal 2 4 mg protein dlm contoh) Absorbansi dpt dipengaruhi /diperoleh dari pigmen bile jika ada . Konsentrasi yg tinggi dari garam amonium dpt menganggu reaksi Warna bervariasi dari protein yg berbeda ; gelatin (ungu merah jambu). Opalescence dpt terbentuk jika kandungan lipid atau karbohidrat tinggi. Bukan metode absolut; warna harus distandarkan dengan protein yg sdh diketahui (BSA) atau metode Kjeldahl

3. Metode LowryPrinsip : kombinasi reaksi Biuret dg reduksi reagent Folin Ciocalteau phenol (asam fosfomolibdat fosfotungstat) oleh residu tirosin dan triptofan dalam protein. Terbentuknya warna kebiruan diukur pd 750 nm ( sensitivitas tinggi utk kons protein rendah) atau 500 nm ( sensititvitas rendah utk konsentrasi protein tinggi)

Prosedur (modifikasi Hartree) : Sampel protein yg akan dianalisis dilarutkan dlm air sekitar 20 100 mg. Larutan K Na tartarat Na2CO3 ditambahkan dan stelah dingin dinkubasikan 10 menit pd T kamar Larutan CuSO4-K Na tartarat NaOH ditambahkan, setelah dingin diinkubasikan pd T kamar 10 menit. Reagent Folin segar ditambahkan, dicampur dan diinkubasikan 10 menit pd 500 C . Absorbansi diukur pd 650 nm Suatu kurva standar BSA dibuat untuk estimasi kons. Protein yg ingin diketahui.

Aplikasi : Krn sensitif maka sering digunakan pd protein biokimia Tdk umum digunakan untuk protein dlm sistem pangan tanpa diekstrak dulu protein dari pangan Keuntungan : Sangat sensitif : 50 -100 x lebih sensitif dr metode Biuret 10 20 x lebih sensitif dr abs uv 280 nm bbrp kali lebih sensitif dr metode ninhidrin Kurang dipengaruhi oleh kekeruhan sampel Lebih spesifik dr hampir semua metode Relatif sederhana ( 1 1,5 jam)

Kelemahan : Warna bervariasi tgt dr sumber protein ( > Biuret) Warna tdk proporsional tajam dg kandungan protein Reaksi diganggu oleh adanya sukrosa, lipid bufer fosfat, monosakarida dan hexoamina Konsentrasi yg tinggi dr gula reduksi, amonium sulfat dan senyawa sulfidril akan mengganggu reaksi

4. Metode Absorpsi UV 280 nmPrinsip : protein memiliki absorpsi kuat pd 280 nm terutama residu triptofan dan tirosin dr proteinKrn kandungan tirosin dan triptofan dlm masing2 protein konstan , Abs 280 nm dpt digunakan utk estimasi konsentrasi protein dg Hk. Beer

Prosedur : 1. Sampel dilarutkan dlm bufer atau alkali 2. Absorbansi dibaca pd 280 nm dg reagent blanko 3. Konsentrasi protein dihitung dg persamaan : A = abc

Aplikasi : Metode ini telah digunakan untuk menentukan kadar protein pd : Susu dan produk daging. Metode ini tidak digunakan luas dlm sistem pangan Metode ini lebih baik diaplikasikan pd sistem protein yg sdh dimurnikan atau protein yg telah diekstrak dlm alkali atau agen pendenaturasi spt 8 M urea Keuntungan : Cepat dan relatif sensitif ( > Biuret) Tidak ada gangguan dr amonium sulfat dan bufer Non destructive Sering digunakan pd protein yg telah diseparasi dg kolom

Kelemahan : Asam nukleat juga menyerap pd 280 nm Larutan hrs jernih dan tdk berwarna Metode ini memerlukan sistem yg relatif murni

5. Metode NinhidrinPrinsip : Asam amino, amonia dan gugus amino primer dlm protein, jika didihkan pd bufer pH 5,5 dalam ninhidrin dan hidrindantin akan membentuk warna ungu RuhemannProsedur : Campurkan 1 mL larutan sampel dg 1 mL larutan Ninhidrin Panaskan dlm waterbath selama 15 menit Tambahkan 5 mL etanol atau propanol, kocok dan dinginkan Baca absorbansi pd 570 nm dg blanko air

Aplikasi : Tidak digunakan secara luas untuk menghitung protein dlm pangan. Dpt digunakan untuk menentukan hidrolisis rantai peptida selama proses pengolahan pangan Keuntungan : relatif cepat dibandingkan Kjeldahl Kelemahan : Adanya sejumlah kecil AA, peptida, amina primer dan amonia menyebabkan estimasi yg berlebihan thd kand. Protein Ketelitian rendah Warna bervariasi terhadap bebrbagai komposisi AA. Prolin abs max 440 nm ; AA lain 570 nm Kurva standar kalibrasi hrs dibuat untuk setiap kali analisis.

6. Metode Kekeruhan (Turbidimetri)Prinsip : Konsentrasi rendah (3 10 %) asam trikloroasetat, asam sulfosalisilat dan Kalium ferrisianida dlm asam asetat dpt digunakan utk menggumpalkan ekstrak protein membentuk suspensi yg keruh dr partikel protein.

Prosedur ( protein terigu dg asam sulfosalisilat) : Tepung terigu diekstrak dg 0,05 N NaOH Protein yg larut dlm alkali dipisahkan dg material tak larut

dg acara sentrifugasi Asam salisilat dicampurkan dg prosi seimbang dg larutan protein Tingkat kekeruhan diukur dg cahaya yg diteruskan pd 540 nm dg reagen blanko Kadar protein diestimasi dg kurva kalibarsi yg menggunakan metode kjeldahl

Aplikasi :Metode ini telah digunakan utk mengukur kadar protein terigu dan jagung Keuntungan : Cepat ( selesai dlm 15 menit) Tidak mengukur N non protein kecuali asam nukleat Kelemahan : Protein berbeda digunpalkan dg kecepatan berbeda Kekeruhan bervariasi tergantung kons. Asam Asam nukleat juga digunpalkan oleh reagen asam

Perbandingan Berbagai MetodePreparasi Sampel : Metode Kjeldahl butuh sedikit preparasi (ukuran partikel minimal 20 mesh) Metode lain Butuh partikel yg sangat halus utk ekstraksi protein Prinsip : Metode Kjeldahl total N organik dlm sampel Metode lain mengukur sifat fisiokimia protein Contoh : metode Biuret mengukur ikatan/rantai peptida metode lowry mengukur rantai peptida dan AA tirosin da n triptofan

Sensivitas : Kjeldahl, Biuret kurang sensitif dibandingkan metode UV, dan Lowry Kecepatan : Penentuan dg metode kolorimetri lebih cepat drpd Kjeldahl Metode yg melibatkan pengukuran dg spektrofotometer biasanya hrs memisahkan dulu materi pengganggu (tak larut) sebelum atau setelah direaksikan dg reagent pewarna

Pertimbangan Khusus1. Memilih metode utk aplikasi tertentu hrs mempertimbangkan sensiti vitas, akurasi, reproducibility da n sifat fisiokimia pangan. 2. Proses pengolahan pangan spt pemanasan dpt mengurangi extracability protein ( kadar < sebenarnya) utk metode yg melalui tahap ekstraksi. 3. Semua metode kecuali Kjeldahl dan metode UV utk protein yg sdh dimurnikan, membutuhkan protein referensi / standar atau kalibrasi dg metode Kjeldahl. Pemilihan standar yg tepat utk pangan tertentu mrp hal yg sangat penting .

4. Nitrogen non protein terdapat pd hampir semua pangan. Untuk menentukan nitrogen protein, sampel biasanya diekstrak dg alkali dan diikuti dg penggumpalan dg asam trikloroasetat, atau sulfosalisilat 5. Untuk menentukan nilai nutrisi protein pangan ( daya cerna protein dan rasio efisiensi protein =PER), metode Kjeldahl dg faktor konversi 6,25 biasanya digunakan utk kadar prootein kasar