TEORI BEBERAPA PENGHASIL POLIKETIDA

30

I SIMPLISIA DAN EKSTRAK

1.1 Tinjauan Umum Simplisia

Obat tradisional bukan hal yang baru bagi masyarakat Indonesia. Sebelum obat-obat kimia berkembang secara modern, nenek moyang kita umumnya menggunakan obat-obatan yang berasal dari tumbuh-tumbuhan untuk mengatasi problem kesehatannya.

Dari tumbuhan obat tersebut dapat dibuat berbagai produk yang sangat bermanfaat dalam menunjang industri obat tradisional, farmasi, makanan dan minuman. Ragam bentuk hasil olahannya, antara lain berupa simplisia.

Simplisia adalah bahan baku alamiah yang digunakan untuk membuat ramuan obat tradisional yang belum mengalami pengolahan pengeringan. Proses pembuatan simplisia pada prinsipnya meliputi tahap-tahap pencucian, pengecilan ukuran dan pengeringan.

2.2 Macam-Macam Teknik Pembuatan Simplisia dan Sediaan Obat (Ekstraksi, Maserasi, dan Perkolasi)

Ekstraksi adalah suatu proses pemisahan dari bahan padat maupun cair dengan bantuan pelarut. Pelarut yang digunakan harus dapat mengekstrak substansi yang diinginkan tanpa melarutkan material lainnya. Ekstraksi merupakan proses pemisahan suatu bahan dari campurannya, ekstraksi dapat dilakukan dengan berbagai cara. Ekstraksi menggunakan pelarut didasarkan pada kelarutan komponen terhadap komponen lain dalam campuran (Suyitno, 1989).

Ekstraksi padat cair atau leaching adalah transfer difusi komponen terlarut dari padatan inert ke dalam pelarutnya. Proses ini merupakan proses yang bersifat fisik karena komponen terlarut kemudian dikembalikan lagi ke keadaan semula tanpa mengalami perubahan kimiawi. Ekstraksi dari bahan padat dapat dilakukan jika bahan yang diinginkan dapat larut dalam solven pengekstraksi. Ekstraksi berkelanjutan diperlukan apabila padatan hanya sedikit larut dalam pelarut. Namun sering juga digunakan pada padatan yang larut karena efektivitasnya. [Lucas, Howard J, David Pressman. Principles and Practice In Organic Chemistry]

Faktor-faktor yang mempengaruhi laju ekstraksi adalah :Tipe persiapan sampleWaktu ekstraksiKuantitas pelarutSuhu pelarutTipe pelarut

Ekstraksi bahan makanan biasa dilakukan untuk mengambil senyawa pembentuk rasa bahan tersebut. Misalnya senyawa yang menimbulkan bau dan/atau rasa tertentu.

Secara umum, terdapat empat situasi dalam menentukan tujuan ekstraksi :

1)Senyawa kimia telah diketahui identitasnya untuk diekstraksi dari organisme. Dalam kasus ini, prosedur yang telah dipublikasikan dapat diikuti dan dibuat modifikasi yang sesuai untuk mengembangkan proses atau menyesuaikan dengan kebutuhan pemakai.

2)Bahan diperiksa untuk menemukan kelompok senyawa kimia tertentu, misalnya alkaloid, flavanoid atau saponin, meskipun struktur kimia sebetulnya dari senyawa ini bahkan keberadaannya belum diketahui. Dalam situasi seperti ini, metode umum yang dapat digunakan untuk senyawa kimia yang diminati dapat diperoleh dari pustaka. Hal ini diikuti dengan uji kimia atau kromatografik yang sesuai untuk kelompok senyawa kimia tertentu.

3)Organisme (tanaman atau hewan) digunakan dalam pengobatan tradisional, dan biasanya dibuat dengan cara, misalnya Tradisional Chinese medicine (TCM) seringkali membutuhkan herba yang dididihkan dalam air dan dekok dalam air untuk diberikan sebagai obat. Proses ini harus ditiru sedekat mungkin jika ekstrak akan melalui kajian ilmiah biologi atau kimia lebih lanjut, khususnya jika tujuannya untuk memvalidasi penggunaan obat tradisional.

4)Sifat senyawa yang akan diisolasi belum ditentukan sebelumnya dengan cara apapun. Situasi ini (utamanya dalam program skrining) dapat timbul jika tujuannya adalah untuk menguji organisme, baik yang dipilih secara acak atau didasarkan pada penggunaan tradisional untuk mengetahui adanya senyawa dengan aktivitas biologi khusus.

Proses pengekstraksian komponen kimia dalam sel tanaman yaitu pelarut organik akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif, zat aktif akan larut dalam pelarut organik di luar sel, maka larutan terpekat akan berdifusi keluar sel dan proses ini akan berulang terus sampai terjadi keseimbangan antara konsentrasi cairan zat aktif di dalam dan di luar sel.

Prinsip ekstraksi :

1)Prinsip Maserasi

Penyarian zat aktif yang dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari yang sesuai selama tiga hari pada temperatur kamar terlindung dari cahaya, cairan penyari akan masuk ke dalam sel melewati dinding sel. Isi sel akan larut karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan di dalam sel dengan di luar sel. Larutan yang konsentrasinya tinggi akan terdesak keluar dan diganti oleh cairan penyari dengan konsentrasi rendah (proses difusi). Peristiwa tersebut berulang sampai terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan di luar sel dan di dalam sel. Selama proses maserasi dilakukan pengadukan dan penggantian cairan penyari setiap hari. Endapan yang diperoleh dipisahkan dan filtratnya dipekatkan.

Maserasi merupakan cara penyarian sederhana yang dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari selama beberapa hari pada temperatur kamar dan terlindung dari cahaya. Metode maserasi digunakan untuk menyari simplisia yang mengandung komonen kimia yang mudah larut dalam cairan penyari, tidak mengandung benzoin, tiraks dan lilin.

Keuntungan dari metode ini adalah peralatannya sederhana. Sedang kerugiannya antara lain waktu yang diperlukan untuk mengekstraksi sampel cukup lama, cairan penyari yang digunakan lebih banyak, tidak dapat digunakan untuk bahan-bahan yang mempunyai tekstur keras seperti benzoin, tiraks, dan lilin. Metode maserasi dapat dilakukan dengan modifikasi, seperti modifikasi maserasi melingkar, modifikasi maserasi digesti, modifikasi maserasi melingkar bertingkat, modifikasi remaserasi, modifikasi dengan mesin pengaduk, dan metode Soxhletasi.

Keuntungan metode ini adalah :Dapat digunakan untuk sampel dengan tekstur yang lunak dan tidak tahan terhadap pemanasan secara langsung.Digunakan pelarut yang lebih sedikit.Pemanasannya dapat diatur.Kerugian dari metode ini:Karena pelarut didaur ulang, ekstrak yang terkumpul pada wadah di sebelah bawah terus-menerus dipanaskan sehingga dapat menyebabkan reaksi peruraian oleh panas.Jumlah total senyawa-senyawa yang diekstraksi akan melampaui kelarutannya dalam pelarut tertentu sehingga dapat mengendap dalam wadah dan membutuhkan volume pelarut yang lebih banyak untuk melarutkannya.Bila dilakukan dalam skala besar, mungkin tidak cocok untuk menggunakan pelarut dengan titik didih yang terlalu tinggi, seperti metanol atau air, karena seluruh alat yang berada di bawah komdensor perlu berada pada temperatur ini untuk pergerakan uap pelarut yang efektif.

Metode ini terbatas pada ekstraksi dengan pelarut murni atau campuran azeotropik dan tidak dapat digunakan untuk ekstraksi dengan campuran pelarut, misalnya heksan :diklormetan = 1 : 1, atau pelarut yang diasamkan atau dibasakan, karena uapnya akan mempunyai komposisi yang berbeda dalam pelarut cair di dalam wadah.

Prinsip Perkolasi

Metode ini terbatas pada ekstraksi dengan pelarut murni atau campuran azeotropik dan tidak dapat digunakan untuk ekstraksi dengan campuran pelarut, misalnya heksan :diklormetan = 1 : 1, atau pelarut yang diasamkan atau dibasakan, karena uapnya akan mempunyai komposisi yang berbeda dalam pelarut cair di dalam wadah.

II TEORI BEBERAPA PENGHASIL POLIKETIDA

LICHENS (LUMUT KERAK)

Lichenes (lumut kerak) merupakan gabungan antara fungi dan algae sehingga secara morfologi dan fisiologi merupakan satu kesatuan. Lumut kerak ini hidup secara epifit pada pohon-pohonan, di atas tanah terutama di daerah sekitar kutub utara, di atas batu cadas, di tepi pantai atau gunung-gunung yang tinggi. Tumbuhan ini tergolong tumbuhan perintis yang ikut berperan dalam pembentukan tanah. Tumbuhan ini bersifat endolitik karena dapat masuk pada bagian pinggir batu. Lichens menghasilkan lebih dari 500 senyawa biokimia yang unik untuk dapat beradaptasi pada habitat yang ekstrim. Senyawa tersebut berguna untuk mengontrol sinar terik matahari, mengusir atau menolak (repellen) herbivora, membunuh mikroba dan mengurangi kompetisi dengan tumbuhan, dan lainnya. Diantaranya berbagai jenis pigmen dan antibiotik yang juga membuat lichens ini sangat berguna bagi manusia pada masyarakat tradisional. Tumbuhan ini memiliki warna yang bervariasi seperti putih, hijau keabuabuan, kuning, oranye, coklat, merah dan hitam.Algae dan jamur bersimbiosis membentuk lichens baru jika bertemu jenis yang tepat. Dimana sedikit banyak berpengaruh, seperti jamur tidak bisa melakukan fotosintesis, kemampuan ini secara alami dilakukan secara bebas oleh algae. Lichens biasanya ditemukan disekitar lingkungan dimana organisme lain tidak dapat tumbuh dan mereka berhasil membuat suatu koloni pada lingkungan tersebut yang dikarenakan oleh hubungan mutualisme antara algae dengan jamur. Para ahli mengemukakan berbagai pendapat mengenai pengelompokan atau klasifikasi lichens dalam dunia tumbuhan. Ada yang berpendapat bahwa lichens dimasukkan ke dalam kelompok yang tidak terpisah dari jamur, tapi kebanyakan ahli berpedapat bahwa lichens perlu dipisahkan dari fungi atau menjadi golongan tersendiri. Alasan dari pendapat yang kedua ini adalah karena jamur yang membangun tubuh lichens tidak akan membentuk tubuh lichens tanpa algae. Hal lain didukung oleh karena adanya zat-zat hasil metabolisme yang tidak ditemui pada algae dan jamur yang hidup terpisah.Sebagian besar lichens tumbuh secara ekstrim lambat untuk tumbuh 2 cm saja, lichens yang tumbuh pada batu bisa menempuh waktu bertahun-tahun. Pengukuran pertumbuhan lichens, berkisar antara 1 mm per tahun tetapi tidak lebih 3 cm/tahun tergantung dari organisme yang bersimbiosis, banyaknya hujan yang turun dan sinar matahari yang didapat, dan cuaca pada umumnya. Walaupun lichens hidup tumbuh dialam pada kondisi yang tidak menguntungkan, lichens sangat sensitif terhadap pencemaran udara dan cepat menghilang pada daerah yang mempunyai kadar polusi udara yang berat. Salah satu yang menyebabkan ini terjadi lichens dapat menyerap dan mengendapkan mineral dari air hujan dan udara dan tidak dapat mengeluarkannya sehingga konsentrasi senyawa yang mematikan seperti SO2 sangat mudah masuk.

MORFOLOGI THALLUS

Tubuh lichens dinamakan thallus yang secara vegetatif mempunyai kemiripan dengan algae dan jamur. Thallus ini berwarna abu-abu atau abu-abu kehijauan. Beberapa spesies ada yang berwarna kuning, oranye, coklat atau merah dengan habitat yang bervariasi. Bagian tubuh yang memanjang secara selluler dinamakan hifa. Hifa merupakan organ vegetatif dari thallus atau miselium yang biasanya tidak dikenal pada jamur yang bukan lichens. Algae selalu berada pada bagian permukaan dari thallus. Berdasarkan bentuknya lichens dibedakan atas empat bentuk :CrustoseLichens yang memiliki thallus yang berukuran kecil, datar, tipis dan selalu melekat ke permukaan batu, kulit pohon atau di tanah. Jenis ini susah untuk mencabutnya tanpa merusak substratnya. Contoh : Graphis scipta, Haematomma puniceum, Acarospora atau Pleopsidium.

Haematomma accolens Acarospora

Lichen Crustose yang tumbuh terbenam di dalam batu hanya bagian tubuh buahnya yang berada di permukaan disebut endolitik, dan yang tumbuh terbenam pada jaringan tumbuhan disebut endoploidik atau endoploidal. Lichen yang longgar dan bertepung yang tidak memiliki struktur berlapis, disebut leprose.

Caloplaca luteominea subspesies bolanderi (lichen endolitik)FolioseLichen foliose memiliki struktur seperti daun yang tersusun oleh lobuslobus. Lichen ini relatif lebih longgar melekat pada substratnya. Thallusnya datar, lebar, banyak lekukan seperti daun yang mengkerut berputar. Bagian permukaan atas dan bawah berbeda. Lichens ini melekat pada batu, ranting dengan rhizines. Rhizines ini juga berfungsi sebagai alat untuk mengabsorbsi makanan. Contoh : Xantoria, Physcia, Peltigera, Parmelia dan lainnya.

Xantoria elegans Physcia aipolia Peltigera malacea Parmelia sulcata

FruticoseThallusnya berupa semak dan memiliki banyak cabang dengan bentuk seperti pita. Thallus tumbuh tegak atau menggantung pada batu, daun-daunan atau cabang pohon. Tidak terdapat perbedaan antara permukaan atas dan bawah. Contoh : Usnea, Ramalina dan Cladonia.

Usnea longissima Cladonia perforate Ramalina stenospora

SquamuloseLichen ini memiliki lobus-lobus seperti sisik, lobus ini disebut squamulus yang biasanya berukuran kecil dan saling bertindih dan sering memiliki struktur tubuh buah yang disebut podetia.

Psora pseudorusselli Cladonia carneola

KEGUNAAN EKONOMI LICHENS

Lichens memiliki bermacam-macam kegunaan dan bahaya, antara lain :Lichens sebagai bahan makanan

Thallus dari lichens belum digunakan sebagai sumber makanan secara luas, karena lichens memiliki suatu asam yang rasanya pahit dan dapat menimbulkan gatal-gatal, khususnya asam fumarprotocetraric. Asam ini harus dibuang terlebh dahulu dengan merebusnya dalam soda. Tanaman ini mempunyai nilai, walaupun tidak sama dengan makanan dari biji-bijian. Pada saat makanan sulit didapat, orang-orang menggunakan lichens sebagai sumber karbohidrat dengan mencampurnya dengan tepung. Di Jepang disebut Iwatake, dimana Umbilicaria dari jenis foliose lichens digoreng atau dimakan mentah.Lichens juga dimakan oleh hewan rendah maupun tingkat tinggi seperti siput, serangga, rusa dan lain-lain. Rusa karibu menjadikan sejumlah jenis lichens sebagai sumber makanan pada musim dingin, yang paling banyak dimakan adalah Cladina stellaris. Kambing gunung di Tenggara Alaska memakan lichens dari jenis Lobaria linita. Umbilicaria placeCityamericana Cladina stellaris Lobaria linita

Lichens sebagai obat-obatan

Pada abad pertengahan lichens banyak digunakan oleh ahli pengobatan. Lobaria pulmonaria digunakan untuk menyembuhkan penyakit paru-paru karena Lobaria dapat membentuk lapisan tipis pada paru-paru. Selain itu lichens juga digunakan sebagai ekspektoran dan obat liver. Sampai sekarang penggunaan lichens sebagai obat-obatan masih ada.Dahulu di Timur Jauh, Usnea filipendula yang dihaluskan digunakan sebagai obat luka dan terbukti bersifat antibakteri. Senyawa asam usnat (yang terdapat dalam ekstrak spesis Usnea) saat ini telah digunakan pada salep antibiotik, deodoran dan herbal tincture. Spesies Usnea juga digunakan dalam pengobatan Cina, pengobatan homeopathic, obat tradisional di kepulauan Pasifik, Selandia Baru dan lain benua selain placecountry-regionAustralia. Banyak jenis lichens telah digunakan sebagai obat-obatan, diperkirakan sekitar 50% dari semua spesies lichens memiliki sifat antibiotik. Penelitian bahan obat-obatan dari lichens terus berkembang terutama di Jepang. Lobaria pulmonaria Usnea filipendula

Lichens sebagai antibiotik

Substrat dari lichens yaitu pigmen kuning asam usnat digunakan sebagai antibiotik yang ampu menghalangi pertumbuhan Mycobacterium. Cara ini telah digunakan secara komersil. Salah satu sumber dari asam usnat ini adalah Cladonia dan antibiotik ini terbukti ampuh dari penisilin. Selain asam usnat terdapat juga zat lain seperti sodium usnat, yang terbukti ampuh melawan kanker tomat. Virus tembakau dapat dibendung dan dicegah oleh ekstrak lichens yaitu : lecanoric, psoromic dan asam usnat.

Lichens yang berbahaya

Pigmen kuning yang berasal dari jenis Usnea dan Everia dapat menyebabkan alergi pada kulit dan menyebabkan gatal-gatal. Abu soredia yang melekat pada kulit akan menimbulkan rasa gatal. Lichen serigala atau Letharia vulpina adalah lichen beracun. Dari namanya menggambarkan kegunaannya secara tradisional di bagian utara Eropa sebagai racun untuk serigala. Bangsa Achomawi menggunakannya (kadang-kadang dicampur dengan bisa ular) untuk membuat panah beracun. Walaupun demikian, suku Blackfoot dan Okanagan-Colville memakai Letharia sebagai teh obat.

Kegunaan lain dari lichen

Dari hasil ekstraksi Everina, Parmelia, dan Ramalina diperoleh minyak. Beberapa di antaranya digunakan untuk sabun mandi dan parfum. Di Mesir digunakan sebagai bahan pembungkus mummi dan campuran buat pipa cangklong untuk merokok, khususnya Parmelia audina yang mengandung asam lecanoric. Ekstrak lichens dapat juga dibuat sebagai bahan pewarna untuk mencelup bahan tekstil. Bahan pewarna di ekstrak dengan cara merebus lichens dalam air, dan sebagian jenis lain diekstrak dengan cara fermentasi lichens dalam amonia. Parmelia sulcata digunakan untuk pewarna wol di Amerika Utara.

Evernia prunastri yang tumbuh di ranting pohon oak diUtara California. Spesies ini di diproduksi secara komersialdi Eropa dan dikirim ke Perancis untuk industri parfum.

DAFTAR PUSTAKA

Bold, H.C., C.J. Alexopoulus, T. Delevoryas, 1987. Morphology of Plants andFungi. Fifth edition. Harper and Row Publishers. placeStateNew York.

Duta, A.C. 1968. Botany for Degree Stuudens. placePlaceNameOxford PlaceTypeUniversity Press. Bombay-Calcuta-Madras.

Misra, A. ,R.P. Agrawal. 1978. Lichens (A Preliminary Text). placeCityOxford and IBHPublishing Co. New York-Bombay-Calcuta.

Sharnoff. S. D. 2002. Lichen Biology And The Environment The Special Biology Of Lichens. http:/ www.lichen.com.

_________________. Lichens And Wildlife. http://www.lichen.com

_________________. Lichens And People. For a Bibliographical Database of the Human Uses of Lichens. http://www.lichen.com

Tjitrosoepomo, G. 1989. Taksonomi Tumbuhan. placePlaceNameGadjah PlaceNameMada PlaceTypeUniversity Press. placeYogyakarta.

PERCOBAAN 1

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI MINYAK ATSIRI

A. ISOLASI DAN IDENTIFIKASI KOMPONEN MUDAH MENGUAP DARI DAUN KAYU PUTIH ATAU DARI KULIT BUAH JERUK.

Tujuan:Setelah mengikuti praktikum, diharapkan mahasiswa dapat memahami dan menerapkan cara pemakaian TAS OVEN dan ALAT DESTILASI STAHL.

Pendahuluan:TAS OVEN (Tanur TAS) adalah alat untuk deteksi komponen yang mudah menguap atau menyublim dari suatu bahan placeCitybaku alami (simplisia). Alat destilasi STAHL adalah alat yang digunakan untuk menentukan kadar minyak atsiri dari suatu bahan placeCitybaku alami (simplisia).Prinsip kerja dari tanur TAS dan alat destilasi Stahl dapat dipelajari di Materia Medika.

Prinsip Kerja:Alat destilasi Stahl dirakitsedemikian rupa sehingga dengan alat ini dapt dilakukan penyulingan dengan air dari simplisia, sedang destilat yang terdiri dari campurang antara minyak atisiri dan air, dapat tertampung dalam penampung berskala sehingga volume minyak atisiri yang tertampung dapat segera terbaca.Perangkat tanur TAS disusun sedemikian rupa sehingga dapat dilaekukan penguapan dan sublimasi senyawa-senyawa yang mudah menguap dan menyublim, setelah itu uap maupun sulimate yang terjadi ditampung pada suatu lemeng kromatografi,. Noda ang terdap;at dalam lempeng kemudian diseparasi dengan kromatografi lapis tipis.

Bahan:Daun kayu putih atau kulit buah jeruk.Minyak kayu putih.Larutan elusi kromatografi.Lempeng kromatografi GF 254 ukuran 5 x 7,5 cmLarutan pewarna anisaldehid asam sulfat.Larutan pewarna FeCl3.

Alat:Perangkat alat Stahl.Perangkat tanur TASBejana KLTPipa kapiler.Corong pisah kecilCorong gelas kecil.

Cara Kerja:Pasang alat destilasi Stahl sesuai petunjuk. Masukkan 100 gram simplisia, kemudian lakukan destilasi selama 2 jam. Ukur minyak yang diperoleh untuk mengetahui randemen. Pisahkan minyak atsiri dari air, kemudian larutkan dalam etanol. Siapkan tanur TAS sesuai petunjuk. Sebagai sampel yang diaplikasikan yaitu serbuk daun kayu putih. Suhu operasi 150oC. Jumlah totolan 2.Totolkan larutan minyak kayu putih pada lempeng yang telah tersedia, dengan pipa kapiler. Jumlah totolan 2, dibuat berseling seling degan totolan minyak atisiri daun kayu putih dan totolan dari tanur TAS.

Evaluasi lempeng KLT tersebut dengan kondisi:Fase diam: silika gel GF 254Fase gerak: Heksana : etil asetat = 7:3 v/vPenampak bercak: anisaldehid asam sulfat dan larutan FeCl3.

Amati keempat kromatogram tersebut. Perhatikan perbedaan kandungan masing-masing bercak.

Tugas:Mengapa kromatogram minyak atsiri dan hasil TAS kadang-kadang berbeda?Zat-zat apa saja yang menyusun minyak atsiri kayu putih?

B. ISOLASI DAN IDENTIFIKASI MINYAK ATSIRI DARI DAUN KAYU PUTIH(Cara Kerja seperti pada point A)

C. ISOLASI DAN IDENTIFIKASI ETIL PARA METOKSI SINAMAT DARI RIMPANG (Kaemferia galanga)

Tujuan Praktikum:Pada akhir praktikum ini diharapkan mahasiswa memahami prinsip langkah-langkah dan mampu melakukan isolasi etil para metoksi sinamat serta identifikasi isolat secara kualitatif.

Pendahuluan:Etil para metoksisinamat merupakan kandungan kimia utama ripang kencur (Kaemferia galanga) dengan aktivitas analgetik dan diduga bertanggung jawab pula terhadap efek penambah nafsu makan rimpang tersebut. Sebagai turunan senyawa fenol, etil para metoksi sinamat dapat dideteksi dengan pereaksi yang emruapakna senyawa aldehid seperti anisaldehid asam sulfat dan vanilin asam sulfat. Sebagai ester asam sinamat dengan gugus fenol yang termetilasi, polaritasnya relatif tidak tinggi. Larut baik dalam heksan, petroleum eter tetapi juga larut dalam etanol, tidak larut dalam air.

Prinsip Kerja:Etil para metoksi sinamat larut dalam etanol dan merupakan komponen utama secara kuantitatif sehingga dapat diekstraksi dengan etanol dan kristalisasi melalui pemekatan dan pendinginan.

Bahan:Rimpang kencur 30 gramEtanol 95% 250 ml

Alat:Botol bertutup 2 buahCawan porselin 1 buahPerangkat penangas air 1 unitPerangkat KLT 1 buah.

Cara kerja: (buatlah skema pada buku laporan sementara dan resmi).Minggu pertama:Serbuk rimpang kencur 30 gram dimasukkan ke dalam botol bertutup yang bersih, ditambah 200 ml etanol 95% kemudian digojog selama 2,5 jam. Selanjutnya diamkan termaserasi selama 1 minggu dalam suhu kamar sambil sering digojog (harap dibawa pulang dan sering digojog).

Minggu kedua:Campuran disaring sehingga didapat maserat. Maserat yang diperoleh diuapkan pada cawan porselin dia atas penangas air dengan bantuan kipas angin, hingga volume cairan menjadi kurang lebih 10 ml. Tuangkan cairan ke dalam botol kecil bertutup. Sisa sisa zat yang tertinggal pada cawan porselin dicuci dengan 5 ml etanol 95% dan dicampurkan ke dalam almari pendingin.

Minggu ketiga:Kristal yang diperoleh dipisahkan dari cairannnya dengan menuangkannya ke dalam corong yang diberi kertas saring yang telah ditara. Krisal pada kertas saring dikeringkan dalam oven 50oC. Karakterisasi dilakukan dengan mengamati bentuk kristal di bwah mikroskop, menguji kelarutan dalam petroleum eter, etanol 95%, dan air serta menganalisis secara kromatografi lapis tipis dengan sistem sebagai berikut:Fase diam: Silika gel GFase gerak: toluenCuplikan: larutan isolat dalam etanol dan larutan pembanding etil para metoksi sinamat.Deteksi: sinar ultraviolet 366 nm.Pereaksi anisaldehid asam sulfat, dipanaskan dalam oven 110 oC selama 5 menit.

Pertanyaan:Gambarkan struktur etil para metoksi sinamat.Mengapa etil para metoksi sinat memberikan fluorosensi pada sinar uv 366 nm.Mengapa etil para metoksi sinamat dapat dideteksi dengan pereaksi anisaldehid asam sulfat.

PERCOBAAN PEMISAHAN DAN IDENTIFIKASI MINYAK ATSIRI DENGAN GC-MS

Komponen minyak atsiri umumnya adalah monoterpen dan seskuiterpen. Untuk identifikasi monoterpen dan seskuiterpen digunakan kromatografi lapis tipis (KLT) dan kromatografi gas (GC). Dengan GC dimungkinkan sekali kerja dapat digunakan untuk analisa kualitatif dan kuantitatif. Untuk memastikan identitas, GC dapat digabung dengan spektrometri massa, karena kebanyakan terpen memberikan pecahan yang khas. Kombinasi GC-MS dapat digunakan untuk penentuan struktur kimia atau identifikasi senyawa alam, bahan hayati dan hasil sintesis, terutama yang mudah menguap. Identifikasi tersebut dapat dilakukan dengan membandingkan spectrum massa zat murni serta fragmentasinya. Instrumen GC-MS biasanya dilengkapi dengan library yang memuat pola fragmentasi dari berbagai senyawa. Berikut adalah contoh hasil GC MS minyak atsiri C.manggaNama alat: GC-MS Shimadzu (GC-17 QP 5000)Kolom : kapiler CBP 5Panjang kolom: 50 mDiameter: 0,22 mmSuhu: suhu awal 120oC, deprogram dengan kenaikan 7,5 oC/menitGas pembawa: helium dengan tekanan 44,40kPa, dengan kecepatan alir 4,40 ml/menit.

Hasil Kromatogram GC

Kromatogram gas minyak atsiri C. mangga

Hasil Fragmentasi pada waktu retensi 10,307 menit

Berdasarkan data library, senyawa pada waktu retensi 10,307 adalah -felandren. Analisis fragmentasi -felandren adalah sebagai berikut:

Reaksi fragmentasi -felandren dalam spektrometri massa.

Fragmen ion pada m/z 93 adalah base peak, dengan kelimpahan terbesar, karena fragmen ion ini distabilkan melalui resonansi berikut:

Stabilisasi resonansi karbonium 3-metilen-4-metilsiklopenten.

TUGAS MATA PRAKTIKUM IDENTIFIKASI MINYAK ATSIRI GC-MSMahasiswa memperoleh output hasil GC-MS, selanjutnya membuat interpretasi hasil dari spektra yang diberikan, dituliskan pada laporan resmi praktikum.Kegiatan pretest, mahasiswa dapat menjelaskan hasil interpretasi GC-MS contoh di atas.

PERCOBAAN 2

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI ALKALOID

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI ALKALOID PIPERIN DARI FRUCTUS PIPERIS NIGRI ATAU ALBI.

Tujuan Praktikum:Pada akhir praktikum diharapkan mahasiswa dapat:

Memahami prinsip dan melakukan isolasi piperin dari piperis nigri atau piperis albi beserta analisis kualitatif hasil isolasi dengan metode KLT

PendahuluanPiperin merupakan senyawa alkaloid. Piperin berupa senyawa amida basa lemah yang dapat membentuk garam dengan asam mineral kuat. Piperin dihidrolisis dengan KOH-etanolik akan menghasilkan kalium piperinat dan piperidin. Tumbuhan yang termasuk jenis piper ini selain mengandung 5-9% piperin juga mengandung :Minyak atsiri berwarna kuning, berbau aromatisSenyawa berasa pedas (kavisin)AmilumResinProteinSenyawa piperin secara fisik berupa kristal berbentuk jarum berarna kuning, tak berbau, tak berasa lama kelamaan pedas, larut dalam etanol asam cuka, benzene dan kloroform.

Prinsip kerjaPiperin disari dari buah piper dengan etanol 96 %, dipisahkan dari senyawa resin dengan penambahan KOH-etanol 10% b/v. kristalisasi dilakukan dengan etanol.

Bahan dan AlatBahan:Serbuk buah piper nigrum atau albumEtanol 96% (teknik)KOH-etanolik 10 %Silica gel F 254BenzeneEtil asetatPereaksi semprot Dragendorrf

Alat:Perangkat penyari Soxhlet (volume ekstraktor 100 ml)Kompor dengan penangas air atau heating mantleBatang pengadukCawan porselinCorongPerangkat KLTGlass wool

Cara Kerja Minggu ITimbang 40 g serbuk merica, masukkan ke dalam kertas saring. Serbuk yang telah terbungkus kertas saring dimasukkan ke alat penyari Soxhlet dan tambahkan etanol teknik 96% sebanyak 2 kali sirkulasi. Penyarian dilakukan selama 2 jam dengan kecepatan 6 8 sirkulasi per jam. Setelah dingin, ambil filtrate jernih dalam labu dan sisihkan 3 ml sari jernih dalam flakon tutup. Sisanya diuapkan diatas penangas air sampai lebih kurang 20 ml (terluhat sebagai ekstrak kental). Kemudian tambahkan 10 ml KOH-etanolik 10% sambil diaduk sehingga timbul endapan. Setelah mengendap, pisahkan sari dari bagian yang tidak larut melalui glass wool atau dengan kertas saring yang telah ditara/ditimbang kemudian dibasahi etanol. Sari jernih yang didapat dimasukkan flakon atau botol kecil dan didiamkan dalam almari es sampai hari praktikum berikutnya. Beri etiket yang jelas dalam flakon atau botol tersebut.

Minggu IIJika diperoleh kristal, kristal yang diperoleh dipisahkan dari cairan. Kristal dicuci dengan etanol 96% (dingin) dan dikeringkan dalam almari pengering pada suhu 40 C selama 30 -45 menit kemudian disimpan dalam eksikator yang dilengkapi kapur tohor.

Minggu IIISebelum melakukan praktikum pelajari dulu tentang sifat alkaloid dan cara ekstraksinya.Pada saat praktikum perhatikan sirkulasi yang terjadi padas aat penyarian dengan alat Soxhlet. Jika diperoleh kristal, hitung rendemen hasil percobaan terhadap serbuk simplisia. Lakukan percobaan KLT terhadap larutan kristal dalam etanol dan sari hasil penyarian dengan Soxhlet, dengan kondisi:Fase gerak: Toluen : etil asetat (7:3) sebanyak 10 mlFase diam: silica gel F 254Pembanding : piperin standar

Tugas: Hitung rendemen hasil percobaanLakukan percobaan KLT terhadap larutan kristal dalam etanol dan sari hasil penyarian dengan Soxhlet, dengan kondisi:Fase gerak : Toluen : Etil asetat (7 : 3) sebanyak 10 mlFase diam : silica gel F 254 nmAmati warna bercak yang timbul pada kromatogramPada sinar tampakPada sinar UV 254 dan 366 nmPada sinar tampak setelah disemprot DragendorrfHitung hRf bercakLakukan pengamatan organoleptik terhadap kristal yang diperoleh (bau, warna dan rasa)Tentukan jarak lebur kristal yang diperolehSerahkan kristal yang diperoleh kepada petugas labortorium dalam flakon yang diberi nama kristal dari tanaman apa dan nama kelompok.

Pertanyaan yang harus dijawabApa yang dimaksud dengan alkaloid? Apa yang dimaksud dengan amida?Gambarkan kerangka dasar alkaloid!Gambarkan struktur piperindan bagaimana polaritasnyaApa fungsi penambahan KOH etanolik dalam percobaan ini dan jelaskan dengan reaksi yang terjadi !Bagaimana kedudukan sistematika Piper nigrum?Sebutkan kandungan golongan senyawa yang pada umumnya terdapat dalam tumbuhan yang termasuk satu jenis dengan Piper nigrum !Apa perbedaan antara Fructus piperis nigri dan Fructus piperis albi?

B. ISOLASI DAN IDENTIFIKASI ALKALOID DARI DAUN MENGKUDU

Cara Kerja:Minggu ITimbang 30,0 g serbuk daun mengkudu, masukkan ke dalam kertas saring. Serbuk yang telah terbungkus kertas saring dimasukkan ke alat penyari Soxhlet dan tambahkan etanol teknik 96% sebanyak 2 kali sirkulasi. Penyarian dilakukan selama 2 jam dengan kecepatan 6 8 sirkulasi per jam. Setelah dingin, ambil filtrate jernih dalam labu dan sisihkan 3 ml sari jernih dalam flakon tutup. Sisanya diuapkan diatas penangas air sampai lebih kurang 20 ml (terlihat sebagai ekstrak kental).

Minggu ke IISari kental + asam 15 %, 15 ml Saring

Filtrat diekstraksi dg PE (3 x @ 15 ml)

Sari PESari asam asetat (klorofil, zat nonpolar lain) + NH4OH sampai pH 10Endapan dipisahkan

Rekristalisasi dg Etanol

Bila dg penambahan NH4OH tidak mengendap

Ekstraksi dg Eter ( 2 x @ 15 ml)

Sari eter

Diuapkan sampai 15 ml

Simpan di kulkas

Kristal dipisahkan

Minggu IIILakukan analisis KLT

Tugas: Hitung rendemen hasil percobaanLakukan percobaan KLT terhadap larutan kristal dalam etanol dan sari hasil penyarian dengan Soxhlet, dengan kondisi:Fase gerak : Metanol : NH4OH (100:1,5)Fase diam : silica gel F 254 nmAmati warna bercak yang timbul pada kromatogramPada sinar tampakPada sinar UV 254 dan 366 nmPada sinar tampak setelah disemprot DragendorrfHitung hRf bercakLakukan pengamatan organoleptik terhadap kristal yang diperoleh (bau, warna dan rasa)Tentukan jarak lebur kristal yang diperolehSerahkan kristal yang diperoleh kepada petugas labortorium dalam flakon yang diberi nama kristal dari tanaman apa dan nama kelompok.

PERCOBAAN 3

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA POLIKETIDA

A. Isolasi dan Identifikasi Asam Usnat dari Usnea sp

Tujuan Praktikum: Pada akhir praktikum diharapkan mahasiswa paham dan trampil melakukan isolasi asam usnat, dan melakukan identifikasi hasil isolasi secara kualitatif.

Pendahuluan:Asam usnat merupakan salah satu senyawa lichen dan termasuk senyawa yang mempunyai khasiat sebagai antibakteri. Selain terdapat dalam spesies usnea, asam usnat ini juga terdapat di dalam lichen-lichenes yang lain seperti: Alectoria, Ramalina, Everinea. Cetraria, Cladonia, Lacanora, dan Hematoma.Dilihat dari struktur kimia, asam usnat merupakan derivat dibenzofuran.Tugas: tuliskan struktur asam usnat pada buku The Merck Index, dan tunjukkan mengapa dimasukkan dalam golongan poliketida.

Prinsip Kerja:Asam usnat larut antara lain dalam aseton dan kloroform, dan tahan pemanasan, maka untuk ekstraksinya menggunakan metode Soxhlet menggunakan aseton dilanjutkan pemurnian dengan kloroform.

Bahan:Serbuk usnea (yang berwarna kekuningan)Aseton teknik.Heksana PaKloroform paAseton paEtil asetat paAsam asetat glasialEtil asetat paLempeng KLT silika gel GF 254

Pereaksi semprot:Anisaldehid asam sulfatFeCl32,4-dinitro fenilhidrasin

Alat:Perangkat alat SoxhletGelas ukur 100 mlCorong gelasPiring PetriErlenmeyer 100 ml,Bejana KromatografiAlat pengukur titik lebur.

Cara kerja:Minggu pertama :Timbang lebih kurang 25 gram serbuk usnea sp, kemudian masukkan secara hati-hati ke dalam alat Soxhlet bagitan extraction thimble ang bagian di dalammnya telah dilapisi dengan kertas saring. Rangkaikan dengan labu alas bulat 250 ml yang telah diberi batu didih 2-5 butir (anti bumping granules). Tambahkan aceton secukupnya sampai terjadi 2 klai sirkulasi. Lakukan penyarian dengan alat Soxhlet selama 1,5 jam.

Hasil penyarian dinginkan pada suhu kamar kemudian saring. Uapkan filtrat yang diperoleh sehigga asetonnya habis dengan menggunakan cawan porselin di atas penagas air dengan bantuan hembusan angin.Residu dilarutkan dalam kloroform dengan cara digojog dua kali, setiap kali enggunakan 25 ml kloroform. Saring melalui kertas saring, tampung dalam botol bersih. Simpan dalam suhu kamar untuk praktikum selanjutnya. Uapkan kloroform dengan evaporator sehingga kloroformnya habis.Tambahkan 3 ml aseton ke dalam labu untuk melarutkan residu. Tuangkan campuran ke dalam botol kecil yang bersih dan kering. Bilas labu dengan aseton dan campurkan bilasan dengan larutan dalam botol, sampai padatan tepat larut. Simpan dalam almari pendingin sehingga terbentuk kristal.

Minggu kedua :Kristal yang terbentuk dipisahkan dari cairannnya dengan corong berlapis kertas saring yang telah ditara. Bilas botol dengan etanol yang sudah didinginkan dalam freezer selama 1 jam, kemudian bilasan digunakan untuk mencuci kristal yang usah ada pada kertas saring.Kristal yang diperoleh dikeringkan dalam oven 50oC. Timbang hasilnya dan hitung randemennya.

Minggu ketiga :Lakukan analisis KLT. Ambil sedikit kristal menggunakan ujung jarum, lartkan dalam 2 ml etil asetat dan lakukan percobaan kromatografi lapis tipis.Fase diam: silika gel GF 254Fase gerak: Heksana:etil asetat:asam asetat = 4 : 1 : 1 Pembanding: asam usnat baku pembandingCuplikan: 5-10 mikroliter larutan asam usnat baku pembanding dalam etil asetat (1%)Deteksi: sinar UV 254 dan 366 mmPereaksi anisaldehid-asam sulfat, panasi lempeng pada suhu 100 oC, selama 15 menit.Pereaksi FeCl3 dalam HCl 0,5 NPereaksi 2,4 dinitrofenilhidrasin (larutan 2,4-DNP 0,4% dalam HCl 2 N)

Tentukan titik lebur kristal yang diperoleh dengan alat Tiele.

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI GLIKOSIDA ANTRAKINON DARI AKAR PASAK BUMI

Cara kerja seperti pada Isolasi dan Identifikasi Glikosida Flavonoid pada daun ketela pohon. Perbedaan pada Analisis Kromatografi.Analisis Kromatografi:Fase Gerak: n-butanol:asam asetat:air = 4:1:5Fase diam: silika gel GF 254Cuplikan: sari-1, sari-2, sari -3 dengan pembanding larutan antrakinon yang diperoleh dari penyarian buah klerak dengan etanol Masing-masing 10 totolan, kecuali sari-3 sebanyak 30 totolan. Dibuat dalam dua lempeng.Detektor: Lempeng pertama dengan KOH etanolik. Lempeng kedua dengan KMnO4.

PERCOBAAN 4

ISOLASI DAN ELUSIDASI STRUKTUR PARSIAL FLAVONOID

TUJUAN PRAKTIKUMSebelum melakukan praktikum ini, mahasiswa harus telah memahami tentang pengertian flavonoid, penggolongan dan tata nama flavonoid serta sifat fisikokimia dan teknik ekstraksinya.

Tujuan dari praktikum ini adalah agar mahasiswa mampu melakukan: Teknik ekstraksi terhadap simplisia yang mengandung senyawa flavonoid.Teknik isolasi senyawa flavonoid dan mengidentifikasi struktur parsialnya.

PENDAHULUANFlavonoid termasuk senyawa fenolik yang mencakup sejumlah besar senyawa dalam tanaman. Pada umumnya memiliki cincin aromatik yang mengikat satu atau lebih gugus hidroksi. Senyawa flavonoid ditandai oleh struktur umum C6-C3-C6 dimana dua inti benzen dihubungkan oleh rantai alifatik tiga karbon. Senyawa flavonoid tersebar luas pada bagian tumbuhan seperti daun segar, tepung sari, kayu, nektar, bunga, buah dan biji. Di dalam tumbuhan, flavonoid sering terdapat dalam campuran yang terdiri atas berbagai jenis flavonoid.

Penyebaran jenis flavonoid pada golongan tumbuhan yang terbesar, yaitu angiospermae, flavonoid yang ditemukan pada lumut batu (Charophyceae) merupakan satu-satunya flavonoid yag terdapat dalam klorofita, dan sintesis flavon yang terhalogenasi oleh fungi. Penyebaran flavonoid terbatas pada golongan tumbuhan dengan tingkat kerumitan briofita atau yang lebih tinggi. Segi pentingnya dari penyebaran flavonoid dalam tumbuhan adalah adanya kecenderungan kuat bahwa tumbuhan yang secara taksonomi berkaitan akan menghasilkan flavonoid yang sejenisnya serupa, misalnya dari marga atau suku yang sama (Markhan, 1998).Penggolongan flavonoid berdasarkan pada substituen cincin heterosiklik yang mengandung oksigen (O2) dan perbedaan distribusi dari gugus hidroksi. Perbedaan di bagian atom C3 menentukan sifat, khasiat dan golongan atau tipe flavonoid, yaitu flavon, flavonol, flavanon, flavononol, flavan dan flavanol (Markkham, 1998). Kerangka dan skema pemberian nomor dalam tipe-tipe flavonoid seperti pada Gambar 1 berikut.

Gambar 1. Kerangka tipe-tipe flavonoid (Markham, 1988)

Ekstraksi flavonoid dari tumbuhan dapat dilakukan dengan berbagai pelarut berdasarkan atas perbedaan kelarutannya dalam pelarut-pelarut tersebut. Kelarutan senyawa flavonoid bermacam-macam sehingga untuk mengekstraksinya digunakan pelarut yang memiliki polaritas sesuai flavonoid tersebut. Dalam pemilihan pelarut tidak hanya bergantung pada kandungan zat yang diselidiki, tetapi juga tergantung tempat terdapatnya dan substitusi apa saja yang terkandung di dalamnya (Harborne, 1987).Metode yang paling menguntungkan untuk mengisolasi atau memisahkan campuran flavonoid antara lain adalah kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis, karena hanya membutuhkan jumlah sampel yang relatif sedikit dan fase diam dalam kromatografi tergantung dari tipe flavonoid yang akan dipisahkan, fase diam yang paling umum adalah poliamida dan selulosa mikrokristal (Markham, 1988).Flavonoid merupakan senyawa yang mudah larut dalam air, terutama bentuk glikosidanya. Bahkan senyawa yang sedikit larut dalam air dapat diekstraksi dengan methanol, etanol atau aseton. Pengekstraksian kembali larutan dalam air dengan pelarut organik yang tidak bercampur dengan air tetapi agak polar seringkali bermanfaat untuk memisahkan golongan ini dari senyawa yang lebih polar (Robinson, 1991). Pelarut-pelarut alkoholik merupakan pelarut pilihan untuk mengekstraksi semua golongan flavonoid, biasanya digunakan etanol, methanol atau propanol.Untuk memisahkan flavonoid yang bersifat polar seperti glikosida digunakan selulosa mikrokristal. Sedangkan untuk memisahkan flavonoid yang non polar misalnya aglikon-aglikon dari isoflavon, flavon dan flavonol yang termetoksilasi maka digunakan silika gel. Poliamid dapat digunakan untuk memisahkan campuran glikosida dan aglikon dari isoflavon, flavon, dihidrovanol dan flavonon dengan fase gerak campuran methanol dan air (Mabry, et. al, 1970).

PERCOBAANBahanPereaksi untuk identifikasi flavonoid

Bahan yang digunakan untuk mendeteksi flavonoid adalah :Uap amoniakPereaksi sitroborat, yang dibuat dengan :

Asam sitrat 2,5 gAsam borat 2,5 gMetanol ad 50 mlBahan pereaksi diagnostik untuk penentuan struktur flavonoid secara spektroskopi UV-Vis (Markham, 1988) :Pereaksi natrium hidroksida (NaOH) 2 M, pereaksi ini dibuat dengan cara melarutkan 4 gram kristal natrium hidroksida dalam 50 ml air.Pereaksi aluminium klorida (AlCl3) 5% dibuat dengan cara melarutkan 5 gram aluminium klorida anhidrat dalam 100 ml methanol dan didiamkan selama 24 jam, agar larut dengan sempurna.Pereaksi asam klorida (HCl), pereaksi ini dibuat dengan cara 50 ml asam klorida pekat (35%) ke dalam 100 ml air.Pereaksi natrium asetat (CH3COONa), pereaksi ini dibuat dengan cara memanaskan serbuk natrium asetat dalam gelas piala selama 10 menit di atas nyala api kecil kemudian dituang dalam lempeng porselin dan digerus halus.Pereaksi asam borat (H3BO3). Pereaksi ini merupakan sebuk asam borat anhidrat yang dibuat dengan cara memanaskan serbuk asam borat dalam gelas selama 10 menit di atas nyala api kecil kemudian dituang dalam lempeng porselin dan digerus halus.

2. AlatAlat-alat yang digunakan :a. Alat EkstraksiToples maserasiPenangas air Corong pisah dan corong BuchnerAlat-alat gelasKompor listrik

b. Alat KromatografiChamberLampu UV 366 nmPipa kapilerKertas saring

c. Alat Analisis Spektro UV-VisSpektroskopi UV-Vis Kuvet

Cara kerjaa. Penyarian FlavonoidSebanyak 150 gram serbuk bahan dimasukkan dalam panci infusa kemudian di tambah akuades 300 ml (2x bobot bahan untuk pembasahan) dan diaduk. Setelah semua serbuk terbasahi kemudian ditambah akuades sebanyak 750 ml panaskan 30 menit pada suhu 90 oC. Cairan yang diperoleh disaring panas dengan kertas saring, dekokta yang diperoleh dimasukan dalam botol dan disimpan dalam kulkas hingga diperoleh kristal.

Kristal yang diperoleh disaring dengan kertas saring yang telah ditara dan dicuci dengan akuades dingin. Kristal yang diperoleh dikeringkan dioven pada suhu 50 oC dan ditimbang untuk menghitung rendemennya. Bila tidak diperoleh kristal maka perlu dilakukan isolasi flavonoid secara preparatif (b dan c). Bila diperoleh kristal langsung masuk ke tahap pemeriksaan kemurnian flavonoid dengan KKt 2 dimensi (d). b. Pemeriksaan Kandungan Flavonoid dengan KKtPemeriksaan kandungan flavonoid dilakukan secara kromatografi kertas dengan menggunakan berbagai fase gerak. Fase diamnya adalah kertas Whatman no.1 dan fase geraknya adalah BAW (4:1:5) dan asam asetat 15 %. Fase gerak yang paling baik untuk pemisahan senyawa flavonoid digunakan untuk analisis selanjutnya.c. Isolasi Flavonoid secara KKt preparatifSampel ditotolkan berupa pita atau garis pada kertas Whatman no.1 yang berukuran 15 x 15 cm sebanyak 40 lembar dengan jumlah totolan tiap lembar 6-7 totolan, kemudian dikembangkan dengan fase gerak asam asetat 15%. Bercak flavonoid yang berwarna kuning dan memiliki Rf yang sama jika diuapi amonia, dipotong, dikumpulkan dan diekstraksi dengan metanol p.a secukupnya, kemudian diambil sari metanolnya dengan disaring sehingga diperoleh isolat flavonoid.d. Pemeriksaan Kemurnian Flavonoid dengan KKt Dua DimensiUntuk mengetahui kemurnian isolat flavonoid yang diperoleh dilakukan pemeriksaan kemurnian dengan kromatografi kertas dua dimensi, yaitu Whatman no. 1 berukuran 20 cm x 20 cm dan dikembangkan dengan asam asetat 15% setelah diangkat dan kering, dikembangkan lagi dengan BAW (4:1:5). Jika yang timbul hanya satu bercak berarti telah murni. Larutan penotolan dibuat dengan cara melarutkan 10 mg kristal glikosida flavonoid dalam 1 ml MeOH (untuk yang diperoleh kristal). Bagi yang tidak diperoleh kristal gunakan isolat dalam MeOH hasil isolasi glikosida flavonoid secara KKt preparatif. e. Pemeriksaan Hidrolisis Isolat FlavonoidPemeriksaan isolat flavonoid menurut Markham (1998) dimulai tahapan berikut :Larutan glikosida flavonoid (50 mg) dalam 50 ml HCl 2 N : MeOH (1:1) dalam labu bundar 100 ml dan panaskan (dipasang pendingin) pada penangas air selama 60 menit. Uapkan sampai kering dengan menggunakan penguap-putar. Sisa dilarutkan sempurna dalam sedikit pelarut MeOH : H2O (1:1) dan dikromatografi (asam asetat15%). Totolkan pada kertas Wathmann sebanyak 2 totolan, totolan pertama adalah kristal glikosida dalam MeOH dan totolan ke dua adalah hasil hidrolisis.Jika telah terjadi hidrolisis, misalnya RF telah menjadi lebih kecil, flavonoid tersebut adalah suatu O-glikosida (atau kemungkinan kecil suatu bisulfat atau C-glikosida yang ter-O-glikosilasi).Jika tidak terjadi hidrolisis, glikosida tersebut adalah C-glikosida atau mungkin suatu glukuronida.Jika terjadi hidrolisis sebagian, glikosida tersebut mungkin glukoronida.

Untuk mengisolasi gula dan aglikon untuk analisis lebih lanjut, uapkan larutan MeOH-air sampai volumnya tinggal setengah agar MeOH hilang. Tambahkan akuades 25 ml dan lakukan ekstraksi beberapa kali minimal 3 kali dengan EtOAc (dengan mengocok kuat-kuat dalam corong pisah). Aglikon akan berada dalam fraksi EtOAc dan gula dalam fraksi air. Fraksi EtOAc diuapkan sampai semua pelarut menguap, kemudian tambahkan MeOH sebanyak 10 ml. Sehingga akan diperoleh 3 sari yaitu:Sari I : larutan 10 mg kristal dalam 10 ml MeOHSari II: Fraksi EtOAc Sari III: Sari airKetiga sari ditotolkan pada 2 buah kertas Wathmann bersama dengan pembanding rutin, glukosa dan rhamnosa. Sehingga total masing-masing kertas Wathmann ada 6 totolan. Kemudian dikembangkan pada 2 fase gerak BAW (4:1:5) dan asam asetat 15%. Sisa Sari I digunakan oleh sub A untuk dilakukan identifikasi flavonoid secara Spektroskopi UV-Vis (Tahap f). Sedangkan sub B menggunakan sari II.f. Pemeriksaan Isolat Flavonoid secara Spektroskopi UV-Vis dengan Menggunakan Pereaksi Diagnostik

Pemeriksaan isolat flavonoid menurut Markham (1998) dimulai melalui tahapan berikut ini:1. Larutan isolat flavonoid dalam metanol dimasukkan ke dalam kuvet, selanjutnya metanol murni dimasukkan dalam kuvet pembanding, keduanya kemudian direkam spektrumnya secara bersama-sama.2. Larutan isolat flavonoid dalam metanol ditambahkan 3 tetes pereaksi NaOH 2M kemudian direkam spektranya. Untuk mengetahui apakah ada penguraian, spektrum diperiksa lagi setelah 5 menit, kemudian cuplikan dibuang, kuvet yang telah dipakai dicuci dengan aquadest.3. Kuvet diisi kembali dengan isolat flavonoid persediaan ditambah 6 tetes pereaksi AlCl3, kemudian direkam spektrumnya. Selanjutnya ditambah 3 tetes HCl dan spektrum direkam lagi. Cuplikan dibuang dan kuvet dicuci.4. Pada isolat flavonoid dalam kuvet ditambahkan serbuk CH3COONa sedemikian rupa sehingga terdapat kira-kira 2 mm lapisan CH3COONa pada dasar kuvet, kemudian dikocok sebelum spektrum direkam. Spektra dibaca 2 menit setelah penambahan CH3COONa.5. Dalam kuvet yang telah berisi isolat flavonoid dan CH3COONa ditambahkan H3BO3 kira-kira banyaknya setengah dari penambahan CH3COONa, kemudian spektrum dibaca kembali.g. Pemeriksaan Gula Campuran baku harus dibuat pembanding, terdiri atas glukosa, galaktosa, arabinosa masing-masing 100 mg, dilarutkan dalam 20 ml air (mengandung isopropil alkohol 10% sebagai pengawet). Aliquot (4 ml) dari larutan pembanding ini ditotolkan sebagai titik di sepanjang garis awal lembaran kertas kromatografi Whatman no. 1 (panjang 57 cm), dan larutan gula yang diperiksa ditotolkan di antara titik-titik tadi dengan berbagai jumlah totolan (minimal 40 totolan per bercak).h. Analisis HasilData penelitian yang berupa harga Rf, fluoresensi bercak atau warna bercak, hasil dideteksi dengan pereaksi diagnostik dari pola spektra pergeseran panjang gelombang yang terjadi dianalisis bedasarkan pustaka acuan dan dibandingkan dengan data yang telah dilaporkan pada berbagai pustaka.

D. DAFTAR PUSTAKAHarborne, J.B., 1987, Phytochemical Methods, Diterjemahkan oleh Kosasih Padamawinata, Edisi II, Penerbit ITB, Bandung.

Mabry, T.J., Markham, K.R., Thomas, M.B., 1970, The Systemic and Identification of Flavonoid, Springer Verlag, Hiedelberg, Berlin.

Markham, K.R., 1988, Techniques of Flavonoid Identification, Diterjemahkan oleh Kosasih Padamawinata, Penerbit ITB, Bandung.

Robinson T., 1991, The Organic Constituen of Higher Plants, Diterjemahkan oleh Kosasih Padamawinata, Penerbit ITB, Bandung.